DE4314091A1

DE4314091A1 - Immunologisches Nachweisverfahren für Triazine

Info

Publication number: DE4314091A1
Application number: DE4314091A
Authority: DE
Inventors: Eva Dipl Chem Dr Hoess; Erasmus Dipl Chem Dr Huber; Christine Markert-Hahn; Wolfgang Rollinger
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1993-04-29
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 1994-11-03
Also published as: EP0622633A2; EP0622633A3; US5573922A

Description

Die Erfindung betrifft ein immunologisches Verfahren zum Nachweis von Triazinen sowie die hierfür verwendeten Reagentien.

Triazine und Triazinderivate, wie Atrazin, Simazin, Ametryn, Propazin, Terbutylazin, Cyanazin, Desethylterbu tylazin, sind Substanzen, die als Herbizide in großem Umfang im Pflanzenschutz eingesetzt werden. Da Triazine nur sehr langsam im Boden abgebaut werden und damit ins Grundwasser übertreten können, ist ein schneller und empfindlicher Nachweis für Triazine von besonderer Bedeu tung.

Die Bestimmung von Triazinen erfolgt entweder durch instrumentelle Analytik (HPLC- oder GC-MS-Methoden, U. Obst, GIT Fachz. Lab. 4 (1992) 365), mikrobiologisch (R. Reupert, GIT Spezialchromatographie 1 (1992, 30) oder durch immunologische Nachweisverfahren (Achr. Chem. Tech. Lab. 39 (1991) M1-M42).

Die immunologischen Nachweisverfahren für Triazine werden vorzugsweise als ELISA-Test durchgeführt. Üblicherweise handelt es sich dabei um einen kompetitiven Test, bei dem ein Antikörper gegen ein Triazin oder Triazinderivat immo bilisiert wird und das Triazin aus der Probe mit einem Konjugat aus Triazin und einer Markierung, vorzugsweise einem Enzym, kompetiert. Je mehr Triazin in der Probe enthalten ist, um so weniger des enzymmarkierten Konjugats wird an den Antikörper gebunden. Nach Bildung der immuno logischen Komplexe wird die Menge des Markierungsenzyms als Maß für die Menge des in der Probe enthaltenen Triazins, üblicherweise photometrisch, bestimmt.

Mit derartigen Immunoassays lassen sich entweder einzelne Atrazine bestimmen oder ganze Gruppen von Atrazinen. Üblicherweise werden bei den bekannten Immunoassays mono klonale Antikörper (für Tests auf einzelne Atrazine) oder polyklonale Antikörper (für Tests auf einzelne Atrazine oder Atrazingruppen) verwendet sowie ein Konjugat aus einem Enzym, vorzugsweise Peroxidase, und dem Hapten, welches auch bei der Immunisierung verwendet wurde (homo loges Konjugat). Ein homologes Enzymkonjugat ist also ein Konjugat aus Hapten und Enzym, bei dem das Hapten im Konjugat und Immunogen bzgl. Substituentenmuster als auch Kupplungsposition des aktivierten Haptens identisch ist.

Mit den bekannten gruppenspezifischen Triazintesten ist es zwar möglich, Atrazin mit einer hohen Empfindlichkeit nachzuweisen, die Empfindlichkeit gegenüber anderen Tri azinen ist jedoch gering (L. Weil, Nachr. Chem. Tech. Lab. 39 (1991) 1277).

Aus der EP-A 0 300 381 ist ein immunologisches Nachweis verfahren für Triazine bekannt, bei dem polyklonale Anti körper aus Kaninchen sowie ein Enzymkonjugat aus alkalischer Phosphatase und einem Triazin, das je nach Art des Antikörpers ausgewählt ist, verwendet werden. Wird der Nachweis mit einem Antikörper durchgeführt, der durch Immunisierung mit Ametryn hergestellt wurde, so wird Ametryn im Konjugat verwendet.

Aus der EP-B 0 180 305 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Atrazinen bekannt, bei dem ebenfalls zur Immunisierung das gleiche Hapten wie im Enzymkonjugat verwendet wird. Analoge Tests sind beschrieben von B. Dunbar, J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 433-437, M. H. Goodrow, J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 990-996. Dort wird zusätzlich ausgeführt, daß derartige homologe Konjugate (bei denen die Bindung des Triazins an das Trägerprotein für die Immunisierung und an das Enzym im Konjugat über die glei che Stelle erfolgt) bessere Ergebnisse im Test ergeben, wie wenn ein heterologes Konjugat (bei dem die Bindung von immunologischem Träger und Enzym über unterschiedliche Positionen am Triazinring erfolgt) verwendet wird.

Mit den bekannten Tests wird jedoch für einige Triazine nur eine geringe Empfindlichkeit erreicht, so daß nicht festgestellt werden kann, ob die Verunreinigung der Probe mit Triazinen insgesamt unter dem vom Gesetzgeber festge legten Wert liegt. Eine vollständige Erfassung aller Triazinderivate in Wasserproben ist demnach durch die bekannten immunologischen Tests nicht gewährleistet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Bestimmung von Triazin und Triazinderivaten zur Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe ein Screening von triazinverunreinigten Wasserproben möglich ist, eine hohe Sensitivität und Kreuzreaktivität zu Atrazin, Ametryn, Propazin, Terbutylazin, Simazin, Cyanazin und Desetylterbutylazin erreicht wird und ein Nachweis der Mengen in den gesetzlichen Grenzwerten von 0,1 µ/l Atrazin und 0,5 µ/l Gemisch aus Triazinen möglich ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Triazin und Triazinderivaten durch einen kompetitiven Immunoassay, bei dem Probe und markiertes Atrazin um einen vor, während oder nach der immunologischen Reaktion festphasengebunde nen polyklonalen Antikörper konkurrieren, Bindung des immunologischen Komplexes an die Festphase, Trennung von Festphase und ungebundenem markiertem Atrazin und Bestim mung der Markierung in der festen oder flüssigen Phase, als Maß für den Gehalt an Atrazin und Atrazinderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß polyklonale Antikörper, die durch Immunisierung mit einem 4-Alkyl-amino-S-Triazin erhalten wurden, und als markiertes Atrazin ein Konjugat aus einer Markierung und 4-Amino-S-Triazin, welches über die 6-Position an die Markierung gebunden ist, verwendet werden.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß bei Kombina tion von derartig hergestellten polyklonalen Antikörpern und Konjugaten eine hohe Kreuzreaktivität des Bestimmungs verfahrens für Atrazin, Terbutylazin, Desethylterbutyl azin, Propazin, Simazin, Cyanazin, Desethylatrazin und Desisopropylatrazin erreicht wird. Die Kreuzreaktivität bei Verwendung eines homologen Konjugats (Hapten in Immu nogen und Konjugat identisch) zeigt dagegen eine wesent lich schlechtere Kreuzreaktivität.

Als Immunogene werden Triazine verwendet, welche in 4- Position einen Alkylaminorest tragen und über die 6-Posi tion an den immunogenen Träger gebunden sind. Als Alkyl reste werden kurzkettige, verzweigte und unverzweigte Alkylreste mit 1-4 C-Atomen verwendet. Besonders bevor zugt wird der Isopropylrest verwendet.

Die Kopplung an den immunogenen Träger (z. B. KLH, β-Galactosidase, Edestin) erfolgt vorzugsweise durch nucleophile Substitution. Dazu wird eine substituierte Aminogruppe eingeführt, deren Substituent zur Kopplung an den immunologischen Träger geeignet ist. Beispielsweise wird als aktivierte Gruppe eine Carboxylgruppe eingeführt, die zum Hydroxysuccinimid aktiviert wird und anschließend über die Aminogruppe des immunologischen Trägers gekoppelt wird. Weitere Kopplungsmethoden sind dem Fachmann geläufig (M. Brinkley, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 2-13).

Die Herstellung des polyklonalen Antiserums erfolgt eben falls nach den üblichen, dem Fachmann geläufigen Methoden, vorzugsweise in Schafen. Eine derartige Immunisierung ist beispielsweise bei B. Dunbar, J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 433-437 und N.H. Goodrow, J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 990-996 beschrieben. Die erhaltenen polyklonalen Antiseren können ohne weitere Reinigung eingesetzt wer den.

Im Konjugat aus Markierung und Triazinderivat kann als Markierung jede dem Fachmann geläufige Markierung verwen det werden. Bevorzugt wird jedoch eine Enzymmarkierung (Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Calactosidase) verwendet. Die Kopplung des Triazinderivats an das Enzym erfolgt über 6-Position. Zur Herstellung dieser Konjugate wird in 6-Position zunächst über die Aminogruppe eines heterobifunktionellen Spacers Chlor nucleophil substi tuiert. Als zweite Funktion des Spacers kann jede akti vierbare Gruppe verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch eine Thiolgruppe, die S-Acetyl-geschützt ist, verwendet. Die Länge des Spacers zwischen Triazin und Peroxidase ist unkritisch, beträgt jedoch zweckmäßig zwischen 10 und 30 Atomen. In einem weiteren Reaktionsschritt wird dann das Chlor in 4-Position durch eine Aminogruppe substituiert. Anschließend wird die geschützte Thiolfunktion freigesetzt und zweckmäßig über ein Maleinimido-funktionalisiertes Enzym Triazin und Enzym gekoppelt.

Die Durchführung der immunologischen Bestimmung von Tria zin und Triazinderivaten erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Verfahren. Derartige Verfahren sind beispiels weise in S. Wüst, Git Fachz. Labor 2 (1990) 99, S.J. Huber, Git Fachzt. Labor 10 (1985) 969, B. Dunbor, JU. Agric. Food. Che. 38 (1990) 433, M.H. Goodrow, J. Agric. Food. Chem. 38 (1990) 990 beschrieben. Üblicherweise wird hierzu das polyklonale Antiserum an einen Träger, wie Mikrotiterplatten, gebunden. Diese Bindung kann adsorptiv, kovalent oder über ein weiteres Bindungspaar, wie bei spielsweise Biotin/Avidin, erfolgen. In letzterem Fall wird beispielsweise an der Mikrotiterplatte Streptavidin immobilisiert und die Antikörper des polyklonalen Antise rums an Biotin gekoppelt. Die Durchführung der Bestimmung erfolgt in der Weise, daß zu den immobilisierten oder immobilisierbaren polyklonalen Antikörpern Probe und Konjugat aus Atrazinderivat und Markierung gegeben werden. Nach Inkubation werden flüssige und feste Phase getrennt und die Markierung in der festen oder abgetrennten flüssi gen Phase bestimmt. Bevorzugt wird eine Enzymmarkierung verwendet. In diesem Fall erfolgt der Nachweis vorzugswei se über eine nachgeschaltete Farbbildungsreaktion. Wird Peroxidase als Enzym verwendet, erfolgt die Nachweisreak tion zweckmäßig über ABTS® oder ähnliche H₂O₂-Nachweis systeme.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung wei ter:

Beispiel 1 Herstellung des Triazin-Immunogens Beispiel 1.1 2,4-Dichlor-6-tert.butylamino-1,3,5-triazin

9.23 g (50 mmol) Cyanurchlorid in 200 ml Toluol gelöst werden mit 10 ml 0.1 n Natronlauge und 6.74 g (92.25 mmol) tert. Butylamin versetzt und 1 h bei 20°C gerührt. Der pH-Wert der Reaktion wird in dieser Zeit ständig kontrol liert und ggf. mit 1 n Natronlauge auf pH 11-12 nachge stellt. Anschließend wird das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand in 150 ml Wasser aufgenommen, zweimal mit je 150 ml Essigester extrahiert, die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wird in 200 ml Essigester/Petrolether (v/v 4/1) gelöst, unlösliche Bestandteile abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Die Reinigung des Rohprodukts erfolgt durch Säulenchromatographie (Kieselgel Merck 60, 5 × 30 cm, Eluent: Essigester/Petrolether (v/v 4/1)).
Ausbeute: 8.84 g (74% d. Th.)
¹H-NMR (D₆-DMSO/TMS): 1.36 (s, 9H, CH₃); 8.91 ppm (s, 1H, NH).
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Petrolether (v/v 4/1).
R_f = 0.88

Beispiel 1.2 6-[N-(6-Aminohexylcarboxyl)]-2-chlor-4-tert.butylamino- 1,3,5-triazin

Zu einer Lösung aus 4.42 g (20 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1.1 in 100 ml Toluol werden langsam 5.25 g (40 mmol) 6-Aminocapronsäure in 20 ml 0.1 n Natronlauge getropft. Der pH-Wert wird mit 1 n Natronlauge auf pH 11- 12 nachgestellt und das Reaktionsgemisch 3 h unter Rück fluß gehalten. Anschließend wird das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum entfernt, der Rückstand in wenig THF gelöst und langsam zu 500 ml eisgekühltem Diisopropylether getropft. Die Suspension wird noch 30 min unter Eiskühlung gerührt, der Niederschlag abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 0.76 g (6% d. Th.)
¹H-NMR (D₆-DMSO/TMS): 1.34 (s, 9H, CH₃), 1.48 (m, 6H, CH₂); 2.12 (t, 2H, J=7.0 Hz, CH₂- COOH); 3.17 (m, 2H, CH₂-NH); 7.39 (s br, 1H, NH-C); 7.75 ppm (m, 1H, NH-CH₂); COOH tauscht unter der Aufnahmebedingungen aus.

DC: Kieselgel (Merck 60 ), Essigester/Methanol (v/v 3/1) und 1% Essigsäure.

R_f = 0.77

Beispiel 1.3 Methansulfonsäure-N-hydroxysuccinimidester

1.15 g (10 mmol) N-Hydroxysuccinimid werden in 10 ml wasserfreiem THF gelöst und langsam mit 1.6 ml Triethyl amin versetzt. Die entstandene Suspension wird mit einer Eis/Kochsalzmischung gekühlt und bei 0-5°C unter Rühren mit 0.78 ml (10 mmol) Methansulfonylchlorid versetzt. 30 min wird bei 0°C nachgerührt, danach läßt man die Tempera tur auf 20°C ansteigen. Die Mischung wird über Nacht bei 20°C stehen gelassen und anschließend im Vakuum einge dampft. Der kristallisierte Rückstand wird in Wasser aufgenommen, abgesaugt und gut mit Wasser gewaschen. Im Exsiccator wird das Produkt über Sicapent bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Ausbeute: 1.63 g (84% d. Th.)

Beispiel 1.4 Aktiviertes Triazin-Hapten

633 mg (2 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1.2 werden in 30 ml Methanol suspendiert und mit 113.4 mg (1.6 mmol) festen Kaliumhydroxid versetzt. Die sich bildende klare Lösung wird 20 min bei 20°C gerührt und anschließend das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in 20 ml THF aufgenommen, mit 386.3 mg (2 mmol) Methansulfonsäure-N-hydroxysuccinimidester aus Beispiel 1.3 und katalytischen Mengen Dibenzo-18-krone-6 versetzt und 21 h bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, der Rückstand in 50 ml Essigester aufgenommen und Unlösliches abfiltriert. Das Filtrat wird einmal mit 50 ml ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und zweimal mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und am Hochvakuum eingeengt.
Ausbeute: 710 mg (86% d. Th.)
¹H-NMR (D₆-DMSO/TMS): 1.37 (s, 9H, CH₃); 1.40 (m, 2H, CH₂); 1.53 (in, 2H, CH₂); 1.64 (m, 2H, CH₂); 2.65 (t, 2H, J=7.0 Hz, CH₂-COO); 2.82 (s, 4H, CH₂COO); 3.33 (in, 2H, CH₂-NH); 7.45 (s, 1H, NH-C); 7.80 ppm (t, 1H, J=6.8 Hz, NH-CH₂).
¹³C-NMR (D₆-DMSO/TMS): 23.88, 25.23 (CH₂); 25.35 (CH₃); 28.10, 30.08 (CH₂); 39.40 (CH₂-NH); 50.50 (C-(CH₃)₃); 164.56, 164.89 (N=C-N); 167.23 (C-Cl); 168.74 (COO); 170.07 ppm (OCO-CH₂).
MS (EI): 412 [M]⁺
DC: Kieselgel (Merck 60), Essigester/Methanol (v/v 3/1).
R_f = 0.91

Beispiel 1.5 Triazin-Immunogen

Zu einer Lösung aus 4 g (2.1 × 10⁻6 mol, 1 g β-Gal-Wirk stoff) β-Galactosidase-Lyophilisat in 100 ml Wasser, mit 0.1 n Natronlauge auf pH 8.5-9.0 eingestellt, tropft man 157 mg (3.8 × 10^-4 mol) der Verbindung aus Beispiel 10 in 20 ml Dioxan gelöst. Nach 30 min wird der pH-Wert auf pH 8.5-9.0 nachgestellt und der Ansatz weitere 16 h bei 20°C gerührt. Anschließend wird die Reaktionslösung in einer Amiconzelle aufkonzentriert, mit 50 mml 10 mmol KPO₄-Puffer pH 7.0, der 0.9% Natriumchlorid enthält, versetzt. Das Immunogen wird über eine AcA 202-Gelsäule (3 ×50 cm, Eluent: 10 mmol KPO₄-Puffer pH 7.0 enthält 0.9% Natriumchlorid) aufgereinigt. Die Fraktionen des ersten Peaks (UV-Detektor, 280 nm) werden gepoolt.

Beispiel 2 Herstellung des homologen POD-Konjugats

¹) Vorpolymerisierte POD (PODp) kann durch Reaktion von monomerer POD mit Glutardialdehyd, wie bei Engvall und Perlmann beschrieben (Immunochemistry 8 (1971), 871- 874), erhalten werden.

Meerrettich Peroxidase (PODp)¹) wird in 10 mM Kalium phosphatpuffer pH 8.5, 0.1 M NaCl, 025 mM CaCl₂ und das aktivierte Triazin-Hapten aus 1.3 in DMSO gelöst. Die entsprechenden Mengen PODp und Triazin werden gemischt, so daß eine molare Stöchiometrie von 5 : 1 (Hapten : Protein) resultiert. Die DMSO-Konzentration beträgt bei der Kopp lung 20%. Die Inkubation erfolgt 2 h bei 25°C untere Rühren. Anschließend wird zur Abtrennung des nicht abre agierten Haptens über Nacht dialysiert gegen 10 mM Kalium phosphatpuffer, pH 7.0, 0.1 M NaCl, 0.025 mM CaCl₂.

Beispiel 3 Herstellung des heterologen Triazin-Konjugats Beispiel 3.1 1-Butoxycarbonyl-1,2-diaminoethan (m-Boc-ED) Zwischenprodukt

Zu einer Lösung aus 120 g (2 mol) Ethylendiamin und 2 l Dioxan/Wasser(v/v 1/1) werden unter Rühren bei 0°C 218 g (1 mol) Di-tert.butyldiarbonat in 1 l Dioxan innerhalb 1 h zugetropft. Nach einstündigem Rühren bei 20°C engt man das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum ein, filtriert vom als Nebenprodukt entstandenen Bis-1,2-butoxycarbonyl-1,2- diaminoethan ab und extrahiert das Filtrat mit 300 ml Essigester. Die organische Phase wird noch dreimal mit je 100 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Wasserstrahlvakuum eingeengt.
Ausbeute: 27.3 g (8.5% d. Th.)
¹H-NMR (CDCl₃/TMS): 1.45 (s, 9H, O-C(CH₃)₃); 2.79 (T, 2H, J=7.5 Hz, CH₂-NH); 3.14 (m, 4H, CONH) 5.00 ppm (s, br, 1H, O-CH₂-NH₂);
DC: Kieselgel 60 (Merck), Isopropanol/Butylacetat/Wasser/ Ammoniak (v/v/v/v/ 50/30/15/5), Detektion mit Ninhydrin.
R_f= 0.23

Beispiel 3.2 1-Butoxycarbonyl-2-[(3-methylcarbonylthio)propionyl]-1-2- diaminoethan (Boc-ED-(S)ATP)

8.00 g (50 mmol) Verbindung aus Beispiel 3.1 und 12.26 g (50 mmol) N-Succinimidyl-S-acetylthiopropionat (SATP) werden in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst und 4 h bei 20°C gerührt. Anschließend kühlt man die Lösung im Eisbad, saugt das ausgefallene Produkt ab und trocknet es im Hochvakuum bei 40°C.
Ausbeute: 9.22 g (63.9% d. Th.)

Beispiel 3.3 1-[(3-Methylcarbonylthio)propionyl]-1,2-diaminoethan-Tri fluoracetat (ED-(S)ATP × TFA)

7.25 g (25 mmol) Verbindung aus Beispiel 3.2 werden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und 4 h bei 20°C gerührt. Anschließend wird die Lösung im Wasserstrahlvakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 50 ml Diisopro pylether digeriert. Das Produkt wird im Hochvakuum getrocknet und kristallisiert nach einer längeren Induk tionsphase aus.
Ausbeute: 5.54 g (65% d. Th.)
¹H-NMR (D₆-DMSO/TMS): 2.31 (S, 3H, -CH₃); 2.39 (t, 2H, J=7.0 Hz, CH₂-CO); 2.85 (t, 2H, J=7.0 Hz, CH₂S); 3.00 (t, 2H, J=7.0 Hz, CH₂NH); 3.26 (t,2H, J=7.0 Hz, CH₂NH); 7.92 (s, br, NH); 8.13 ppm (s, br, 1H, NH-CO)
DC: Kieselgel 60 (Merck), Essigester/Eisessig/Wasser (v/v/v 5/5/2), Detektion mit Ninhydrin.
R_f= 0.62

Beispiel 3.4 6-[N-[3-Methylcarbonylthio)-propionyl]-1,2-diamino ethyl]-2,4-dichlor-1,3,5-triazin (Dichlortriazin-ED- (S)ATP)

1.52 g (5 mmol) 1-[(3-Methylcarbonylthio)propionyl]-1,2- diamino-ethan-Trifluoracetat-Salz (ED-(S)ATPXTFA) aus Beispiel 3.3 werden in 50 ml Tetra-hydrofuran/Dioxan (v/v 1/4) gelöst und mit 0.51 mg (0.70 ml, 5 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend kühlt man das Reaktionsgemisch auf 0°C und gibt 0.92 g (5 mmol) Cyanurchlorid und 0.51 mg (0.70 ml, 5 mmol) Triethylamin zu. Während dem 3-stündigen Rühren unter Eiskühlung kontrolliert man den pH-Wert der Reaktionslösung und stellt ggf. mit Triethylamin auf pH 6 nach. Der Niederschlag wird abgetrennt und das Lösungsmit tel ohne Erwärmen im Hochvakuum abdestilliert. Der Rück stand wird in wenig Essigester/ Hexan (v/v 9/1) gelöst und mittels Säulenchromatographie [Kieselgel 60 (Merck) 4 × 11 cm, Eluent: Essigester/Hexan (v/v 9/1)] gereinigt.
Ausbeute: 935 mg (55.3% d. Th.)
¹H-NMR (D₆-Aceton/TMS): 2.27 (s, 3H, CH₃); 2.45 (t, 2H, J=7.0 Hz, CH₂S); 3.07 (t, 2H, J=7.0 Hz); 3.53 (in, 4H); 7.30 ppm (s br, 1H, NH).
¹³C-NMR (D₆-Aceton/TMS): 25.4 (CH₂S); 30.5 (CH₃); 36.4 (CH₂CO); 39.1 und 42.4 (CH₂N); 170.3 und 171.2 (Triazin-Ring); 171.9 (CONH); 195.6 ppm (CSNH).
DC: Kieselgel 60 (Merck), Essigester/Hexan (v/v 9/1).
R_f = 0.57

Beispiel 3.5 Aktiviertes Triazin-Hapten

338 mg (1 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3.4 werden mit 17 ml einer Dioxan/Ammoniak-Lösung (1 l Dioxan enthält 0.6 in NH_3GaS, 17 ml = 10 mmol) versetzt. Nach 6-stündigem Rühren bei 20°C wird das Lösungsmittel im Wasserstrahl vakuum entfernt und der Rückstand mittels präparativer HPLC (Wasser/Acetonitril 0.1% TFA) gereinigt.
Ausbeute: 126 mg (34% d. Th.)
¹H-NMR (D₆-DMSO/TMS): 2.31 (s, 3H, CH₃); 2.36 (t, 2H, J=6.9 Hz, CH₂-S); 2.99 (t, 2H, J=6.9 Hz, CH₂CO); 3.21 (m, 4H, CH₂NH); 7.33 (s, br, 2H, NH₂); 7.66 (t, br, 1H, J=7.0 Hz, NH); 8.03 ppm (t, br, 1H, J=7.0 Hz, NH).
¹³C-NMR (D₆-DMSO/TMS): 24.4 (CH₂-S); 30.5 (CH₃CO); 34.8 (CH₂CO); 38.0, 39.6 (CH₂NH); 165.5, 166.8, 168.8 (N=C-N); 170.2 (CONH); 195.5 ppm (COS).
FAB-MS: 319 [M+H]⁺
DC: Kieselgel 60 (Merck), Essigester/Methanol (v/v 9/1).
R_f = 0.61

Beispiel 3.6 Atra(Deethyl-4-ED)-SATP-PODp(MH)

Zur Aktivierung der PODp wird die PODp mit MHS (Maleimido hexanoyl-N-hydroxy-succinimidester) im molaren Verhältnis von 20 : 1 (Hapten zu Protein) umgesetzt. Das überschüssi ge MHS wird dann durch Dialyse entfernt. Zur Freisetzung der geschützten SH-Gruppen im Hapten wird eine Hydroxyl aminolyse durchgeführt (0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8.0, 0.1 M Hydroxylamin Endkonzentration bei 25°C in 1 h). Für die Kopplung wird die maleinimido-aktivierte PODp in 0.01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6.2, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA gelöst und mit der entsprechenden Menge aktiviertem Hapten gemischt, so daß eine molare Stöchiometrie von 1 : 1 resultiert. Die DMSO-Konzentration in allen, akti viertes Hapten enthaltenenden Lösungen sollte 20% betra gen, da sonst das Hapten ausfällt. Der Kopplungsansatz wird 1.5 h bei 25°C inkubiert. Anschließend werden die noch freien MH-Gruppen auf der POD mit 1/100 des Volumens an 0.2 M Cysteinlösung abgesättigt (30 min., 25°C). Zur Abtrennung der niedermolekularen Bestandteile wird der Kopplungsansatz über Nacht gegen 10 mM Kaliumphosphat- Puffer pH 7.0, 0.1 M NaCl, 0.025 mM CaCl₂ dialysiert.

Beispiel 4: Immunisierung und Prüfung der Antiseren

10 Schafe werden mit Triazin-Immunogen gemäß Beispiel 1 in Freund′schem Adjuvans immunisiert. Die Dosis beträgt 500 g je Tier. Die Immunisierungen werden über 6 Monate oder länger jeweils in Abständen von 4 Wochen wiederholt. Monatlich einmal werden von allen Tieren Antiserumproben entnommen und auf Anwesenheit von Triazin-Antikörpern untersucht. Zu diesem Zweck wird in einem kompetitiven ELISA mit dem heterologen POD-Konjugat Atra (Deethyl-4-ED)-SATP-PODp(MH) gemäß Beispiel 3 eine Reihe von Terbutylazin-Standards vermessen. Die Durchführung dieser Messung ist in Beispiel 5 ausführlich beschrieben.

Als tauglich werden solche Antiseren ausgewählt, die ausreichend hohes Meßsignal liefern (mind. 1000 mE nach 30- 60 Min. Farbentwicklung) und mit Terbutylazin gut reagieren (50% Verdrängung mit weniger als 300 ng/l Terbutylazin).

Beispiel 5: Bestimmung der Konzentration verschiedener Triazine Verwendete Lösungen

Beschichtungspuffer: 50 mM Natriumbicarbonat; 0.1% Natriumazid; pH 9,6
Inkubationspuffer: 10 mM Natriumphosphat; 0,1% Tween 20 (Fa. Brenntag, Best.Nr. 460761); 0,9% NaCl; 1% Crotein C (Fa. CRODA GmbH, Best.Nr. 38241422); pH 7,4
Waschlösung: 0,9% NaCl; 0,1% Tween 20;
Substratlösung: Substratlösung Enzymun (Boehringer Mannheim GmbH, Best.Nr. 857424), enthält 1,9 mM ABTS und 3,2 mM Natriumperborat in Phosphat-Citrat-Puffer pH 4,4) mit 2 mg/ml Vanillin

Durchführung Beschichtung

Mikrotiterplatten (Maxisorp F96, Fa. Nunc, Best.Nr. 4-42404) werden mit Antikörpern gegen den Fc-Teil von Schaf-IgG beschichtet, die durch immunsorptive Reinigung der IgG-Fraktion aus Esel-Antiserum gewonnen worden sind. Der Esel-Antikörper wird in der Konzentration 10 g/ml Protein im Beschichtungspuffer gelöst und in jeden Napf der Mikrotiterplatte 100 µl dieser Lösung pipettiert. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln wird die Lösung ausgeschüttet und die Platte dreimal mit Waschlösung gewaschen.

Bindung der Triazin-Antikörper

Schaf-Antiserum gegen Triazin wird 1 : 50 000 mit Inkuba tionspuffer verdünnt. Jeder Napf der Mikrotiterplatte wird mit 100 µl der verdünnten Lösung beschickt. Während der Inkubationszeit (1 Stunde, Bedingungen wie oben) binden die IgG-Moleküle aus dem Schafserum an die wandgebundenen Esel-Antikörper. Anschließend wird gewaschen wie oben.

Reaktion mit Triazinen und Triazin-POD-Konjugat

Es wird eine Reihe von Lösungen hergestellt, die Terbutyl azin in den Konzentrationen 1000 / 500 / 250 / 125 / 62,5 / 31 / 16 / 8 / 4 / 0 ng/l sowie das erfindungsgemäße Konjugat Atra(Deethyl-4-ED)-SATP-PODp(MH) in einheitlicher Konzen tration 50 mU/ml im Inkubationspuffer enthalten.

Analog werden Verdünnungsreihen anderer Triazine mit den Maximalkonzentrationen 1000 ng/l (Atrazin, Cyanazin und Desethylterbutylazin), 10 000 ng/l (Propazin, Simazin, Desethylatrazin) und 100 000 ng/l (Desisopropylatrazin) und Verdünnungsstufen 1 : 2 hergestellt, die ebenfalls das genannte Hapten-POD-Konjugat enthalten.

Die wie beschrieben vorbeschichten Näpfe der Mikrotiter platte werden mit diesen Lösungen (je 100 µl) gefüllt, 1 Stunde inkubiert und anschließend gewaschen wie beschrie ben.

Die freien Haptenmoleküle konkurrieren mit dem Hapten-POD- Konjugat um die limitiert vorhandenen haptenspezifischen Antikörper an der Wand der Näpfe. Es wird umso weniger Konjugat gebunden, je mehr freies Hapten in der Lösung vorhanden ist und je besser das Hapten von den Antikörpern erkannt wird.

Substratreaktion

Alle Näpfe werden mit je 100 µl Substratlösung gefüllt und unter Schütteln inkubiert, bis die Farbentwicklung in den Proben ohne Hapten subjektiv ausreichend hoch erscheint. Dann wird die Extinktion aller Näpfe als Differenzmessung bei den Wellenlängen 405/492 nm bestimmt.

Auswertung

In der Grafik Meßsignal als Funktion der eingesetzten Haptenkonzentration wird für jede Triazinverbindung die "relative Affinität", d. h. die Haptenkonzentration bestimmt, deren Meßsignal halb so groß wie das Maximal signal (bei Haptenkonzentration gleich 0) ist. Dabei wird zwischen den Stützstellen der Kurve linear interpoliert. Daraus ergibt sich die Kreuzreaktion der Triazine, bezogen auf Terbutylazin, als Quotient

Als "untere Nachweisgrenze" wird analog für jede Triazin-Verbindung die Konzentration festgestellt, bei der das Meßsignal 80% des Maximalsignals beträgt.

In einem 2. Versuch wird analog die Kreuzreaktion und die untere Nachweisgrenze für jedes der genannten Triazine bei Einsatz des "homologen" Konjugats Atra (terbutryn-6ah)-OSu-POD bestimmt. In diesem Fall beträgt die POD-Konzentration 30 mU/ml. Die höchsten Haptenkonzen trationen sind für Terbutylazin 10 000 ng/l, für alle Triazine 100 000 ng/l. Acht weitere Haptenkonzentrationen werden durch serielle Verdünnung dieser Lösungen im Ver hältnis 1 : 2 hergestellt und jeweils ein Leerwert ohne Triazin mitgeführt.

Ergebnisse

Von 10 mit dem erfindungsgemäßen Immunogen behandelten Schafen reagieren 3 gut mit dem o.g. heterologen POD-Konjugat.

In Tab. 1 sind die Ergebnisse der beiden Versuche mit einem der ausgewählten Antiseren zusammengestellt.

Durch die erfindungsgemäße Kombination von Antikörper und Konjugat wird sowohl die Nachweisempfindlichkeit als auch die Kreuzreaktion entscheidend verbessert.

Tabelle 1

Kreuzreaktion und Nachweisempfindlichkeit für Anti serum S 4612. Abnahme 07.01.92

Claims

1. Immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Triazin und Triazinderivaten durch einen kompetitiven Immuno assay, bei dem die Probe und markiertes Atrazin um einen vor, während oder nach der immunologischen Reak tion festphasengebundenen polyklonalen Antikörper konkurrieren, Bindung des immunologischen Komplexes an die Festphase, Trennung von Festphase und ungebundenem markierten Atrazin und Bestimmung der Markierung in der festen oder flüssigen Phase als Maß für den Gehalt an Atrazin und Atrazinderivaten, dadurch gekennzeich net, daß polyklonale Antikörper, die durch Immunisie rung mit einem 4-Alkylamino-S-Triazin erhalten wurden und als markiertes Atrazin ein Konjugat aus einer Markierung und 4-Ainino-S-Triazin, welches über die 6- Position an die Markierung gebunden ist, verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß polyklonale Antikörper verwendet werden, die durch Immunisierung mit einem 4-Alkylamino-S-Triazin, in dem der Alkylrest 1-4 C-Atome enthält, verwendet wer den.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß polyklonale Antikörper verwendet werden, die durch Immunisierung mit einem 4-Isopro-pylamino-S- Triazin erhalten wurden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß als Markierung ein Enzym verwendet wird.