DE4122886C2

DE4122886C2 - Diagnostischer Kit für die Diagnose und Charakterisierung von Brustschmerzen bei ihrem ersten Auftreten

Info

Publication number: DE4122886C2
Application number: DE4122886A
Authority: DE
Inventors: Georg Jackowski
Original assignee: Spectral Diagnostics Inc Canada
Current assignee: Nanogen Inc
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-07-11
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2011-07-12
Also published as: FR2667944A1; KR0167564B1; CA2027434C; JPH04258765A; AR247634A1; GB2248688A; CN1036155C; AU654672B2; FR2667944B1; ES2070658A1; BE1004994A5; IT1251682B; ES2070658B1; MX9101550A; NZ239938A; ITMI912687A0; US5290678A; DE4122886A1; ITMI912687A1; GB9111965D0

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen neuen einstufigen Diagnose test in Form einer Platte, der verwendet wird, um eine genaue, einfache, rasche und tragbare Diagnosemöglichkeit zur Beurteilung bereitzustellen, ob Brustschmerzen eines Patienten kardialischen Ursprungs sind, und um zwischen instabiler Angina und Myokardinfarkt ("MI") beim ersten Auftreten von Brustschmerzen des Patienten zu differenzie ren. Insbesondere beurteilt der Plattentest gleichzeitig die Serum- oder Plasmaspiegel von drei verschiedenen Sub stanzen oder Markern, die im Serum oder Plasma während oder nach einem Kardialschaden gefunden werden, unter Ver wendung eines Enzymimmunoassays in Form einer trockenen chemischen Sandwichstruktur (sandwich dry chemistry for mat). In der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die drei Marker Kreatinkinase (CK), Myoglobin und Myosinleichtketten (MLC).

Hintergrund der Erfindung

Eine sofortige Diagnose von Myokardinfarkt war von der ärztlichen Scharfsinnigkeit abhängig und einer Beurteilung von Symptomen des Patienten, wie z. B. Brustschmerzen oder Druck, die möglicherweise die Arme hinunter und den Nacken hinauf ausstrahlen, Müdigkeit, dem Gefühl eines nahenden Todes, Atemlosigkeit, Blässe, feuchtkalter Haut, periphä rer Cyanose oder einem raschen Fadenpuls.

Die meisten nordamerikanischen Patienten mit Brustschmer zen gehen innerhalb von sechs (6) Stunden nach Beginn der Brustschmerzen zu einem Arzt oder einer Notfallstation. Es ist deshalb wesentlich, daß ein diagnostischer Test beim ersten Auftreten von MI effektiv ist.

Vorrichtungen zum Nachweis von Analyten in einer Probe sind in der Technik, z. B. aus der US-A-4 857 453 (siehe dort insbesondere Fig. 1), bekannt. Solche Vorrichtungen enthalten häufig ein zum Flüssigkeitstransport geeignetes saugfähiges Material, auf dem in einer bestimmten Zone beispielsweise Antikörper gegen den gewünschten Analyten gebunden sind. Nach Auftragen der Probe auf diese Vorrichtungen wird der Analyt durch den Antikörper gebunden und läßt sich dann mit weiteren Reagenzien sichtbar machen.

Zur Bestimmung von MI wurden verschiedene Kardialtests verwendet. Diese Tests umfassen: ECG, SGOT/AST, LDH, CK-MB Immunoassay und NA Latex Myoglobin Particle Enhanced As say. Es gibt jedoch keinen einzigen Enzymkardialtest, der es einer ärztlichen Notstation erlaubt, die Ursache für die Brustschmerzen als kardial oder nicht kardial zu iden tifizieren. Ferner kann nur nach Bestätigung eines Myo kardinfarkts eine thrombolytische Therapie eingeleitet werden. Je früher eine solche Therapie eingeleitet wird, um so größer ist die Wahrscheinlichkeit einer vollständi gen Wiederherstellung des Patienten, oder zumindest einer Minimierung des Kardialschadens. Es ist deshalb für einen Arzt wesentlich, die Schmerzen als kardial oder nicht kar dial zu identifizieren.

Das Elektrokardiogramm (ECG) kann verwendet werden, um einen MI zu bestimmen. Das ECG ist jedoch nur eine diagno stische Methode, wenn das Herz bereits einen schweren Schaden erlitten hat. Die diagnostische Spezifität des ECG beträgt nur 51% der Anfangsphasen von Brustschmerzen. Das ECG ist deshalb für eine Frühbestimmung von MI nicht ge eignet.

Serum-Glutaminoxalessigsäuretransaminase/Aspartattrans ferase (SGOT/AST) ist ein vorherrschendes Enzym, das in hohen Konzentrationen im Herzmuskel gefunden wird. Zur Diagnose des Myokardinfarkts werden Serumtests zur Bestim mung der SGOT-Spiegel verwendet. SGOT beginnt jedoch erst ca. 8 bis 10 Stunden nach dem Auftreten von Brustschmerzen anzusteigen, mit Peaks innerhalb von 24 bis 36 Stunden, und einem Rückgang auf normale Werte nach 5 bis 7 Tagen. SGOT ist zur Diagnose von Myokardinfarkten in einer Not station beim ersten Auftreten von Brustschmerzen nicht besonders hilfreich. Außerdem ist SGOT nicht spezifisch für Herzmuskel. Es wird in vielen Geweben einschließlich Skelettmuskel, Leber und Niere gefunden, und wird als Er gebnis von intramuskulären Injektionen, Schock, während Erkrankungen der Leber und Leberkongestion freigesetzt, und ist deshalb von geringem Wert zur Bestimmung spezifi scher Kardialgewebeschäden.

Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein Enzym, das in hoher Kon zentration in vielen Geweben, einschließlich Herz, Ske lettmuskel und Leber, gefunden wird. Tests zur Bestimmung der Gegenwart von LDH im Serum werden zur Diagnose von Myokardinfarkten verwendet. Es gibt fünf bekannte Iso-Ty pen, von denen das Herz überwiegend LDH1 und LDH2 enthält. Die LDH-Spiegel beginnen 24 bis 36 Stunden nach Beginn von Brustschmerzen zu steigen, mit Peaks nach 48 bis 72 Stun den, und einem Rückgang auf normale Werte nach 4 bis 8 Tagen. LDH ist deshalb als Indiz für MI beim ersten Auf treten von Brustschmerzen des Patienten nicht brauchbar. Zusätzlich ist LDH nicht spezifisch für Kardialschäden, und tritt zusammen mit Lungenembolie, Hämolyse, Leberkon gestion, Nierenerkrankung und Skelettmuskelschäden auf. Dieser Mangel an Spezifizät verringert ebenfalls die Brauchbarkeit von LDH als diagnostisches Hilfsmittel.

Kreatinkinase (CK) ist ein Enzym, das im Muskelgewebe ge funden wird. CK katalysiert die Umwandlung von Kreatin und Adenosintriphosphat (ATP) zu Phosphorkreatin und Adenosin diphosphat (ADP). Eines von mehreren CK Isoenzymen ist CK- MB, das im Kardialgewebe gefunden wird. CK-MB ist ein sen sitiver Marker zur Bestimmung von Myokardinfarkt, weil es aus geschädigtem Myokardgewebe freigesetzt wird. CK-MB ist danach im Serum eines befallenen Individuums vorhanden. Die Fig. 1 veranschaulicht die Konzentration von CK im Serum eines Patienten als Funktion der Zeit (siehe T. H. Lee et al., Ann. Intern. Med. 105 (1986), 221-233).

Der CK-MB Immunoassay ist der diagnostische Standardtest auf Myokardinfarkt. Ein Verfahren, das die Verwendung von CK-MB beschreibt, ist aus dem US-Patent 4 900 662 mit dem Titel "CK-MM Myocardial Infarction Immunoassay" bekannt.

Shah, US-Patent 4 900 662 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des anfänglich erhöhten Konzentrationsspiegels von CK-MM-a, einer Iso-Form von CK-MM, wobei CK-MM-a und CK-MM-b gleichzeitig in einem Patientenserum nach einem Myokardinfarkt auftreten. Die Verwendung des Verfahrens ermöglicht eine genaue Abschätzung der Infarktzeit. Die Methode umfaßt die Bestimmung der kombinierten Konzentra tion von CK-MM-a und CK-MM-b und die Konzentration von CK-MM-a im Serum, um die Zeit der akuten Phase des Myo kardinfarkts zu bestimmen. Es werden die Reagentien beschrieben, die neue polyklonale und monoklonale Antikör per für CK-MM-a umfassen, die mit CK-MB, CK-MM-b oder CK- MM-c nicht wesentlich binden, einen Anti-CK-MM-b Antikör per, der mit CK-MB, CK-MM-a oder CK-MM-c nicht wesentlich bindet, einen Anti-CK-MM-a + b Antikörper, der mit CK-MM-a und CK-MM-b bindet, aber nicht wesentlich mit CK-MB oder CK-MM-c, markierte Derivate dieser Antikörper, unlösliche Träger, auf denen diese Antikörper anhaften, und Kits, die ein oder mehrere dieser Reagentien enthalten. Enzym-mar kierte und radiomarkierte CK-Reagentien sind besonders brauchbar.

Ein anderer Immuno-Sandwichassay zur schnellen Bestimmung erhöhter Mengen von CK-MB im Serum wird in der US-A-4 624 916 beschrieben. Bei diesem Assay läßt man in einer ersten Stufe eine Serumprobe mit CK-MB mit einer Matrix aus einer festen und einer flüssigen Phase reagieren, wobei die feste Phase einen auf ihrer Oberfläche immobilisierten Antikörper gegen eines der Isoenzyme CK-MM oder CK-BB aufweist und von der flüssigen Phase umgeben ist. Nach dem Abtrennen wird die feste Phase dann mit einem markierten Antikörper, der für das Isoenzym von CK-MB spezifisch ist, das in der ersten Stufe nicht verwendet wurde, inkubiert. Der Nachweis des markierten Antikörpers auf der festen Phase zeigt die Anwesenheit von CK-MB an.

Es gibt Schwierigkeiten mit der Verwendung von CK-MB al leine als diagnostischer Marker. Erstens sind die Serum spiegel von CK-MB nicht vor 6 bis 8 Stunden nach dem Auf treten des Myokardinfarktes erhöht, und ein Peak tritt erst nach 12 Stunden auf, was eine frühzeitige Notdiagnose und Behandlung schwierig machen.

Zweitens muß der CK-MB-Test in einem Laboratorium durch geübtes technisches Laboratoriumspersonal durchgeführt werden. In nicht-städtischen Gegenden kann es möglich sein, daß der Test nicht rasch durchgeführt und die Ergeb nisse nicht rasch interpretiert werden können, was eine vergrößerte Verzögerung der Diagnose ergibt, und aufgrund von Krankenhausaufenthaltskosten eines die Diagnose abwar tenden Patienten erhöhte Kosten für das Gesundheitswesen ergibt.

Drittens wurde CK-MB im normalen Skelettmuskelgewebe fest gestellt, wodurch der Test weniger kardialspezifisch wirkt und die Diagnose weniger sicher ist.

Myoglobin ist ein anderes Protein, das in der Nähe der Skelett- oder Myokardzellmembran lokalisiert ist. Es wird aus der Zelle ausgestoßen, sobald die Zellmembran abnormal durchlässig wird, z. B. während einer myokardialen Ischä mie, einem reversiblen Zustand. Myoglobin ist im Serum innerhalb von 1,5 Stunden ab Beginn der Brustschmerzen bestimmbar. Die medizinische Forschung glaubt, daß Myoglo bin durch Myokardialnekrose freigesetzt wird, und es des halb ein nützlicher frühzeitiger Marker für eine Myokardi alverletzung ist. Die Fig. 2 zeigt die Konzentration von Myoglobin im Serum als Funktion der Zeit (vgl. E. Grenadier et al., Am. Heart J. 105 (1981) 408-416; J. Seguin et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 95 (1988) 294- 297).

Bei der Bestimmung des Ursprungs der Brustschmerzen kann ein akuter Myokardinfarkt ausgeschlossen werden, wenn kei ne Erhöhung von Serummyoglobin innerhalb von 2 bis 3 Stun den nach Beginn der Schmerzen bestimmt wird.

Ein NA Latex Myoglobin Particle Enhanced Assay ist ein kommerziell erhältlicher Assaykit zur Bestimmung von Myo globin. Der Assay basiert auf der Reaktion zwischen Anti gen, das in menschlichen Körperflüssigkeiten vorhanden ist, und Antimyoglobin-Antikörpern, die kovalent an Poly styrolteilchen gekuppelt sind. Die Probe, N Myoglobin-Rea gens, eine Lösung zur Bestimmung der nicht spezifischen Reaktionen und N Reaktionspuffer werden automatisch in eine Kuvette pipettiert. Die Lichtstrahlung wird mittels einem nephelometrischen Verfahren nach 12-minütiger Inku bationszeit gemessen, und die Myoglobinkonzentration wird aus einer Eichkurve berechnet.

Das Myoglobin kann auch unter Verwendung eines Radioimmu noassays bestimmt werden, aber es ist noch kein Enzym linked Immunosorbentassay (ELISA) verfügbar.

Bei der Verwendung von Myoglobin allein als diagnostischer Marker gibt es Schwierigkeiten. Myoglobin zeigt nicht einen besonderen Typ eines Myokardialschadens an, wie z. B. Myokardinfarkt. Myoglobin kann auch während andersartiger Bedingungen, wie z. B. Schock, Nierenkrankenheit, Rhabdo myolyse und Myopathien vorhanden sein. Zusätzlich hängen die Myoglobinkonzentrationen im Serum und Plasma im all gemeinen vom Alter und Geschlecht ab und variieren in nor malen gesunden Menschen in einem weiten Bereich. Serumkon zentrationen bis zu 90 µg/l werden im allgemeinen als obe re Grenze für den Referenzbereich für gesunde Personen betrachtet. Was deshalb ein normaler Spiegel für ein Indi viduum sein kann, könnte für ein anderes Individuum ein ernsthaftes Problem anzeigen, was die Diagnose in gewisser Weise weniger genau macht als es wünschenswert ist.

Myosin-Leichtketten (myosin light chains) (MLC) sind inte grale Bestandteile der Myosinmyofibrillen, aber ihre funk tionelle Rolle ist noch unklar. MLCs treten in langsamen, schnellen, Atrium- und Ventrikularmuskeln auf. Es ist be kannt, daß MLCs für Myokardischämie hochempfindlich sind. Beispielsweise beschreiben E. Hoberg et al. (European Heart Journal 8 (1987) 989-94) die Bestimmung von Herzmuskelmyosin- Leichtketten (HMLC), von Myoglobin und von CK-B in Patienten mit Angina pectoris ohne Anzeichen eines akuten Myokardinfarkts. Dabei wurde gefunden, daß HMLC häufiger erhöht war als Myoglobin oder CK-B.

MLCs erscheinen rasch im Serum, und ihre Spiegel bleiben bis zu 10 Tage nach der Myokardialnekrose erhöht. Die Fig. 3 veranschaulicht die Konzentration von MLC im Patientenserum als Funktion der Zeit (vgl. J. Wang et al., Clin. Chimica. Acta 181 (1989) 325-336; G. Jackowski, J. C. Symmes et al. (1989) Circulation Suppl. 11 80, 355). MLC hat auch einen prognostischen Wert bei der Bestimmung des Erfolges einer thrombolytischen Therapie. Höhere Spie gel von MLC zeigen eine schlechtere Prognose an und ent sprechen auch einem größeren Infarkt. Fallende Spiegel während mehrerer Tage zeigen eine Tendenz zur Wiederher stellung des Patienten an, während ein zackiges Muster eine Tendenz zum Infarkt und die Notwendigkeit einer In tervention anzeigt.

Es gibt zwei Haupttypen von MLC, die als MLC1 und MLC2 bekannt sind, die als löslicher Pool in dem myokardialen Zellzytoplasma vorhanden sind, und auch mit den Myosinmyo fibrillen integriert sind. Im Ventrikularmuskel ist MLC2, und vermutlich MLC1, identisch mit dem im langsamen Ske lettmuskel offenbarten Iso-Typ. MLC1 ist in 80-85% der Patienten mit Kardialschäden erhöht. MLC1 ist ein sehr empfindlicher Indikator für instabile Angina und koronare Herzkrankheit.

Um einen sensitiven Nachweis von Herzmuskelmyosin-Leichtketten im Blutplasma und damit eine bessere Diagnostik von Myokardin farkten zu ermöglichen, beschreibt die EP-A-0 282 021 spezifische Antikörper gegen HMLC, die nur eine geringe Kreuzreaktivität gegenüber den Myosin-Leichtketten aus Skelettmuskel (SMLC) besitzen. Diese Antikörper können als immunologische Reagenzien, beispielsweise in Sandwichtests, zur Bestimmung von HMLC verwendet werden.

Als kardiale Marker können auch andere kardiale Marker, nämlich kardiale Proteine mit niedrigem Molekulargewicht (LMWCP) verwendet werden. Beispiele solcher kardialer Mar ker umfassen Komponenten des kontraktilen Apparates, näm lich Troponin, Troponin-T, Troponin-I und Troponin C, mitochondriale Enzyme, wie z. B. Triose P-Isomerase, nie dermolekulare Polypeptide, die leicht aus dem Herz freige setzt werden und sarkolemmale Membranproteine oder Pro teinfragmente, die frühzeitig nach dem Beginn von Ischämie freigesetzt werden können, insbesondere ein 15 kd Sarkolem maprotein und ein 100 kd Komplex Glykoprotein, die kardial spezifisch sind.

Der kardiale Isotyp Troponin-I hemmt die Wechselwirkung zwischen Actin- und Myosinmolekülen während der Ruhe perioden zwischen Kontraktionen des Herzmuskels. Troponin- I tritt im Serum von Patienten innerhalb von 4-6 Stunden nach MI auf und bleibt während 7-8 Tagen erhöht. Die Fig. 4 veranschaulicht die Konzentration von Troponin-I als Funktion der Zeit (vgl. B. Cummins, M. L. Auckland und P. Cummins, Am. Heart J. 113 (1987) 1333-1344). Es ist kar dialspezifisch und hat bei der Bestimmung von kardialen gegen Skelettmuskelschäden eine größere Sensitivität.

Troponin-T ist Teil des Troponin-Tropomyosin-Komplexes der dünnen Fädchen und dient als Bindeglied zwischen der Tro pomyosinstütze und dem Troponin-I/Troponin-C-Komplex. Troponin-T ist ein Basisprotein und hat Iso-Typen in den Kardial-, schnellen und langsamen Skelettmuskeln. Es tritt im Serum innerhalb von 3 Stunden auf und bleibt während mindestens 10 Tage nach MI erhöht. Die Fig. 5 veranschau licht die Konzentration von Troponin-T als Funktion der Zeit (vgl. H. A. Katus et al., J. Mol. Cell Cardiol. 21 (1989) 1349-1353. Troponin-T folgt einem biphasischen Ab gabemuster. Es ist kardialspezifisch und für MI sehr emp findlich.

Myosin-schwere Ketten (myosin heavy chains) (MHC) und Tro pomyosin sind Proteine mit höherem Molekulargewicht, die auch als Kardialmarker verwendet werden können. MHC ist Teil der Hauptmenge des kontraktilen Proteins von Muskeln. Fragmente von MHC können nach myokardialer Zellnekrose und nachfolgender irreversibler Membranschädigung aus der Ven trikel in das Serum freigesetzt werden. Obgleich MHC-Frag mente nach einer myokardialen Zellnekrose im Serum nicht rasch auftreten, bleiben die MHCs mindestens 10 Tage nach MI erhöht, und 4 Tage nach MI werden Peak-Spiegel von MHC beobachtet. Fig. 6 veranschaulicht die Konzentration von MLC als Funktion der Zeit (vgl. J. O. C. Leger et al., Eur. J. of Clin. Invet. 15 (1985) 422-429; J. R. Seguin et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. (1989) 397-401). Die Fläche unter der MHC-Freisetzungskurve entspricht sehr gut dem Ausmaß der myokardialen Zellschädigung. Die MHC-Spie gel sind jedoch während der akuten Phase von MI von gerin gem klinischen Wert.

Tropomyosin ist ein Dimeres, das aus zwei Polypeptiden gebildet wird, die Teil des Regulatorsystems bei der Mus kelkontraktion sind. Tropomyosin ist im Serum ca. 7-8 Stunden nach Myokardinfarkt bestimmbar, und wie CK-MB sehr empfindlich für Myokardinfarkt. Die Fig. 7 veranschaulicht die Konzentration von MLC als Funktion der Zeit (vgl. P. Cummins et al., Clin. Sci. 60 (1981) 251-259). Tropomyosin ist jedoch nicht kardialspezifisch, weil es auch unter Bedingungen des Skelettmuskeltraumas erhöht ist.

Für jede der gegenwärtigen diagnostischen Standardmethoden für Myokardinfarkt gibt es Beschränkungen. Keine stellt einen hochempfindlichen, spezifischen, raschen und einfa chen diagnostischen Test dar, der bald nach dem Auftreten der Brustschmerzen durchgeführt werden kann, z. B. in einer Ambulanz oder Arztpraxis.

Die vorliegende Erfindung kombiniert und mißt mindestens drei verschiedene Marker für Kardialschädigung im Blut oder Serum eines Patienten beim ersten Auftreten von Brustschmerzen, um ein verbessertes Diagnoseverfahren für Myokardinfarkt zur Verwendung in den frühen Stadien von instabiler Angina oder MI bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Nachteile des Standes der Technik können vermieden werden durch Bereitstellung eines einstufigen, genauen, raschen und tragbaren diagnostischen Plattentests, der in Notsituationen verwendet werden kann, um die Gegenwart von mindestens drei Markern für Kardialschädigung im Serum eines Patienten zu bestimmen. Die Testergebnisse zeigen an, ob der Patient an einer instabilen Angina leidet oder ob ein Myokardinfarkt stattgefunden hat. Die frühzeitige Bestimmung von MI erlaubt es, eine thrombolytische Thera pie in einem frühzeitigen Stadium zu beginnen. Die Kardi alschädigung wird deshalb minimalisiert und die Überle benschance des Patienten erhöht. Die Ergebnisse des Plat tentests unterscheiden zwischen instabiler Angina und Myo kardinfarkt, sogar noch einige Tage nach Beginn der Brust schmerzen. Der Plattentest verwendet einen Enzymimmunoas say in Form einer trockenen chemischen Sandwichstruktur (enzyme immunoassay sandwich dry chemistry format). Peri odische Messungen mit der Platte in bestimmten Zeitabstän den geben dem Arzt prognostische Informationen im Hinblick auf das Ausmaß der Muskelschädigung und den Erfolg einer thrombolytischen Behandlung. In einer bevorzugten erfin dungsgemäßen Ausführungsform sind die drei Marker Kreatin kinase (CK), Myoglobin und Myosin light chains (MLC).

Gegenstand der Erfindung sind also diagnostische Testkits und Verfahren zur Beurteilung, ob Brustschmerzen eines Patienten kardialen Ursprungs sind und, wenn dies der Fall ist, ob es sich dabei um eine instabile Angina oder einen Myokardinfarkt handelt, wie sie in den Ansprüchen 1 bis 25 beschrieben sind.

Gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein diagnosti scher Testkit zur Bestimmung eines Myokardinfarktes beim ersten Auftreten von Brustschmerzen des Patienten bereit gestellt. Der Testkit umfaßt ein Gefäß zur Aufnahme und Aufbewahrung einer Probe des Bluts oder Serums des Patien ten und ein Bestimmungsmittel zur Kommunikation mit der Probe. Das Bestimmungsmittel umfaßt mindestens drei mono klonale oder polyklonale Antikörper, die an einem Träger suspendiert sind, wobei jeder Antikörper komplementär ist zu einem verschiedenen Protein, das während der ersten Stadien eines Myokardinfarktes durch den Herzmuskel frei gesetzt wird, und entsprechende Reagentien, die unabhängig voneinander auf jeden Antikörper, der mit dem komplementä ren Protein reagiert, anspricht. Die kombinierte Antwort der Reagentien zeigt den diagnostischen Zustand des Pa tienten an.

In einer weiteren Ausführungsform sind die monoklonalen und polyklonalen Antikörper komplementär zu mindestens drei der folgenden Proteine oder Enzyme: Kreatinkinase, Myoglobin, Myosinleichtketten (myosin light chains), Troponin, Troponin I, Troponin C, Troponin T und sarkolemmalen Membranproteinen, Triose P-Isomerase oder irgendeinem Kardialprotein niedrigen Molekulargewichts, das die Charakteristika und Eigenschaften von Kreatinkinase, Myoglobin oder Myosin light chains besitzt, Tropomyosin oder irgendeinem Kardialprotein hohen Molekuargewichts, das die Charakteristika und Eigenschaften von Kreatinkinase, Myoglobin oder Myosin light chains besitzt, wobei mindestens zwei ausgewählt sind von Kreatinkinase, Myoglobin, Myosin light chains und Troponin-T.

Die monoklonalen und polyklonalen Antikörper können einen immobilisierten Antikörper umfassen, der mit dem entsprechenden Reagens, das ein Antikörper-Enzym-Konjugat umfaßt, das gegen ein Epitop gerichtet ist, das von dem durch den Antikörper erkannten verschieden ist, schichtförmig verbunden ist.

Bevorzugt ändern die Reagentien in Antwort auf jeden Antikörper, der mit dem komplementären Protein reagiert, die Farbe, wobei die Farbänderung proportional zur Konzentration des komplementären Proteins in der Probe ist.

In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Gefäß eine Frontplatte mit einem Probenfenster zur Aufnahme der Probe und einem Anzeigefenster zur Anzeige der Reagentien, eine Rückplatte und Verschlußmittel zur Befestigung der Frontplatte an der Rückplatte, die den zwischen ihnen liegenden Träger sandwichartig einschließen und dabei eine integrale Einheit bilden.

Als Träger kann eine chemische Trockenmembran verwendet werden. Die Membran kann durch ein Absorbensmaterial gestützt werden, um den Zug der Probe zu den Bestimmungsmitteln zu erhöhen. Die Membran erstreckt sich zweckmäßig über das Probenfenster zum Anzeigefenster und die Antikörper und die entsprechenden Reagentien befinden sich in räumlichem Abstand vom Probenfenster im Anzeigefenster.

Bevorzugt ist die Frontplatte markiert, um eine Stelle der Protein-Antikörper-Reaktion zu identifizieren. Ferner kann die Frontplatte mit einem Reflektometer versehen sein, um die Konzentration des Proteins in der Probe quantitativ zu bestimmen.

Das Bestimmungsmittel kann einen Kontrollantikörper umfassen, der mit einem Protein komplementär ist, das normalerweise im Serum gefunden wird, und ein entsprechendes Reagens, das auf den Kontrollantikörper, der mit dem komplementären Protein reagiert, anspricht. Eine solche Antwort zeigt an, daß der Test funktioniert. Der Kontrollantikörper und das entsprechende Protein sind auf dem Träger zweckmäßig vom Probenfenster am weitesten entfernt angebracht, um die Beendigung des Tests anzuzeigen.

Bevorzugt ist das Gefäß ein dicht verschließbarer klarer Behälter, wobei der Träger eine Seite des Behälters bildet.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Myokardinfarkt, bei dem eine einem Patienten entnommene Blut- oder Serumprobe auf einen wie oben beschriebenen diagnostischen Testkit aufgetragen wird.

In den Zeichnungen, die erfindungsgemäße Ausführungsformen veranschaulichen, bedeuten:

Fig. 1 eine Grafik, die den Spiegel von CK im Serum als Funktion der Zeit veranschaulicht;

Fig. 2 eine Grafik, die den Spiegel von Myoglobin im Serum als Funktion der Zeit veranschaulicht;

Fig. 3 eine Grafik, die den Spiegel von MLC im Serum als Funktion der Zeit darstellt;

Fig. 4 eine Grafik, die den Spiegel von Troponin-I im Serum als Funktion der Zeit darstellt;

Fig. 5 eine Grafik, die den Spiegel von Troponin-T im Serum als Funktion der Zeit darstellt;

Fig. 6 eine Grafik, die den Spiegel von MHC im Serum als Funktion der Zeit darstellt;

Fig. 7 eine Grafik, die den Spiegel von Tropomyosin im Serum als Funktion der Zeit darstellt;

Fig. 8 eine Grundrißansicht einer bevorzugten Ausfüh rungsform;

Fig. 9 eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht der Ausführungsform von Fig. 8;

Fig. 10 eine Schrägansicht der Membran der Ausführungs form von Fig. 8; und

Fig. 11 eine Schrägansicht einer zweiten Ausführungsform der Membran.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird allgemein in Fig. 8 veranschaulicht. In der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt eine Plattenausgestaltung, die mit 1 bezeichnet ist, vor.

Die zu verwendende Plattenausgestaltung ist bekannt und kommerziell erhältlich. Die Plattenausgestaltung ist ähn lich der einer Ausgestaltung, die im Zusammenhang mit ei nem Schwangerschaftstest gegenwärtig benützt wird und un ter dem Warenzeichen BIOSIGN kommerziell erhältlich ist.

Die Platte besteht aus einer Polypropylenkarte mit einer Frontplatte 10 und einer Rückplatte 12. Die Frontplatte 10 hat ein Anzeigefenster 14, eines für jeden Kardialmarker und ein Probenfenster 16, wie in Fig. 8 veranschaulicht. Unterhalb der Frontplatte 10 ist eine exponierte chemische Trockenmembran (dry chemistry membrane) 18, die auf dem Rücken der Frontplatte 10 durch geeignete Mittel fixiert ist. Die Rückplatte 12 ist mit einer Kante 20 versehen, die sich über den Umfang der Rückplatte 12 erstreckt, um die Frontplatte 10 in einem Schnappsitz aufzunehmen, wo durch die Membran 18 zwischen der Front- und Rückplatte abgedichtet wird.

Obgleich die Front- und Rückplatte so beschrieben wurden, daß sie ineinander einrasten, gibt es, wie dies für einen Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich sein wird, zahlrei che andere geeignete Methoden, um die beiden zu verbinden.

Die Frontplatte 10 kann auch mit einer Fläche 13 versehen sein, auf der der Name des Patienten oder eine Identifi zierung auf geschrieben sein können. Es kann auch Raum ver fügbar sein, um die Ergebnisse des Tests aufzuschreiben.

In Fig. 10 stellt die Membran 18 den Träger der monoklona len und der polyklonalen Antikörper dar. In der bevorzug ten Ausführungsform ist der Fluß des Blutes oder Serums von einem Ende zum anderen Ende wie durch den Pfeil darge stellt. Das Ende 22 ist mit dem Probenfenster 16 in Über einstimmung gebracht. Ein immobilisierter Antikörper 24 liegt schichtförmig gegen ein Antikörper-Enzym-Konjugat 26 an oder ist mit diesem verbunden, das gegen ein Epitop des Antigens gerichtet ist, das verschieden ist von dem, das durch den Antikörper 24 erkannt wird. Der Antikörper 24 ist komplementär zum Myosinprotein. Auf ähnliche Weise ist der Antikörper 28 schichtförmig mit einem entsprechenden Reagens 30 angeordnet. Der Antikörper 28 ist komplementär zu CK-MB. In gleicher Weise ist der Antikörper 32 schicht förmig mit einem Reagens 34 angeordnet. Der Antikörper 32 ist komplementär mit dem Myosin light chain. Der Antikör per 36 ist ein solcher, der komplementär zu irgendeinem Protein ist, das in normalem Serum oder Blut gefunden wird. Der Antikörper 36 ist schichtförmig mit dem Reagens 38 angeordnet.

Die monoklonalen und polyklonalen Antikörper können unter Verwendung üblicher Verfahren mit irgendeinem Säugetier, das für eine polyklonale Antikörperherstellung verwendet wird, hergestellt werden.

In der bevorzugten Ausführungsform wird ein markiertes Reagens verwendet. Das Antikörperreagens wird markiert oder chemisch an eine bestimmte Einheit gebunden, die be obachtet oder gemessen werden kann, um die Gegenwart eines Antikörpers im Serum oder Blut oder an der chemischen Trockenmembran nachzuweisen oder zu quantifizieren. Die Liganden und Gruppen, die mit den erfindungsgemäßen Anti körpern zur Verwendung als diagnostisches Mittel konju giert sein können, umfassen Elemente, Verbindungen oder biologische Materialien, die physikalische oder chemische Eigenschaften besitzen, die verwendet werden können, um die Antikörper, an die sie gebunden sind, von anderen An tikörpern zu unterscheiden.

Mindestens zwei Antikörper vom Typ Mono/Poly oder Kanin chen/Poly, Ziege/Poly sind pro Kardialmarker erforderlich. Die Antikörper werden gegen ihr spezifisches kardiales Immunogen affinitätsgereinigt und dann durch Kreuzadsorp tion gegen nicht verwandte Spezien weiter gereinigt, um nicht spezifische Immunoglobuline zu eliminieren.

In der Verwendung trägt der Diagnostizierende, z. B. ein Arzt, Ambulanzmitarbeiter oder eine Schwester, drei Trop fen oder weniger als 100 µl des Serums oder Bluts des Pa tienten auf dem Probenfenster 16 auf. Die Probe wandert entlang der Membran 18 durch Kapillarwirkung und kommt nacheinander in Kontakt mit den Antikörper- und Reagens paaren 24 und 26, 28 und 30, 32 und 34 und 36 und 38.

Wenn der spezifische Kardialmarker in der Probe vorhanden ist, bindet er an den immobilisierten Antikörper auf der Membran. Das entsprechende Reagens wird ebenfalls reagieren und wird durch eine Änderung der Farbe des Reagens sicht bar. Die Farbänderung ist proportional zur Konzentration des Markers in der Probe. Wenn deshalb der Testkit in zeitlichen Intervallen verwendet wird, kann der Anstieg oder Abfall in der Markerkonzentration ebenfalls bestimmt und als diagnostisches Mittel verwendet werden. Die Ergeb nisse der Tests sollten innerhalb von 3 bis 5 Minuten vollendet sein.

In der bevorzugten Ausführungsform zeigt ein blaues Band jeden Kardialmarker an, der in der Probe vorhanden ist. Die Intensität des Bandes ist unter Verwendung eines Re flektometers, das die Farbintensität in Relation zur Kon zentration des bestimmten Markers bringt, quantifizierbar. Das Reflektometer kann einen Mikroprozessor enthalten, so daß das quantifizierte Ergebnis für jeden auf der Platte getesteten Kardialmarker ermittelt und als Konzentration für jeden Marker zusammen mit dem Namen des Patienten oder der Identifikation ausgedruckt werden kann.

Der Test ist vorzugsweise für Markerkonzentrationen von 0,5 ng/ml bis 25 ng/ml unter Verwendung von drei Tropfen oder weniger als 100 µl Serum oder Plasma empfindlich, wobei der Variationskoeffizient innerhalb einer Bestimmung und zwischen Bestimmungen weniger als 15% beträgt.

Die im Test verwendeten Kardialmarker hängen von den Ei genschaften dieser Marker ab. In der bevorzugten Ausfüh rungsform weist die Platte Myoglobin, MLC und CK-MB auf, wie dies in Fig. 8 veranschaulicht ist.

Myoglobin wird sehr früh aus der Myokardialzelle freige setzt, ist nicht kardialspezifisch und hat eine sehr hohe Sensitivität für Myokardialinfarkt und Nekrose und wird durch eine anoxische Schädigung in Abwesenheit von Nekrose nicht freigesetzt. MLC ist kardialspezifisch und erlaubt eine Differenzierung zwischen einem kardialen und nicht kardialen Schmerz und wird frühzeitig freigesetzt, aber nicht so früh wie Myoglobin. CK-MB unterscheidet Angina von Myokardinfarkt, ist aber erst ca. 6 Stunden nach dem Beginn des Brustschmerzes bestimmbar, und deshalb allein zur Verwendung als diagnostischer Nottest nicht geeignet.

Unter Bezugnahme auf die Fig. 1, 2 und 3, und wenn die verwendeten Kardialmarker CK-MB, Myoglobin und MLC sind, würde die folgende Interpretation der Ergebnisse eine Dia gnose liefern.

Wenn die Platte für MLC ein positives Ergebnis anzeigt und ein negatives für Myoglobin und CK-MB, so würde dies an zeigen, daß die Brustschmerzen des Patienten kardial sind, und die Ursache instabile Angina ist.

Wenn Myoglobin und MLC positiv sind und CK-MB negativ, würde dies eine frühzeitige Entwicklung eines Myokardin farkts anzeigen, und es könnte eine Interventionstherapie eingeleitet werden.

Wenn alle drei positiv sind, würde dies einen Myokardin farkt anzeigen.

Wenn MLC und CK-MB positiv sind und Myoglobin negativ ist, würde dies einen Myokardinfarkt anzeigen.

Wenn Myoglobin und CK-MB positiv sind und MLC negativ ist, könnte der Patient ein Skelettmuskeltrauma haben (ein fal sches Positiv) oder sich in der Mitte eines Myokardinfark tes befinden.

In diesem Fall könnte der Test nicht zwischen einem fal schen Positiv und einem "kleinen" Myokardinfarkt unter scheiden, weil die MLC-Freisetzungskurve in mehreren In tervallen leichte Senkungen aufweist und der Patient einen kleinen subendokardialen Infarkt besitzen könnte und wäh rend der Zeit eine "Senkung" getestet sein könnte. Wenn der Infarkt gering ist, ist die "Senkung" bei fast norma len Spiegeln unten, und der Patient würde deshalb als ne gativ für MLC getestet werden. Eine positive Diagnose wür de von der Gegenwart von CK-MB abhängen.

Im Fall, daß der Patient einen großen Myokardinfarkt be sitzt, wird die "Senkung" der MLC-Spiegel nicht so groß sein, daß sie die gleichen sind wie normale Spiegel, und deshalb bleibt MLC bestimmbar.

In anderen Ausführungsformen kann die Testplatte verschie dene Kombinationen von Antikörpern in der gleichen Ausge staltung verwenden, so daß verschiedene Kardialmarker be urteilt werden. Um sicherzustellen, daß die Platte eine kardiale Gewebeschädigung in einem frühen Stadium der Brustschmerzen des Patienten anzeigt, ist es notwendig, mindestens einen Antikörper zu verwenden, der einem Marker entspricht, der in großen Mengen in einem frühzeitigen Stadium einer Kardialschädigung vorhanden ist, wie z. B. CK, Myosin light chains oder Myoglobin. Kardialproteine mit niedrigem Molekulargewicht, die die Charakteristika und Eigenschaften von CK, Myosin light chains oder Myoglo bin besitzen, können in dem Kit ebenfalls verwendet wer den.

Geeignete Proteine und Enzyme können ausgewählt sein aus den folgenden: Troponin, Troponin-I, Troponin C, Troponin- T und sarkolemmalen Membranproteinen, Triose P-Isomerase oder irgendwelchen Kardialproteinen mit hohem Molekularge wicht, die die Charakteristika und Eigenschaften von Krea tinkinase, Myoglobin oder Myosin light chains besitzen.

Andere Proteine, wie z. B. Tropomyosin, und Myosin heavy chains können ebenfalls zum Kit zugefügt werden. Der Kit würde dann dazu fähig sein, MI anzuzeigen, wenn der Pa tient viele Stunden nach Beginn der Brustschmerzen zur Diagnose erscheint, wo sich der Patient in den späteren Stadien von MI befindet.

In einer zweiten Ausführungsform kann die Membran 18 eine Schicht eines Antikörpers 124 und eines entsprechenden Reagens 126 aufweisen. Ein entsprechendes Paar von Anti körpern und Reagentien kann auf ähnliche Weise für jeden anderen zu bestimmenden Marker vorgesehen werden, d. h. 128 und 130, 132 und 134, und das Kontrollpaar 136 und 138. Bei der Verwendung wird die Probe auf jedes Paar aufgetropft und die Ergebnisse werden in der gleichen Wei se wie oben beschrieben abgelesen.

Die chemische Trockenmembran 118 kann durch das Absorbens- Material 120 gestützt sein. Das Absorbens-Material 120 erhöht den Zug des Serums durch die Membran.

In einer weiteren Ausführungsform des Testkits wird ein Blutprobenröhrchen verwendet, das üblicherweise verwendet wird, um Blutproben vom Patienten abzuziehen. Die innere Wand des Röhrchens kann als Träger für die monoklonalen und polyklonalen Antikörper und Reagentien dienen. Nachdem die Probe vom Patienten abgezogen ist, schüttelt der An wender einfach das Röhrchen, damit der Antikörper mit dem Blut reagiert. Farbänderungen, wie sie vorstehend be schrieben sind, finden statt, wenn das kardiale Protein im Blut vorhanden ist.

Obwohl die Offenbarung bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschreibt und veranschaulicht, ist die Erfin dung nicht auf diese besonderen Ausführungsformen be schränkt. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet sind Va rianten und Modifikationen möglich. Die Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.

Claims

1. Diagnostischer Testkit zur Beurteilung, ob Brust schmerzen eines Patienten kardialen Ursprungs sind und, wenn dies der Fall ist, ob es sich dabei um eine in stabile Angina oder einen Myokardinfarkt handelt, welcher mindestens drei markierte Antikörper umfaßt, die für drei verschiedene Marker spezifisch sind, wobei die Antikörper so ausgewählt sind, daß:

a) ein erster Antikörper an einen ischämischen Marker bindet;
b) ein zweiter Antikörper an einen Marker bindet, der nur bei einem Myokardinfarkt freigesetzt wird; und
c) ein dritter Antikörper an einen ischämischen Marker bindet oder an einen Marker, der nur bei einem Myokardinfarkt freigesetzt wird.

2. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 1, worin die Antikörper irreversibel an einem Festphasenträger immobilisiert sind.

3. Diagnostischer Testkit zur schnellen Diagnose der Ur sache für Brustschmerzen eines Patienten bei deren erstem Einsetzen, welcher mindestens drei Antikörper umfaßt, die für mindestens drei Marker spezifisch sind, wobei

a) ein erster Antikörper spezifisch an Myoglobin bindet,
b) ein zweiter Antikörper spezifisch an CK-MB bindet,
c) ein dritter Antikörper spezifisch an ein Protein bindet, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Myosin-Leichtketten, Troponin I und Troponin T;

wobei der Kit außerdem Nachweismittel für die Bindung eines jeden Antikörpers an seinen Marker umfaßt.

4. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 1 oder 2, worin die Antikörper so ausgewählt sind, daß:

a) der erste Antikörper an einen ischämischen Marker bindet;
b) der zweite Antikörper an einen Marker bindet, der nur bei einem Myokardinfarkt aus Herzgewebe freigesetzt wird; und
c) der dritte Antikörper an einen kardialspezifischen ischämischen Marker bindet.

5. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 1 oder 2, worin die Antikörper so ausgewählt sind, daß:

a) der erste Antikörper an einen ischämischen Marker bindet; und
b) die zweiten und dritten Antikörper jeweils an einen Marker binden, der nur bei einem Myokardinfarkt freigesetzt wird.

6. Diagnostischer Testkit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der in Membranform ausgestaltet und zur Trockenchemie ausgelegt ist.

7. Diagnostischer Testkit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin alle Antikörper monoklonale Antikörper sind.

8. Diagnostischer Testkit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der außerdem als Kontrolle dafür, ob der Test funktioniert, eine Substanz umfaßt, die an einen üblicherweise im Blut vorhandenen Reaktanten bindet.

9. Diagnostischer Testkit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Marker gleichzeitig nachgewiesen werden.

10. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 9, worin der Anti körper, der an den nur bei einem Myokardinfarkt freigesetzten Marker bindet, an Myoglobin bindet.

11. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 1 oder 2, worin der Antikörper, der an den nur bei einem Myokardinfarkt freigesetzten Marker bindet, an CK-MB bindet.

12. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 1 oder 2, worin der ischämische Marker ein kardialer ischämischer Marker ist.

13. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 12, worin der kardiale ischämische Marker Troponin I ist.

14. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 12, worin der dritte Antikörper für Troponin I spezifisch ist.

15. Verfahren zur Beurteilung, ob Brustschmerzen eines Patienten kardialen Ursprungs sind und, wenn dies der Fall ist, ob es sich dabei um eine instabile Angina oder einen Myokardinfarkt handelt, das umfaßt:

a) Nachweis erhöhter Spiegel von drei verschiedenen Markern für Kardialschäden in einer Blut-, Serum- oder Plasmaprobe eines Patienten nach Einsetzen von Brustschmerzen, wobei
- a) ein erster Antikörper an einen ischämischen Marker bindet;
- b) ein zweiter Antikörper an einen nur bei einem Myokardinfarkt freigesetzten Marker bindet; und
- c) in dritter Antikörper an einen ischämischen Marker bindet oder an einen Marker, der nur bei einem Myokardinfarkt freigesetzt wird;

indem man die Probe mit drei Antikörpern in Kontakt bringt, von denen jeweils einer für jeweils einen der Marker spezifisch ist, und die Bindung des Antikörpers an den Markern nachweist, wobei erhöhte Spiegel eines Markers in der Probe durch Binden des Markers an den jeweiligen Antikörper angezeigt werden; und

a) Korrelation der erhöhten oder nicht erhöhten Spiegel eines jeden der drei Marker mit dem Vorliegen oder Nichtvorliegen einer instabilen Angina oder eines Myokardinfarkts.

16. Verfahren zur schnellen Diagnose der Ursache für Brust schmerzen eines Patienten bei deren erstem Auftreten, das die Schritte umfaßt:

a) Inkontaktbringen einer Serum-, Plasma- oder Blut probe eines Patienten mit mindestens drei Anti körpern, wobei
- a) ein erster Antikörper spezifisch an Myoglobin bindet,
- b) ein zweiter Antikörper spezifisch an CK-MB bindet,
- c) in dritter Antikörper spezifisch an ein Protein bindet, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Myosin-Leichtketten, Troponin I und Troponin T;

wobei nach Zugabe der Probe zu den Antikörpern Analyte in der Probe, die zu den Antikörpern komplementär sind, an die Antikörper binden; und

a) Nachweis des Bindens oder Nichtbindens eines jeden Antikörpers an seinen Marker und dadurch Diagnose der Ursache für die Brustschmerzen.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Marker gleichzeitig nachgewiesen werden.

18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Probe innerhalb der ersten sechs Stunden nach Einsetzen der Brustschmerzen erhalten wird.

19. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Probe nach den ersten sechs Stunden nach Einsetzen der Brust schmerzen erhalten wird.

20. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin alle Antikörper monoklonale Antikörper sind.

21. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin die Anti körper markiert sind.

22. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, welches außerdem das Inkontaktbringen der Probe mit drei anderen markierten Markern umfaßt, die jeweils den drei verschiedenen Markern für den Herzschaden entsprechen.

23. Verfahren nach Anspruch 15, worin der ischämische Marker ein kardialer ischämischer Marker ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin der kardiale ischämische Marker Troponin I ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23, worin der dritte Antikörper für Troponin I spezifisch ist.