DE4104075C1 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur gekoppelten Flüssigkeitschromatographie- und Kernresonanzspek­ troskopiemessung, wobei flüssigkeitschromatographisch Kompo­ nenten einer Probenfraktion erfaßt, separiert und anschließend diese Komponenten kernresonanzspektroskopisch gemessen werden.

Ein solches Verfahren und ein solche Vorrichtung sind, z. B. aus J. Chromatography 186, 497 (1979) "On-line Coupling of High-performance Liquid Chromatography and Magnetic Resonance" bekannt.

Bei einer strengen on-line-Kopplung ist das NMR-Spektrometer, direkt dem Flüssigkeitschromatographen nachgeschaltet.

Beim "Continuous Flow"-Verfahren werden bei der HPLC-Messung (HPLC = High Performance Liquid Chromatography) das Eluent und die sich ergebenden Peaks kontinuierlich und sequentiell dem NMR-Spektrometer zugeleitet und dort "on-line" spektro­ metrisch untersucht.

Alternativ zum Continuous-Flow-Verfahren wird auch die Stop- Flow-Technik verwendet, bei der die Strömungspumpe das zu mes­ sende Eluent nur zu bestimmten Zeitabschnitten fördert und immer dann anhält, wenn sich eine interessierende Komponente gerade im NMR-Spektrometer befindet.

Beim Continuous-Flow-Verfahren kann die erzielte NMR-Signal­ empfindlichkeit in Abhängigkeit von der Konzentration der inte­ ressierenden Komponente zu gering sein, da die Verweildauer in der NMR-Meßzelle begrenzt ist.

Durch das Stop-Flow-Verfahren wird die erzielte chromatogra­ phische Trennleistung der nachfolgenden Komponenten, die sich noch in der Trennsäule befinden, durch Diffusion verschlechtert.

Ein zu messendes Probengemisch kann aus vielen Komponenten bestehen. Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur gekoppelten Flüssigkeits­ chromatographie- und Kernresonanzspektroskopiemessung so zu ermöglichen, daß vor der kernresonanzspektrometrischen Messung eine Komponententrennung stattfindet, die NMR-seitig sowohl das Continuous-Flow-Verfahren als auch das Stop-Flow-Verfahren erlaubt.

Die Erfindung sieht zur Lösung dieser Aufgabe ein automati­ siertes Verfahren vor, wo die chromatographische Gemischtrennung kontinuierlich abläuft, chromatographisch getrennte Komponenten optionell on-line dem NMR-Spektrometer über eine Leitung zu­ geführt oder in Zwischenspeichern deponiert werden können, von wo sie zu beliebigen Zeiten dem NMR-Spektrometer ohne Umfüll­ vorgang und ohne manuellen Eingriff über dieselbe Leitung zu­ führbar sind. Dieses Verfahren erlaubt NMR-seitig einen Stop- Flow-Betrieb mit beliebig langen Meßzeiten ohne die chromato­ graphische Trennleistung durch längere Haltezeiten nachteilig zu beeinflussen.

Vorzugsweise werden die chromatographisch getrennten Komponenten durch den LC-Detektor (z. B. UV/VIS bzw. RI) erkannt und dadurch das Zwischenspeichern veranlaßt. Nicht interessierende Frak­ tionen des Eluents werden einem Abfallbehälter zugeführt.

Eine die oben genannte Aufgabe lösende Vorrichtung ist durch eine Zwischenspeichereinrichtung gekennzeichnet, die mehrere Speicherkapillaren enthält, bei der jede Kapillare zur wahl­ weisen Aufnahme einer Komponente vorgesehen ist, so daß eine örtliche Aufteilung der Komponenten in die Kapillaren erfolgt.

Vorzugsweise sind Kapillaren der Zwischenspeicherschaltung in verschiedene Längen entsprechend den verschiedenen NMR-Meß­ zellenvolumina vorgesehen.

Es ist zu bevorzugen, daß vor und hinter der Zwischenspeicher­ schaltung je eine steuerbare Ventilanordnung vorgesehen ist, durch die Komponenten des Probengemischs einer ausgewählten Kapillare zugeleitet werden können bzw. der Inhalt einer be­ liebigen Kapillare der Meßzelle des NMR-Spektrometers zugeführt werden kann.

Bevorzugt bestehen die genannten Ventilanordnungen aus handels­ üblichen Mehrwegedrehventil mit Motorantrieb, wobei den Mehr­ wegedrehventilen die Ventistellung und die Drehrichtung durch entsprechende Steuerbefehle von einer Auswerte- und Steuer­ einrichtung eingegeben werden.

Die Erfindung ermöglicht eine vorteilhafte, weil flexible und genau steuerbare Kopplungsmessung zwischen Flüssigkeitschro­ matographie und Kernresonanzspektroskopie.

Im Folgenden wird die Erfindung in Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine Ausführungsart der Erfindung;

Fig. 2 eine zweite Auführungsart der Erfindung, die jeweils einen Flüssigkeitschromato­ graphiedetektor vor und nach der Zwischen­ speicherschaltung aufweist; und

Fig. 3 Details einer bevorzugten Zwischenspeicher­ schaltung, die bei der Erfindung verwendbar ist.

Zunächst wird anhand der Fig. 1, welche einen schematischen Grundaufbau einer ersten erfindungsgemäßen Ausführungsart zeigt, das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert. Ein an einem Eingang 9 aufgegebenes Probeneluent wird von einer LC-Pumpe 10 zu einer LC-Säule 11 gepumpt und dort fraktioniert. Das frak­ tionierte Probeneluent wird von der LC-Säule 11 einem LC-Detek­ tor 12, der i. a. im UV/VIS-Bereich arbeitet, zugeführt, durch welchen die LC-Peakerfassung ausgeführt wird. Der LC-Detektor 12 liefert ein Detektorsignal 1 an eine schematisch dargestellte Auswerte- und Steuereinrichtung 18. (LC = Liquid Chromatogra­ phy).

Die Auswerte- und Steuereinrichtung 18 wertet unter anderem die Strömungsgeschwindigkeit der Probenflüssigkeit und die Zeiten der Peakmessung (Retention) aus und setzt sie zueinander in Beziehung. Dem LC-Detektor 12 ist eine Zwischenspeicher­ schaltung 8 nachgeschaltet, die mit Mehrwegedrehventilen 13 und 15 jeweils an ihrem Eingang und an ihrem Ausgang gekoppelt ist.

Die Mehrwegedrehventile 13 und 15 werden von der Auswerte- und Steuereinrichtung 18 entsprechend den Retentionen so gesteuert, daß gewünschte Komponenten örtlich auf die einzelnen Kapillaren 14 der Zwischenspeicherschaltung 8 aufgeteilt werden und daß gewünschte, von einem nachgeschalteten NMR-Spektrometer 7 zu messende Komponenten vom Mehrwegedrehventil 15 am Ausgang der Zwischenspeicherschaltung entnommen werden können. Auf diese Weise läßt sich eine flexible und wahlweise sequentielle Ver­ bindung einzelner gewählter Zwischenspeicherkapillaren 14 zur NMR-spektrometischen Auswertung im NMR-Spektrometer 7 erzielen.

Im NMR-Spektrometer 7 gemessene Komponenten werden nach der Messung einem Abfallsammelbehälter 17 zugeführt.

Die in Fig. 1 gezeigte Zwischenspeicherschaltung 8 in Kom­ bination mit den Drehventilen 13 und 15 kann z. B. eine in Fig. 3 gezeigte Ausführung haben. Die hier dargestellten Kapil­ laren 14a, 14b, 14c, 14d, 14e und 14f können unterschiedliche Fassungsvolumina und Säulenlängen haben. Im allgemeinen haben alle Kapillaren eines verwendeten Satzes gleiche Länge bzw. Fassungsvermögen, das sich an der Größe der verwendeten NMR- Meßzelle orientiert. Bei einer anderen Meßzelle wird dann der gesamte Kapillarensatz der Zwischenspeicherschaltung ausge­ wechselt. In Ausnahmefällen können jedoch auch, wie in Fig. 3 angedeutet, innerhalb eines Satzes verschiedene Längen verwendet werden. Die Mehrwegedrehventile werden von Schrittschaltmotoren angetrieben, die von der Auswerte- und Steuereinrichtung 18 entsprechende Steuerbefehlssignale 2 und 3 erhalten. Wenn ein unabhängiger Betrieb der Mehrwegedrehventile 13 und 15 gefordert ist, ist es zweckmäßig, der Auswerte- und Steuereinrichtung 18 jeweilige Ventilstellungssignale 4 und 5 zuzuführen, welche die Drehstellung der Mehrwegedrehventile 13 und 15 angeben.

Bei der in Fig. 1 gezeigten Anordnung hat die Zwischenspeicher­ schaltung 8 einen Eingang vom LC-Detektor 12 und einen Ausgang zum NMR-Spektrometer 7.

Dem Fachmann ist jedoch ohne weiteres ersichtlich, daß sich eine solche Zwischenspeicherschaltung auch anders konfigurieren läßt, z. B. mit einem Eingang und mehreren Ausgängen, beispiels­ weise zur gleichzeitigen, insbesondere parallelen Messung ver­ schiedener Peaks durch parallel angeordnete unterschiedliche Spektrometer oder auch mit einem Ausgang und mehreren Eingängen, wobei beispielsweise zu dem Eingang vom LC-Detektor 12 noch ein Eingang vorgesehen ist, dem eine Vergleichsflüssigkeit, beispielsweise D₂O als Frequenznormal eingegeben wird.

Die Zwischenspeicherschaltung in der in Fig. 1 dargestellten Ausführungsart ist einstufig konfiguriert.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich jedoch auch mit einer mehrstufigen Zwischenspeicherschaltung ausführen.

Zusätzlich zu den vor und nach der Zwischenspeicherschaltung angeordneten Mehrwegedrehventilen 13 und 15 sind im Probenfluß steuerbare Ventile 20 und 22 vorgesehen. Das steuerbare Ventil 20 ist ein Dreiwegeventil, dessen zweiter Ausgang zu einem zweiten Abfallsammelbehälter 21 führt, so daß für die nach­ trägliche NMR-Spektroskopiemessung nicht benötigte Probenfrak­ tionen dem Abfall direkt zugeleitet werden können. Das steuer­ bare Ventil 22 ist ebenfalls ein Dreiwegeventil und dem Mehr­ wegedrehventil 15 nachgeschaltet und wird zum Füllen der Zwi­ schenspeicherschaltung 8 mit dem Abfallsammelbehälter 24 und zum Zuleiten einer Komponente zu dem NMR-Spektrometer 7 mit diesem verbunden. Die Ventile 20 und 22 werden über Signal­ leitungen 6 und 6′ von einer Auswerte- und Steuereinrichtung 18 gesteuert.

Weiterhin ist in der Ausführung gemäß Fig. 1 eine Start-Stop- Automatik 23 vorgesehen, mit der in Verbindung mit den anderen Ventileinheiten ein Start-Stop-Meßverfahren durchführbar ist. Die Start-Stop-Automatik 23 kommuniziert über eine Signalver­ bindung 16 mit der Auswerte- und Steuereinrichtung 18. Die Start-Stop-Automatik 23 ermöglicht in Verbindung mit den über die Steuersignale 2 und 3 gesteuerten Mehrwegedrehventilen 13 und 15 sowie den über die Steuersignale 6, 6′ von der Aus­ werte- und Steuereinrichtung 18 gesteuerten Ventilen 20 und 22 ein Start-Stop-Verfahren ohne die Gefahr einer Verminderung der chromatographischen Trennleistung.

Im folgenden soll beispielhaft eine bevorzugte Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Anordnung entspre­ chend Fig. 1 beschrieben werden.

Die Auswerte- und Steuereinheit 18 wertet u. a. die Strömungs­ geschwindigkeit des Eluents aus, die entweder bekannt und ab­ gespeichert ist oder gemessen wird. Die Auswertung des Detektor­ signals 1 zeigt das Auftreten chromatographischer Peaks an, d. h., der Detektor 12 wird dann gerade von einer Komponente des Probengemischs durchlaufen. Nach einem vorgegebenen Algorithmus entscheidet die Auswerte- und Steuereinheit 18, ob dem gemesse­ nen Peak eine interessierende Komponente zugeordnet wird. So­ lange kein Peak gemessen wird, oder gemessene als irrelevant eingestuft werden, gelangt das Eluent nach Durchlaufen des Detektors 12 über ein Mehrwegdrehventil 20 in einen Abfall­ sammelbehälter 21. Sobald jedoch ein Peak als relevant erkannt wird, gibt die Einheit 18 über eine Steuerleitung 6 einen Steuerbefehl zum Umschalten des Mehrwegventils 20, so daß das Probeneluent nun in eine Zwischenspeicherschaltung 8 gelangt, die mit Mehrwegdrehventilen 13 und 15 jeweils an ihrem Eingang und Ausgang gekoppelt ist. Ein Steuerbefehl über Leitung 2 an Ventil 13 bewirkt, daß das Probeneluent in eine ausgewählte Speicherkapillare 14 der Zwischenspeicherschaltung 8 gelangt. Es durchströmt diese Kapillare und gelangt zunächst über das Mehrwegdrehventil 15 und ein Mehrwegventil 22 in den Abfall­ sammelbehälter 24. Dieser kann mit Behälter 21 identisch sein. Die Ventile 20 und 13 bzw. 22 und 15 können auch jeweils in­ tegriert sein. An dieser Stelle sei angemerkt, daß das gesamte Leitungssystem der Anordnung nach Fig. 1 bzw. Fig. 2 vor einer Messung mit Eluent gefüllt ist. Das in den Sammelbehälter 24 strömende Eluent enthält also zunächst keine interessierenden Komponenten. Da dem Auswerte- und Steuergerät 18 die Strömungs­ geschwindigkeit bekannt ist und es zudem ständig vom Detektor 12 die detektierte Signalintensität erhält, kann on-line be­ rechnet werden, wann gerade die Komponente die Speicherkapillare 14 durchströmt, die am Detektor 12 ein maximales Signal ge­ liefert hat. Sobald also der Bereich des strömenden Proben­ eluents in die Kapillare 14 eingeströmt ist, die dem Maximum eines interessierenden Peaks entspricht, werden über die Steuer­ leitungen 6, 2, 3 und 6′ die Ventile 20, 13, 15 und 22 derart umgeschaltet, daß dieser Bereich in der Kapillare 14 festge­ halten wird und das Eluent entweder über Ventil 20 wieder in den Sammelbehälter 21 strömt oder über Ventil 13 in eine weitere Speicherkapillare 14 geleitet wird. In diesem Fall strömt wei­ terhin Eluent über Ventil 15 und 22 in den Sammelbehälter 24.

Auf diese Weise können nach und nach mehrere interessierende Komponenten in den Speicherkapillaren 14 der Zwischenspeicher­ schaltung 8 aufbewahrt werden. Die chromatographische Trennung in Säule 11 wird dabei niemals unterbrochen.

Noch während die chromatographische Trennung und Detektion erfolgt, kann nun bereits zeitlich unabhängig davon die NMR- Messung beginnen. Dazu gibt die Auswerte- und Steuereinheit 18 über Leitungen 6, 2, 5 bzw. 6′ Steuerbefehle an die Ventile 20, 13, 15 und 22, so daß der Inhalt einer ausgewählten Spei­ cherkapillare 14 in die Meßzelle des NMR-Spektrometers gelangt und von der Pumpe 10 über die Säule 11 und den Detektor 12 neues Eluent nachströmt. Über die gemessene bzw. bekannte Strö­ mungsgeschwindigkeit kann berechnet werden, wann der zwischen­ gespeicherte Inhalt der Kapillare 14 gerade in der Meßzelle des NMR-Spektrometers 7 angekommen ist. Zu diesem Zeitpunkt werden die Ventile wieder umgeschaltet, so daß das Eluent wieder entweder über Ventil 20 direkt in den Sammelbehälter 21 oder durch die Zwischenspeicherschaltung 8 und Ventil 15 in den Sammelbehälter 24 gelangt.

Nachdem die aus der Kapillare 14 entnommene, interessierende Komponente die NMR-Meßzelle anfüllt, kann die NMR-Messung dieser Komponente erfolgen, beispielsweise über eine Start-Stop-Auto­ matik 23, die mit der Auswerte- und Steuereinrichtung 18 über eine Signalverbindung 16 kommuniziert. Für die Messung steht beliebig viel Zeit zur Verfügung, daß durch Akkumulation das Signal-Rauschverhältnis verbessert werden kann oder auch auf­ wendige, z. B. 2D-NMR-Messungen durchgeführt werden können.

Nach der NMR-Messung dieser Komponente können in bereits be­ schriebener Weise wieder die Ventile 20, 13, 15 und 22 ange­ steuert werden, so daß der Zwischenspeicherschaltung eine wei­ tere Komponente entnommen werden kann. Das Probeneluent mit der vorhergehenden Komponente wird dadurch aus der NMR-Meßzelle herausgedrückt und gelangt letztlich wieder in einen Abfall­ sammelbehälter 17, der wiederum mit den Behältern 21 und/oder 24 identisch sein kann; über die Signalleitung 16′ besteht auch eine Start-Stop-Kommunikation zur Chromatographiepumpe.

Fig. 2 zeigt eine weitere vorteilhafte Ausbildung der Erfin­ dung, die auf der Anordnung gemäß Fig. 1 aufbaut. Das Aus­ führungsbeispiel gemäß Fig. 2 weist eine weitere LC-Detektor­ anordnung 12′ im Wege des Probeneluents nach der Zwischenspei­ cherschaltung 8 auf. Dieser zweite LC-Detektor 12′ liefert ein zweites Detektorsignal 1′ an eine Auswerte- und Steuereinrich­ tung 18′. Mit Hilfe des zweiten LC-Detektors 12′, der in der in Fig. 2 gezeigten Ausführungsart unmittelbar vor dem Eingang zum NMR-Spektrometer 7 liegt, läßt sich sicherstellen, daß die Meßzelle des NMR-Spektrometers optimal mit der zwischengespei­ cherten Komponente beschickt wird.

Anstelle des LC-Detektors 12′ kann an dieser Stelle auch ein Detektor eines anderen Typs, beispielsweise ein IR-Detektor bzw. ein IR-Spektrometer vorhanden sein. Dies erweitert den Innformationsgehalt über die zu vermessenden Komponenten.

Das beschriebene Verfahren und die in Fig. 1 und 2 gezeigten Aufbauten haben nur beispielhaften Charakter. So läßt sich durch Verwendung einer weiteren Pumpe das Beschicken und Ent­ leeren der einzelnen Speicherkapillaren 14 völlig unabhängig voneinander gestalten. Dies kann auch bei Verwendung nur einer Pumpe 10 geschehen, wenn die chromatographische Trennung kurz­ zeitig angehalten wird und beispielsweise über eine direkte Leitung zum Ventil 20 oder 13 reines Eluat in die Zwischen­ speicherschaltung geschickt wird.

Die wesentlichen Vorteile der Erfindung sind, daß in einem automatischen Meßverfahren Continuous-Flow-Messungen möglich sind, indem man einfach das Probeneluat kontinuierlich eine Kapillare 14 der Zwischenspeicherschaltung durchströmen läßt, daß aber vor allem mit dem selben Aufbau NMR-seitig diskon­ tinuierliche, auch lang dauernde Messungen durchführbar sind, während das Verfahren chromatographieseitig immer kontinuierlich bleiben kann. Die ganze Anlage ist bis zur letzten Messung geschlossen, d. h. das Eluat kommt nie mit der Umgebung in Berührung und muß auch nie manuell bewegt oder abgefüllt werden.

Für beide in den Fig. 1 bis 2 gezeigten Ausführungsarten der Erfindung gilt, daß die Auswerte- und Steuerfunktionen der jeweiligen Auswerte- und Steuereinrichtungen 18 und 18′ bevor­ zugt programmgesteuert sind. Sie können mit einem in den Zeich­ nungsfiguren nur pauschal angedeuteten Host-Rechner kommuni­ zieren.

Die beschriebenen Merkmale der Ausführungsbeispiele können sowohl jeweils einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Erfindung gerechnet werden.

Claims (9)

1. Verfahren zur gekoppelten Flüssigkeitschromatographie- und Kernresonanzspektroskopiemessung mit folgenden Schrit­ ten:

• a) flüssigkeitschromatographische Trennung von Kompo­ nenten eines Probengemischs;
• b) Detektion dieser Komponenten mit einem Chromatogra­ phiedetektor;
• c) Zuführung dieser Komponenten in die Meßzelle eines NMR-Spektrometers;
• d) Messen des NMR-Spektrums dieser Komponente; gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
• e) systeminterne Zwischenspeicherung von eine vorgegebene Bedingung erfüllenden Komponenten in mehreren Eluent- Zwischenspeichern nach Schritt b) und vor Schritt c);
• f) systeminterne, zeitlich beliebige Zuführung der Spei­ cherinhalte in die Meßzelle des NMR-Spektrometers unabhängig von den Schritten a) und b).

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß eine Zwischenspeicherung durch folgende automatische Schritte erfolgt:

• a) der Chromatographiedetektor detektiert eine interes­ sierende Komponente;
• b) Meldung an eine Auswerte- und Steuereinrichtung;
• c) Ermitteln, ob die Komponente die vorgegebene Bedingung erfüllt;
• d) Berechnung von Transferzeiten durch die Auswerte- und Steuereinrichtung;
• e) Veranlassung der Zwischenspeicherung der betreffenden Komponente.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zwischengespeicherten Komponenten NMR-seitig in Stop- Flow-Technik gemessen werden.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 mit einem Flüssigkeitschromatographen (9, 10, 11) ein­ schließlich eines Flüssigkeitschromatographiedetektors (12, 12′), einem Kernresonanzspektrometer (7) mit einer Meßzelle, der die flüssigkeitschromatographisch detektier­ ten Komponenten zur kernresonanzspektrometrischen Messung zugeführt werden, dadurch gekennzeichnet, daß im Flußweg des Eluents von dem Flüssigkeitschromatographie­ detektor zum Kernresonanzspektrometer eine Zwischenspei­ cherschaltung (8) vorgesehen ist, in der Eluent-Kompo­ nenten, die jeweils eine vorgesehene Bedingung erfüllen, zwischengespeichert werden und Mittel vorgesehen sind, mit denen die zwischengespeicherten Komponenten in zeitlich beliebiger Reihenfolge automatisch der Meßzelle des Kern­ resonanzspektrometers (7) zuführbar sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zwischenspeicherschaltung (8) Speicherkapillaren (14) aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zufuhrmittel jeweils eine Ventilanordnung (13, 15) vor und hinter der Zwischenspeicherschaltung (8) zur wahl­ freien Zufuhr einer Eluentkomponente zu ausgewählten Kapil­ laren der Zwischenspeicherschaltung und zur wahlfreien Zufuhr der in der Zwischenspeicherschaltung (8) enthaltenen Komponenten zum Kernresonanzspektrometer (7) aufweisen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ventilanordnung (13, 15) motorgetriebene Mehrwege­ drehventile aufweist, wobei jede Kapillare (14; 14a, 14b, 14c, 14d, 14e, 14f) der Zwischenspeicherschaltung (8) mit einander entsprechenden Ventilanschlüssen der Mehrwegedrehventile verbunden ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, gekennzeichnet durch eine die Ventilanordnungen steuernde Auswerte- und Steuereinrichtung (18, 18′).

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine Stop-Flow-Automatik (23), die mit der Auswerte- und Steuereinrichtung (18′) kommuniziert.