DE4090565C2

DE4090565C2 - Rekombinantes Herpesvirus-Pockenvirus-Vakzin

Info

Publication number: DE4090565C2
Application number: DE4090565A
Authority: DE
Inventors: Enzo Paoletti
Original assignee: Health Research Inc
Current assignee: Health Research Inc
Priority date: 1989-04-17
Filing date: 1990-04-16
Publication date: 2000-03-09
Anticipated expiration: 2010-04-17
Also published as: NL195016C; DK176464B1; BE1004369A5; FR2647808A1; JPH04505248A; IT9020063A0; GB2246784A; IE901380L; US5338683A; JP3246735B2; IT1241119B; NL9020677A; AU5552090A; US6183750B1; GB2246784B; LU88018A1; GB9120655D0; DK174391A; DK174391D0; CA2014465A1

Abstract

Beschrieben ist ein rekombinantes Pockenvirus, wie ein Vaccinia-Virus, Geflügelpockenvirus und Kanarienpockenvirus, enthaltend Fremd-DNA vom Herpes-Virus. In einer Ausführungsform wird die Fremd-DNA in einem Wirt durch die Produktion eines Herpes-Virus-Glycoproteins exprimiert. In einer anderen Ausführungsform wird die Fremd-DNA in einem Wirt durch die Produktion von mindestens zwei, insbesondere zwei oder drei, Herpes-Virus-Glycoproteinen exprimiert. Beschrieben ist auch ein Vakzin, das das rekombinante Pockenvirus enthält, für die Induktion einer immunologischen Antwort in einem Wirtstier, das mit dem Vakzin geimpft wurde. Durch die vorliegende Erfindung wird die Schranke der maternalen Immunität in einem Neugeborenen überwunden oder vermieden.

Description

Diese Anmeldung ist eine "continuation-in-part" der am 16. August 1989 eingereichten Anmeldung mit der Serien-Nr. 394,488, die ihrerseits eine "continuation-in-part" der am 17. April 1989 eingereichten Anmeldung mit der Serien-Nr. 339,004 ist.

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Pocken virus und Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das Genprodukte eines Herpesvirus-Gens expri miert, und Vakzine, die eine schützende Immunität gegen Her pesvirus-Infektionen bereitstellen.

In der Anmeldung wird durch arabische Ziffern in Klammern auf eine Reihe von Publikationen Bezug genommen. Diese Druckschriften werden am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen vollständig zitiert. Diese Referenzen be schreiben den Stand der Technik, auf den sich die Anmeldung bezieht.

Technischer Hintergrund

Vaccinia-Virus und in jüngerer Zeit andere Pockenviren sind zur Insertion und Expression fremder Gene verwendet worden. In die Basistechnik zur Insertion fremder Gene in ein leben des infektiöses Pockenvirus ist die Rekombination zwischen Pocken-DNA-Sequenzen, die ein fremdes genetisches Element in einem Donor-Plasmid flankieren, und den im Rettungs-Pocken virus homologen Sequenzen involviert (28).

Genauer gesagt, werden die rekombinanten Pockenviren in zwei Schritten konstruiert, die im Stand der Technik bekannt und analog zu den Verfahren zur Erzeugung synthetischer Rekom binanten des Vaccinia-Virus sind, die im US-Patent 4,603,112 beschrieben sind, auf dessen Offenbarungsgehalt hier Bezug genommen wird.

Zuerst wird die DNA-Gensequenz, die in das Virus inseriert werden soll, insbesondere ein offener Leserahmen aus einer Nicht-Pocken-Quelle, in eine E. coli-Plasmidkonstruktion ge bracht, in die DNA inseriert worden war, die homolog zu einem Abschnitt nicht essentieller DNA des Pockenvirus ist. Getrennt davon wird die DNA-Gensequenz, die inseriert werden soll, mit einem Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verbin dung liegt so in der Plasmidkonstruktion, daß sie an beiden Enden von DNA flankiert wird, die homolog mit einer DNA-Se quenz ist, die einen Bereich von Pocken-DNA, der einen nicht essentiellen Ort enthält, flankiert. Die resultierende Plas midkonstruktion wird dann durch Züchten in E. coli-Bakterien vermehrt (11) und isoliert (12, 20).

Zweitens wird eine Zellkultur, z. B. Hühnerembryofibrobla sten, mit dem isolierten Plasmid, das die zu inserierende DNA-Sequenz enthält, zusammen mit dem Pockenvirus transfi ziert. Rekombination zwischen homologer Pocken-DNA im Plas mid und dem viralen Genom ergibt ein Pockenvirus, das durch das Vorhandensein fremder DNA-Sequenzen in einem nicht es sentiellen Bereich seines Genoms modifiziert ist. Der Be griff "fremde" DNA bezeichnet exogene DNA, insbesondere DNA aus einer Nicht-Pocken-Quelle, die Genprodukte codiert, die normalerweise von dem Genom, in das die exogene DNA gebracht wurde, nicht produziert wird.

Genetische Rekombination ist im allgemeinen der Austausch von homologen DNA-Abschnitten zwischen zwei DNA-Strängen. In gewissen Viren kann die DNA durch RNA ersetzt sein. Homologe Nucleinsäurebereiche sind Nucleinsäure-(DNA- oder RNA-) Be reiche, die die gleiche Sequenz von Nucleotidbasen aufwei sen.

Genetische Rekombination kann natürlicherweise während der Replikation oder der Herstellung neuer viraler Genome in der infizierten Wirtszelle stattfinden. Somit kann die geneti sche Rekombination zwischen viralen Genen während des vira len Replikationszyklus vorkommen, der in einer Zelle statt findet, die mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Viren oder anderen genetischen Konstruktionen co-infiziert ist. Ein DNA-Bereich eines ersten Genoms wird austauschbar zum Konstruieren des Genom-Abschnittes eines zweiten co-infizie renden Virus verwendet, in dem die DNA homolog zu der des ersten viralen Genoms ist.

Rekombination kann aber auch zwischen DNA-Bereichen in unterschiedlichen Genomen stattfinden, die keine perfekte Homologie aufweisen. Wenn ein solcher Abschnitt aus einem ersten Genom homolog mit einem Abschnitt aus einem anderen Genom ist, außer daß im ersten Abschnitt beispielsweise ein genetischer Marker oder ein Gen, das eine antigene Determi nante codiert, vorhanden und in einen Teil der homologen DNA inseriert ist, kann Rekombination noch stattfinden, und die Produkte dieser Rekombination lassen sich durch Vorhanden sein dieses genetischen Markers oder Gens im rekombinanten viralen Genom nachweisen.

Eine erfolgreiche Expression der inserierten genetischen DNA-Sequenz durch das modifizierte infektiöse Virus erfor dert zwei Bedingungen. Erstens muß die Insertion in einem nicht essentiellen Bereich des Virus erfolgen, damit das mo difizierte Virus lebensfähig bleibt. Die zweite Bedingung zur Expression der inserierten DNA ist das Vorhandensein eines Promotors in einer geeigneten Beziehung zur inserier ten DNA. Der Promotor muß so plaziert sein, daß er stromauf wärts der zu exprimierenden DNA-Sequenz liegt.

Es gibt zwei Subtypen von Pferde-Herpesvirus, die, obwohl sie kreuz-neutralisierende Epitope enthalten, sich durch ihre antigenen Profile, Restriktionsendonuclease-Fingerab drücke und ihre Pathogenität für Pferde unterscheiden lassen (1). Pferde-Herpesvirus 1 (EHV-1) ist mit Atemwegserkrankun gen, Störungen des Zentralnervensystems und klassischen her pesbedingten Fehlgeburten assoziiert, während Pferde-Herpes virus 4 (EHV-4) vorwiegend mit Atemwegserkrankungen (1, 48) assoziiert ist. Pferde-Herpesviren sind Mitglieder der α- Herpesvirus-Subfamilie und zeigen viele der typischen biolo gischen und biochemischen Eigenschaften menschlicher Herpes viren, wie genomische Isomerisierung, Regulation der Genex pression, Etablierung latenter Infektionen, Erzeugung defek ter störender Viruspartikel, Hervorrufen neurologischer Stö rungen und onkogene Transformation in vitro (1, 4, 23). Damit läßt sich EHV vorteilhaft zur Untersuchung der verschiedenen biologischen Konsequenzen von Herpesvirus-Infektionen unter suchen.

Durch Herpesvirus-Glykoproteine werden wesentliche virale Funktionen, wie die Anheftung und das Eindringen in die Zelle, das Ausbreiten des Virus von Zelle zu Zelle, und, wichtig, das Festlegen des Pathogenitätsprofils der Infek tion, vermittelt. Herpesvirus-Glykoproteine sind entschei dende Bestandteile in der Wechselwirkung mit dem Immunsystem des Wirtes (36, 37).

Die gut charakterisierten Glykoproteine von Herpes simplex- Virus schließen gB, gC, gD, gE, gG, gH und gI ein (36, 37, 49-55). Eine Anzahl von Studien haben die Wichtigkeit von Her pes simplex-Virus-Glykoproteinen beim Hervorrufen von Im munantworten gezeigt. Seither ist bekanntgeworden, das gB und gD wichtige Immunantworten hervorrufen können (6, 8, 13, 18, 21, 22, 26, 27, 30, 44, 46, 47). gC kann die Klasse I eingeschränkt-cytotoxischer Lymphozyten stimulieren (15, 32), wohingegen gD die Klasse II cytotoxischer T-Zell-Antworten stimulieren kann (21, 22, 44, 46, 47). Von gG wurde gezeigt, daß es ein Ziel der komplementabhängigen Antikörper-gesteuerten Virusneutralisation ist (38, 39). Von einer Anzahl anderer Glykoproteine von anderen Herpesviren ist ebenfalls gezeigt worden, daß sie wichtige Immunantworten hervorrufen (5, 10, 36, 56).

Beide Subtypen von EHV exprimieren sechs in größerer Menge vorhandene Glykoproteine (1, 3, 43). Die genomischen Teile der gp2, gp10, gp13, gp14, gp17/18 und gp21/22a codierenden DNA- Sequenzen sind unter Verwendung von λgt11-Expressionsvekto ren und monoclonalen Antikörpern bestimmt worden (3). Die Lage der Glykoproteine gp13 und gp14 wurde in denselben Or ten innerhalb der L-Komponente des Genoms bestimmt, zu denen gC bzw. gB der Herpes simplex-Viruskarte homolog sind (3). EHV-1, dessen Glykoproteingene so kartiert worden sind, daß fünf seiner sechs Hauptglykoproteine durch Sequenzen inner halb der L-Komponente des Genoms codiert sind, während nur eine (gp17/18 im U_S-Bereich kartiert wurde, scheint unter den α-Herpesviren einzigartig zu sein. Aus der Analyse die ser Ergebnisse wurde vorausgesagt, daß einige der in kleiner Menge vorkommenden im EHV-1 Virion identifizierten Glykopro teine genauso wie noch nicht identifizierte EHV-1-Glykopro teine in der S.Komponente des Genoms kartieren (3). Die Hüll-Glykoproteine sind die Hauptimmunogene der Herpesviren, die sowohl ein Hervorrufen von humoralen als auch zellulären Wirts-Immunantworten eine Rolle spielen (5, 8, 73-75) und des halb bei denen höchstes Interesse genießen, die versuchen, Vakzine zu entwickeln.

Kürzlich wurde die Nucleotidsequenz der gp13 codierenden Transkriptionseinheit des EHV-1-Stammes Kentucky T431 mitge teilt (2). Ein offener Leserahmen codiert ein aus 468 Amino säuren bestehendes primäres Translationsprodukt von 51 kDa. Das Protein hat die charakteristischen Merkmale eines mem branüberspannenden Proteins mit neun potentiellen, in der Oberflächendomäne zwischen vermuteten Signal- und Transmem bran-Anker-Anteilen des Proteins vorhandenen N-verknüpften Glykosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr) (2). Es wurde gezeigt, daß das Glykoprotein homolog mit Herpes simplex-Vi rus (HSV) gC-1 und gC-2, mit Pseudorabies-Virus (PRV) gIII und dem Varicella zoster-Virus (VZV) gpV ist (2). EHV-1 gp13 ist somit das strukturelle Homologe des Herpesvirus gC-arti gen Glykoproteins.

Kürzlich wurde die Sequenz von EHV-1 gp14 (71, 72) mitge teilt. Eine Analyse der vorhergesagten Aminosäuresequenz des gp14-Glykoproteins ergab eine signifikante Homologie mit dem korrespondierenden Glykoprotein von HSV, gB.

Es wurde gezeigt, daß gegen einige EHV-1-Glykoproteine ge richtete monoclonale Antikörper neutralisierend wirken (76). Passive Immunisierungsexperimente zeigten, daß gegen gp13 oder gp14 (77) oder gegen gp13, gp14 oder gp17/18 (78) ge richtete monoclonale Antikörper Hamster gegen eine tödliche Infektion schützen konnten. Andere gB und gC-Glykoprotein analoge sind ebenfalls in den Schutz gegen durch α-Herpesvi ren verursachte Krankheiten involviert (8, 10, 73). Vom EHV-1 gp17/18-Glykoprotein ist, obwohl als weiteres potentielles schützendes Immunogen charakterisiert, bis jetzt kein wei teres strukturelles Gegenstück unter den verschiedenen von der 5-Komponente in den anderen α-Herpesviren codierten Gly koproteinen (66, 79, 80) bekanntgeworden. Ausgehend von seiner genomischen Lage hat man spekuliert, daß gp17/18 ein HSV gE- Analog sein könnte (2).

Pseudorabies Virus (PRV), ein α-Herpesvirus, ist der Verur sacher von Aujesky's-Krankheit. Die Krankheit ist hochinfek tiös und führt zu ernstzunehmenden ökonomischen Verlusten in der Schweineindustrie. Die Krankheit ist mit einer hohen Morbidität und Mortalität bei Ferkeln assoziiert und ist charakterisiert durch schwere Atemwegskrankheiten, Fehlge burten, verminderte Größe des Wurfes und herabgesetzten Wachstumsraten der Überlebenden. Eine häufige Konsequenz einer Infektion ist eine tödliche Encephalitis. Latente vi rale Infektionen, ein Charakteristikum von Herpesviren, kön nen sich etablieren und damit dazu führen, daß gesundete er wachsene Schweine als chronische Virusträger dienen, vgl. Wittmann und Rziha (81) bezüglich eines neueren umfassenden Überblicks.

Das PRV-Genom besteht aus einer 90 × 10⁶ Dalton großen dop pelsträngigen DNA (82), die durch invertierte, sich wiederholende Sequenzen in allein nicht vorkommende lange (U_L) oder allein nicht vorkommende kurze (U_S)-Abschnitte unterteilt ist (83, 84). Das PRV-Genom codiert ungefähr 100 Polypeptide, deren Expression in einer kaskadeartigen Weise ähnlich der anderer Herpesviren (85, 86) reguliert ist. Bis heute hat man gezeigt, daß die fünf Glykoproteine gpI, gpII, gpIII, gp63 und gp50 mit der viralen Höhe und mit den verschiedenen membranartigen Strukturen von PRV-infizierten Zellen assoziiert sind (80, 86-91). Ein sechstes PRV- codiertes Glykoprotein (gX) wird in das Kulturmedium freigesetzt (92). Die physikalische Lage dieser Glykoproteine im PHV-Genom und ihre DNA-Sequenz sind gegenwärtig bekannt (62, 80, 91-98). So wie die Glykoproteine anderer Herpesviren üben die PRV-Glykoproteine wesentliche virale Funktionen, wie das zelluläre Anheften und das Einbringen in und die Freisetzung aus den Zellen, aus. Die PRV-Glykoproteine sind für das Pathogenitätsprofil einer PRV-Infektion entscheidend und sind entscheidende Kom ponenten bei der Entwicklung der Krankheit und des Immunsta tus.

PRV gpI ist zur Replikation des Virus in vitro und in vivo nicht essentiell und ist bei den meisten attenuierten PRV- Stämmen nicht vorhanden (99). Die attenuierte Natur dieser Stämme, bei denen gI deletiert ist, gibt ebenfalls einen Hinweis auf eine mögliche Rolle von gI für die Virulenz (99, 100). Andere PRV-Proteine scheinen jedoch in diese Funk tion involviert zu sein, da die alleinige Expression von gI nicht ausreichend ist, um einen hohen Grad an Virulenz zu produzieren (100).

Die Rolle, die gI zum Erzeugen einer Immunantwort gegen PRV spielt, ist unklar. Monoclonale Antikörper gegen gI können in vitro das Virus neutralisieren (101) und immunisierte Mäuse passiv gegen eine letale PRV-Infektion schützen (81). Kost et al. (98) haben kürzlich die Expression von PRV gpI in Vaccinia-Virus-Rekombinanten sowohl alleine als auch in Assoziation mit gp50 und gp63 beschrieben. Eine intracra niale Inoculation von Vaccinia-Rekombinanten in Mäuse ergab eine gesteigerte Virulenz, besonders dann, wenn PRV gpI mit der Coexpression von gp50 und gp63 assoziiert war.

Im Schwein werden aber keine gegen gI gerichteten neutrali sierenden Antikörper produziert (5). Außerdem schützt ein rekombinantes PRV gI-codierte Polypeptide exprimierendes Vaccinia-Virus (98) Mäuse nicht gegen eine tödliche PRV-In fektion (relativ zu dem durch die Wildtyp Vaccinia-Kontrolle gebotenem Schutz). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, daß sich PRV gpI eher dazu eignet, eine diagnostische Sonde als ein Bestandteil in einem Untereinheits-Vakzin zu sein. Das PRV-Glykoprotein gp63 liegt in U_S-Bereich des PRV- Genoms benachbart zu gp50 (80). Die PRV gp63 codierende Se quenz beginnt mit drei aufeinanderfolgenden ATG-Codons unge fähr 20 Nucleotide stromabwärts des Stoppcodons von gp50. Es gibt kein erkennbares Transkriptionssignal-Motiv, und wahr scheinlich wird dasselbe Transkript wie für gp50 transla tiert. PRV gp63 ist in vitro nicht essentiell (88). Wie von Kost et al. (98) beschrieben, wurde PRV gp63 als eine sich fortsetzende DNA-Sequenz von PRV gp50 in Vaccinia-Virus ex primiert. Der Beitrag von PRV gp63 zum Schutz von Mäusen ge gen eine PRV-Infektion läßt sich schwer zuordnen, da in den entsprechenden Untersuchungen die Beiträge von PRV gp50 und gp63 nicht voneinander getrennt wurden. Das PRV-Glykoprotein gX ist ein nicht strukturelles Glykoprotein, dessen Endpro dukt in die extrazelluläre Flüssigkeit sekretiert wird (85, 92). In vitro erhielt man eine Neutralisation von PRV weder mit polyclonalen, noch mit monoclonalen Seren gegen PRV gX (102, 103), und Vakzine mit der Untereinheit gX erga ben keinen Schutz gegen einen Angriff (104).

Das PRV-Glykoprotein gp50 ist das gD-Analog von Herpes sim plex Virus Typ 1 (HSV-1) (97). Der offene Leserahmen der DNA codiert 402 Aminosäuren (54). Die reife glykosylierte Form (50 bis 60 kDa) enthält O-verknüpfte Kohlenhydrate ohne N- verknüpfte Glykosylierung (95). Schweineserum reagiert mit PRV gp50 stark und legt damit seine Richtigkeit als Immuno gen nahe. Monoclonale Antikörper gegen gP50 neutralisieren in vitro die PRV mit oder ohne Komplement (97, 105, 106) und schützen passiv Mäuse (102, 105, 106) und Schweine (102). Re kombinante PRV gp50 exprimierende Vaccinia-Viren induzierten serumneutralisierende Antikörper und schützten sowohl Maus als auch Schwein gegen einen tödlichen PRV-Infektion (98, 107, 108).

Das PRV gpIII-Gen liegt im U_L-Abschnitt des Genoms. Der 1437 bp-offene Leserahmen codiert ein Protein mit 479 Aminosäu ren. Das abgeleitete 50,9 kDa-primäre Translationsprodukt besitzt acht potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen (96). PRV gIII ist das HSV-1 gC-Analog (96). Ein funktionel ler Ersatz von PRV gIII durch HSV-1 gC wurde nicht beobach tet (109). Obwohl PRV gIII für die Replikation in vitro nicht unabdingbar ist (110, 111), ist die reife glykosylierte Form (98 kDa) ein reichlich vorkommender Bestandteil der PRV-Hülle. Monoclonale anti-gpIII-Antikörper neutralisieren das Virus in vitro mit oder ohne Komplement (86, 106, 110) und können passiv Maus und Schwein schützen (102). Das PRV-Gly koprotein gIII kann Maus und Schwein nach Immunisierung mit einem Cro/gIII-Fusionsprotein gegen eine tödliche PRV-Infek tion schützen, wenn es in E. coli exprimiert wird (Robbins, A., R. Watson, L. Enquist, europäische Patentanmeldung 0 162 738 A1) oder wenn es in einer Vaccinia-Rekombinanten exprimiert wird (Panicali, D., L. Gritz, G. Mazzara, europä ische Patentanmeldung 0 261 940 A2).

Einer der Hauptbestandteile der PRV-Hülle ist ein Disulfid verknüpfter Komplex von drei Glykoproteinen (120 kDa, 67 kDa und 58 kDa), der gemäß der Nomenklatur von Hampl (68) als PRV gpII bezeichnet wird. Die PRG gpII codierende DNA-Se quenz liegt am linken Ende von U_L. Der offene Leserahmen von 2976 Nucleotiden codiert ein primäres Translationsprodukt mit 913 Aminosäuren oder 110 kDa. PRV gpII ist mit dem HSV-1 gB homolog (62). Es wurde gezeigt, daß gegen PRV gpII ge richtete monoclonale Antikörper das Virus in vitro (5) mit oder ohne Komplement (81) neutralisieren. Ferner zeigten Un tersuchungen der passiven Immunisierung, daß die neutrali sierenden monoclonalen Antikörper Schweine teilweise schütz ten, nicht aber in der Lage waren, Mäuse gegen den Angriff eines virulenten Virus zu schützen (102). Bisher ist noch nicht berichtet worden, daß es eine aktive Immunisierung vom Schwein mit PRV gpII Glykoprotein gibt.

Während der letzten 20 Jahre hat sich das Auftreten von durch Herpes simplex-Virus Typ 2 (HSV2) verursachten Geni talinfektionen signifikant erhöht. Neueste Schätzungen ge ben an, daß in den Vereinigten Staaten 5 bis 20 Millionen Menschen Genitalherpes haben (112). Obwohl gezeigt wurde, daß eine orale Behandlung mit Acyclovir die Schwere der pri mären Infektionen vermindert (113) und ein erneutes Auftre ten verhindert (114), ist die Kontrolle und die Behandlung dieser Infektionen bei weitem nicht ideal. Man benötigt des halb ein Vakzin, um primäre und wiederkehrende Infektionen zu verhindern.

Das Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV1)-Genom codiert minde stens acht in ihren antigenen Eigenschaften verschiedene Glykoproteine: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI und gJ (115). Ho mologe dieser Gene scheinen in HSV2 vorhanden zu sein (116- 119). Da diese Glykoproteine sowohl in der Virion-Hülle als auch in der Plasmamembran der infizierten Zelle vorhanden sind, können sie humorale und zellvermittelte schützende Immunantworten hervorrufen (37). Die relative Wichtigkeit humoraler und zellulärer Immunität beim Schutz gegen Herpes simplex-Virus-Infektionen ist noch nicht vollständig aufge klärt. Mit gereinigten HSV1 gB, gC oder gD immunisierte Mäuse sind gegen einen letalen HSV1-Angriff geschützt (120). Mäuse sind auch gegen einen letalen HSV1- oder HSV2-Angriff durch passive Immunisierung mit Antikörpern gegen Gesamt- HSV1 (121) oder HSV2-(122)-Virus und mit Antikörpern gegen die individuellen HSV2-Glykoproteine gB, gC, gD oder gE (123) geschützt. Dieser Schutz scheint jedoch von der Ant wort kompetenter T-Zellen abhängig zu sein, da Tiere, die durch Bestrahlung Cyclophosphamid oder anti-Thymocytenserum immunsupprimiert sind, wurden nicht geschützt (124).

Den Beitrag der individuellen Glykoproteine beim Hervorrufen einer schützenden Immunantwort hat man noch nicht vollstän dig verstanden. Die Expression dieser Glykoproteine in einem heterologen System wie Vaccinia hat es ermöglicht, daß sich einige dieser Parameter untersuchen lassen. Es wurde z. B. gezeigt, daß Vaccinia-Virus-Vektoren, die HSV1 gB (125) und HSV1 gC (32) exprimieren, als Antworten cytotoxische T-Zel len hervorrufen. Außerdem wurde gezeigt, daß mit rekombinan ten Vaccinia-Viren, die entweder HSV1 gB (8), HSV1 gC (126) oder HSV1 gD (26) exprimieren, immunisierte Mäuse gegen einen letalen Angriff von HSV1 geschützt sind. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß ein rekombinantes HSV1 gD-exprimie rendes Vaccinia-Virus in einem Meerschweinchen-Modellsystem schützend gegen HSV2 wirkt (44). Man weiß jedoch nicht, ob die Expression multipler HSV-Antigene zu einer Potenzierung dieser Schutzantwort führt.

Rinder-Herpesvirus I (BHV1) ist für eine Reihe von Krankhei ten beim Vieh verantwortlich, einschließlich Conjunctivitis, Vulvovaginitis und Fehlgeburt (127). Es ist außerdem eines der wichtigsten Verursacher von Rinderatemwegserkrankungen, wobei es entweder direkt oder als empfindlich machender Fak tor für eine bakterielle Infektion wirkt (128).

BHV1 spezifiziert mehr als 30 strukturelle Polypeptide, von denen 11 glykosyliert sind (129). Vier dieser Glykoproteine, gI, gII, gIII und gIV, sind charakterisiert, und man hat ge funden, daß sie mit dem Herpes simplex-Virus (HSV) Glykopro teinen gB, gC, gD und gE homolog sind (130, 131).

Es wurde gezeigt, daß Untereinheits-Vakzine, die aus gI, gIII und/oder gIV bestehen, Vieh vor Krankheiten schützen (bei Verwendung eines BHV1/Pasteurella haemolytica-Aerosol- Belastungsmodells), nicht aber vor Infektion (132). Diese Ergebnisse zeigen die Wichtigkeit dieser Glykoproteine beim Hervorrufen einer erfolgreichen Immunantwort gegen BHV1.

gI und gIII sind ebenfalls in Vaccinia-Virus cloniert, und es wurde gezeigt, daß mit diesen Rekombinanten immunisiertes Vieh neutralisierende Antikörper gegen BHV1 produziert (56, 133).

Katzenrhinotracheitis ist eine allgemeine und weltweit ver breitete Katzenkrankheit, die durch ein α-Herpesvirus verur sacht wird, das mit Katzen-Herpesvirus Typ 1 (FHV-1) be zeichnet wird. FHV-1 etabliert, wie andere Herpesviren, eine latente Infektion, die eine periodische Reaktivierung zur Folge hat (134). FHV-1-Infektionen in Brutkolonien sind durch eine hohe Todesrate bei jungen Katzen charakterisiert. Sekundärinfektionen der oberen Atemwege bewirken bei Erwach senen eine ziemliche Schwächung. Diese Krankheit versucht man zur Zeit durch die Verwendung modifizierter lebender oder inaktivierter Vakzine zu kontrollieren, die die Ent wicklung klinischer Anzeichen unterdrücken können, nicht aber die Infektion verhindern, wodurch es zu einer Virusaus scheidung kommt. Daher können vakzinierte Katzen ohne Symp tome virulentes Virus verbreiten, und latente Infektionen können nicht vermieden werden durch die existierenden Vak zine (135) oder durch die sich in der Entwicklung befinden den sicheren gereinigten Untereinheits-Vakzine (136, 137).

Herpesvirus-Glykoproteine sorgen für die Anheftung des Viri ons an die Wirtszelle und sind äußerst wichtig für die vi rale Infektivität (138, 139). Sie bestimmen ebenfalls die Sub-Typen-Spezifität des Virus (140). Herpesvirus-Glykopro tein-Antigene werden sowohl durch das humorale als auch durch das zelluläre Immunsystem erkannt, und es wurde ge zeigt, daß sie schützende Immunantworten in vakzinierten Wirten herbeiführen (44, 107, 141, 142). Es wurde gezeigt, daß FHV-1 mindestens 23 verschiedene Proteine enthält (143, 144). Mindestens 5 von ihnen mit angegebenen Molekulargewichten zwischen 120 kDa bis 60 kDa sind glykosyliert (144, 145). Es wurde gezeigt, daß die FHV-1-Glykoproteine immunogen sind (143, 145).

FHV-1 scheint, wie eins Reihe anderer α-Herpesviren, ein mit dem Glykoprotein B (gB) vom HSV-1 homologes Protein zu be sitzen. Eine partielle Sequenz des FHV-1-gB-Gens wurde kürz lich mitgeteilt (146). HSV-1 gB wird für das Hineingelangen des Virus und zur Zellfusion benötigt (147-149). Es wurde gezeigt, daß HSV-1 gB und die gB-Analogen der anderen Her pesviren einen wichtigen zirkulierenden Antikörper ebenso hervorrufen wie zellvermittelte Immunantworten (8, 10, 37, 47, 73, 150). Das FHV-1 gB Glykoprotein ist ein 134 kDa-Komplex, der mit β-Mercaptoethanol in zwei Glykoproteine von 76 kDa und 60 kDa dissoziiert wird. Das FHV-1 DNA-Genom hat eine Größe von ungefähr 134 kb (153).

Epstein-Barr-Virus (EBV), ein menschliches B-lymphotropes Herpesvirus, ist ein Mitglied der Gattung Lymphocryptovirus, das zur Subfamilie gamma-Herpesvirus gehört (115). Es ist der Erreger von infektiöser Mononucleose (154) und von B- Zell-Lymphomen (156). EBV ist mit zwei menschlichen malignen Erkrankungen assoziiert: dem endemischen Burkitt's Lymphom, und dem undifferenzierten nasopharyngealen Karzinom (156).

Seit das EBV-Genom (207) wie auch die Genome von VZV (66) und HSV1 (158) vollständig sequenziert war, sind vielfältige Homologien zwischen diesen verschiedenen Herpesviren be schrieben worden (159). In einigen Fällen sind diese Homolo gien benutzt worden, um die potentiellen Funktionen von einigen offenen Leserahmen (ORFs) von EBV vorauszusagen. Die mit HSV1 homologen EBV-Gene, die bei der Immunität eine Rolle spielen, sind von besonderem Interesse. So weisen das EBV BALF4-Gen Homologien mit HSV1 gB (68) und das EBV BXLF2- Gen mit HSV1 gH (161) auf. Schließlich enthält das EBV BBRF3-Gen Homologien mit einem CMV-Membranprotein (162).

Unter den EBV-Proteinen sind die am besten charakterisierten potentiellen Vakzinierungsmittel die beiden Haupthüll-Glyko proteine gp340 und gp220. Sie sind durch Spleißen ohne eine Änderung des Leserahmens vom selben Gen abgeleitet (163, 164). Gegen gp340 gerichtete monoclonale Antikörper und polyclonale Seren neutralisieren EBV in vitro (165). Der Cottontop-Tamarin, das einzig susceptible Tier, kann man durch eine Immunisierung mit dem gereinigten gp340 (166) und mit einem rekombinanten EBV gp340 Vaccinia-Virus (167) schützen. In diesem Fall wird der Schutz durch eine Rekom binante erreicht, die sich vom Vaccinia-Stamm WR ableitet, aber nicht durch eine Rekombinante, die sich vom Vaccinia- Stamm Wyeth ableitet. Der Wyeth-Stamm ist ein vielfach be nutzter Vakzinstamm.

Monoclonale Antikörper, die gegen gp85, das EBV-Homologe, zu HSV1 gH, gerichtet sind, sind als in vitro neutralisierende Antikörper beschrieben worden (168, 169).

Menschliches Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Mitglied der beta-Herpesviridae-Subfamilie (Familie Herpesviridae). HCMV kann angesichts einer wirksamen spezifischen Immunität eine produktive persistierende Infektion hervorbringen. Sogar wenn HCMV für gewöhnlich eine niedrige Pathogenität besitzt, verursacht eine intrauterine Infektion Hirnschäden oder Taubheit bei ungefähr 0,15% aller Neugeborenen und stellt die am meisten vorkommende infektiöse Komplikation bei Or gantransplantationen dar (170). Obwohl die Wirksamkeit eines experimentellen lebend attenuierten (Stamm Towne) HCMV-Vak zins nachgewiesen wurde (171), haben Bedenken gegen lebende Vakzinstämme zu Anstrengungen geführt, die als Unterein heitsvakzine verwendbaren HCMV-Proteine zu identifizieren. In dieser Hinsicht ist die Identifizierung von Virion-Glyko proteinen und ihre Bewertung als Schutzstoffe ein wichtiger Schritt.

Drei mit der HCMV-Hülle assoziierte verschiedene Familien von Glykoproteinen sind beschrieben (172): gCI (gp55 und gp93-130); gCII (gp47-52) und gCIII (gp85-p145).

Das gCI codierende Gen ist homolog mit HSVI gB. Die gCII Glykoproteine werden von einer Familie von fünf Genen (HXLF) codiert, die tandemartig angeordnet sind und ein oder zwei homologe Bereiche miteinander teilen. Wahrscheinlicher wird gCII nur von einem dieser beiden Gene codiert (172, 173). Das gCIII codierende Gen ist mit HSVI gH homolog (174).

Es sind in vitro neutralisierende spezifisch gegen jede die ser Familien gerichtete Antikörper beschrieben worden (174- 176).

Geeignete modifizierte Pockenvirus-Mutanten, die exogene Pferde-Herpesvirus-Gene tragen, die in einem Wirtsorganismus als eine antigene Determinante die Produktion von Antikör pern gegen Herpesvirus-Antigene durch den Wirtsorganismus hervorrufen, stellen neue Vakzine dar, die die Nachteile der herkömmlichen Vakzine vermeiden, die abgetötete oder attenu ierte Lebend-Organismen verwenden. So benötigt man z. B. für die Herstellung von Vakzinen aus abgetöteten Organismen das Züchten einer großen Menge der Organismen mit einer an schließenden Behandlung, die selektiv ihre Infektiösität zerstört, ohne ihre Antigenität zu beeinträchtigen. Anderer seits besteht bei Vakzinen, die attenuierte Lebendorganismen enthalten, immer die Möglichkeit einer Reversion des attenu ierten Organismus in einen pathogenen Zustand. Im Gegensatz dazu wird die Möglichkeit einer Reversion zu einem pathoge nen Organismus vermieden, wenn ein rekombinantes Pockenvirus in geeigneter Weise mit einem Pferde-Herpesvirus-Gen modifi ziert ist, das eine antigene Determinante eines krankheits erregenden Herpesvirus codiert, da das Pockenvirus nur das Gen enthält, das die antigene Determinante des Krankheitser regers codiert und nicht die genetischen Anteile des Orga nismus, die zur Replikation des Pathogens verantwortlich sind.

PRV infiziert viele Säugetierarten (Vieh, Hunde, usw.) töd lich. Erwachsene Schweine jedoch überleben für gewöhnlich die Infektion und stellen damit ein wichtiges Virusreservoir dar. Da PRV ernsthafte ökonomische Verluste verursacht, wird eine Vakzinierung von Schweinen mit attenuierten oder abge töteten Vakzinen in vielen Ländern vorgenommen.

Es sind Versuche unternommen worden, beim Schwein durch ak tive Immunisierung mit modifizierten lebenden oder inakti vierten Vakzinen die PRV-Infektion zu kontrollieren und öko nomische Verluste zu vermindern. Attenuierte Vakzine, die für gewöhnlich eine langandauernde Immunität induzieren und preisgünstig sind, weisen das Risiko einer ungenügenden At tenuierung oder genetische Instabilität auf. Inaktivierte Vakzine sind weniger effizient, benötigen mehrere Immunisie rungen und enthalten normalerweise wirksame Adjuvantien. Diese letzteren Verabreichungsformen können nach der Vakzi nierung allergische Reaktionen, wie Appetitlosigkeit, er höhte Temperatur oder Fehlgeburt bei trächtigen Säuen her vorrufen. Diese Vakzin-Typen leiden ebenfalls unter gewissen Nachteilen bezüglich der Vermeidung latenter Infektionen, der Überwindung der Wirkung maternaler Antikörper auf die Vakzinierungswirksamkeit und der Beseitigung der potentiel len Verwendung eines serologischen diagnostischen Tests zur Unterscheidung von vakzinierten Tieren von den vorher mit PRV infizierten.

Alternative Vakzinierungsstrategien, wie die Verwendung re kombinanter Pockenviren, die immunologisch relevante PRV- Genprodukte exprimieren, würden gewisse Vorteile aufweisen. Sie würden: (a) lebend attenuierte PRV-Vakzinstämme aus dem Bereich beseitigen; und (b) die Unterscheidung zwischen vak zinierten und infizierten oder seropositiven Tieren erlau ben. Das letztere ließe sich durch die Verwendung geeigneter Diagnosemittel erreichen, die vakzinierte Tiere genau von natürlich infizierten unterscheiden würden. Dies ist wegen der bestehenden Bestimmungen, die den Transport seropositi ver Tiere kontrollieren, eine wichtige Überlegung. Ferner ist eine Vakzinierung ökonomischer und dem Testen und Aus sondern infizierter Tiere von der Menge vorzuziehen. Zur Entwicklung solcher Vakzine muß man die Beiträge kennen, die die geeigneten PRV-Antigene zur Induktion der Schutz-Immuni tät leisten. Im Falle von PRV sind, wie bei anderen Mitglie dern der Herpesvirus-Familie, die Glykoproteine wichtige Kandidaten für Antigene in einem wirksamen rekombinanten Untereinheitsvakzin.

Die Technik zur Erzeugung von Vaccinia-Virus-Rekombinanten ist kürzlich auf andere Mitglieder der Pockenvirusfamilie ausgedehnt worden, die einen eingeschränkteren Wirtsbereich aufweisen. Insbesondere Vogelpockenviren, die in Vogelarten replizieren, sind so manipuliert worden, daß sie immunolo gisch relevante Genprodukte exprimieren. Die Inoculation von Vogel- (42, 177) und Nicht-Vogelarten (41) mit rekombinanten Vogelpockenviren rief Immunschutzreaktionen gegen das korre spondierende Pathogen hervor.

Attenuierte Lebendvakzine und inaktivierte Vakzine gegen BHV1 sind seit mehr als 30 Jahren verfügbar und haben er folgreich das Auftreten von BHV1 verwandten Erkrankungen vermindert. Diese Vakzine verhindern jedoch nicht eine la tente Infektion oder eine erneute Infektion mit dem Wildtyp virus. Außerdem machen sie die Unterscheidung zwischen infi zierten und vakzinierten Tieren kompliziert.

Beide Vakzintypen haben andere signifikante Nachteile. Eine Vakzinierung von trächtigen Kühen mit attenuierten Lebend vakzinen kann den Tod des Fötus verursachen und zu einer an schließenden Fehlgeburt führen (127). Außerdem ist gezeigt worden, daß vakzinierte Tiere Virus ausscheiden (178). Des halb können vakzinierte Tiere, die mit trächtigen Kühen zu sammengehalten werden, infektiöses Virus auf das trächtige Tier übertragen und einen Abort des Fötus verursachen.

Inaktivierte Vakzine induzieren weder Fehlgeburten noch ru fen sie eine Virusausscheidung hervor. Sie verlangen jedoch die Verwendung von Adjuvantien und können tödliche hypersen sitive Reaktionen (Anaphylaxe) und nicht-tödliche Entzündun gen und Fieber hervorrufen (179).

Einer der wichtigeren Anhaltspunkte bei der Vakzinierung ist die Überwindung oder Vermeidung maternaler Immunität. In dieser Hinsicht wird, wenn ein Muttertier gegen ein bestimm tes Pathogen immun ist, die "Immunität" des Muttertiers mit tels der im Kolostrum und/oder auf zusätzlichen Wegen auf das Neugeborene übertragen. Dennoch kann das Neugeborene nicht erfolgreich vakziniert werden, bis das Niveau der ma ternalen Immunität genügend zurückgegangen ist. Es gibt da her einen engen Bereich, in dem das Neugeborene in Gegenwart der zurückgehenden maternalen Immunität erfolgreich vakzi niert werden kann.

Es läßt sich daher einsehen, daß die Bereitstellung von re kombinantem Herpesvirus-Pockenvirus oder von Vakzinen, die eine schützende Immunität gegen Herpesvirus-Infektionen lie fern und die dem Stand der Technik die Vorteile einer Le bendvirusinokulation verleihen, die aber die vorstehend dis kutierten Probleme vermindern oder beseitigen, einen sehr erwünschten Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik darstellen würde.

Aufgaben der Erfindung

Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung, rekombinante Pockenviren, die Herpesvirus-Genprodukte exprimieren, und ein Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanten Pocken viren bereitzustellen.

Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung, die Clonierung und Expression von Herpesvirus codierenden Sequenzen in einem Pockenvirus-Vektor, insbesondere einem Vaccinia-Vi rus-, Geflügelpockenvirus- oder Kanarienvirus-Vektor, be reitzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Vakzin be reitzustellen, das in der Lage ist, Herpesvirus neutralisie rende Antikörper und eine schützende Immunität gegen einen tödlichen Herpesvirusangriff hervorzurufen.

Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Er findung werden klarer unter Berücksichtigung des Folgenden.

Gegenstand der Erfindung

Unter einem Gesichtspunkt betrifft die Vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das in einem nicht essentiel len Bereich des Pockenvirusgenoms und stromabwärts einer Promotor sequenz, die fähig ist, die Expression des von der DNA-Insertion codierten Proteins durch das rekombinante Virus in einem Wirt zu fördern, eine DNA- Insertion enthält, die ein Herpesvirus-Glykoprotein codiert.

Vorteilhafterweise ist das Herpesvirus ein Mitglied der α-Herpesvirus-, β-Herpesvirus- oder γ-Herpesvi rus-Subfamilie.

Das Herpesvirus-Glykoprotein ist ausgewählt aus dem Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp13, einem wirksamen Bereich des Pferde-Herpesvirus-Glykoproteins gp14, der ein am N- Terminus verkürztes Glykoprotein gp14 mit einer Deletion der Aminosäure 2 bis zu einer beliebigen Aminosäure zwischen der Aminosäure 2 bis einschließlich der Aminosäure 62 ist, dem Pseudorabiesvirus-Glykoprotein gpII, dem Katzen-Herpesvirus- Glykoprotein gB und dem Epstein-Barr-Virus-Glykoprotein gp220, gB oder gH.

Das rekombinante Pockenvirus exprimiert erfindungsgemäß Gen produkte des fremden Herpesvirus-Gens. Insbesondere codiert die fremde DNA-Sequenz ein Herpesvirus-Glykoprotein, und die fremde DNA wird im Wirtsorganismus durch die Produktion des Herpesvirus-Glykoproteins exprimiert. Vorteilhafterweise werden durch das rekombinante Pockenvirus im Wirtsorganismus eine Vielzahl von Herpesvirus-Glykoproteinen coexprimiert. Das Pockenvirus ist vorteilhafter Weise ein Vaccinia-Virus oder ein Vogelpockenvirus, wie Geflügelpocken- oder Kana rienpockenvirus.

Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung oder ein Vakzin zur Induktion einer antigenen und/oder immunologischen Antwort in einem mit dem Vakzin inoculierten Wirtstier, wobei das Vak zin einen Träger und ein rekombinantes Pockenvirus ein schließt, daß in einen nicht essentiellen Bereich Herpesvi rus-DNA enthält. Genauer gesagt, codiert und exprimiert die DNA ein Herpesvirus-Glykoprotein. Vorteilhafterweise werden durch das Pockenvirus in dem Wirt eine Vielzahl von Herpes virus-Glykoproteinen coexprimiert. Das in dem Vakzin erfin dungsgemäß verwendete Pockenvirus ist vorteilhafterweise ein Vaccinia-Virus oder Vogelpockenvirus, wie Geflügelpockenvi rus oder Kanarienpockenvirus.

Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung Mechanismen zur Umgehung der Folge maternaler Im munität. Wenn die Barriere durch das Vorhandensein von Anti körpern gegen ein gegebenes Antigen(e) verursacht ist, kann die Barriere der maternalen Immunität überwunden oder ver mieden werden durch die selektive Verwendung von Vektoren, die definierte Teilsätze von Antigenen exprimieren. Zum Bei spiel kann das trächtige Tier mit einem rekombinanten Vacci nia-Virus vakziniert werden, das das Pseudorabies-Virus-Gly koprotein gp50 exprimiert und die Nachkommenschaft kann bei der Geburt oder kurz danach mit rekombinanten Vaccinia vac ciniert werden, das andere Pseudorabies-Virus-Glykoproteine, gpII oder gpIII, oder eine Kombination von ihnen exprimiert. Wenn auf der anderen Seite die durch die maternale Immunität vorhandene Barriere durch den Vektor verursacht wird, kann man das Muttertier unterscheidbar mit einem Vektor (Vaccinia oder Vogelpocken) und die Nachkommenschaft mit dem anderen Vektor vakzinieren. Dieses Verfahren bezieht sich natürlich nicht nur auf die Verwendung verschiedener Vektoren, sondern auch auf Vektoren, die eine unterschiedliche Konstellation von Glykoproteinen exprimieren. Somit betrifft die vorlie gende Erfindung ein Verfahren zur Überwindung oder zum Ver meiden maternaler Immunität, die andernfalls eine erfolgrei che Immunisierung einer neugeborenen Nachkommenschaft ver hindern würde. Erfindungsgemäß wird die neugeborene Nachkom menschaft mit einem rekombinanten Pockenvirus inoculiert, das in einem nicht essentiellen Bereich des Pockenvirusge noms DNA aus einer Nicht-Pockenquelle enthält, wobei diese DNA ein erstes Antigen eines Pathogens der neugeborenen Nachkommenschaft codiert, und dieses Antigen vom zweiten, zum selben Pathogen gehörenden Antigen verschieden ist, das verwendet wurde, um eine Immunantwort gegen dasselbe Patho gen im Muttertier der neugeborenen Nachkommenschaft zu induzieren. Die neugeborene Nachkommenschaft wird erfin dungsgemäß ebenfalls in einem ersten rekombinanten Pockenvi rus inoculiert, der DNA aus einer Nicht-Pockenquelle in einen nicht essentiellen Bereich des ersten Pockenvirusge noms enthält, wobei diese DNA als Antigen eines Pathogens der neugeborenen Nachkommenschaft codiert und dieses erste Pockenvirus verschieden ist von einem zweiten rekombinanten Pockenvirus, was zur Induktion einer Immunantwort im Muttertier der neugeborenen Nachkommenschaft verwendet wurde.

Somit betrifft die Erfindung ein Inoculationskit zur Inoculation einer neugeborenen Nachkommenschaft und der Mutter dieser Nachkommenschaft zur Vermeidung einer maternalen Immunität in der Nachkommenschaft, wobei das Kit eine erste Vakzine zur Inoculation der Mutter vor der Niederkunft der Nachkommenschaft und eine zweite Vakzine zur Inoculation der neugeborenen Nachkommenschaft enthält, wobei die erste Vakzine ein erstes rekombinantes Pockenvirus gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält, das bei der Inoculation der Mutter zur Expression des insertierten Herpesvirus-Glykoproteins fähig ist und wobei die zweite Vakzine ein zweites rekombinantes Pockenvirus gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält, das bei der Inoculation der Nachkommenschaft zur Expression des insertierten Herpesvirus- Glykoprotein fähig ist, wobei das erste und zweite Herpesvirus- Glykoprotein gleich sind und das erste und zweite rekombinante Pockenvirus verschiedene rekombinante Pockenviren sind, die jedes zur Induktion einer immunologischen Antwort auf das gleiche erste und zweite Herpesvirus-Glykoprotein fähig sind, oder wobei das erste und zweite Herpesvirus- Glykoprotein verschieden, aber vom gleichen Pathogen sind und das erste und zweite rekombinante Pockenvirus die gleichen rekombinanten Pockenviren sind, die jedes zur Induktion einer immunologischen Antwort auf das entsprechende Herpesvirus-Glykoprotein fähig sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die begleitenden Zeichnungen verwiesen.

Fig. 1 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP425;

Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz eines 1,88 kb-Fragmentes von EHV-1, das die gp13 codierenden Sequenzen enthält;

Fig. 3 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP483, das das EHV-1 gp13-Gen enthält;

Fig. 4 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP458;

Fig. 5 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP577, das das EHV-1 gp14-Gen enthält;

Fig. 6 zeigt die DNA-Sequenz eines 3,35 kb-Fragments von EHV-1, das die gp14 codierende Sequenz enthält;

Fig. 7 ist eine Darstellung der relativen Hydrophilizität der EHV-1 gp14 codierenden Sequenzen;

Fig. 8 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Geflügelpockenvirus vFP44, das das EHV-1 gp13-Gen enthält;

Fig. 9 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Kanarienpockenvirus vCP48 zeigt, das das EHV-1 gp13-Gen enthält;

Fig. 10 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide pHES-MP63, pHES-MP1 und pHES-MP34, die modifizierte Versionen des EHV-1 gp14-Gens enthal ten;

Fig. 11 ist eine Karte der BamHI-Spaltstellen des EHV-1- Stammes Kentucky D, in der die invertierten Wieder holungen des Genoms durch Kästchen gekennzeichnet ist, die die Lage der sechs Haupt-EHV-1 Glykopro tein-Gene zeigen und eine Erweiterung des genomi schen Bereichs zeigt, die die Gene gD, gp63 und gE einschließt;

Fig. 12 zeigt die Nucleotidsequenz eines 6402 Basenpaar- Fragments von EHV-1, das die gD, gp63 und gE codie renden Sequenzen enthält;

Fig. 13 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz von 402 Aminosäuren, aus denen sich EHV-1 gD zusammensetzt;

Fig. 14 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz von 413 Aminosäuren, aus denen sich EHV-1 gp63 zusammen setzt;

Fig. 15 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz von 522 Aminosäuren, aus denen sich EHV-1 gE zusammensetzt;

Fig. 16 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide pJCA006, pJCA007 und pJCA008, die das EHV-1 gD-Gen bzw. das EHV-1 gE-Gen oder das EHV-1 gp63-Gen enthalten und die Erzeugung eines rekom binanten Vaccinia-Virus, das diese Gene enthält;

Fig. 17 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide pJCA009 (das die EHV-1 gD und pg63 enthält) und pJCA010 (das die EHV-1-Gene gD, gp63 und gE enthält), und die Erzeugung eines diese Gene enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 18 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids PR18, das das PRV gpII-Gen enthält, und die Erzeugung des das PRV gpII-Gen exprimieren den rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 19 zeigt die DNA-Sequenz des PRV gpII offenen Leserah mens;

Fig. 20 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids pPR24, das das PRV gpIII-Gen enthält, und die Erzeugung des das PRV gpIII-Gen exprimieren den rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 21 zeigt die DNA-Sequenz des PRV gpIII-offenen Leserah mens;

Fig. 22 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids pPR26, das das PRV gp50-Gen enthält und die Erzeugung des das PRV gp50-Gen exprimieren den rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 23 zeigt die DNA-Sequenz des PRV gp50 offenen Leserah mens;

Fig. 24 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pSD478VC und pSD479VCBG und zum Inserieren der β-Galactosidase in Vaccinia-Virus;

Fig. 25 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pMP13PP;

Fig. 26 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pFPPRVII, das das PRV gpII-Gen enthält;

Fig. 27 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Kanarienpockenvirus vCP55, das das PRV gpII-Gen exprimiert;

Fig. 28 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP717, das das PRV gI- Gen exprimiert;

Fig. 29 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP569 und vP734, die das HSV-2 gB-Gen exprimieren;

Fig. 30 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP579, vP748 und vP776, die das HSV-2 gC-Gen exprimieren;

Fig. 31 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP570, vP761, vP775 und vP777, die das HSV-2 gD-Gen exprimieren;

Fig. 32 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP637 und vP724, die das BHV-1 gI-Gen exprimieren;

Fig. 33 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids pJCA001, das das FHV-1-gB-Gen enthält, und zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia- Virus vP713, das das FHV-1 gB-Gen exprimiert;

Fig. 34 zeigt die Nucleotidsequenz des 3400 bp-Abschnittes der das Glykoprotein gB codierenden FHV-1 DNA;

Fig. 35 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz der 947 Aminosäuren, aus denen sich FHV-1 gB zusammensetzt;

Fig. 36 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide 409gp220, das das EBV gp220-Gen ent hält und 409gp340, das das EBV gp340-Gen enthält;

Fig. 37 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Vaccinia-Donorplasmids 409gB, das das EBV gB-Gen enthält;

Fig. 38 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Vaccinia-Donorplasmids 486gH, das das EBV gH-Gen enthält;

Fig. 39 zeigt schematisch die Struktur des Vaccinia-Donor plasmids 513gHgBgp340, das die EBV-Gene gp340, gB und gH enthält;

Fig. 40 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Vaccinia-Donorplasmids 409CMVgB, das das CMV gB-Gen enthält;

Fig. 41 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des HXLF1-Gens von HCMV (Stamm Towne); und

Fig. 42 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des HXLF2-Gens von HCMV (Stamm Towne).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ih rer vielen Vorteile erhält man durch die folgenden, der Er läuterung dienenden Beispiele.

Beispiel 1 Konstruktion von vaccinia-Virus-Rekombinanten, die das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp13 exprimieren

Substitution des HA-Gens von Vaccinia durch das E. coli β-Galactosidasegen. In diesem Beispiel wurde der von Rhone Merieux, Inc. (Athens, Georgia) erhaltene Vaccinia-Stamm Copenhagen verwendet. Das Virus wurde ausgehend von einem gereinigten Plaque-Isolat entweder auf VERO- (ATCC# CCL81) oder MRC-5- (ATCC# CCL171) Zellen in Eagle's minimalen es sentiellem Medium (MEM) mit zusätzlich 10% fötalem Rinder serum (FBS) vermehrt. Ein Abkömmling des Wildtyp-Virus, bei dem die gesamte das Thymidinkinasegen codierende Sequenz nach Standard-Verfahren (25, 28) deletiert war, wurde iso liert und mit vP410 bezeichnet. Diese Thymidinkinase-Dele tionsmutante wurde für weitere Manipulationen verwendet. Plasmide wurden konstruiert, abgesucht und nach Standardver fahren vermehrt (20, 27, 28).

Wie in Fig. 1 gezeigt, wurde das 13 kb SalI F-Fragment des Vaccinia-Virus, das sich über die HindIII A/B-Fragmentver bindung erstreckt, mit SalI gespaltenem pUC8 ligiert, wo durch pSD419VC erzeugt wurde. Der mit dem HindIII B-Teil des SalI F-Fragments korrespondierende rechte Arm von pSD419VC wurde durch Spaltung mit HindIII entfernt, und durch Re-Li gation wurde pSD456VC erzeugt. pSD456VC enthält somit das rechte Ende des HindIII A-Fragments, indem sich auf jeder Seite durch ungefähr 0,4 kb zusätzliche Vaccinia-Sequenzen flankiert, der vollständige codierende Bereich des Hämaglu tinin (HA)-Gens (35) befindet.

Um einen Plasmidvektor, praktisch ohne HA-codierende Sequen zen zu erzeugen, wurde pSD456VC (in einer partiellen Spal tung) an der RsaI-Stelle stromaufwärts des HA-Gens und bei der EagI-Stelle 80 bp vom 3'-Ende des HA-Gens gespalten. Das RsaI/EagI-Fragment mit ungefähr 3,5 kb wurde aus einem Aga rosegel isoliert.

Zum Ersetzen des Bereiches von RsaI-Stelle bis zur Position 2 stromaufwärts der HA-codierenden Sequenz, an die sich un mittelbar die Restriktionsstellen BglII, SmaI und PstI und ein adhäsives EagI-Ende anschließen, wurden die syntheti schen Oligonucleotide MPSYN59-62 hergestellt. Die Sequenz von MPSYN59-62 mit den Restriktionsstellen wie angegeben, lautet wie folgt:

Das aneinandergelagerte MPSYN59-62-Gemisch wurde mit dem 3,5 kb RsaI/EagI-Fragment von pSD456VC ligiert, womit pSD466VC erzeugt wurde. Somit ist das HA-Gen in pSD466VC durch einen Polylinkerbereich ersetzt worden.

Ein 3,2 kb BglII/BamHI (Partiellfragment), das das E. coli β-Galactosidasegen von pMC1871 (34) unter der Transkrip tionskontrolle des 11 kDa Vaccinia-Promotors (7) enthält, wurde in mit BglII gespaltenes pSD466VC cloniert. Ein Plas mid, das die 11 kDa-Promotor/β-Galactosidasegen-Kassette in einer Orientierung von links nach rechts bezüglich der flan kierenden Vaccinia-Arme enthielt, wurde mit pSD466VCBGA be zeichnet und mit der Thymidinkinase-Deletionsmutante vP410 des Vaccinia-Virusstammes Copenhagen rekombiniert, wodurch die β-Galactosidase exprimierende Vaccinia-Rekombinate vP425 erzeugt wurde. 80 Basenpaare am Carboxy-Terminus des HA-Gens wurden behalten, so daß ein kurzer von rechts nach links be züglich des Vaccinia-Genoms transkribierter potentieller of fener Leserahmen nicht auseinandergerissen wurde.

Das rekombinante Vaccinia-Virus vP425 (184) wurde wie von anderen beschrieben (9, 24), aufgrund der Bildung neuer Pla ques in Gegenwart des chromogenen Substrates X-gal identifi ziert. Eine Substitution des β-Galactosidasegens durch wie derum ein anderes fremdes Gen in folgenden Vaccinia-Rekom binanten ließe sich leicht auffinden durch Isolieren von farblosen Plaques anstelle blauer Plaques.

Zur Erleichterung zukünftiger Clonierungsschritte wurde die aus dem pUC8-Multiclonierungsbereich abgeleitete SmaI-Stelle entfernt durch Spaltung von pSD466VC mit BamHI/EcoRI, Stumpfendigmachen mit dem Klenow-Fragment von E. coli-Polyme rase und Re-ligieren. Somit liegt die einzige in dem resul tierenden Plasmid, pSD467VC, verbleibende SmaI-Stelle im Po lylinkerbereich der HA-Deletion.

Identifizierung der DNA-Sequenzen, die das EVH-1 gp13-Gen codieren. Die das Glykoprotein EHV-1 gp13 codierende DNA-Se quenz befindet sich in dem 7,3 kb BamHI-H-Fragment von EHV-1 (3). Nucleotidsequenzdaten für beide Stränge wurden vom pUC (BamHI-H)-Bereich erhalten durch die Benutzung überlappender Subclone unter Verwendung des modifizierten T7-Enzyms SEQUENASE (40) (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH). Standard Didesoxy-Kettenabbruchreaktionen (33) wurden an doppelsträn gigen Plasmidmatrizen vorgenommen, die in Alkali denaturiert worden waren. Um die Anfangssequenzen jedes Clones zu erhal ten, wurden die M13-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer verwen det. Maßgeschneiderte 16 bis 17 mer-Primer, die unter Anwen dung von Standardchemie synthetisiert wurden (Biosearch 8700, San Rafael, CA; Applied Biosystems 380B, Foster City, CA), wurden verwendet, um am übriggebliebenen Fragment ent langzuwandern. Bei allen Sequenzdatenanalysen (29) wurde das IBI-Pustell-Sequenzanalysenprogramm verwendet.

Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß es einen offenen Leserah men mit 1,404 bp gibt, der ein vorausgesagtes primäres Translationsprodukt von 50,9 kDa mit 468 Aminosäuren ergibt. Es wurde eine signifikante Aminosäurehomologie in der Car boxyhälfte des mutmaßlichen offenen Leserahmens gp13 mit gC des Herpes simplex-Virus Typ 1 und Typ 2, mit gIII des Pseu dorabies-Virus und gbV von Varicella zoster-Virus beobach tet, woraus sich schließen läßt, daß gp13 ein Mitglied der gC-artigen Glykoproteine von Herpesviren ist. Eine weitere detaillierte Analyse des EHV-1 gb13 offenen Leserahmens wur de in einer früheren Veröffentlichung (2) vorgenommen. Zur Vereinfachung der Beschreibung der Clonierung und Expression von EHV-1 gp13 in Vaccinia-Virus-Vektoren ist der offene Le serahmen gp13 mit zusätzlichen 5'- und 3'-Sequenzen in Fig. 2 gezeigt. In Fig. 2 sind eine mutmaßliche TATA-Box und Aminosäuren, die mutmaßliche Signale und Membran-Anker-Be standteile umfassen, unterstrichen. Die dem Spaltungssignal ASA (leere Kreise) folgende potentielle Spaltstelle der Sig nalsequenz ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Potentiell gibt es innerhalb der Signal- und Ankersequenzen neun durch das Asn-X-Ser/Thr-Motiv definierte N-verknüpfte Glykosylie rungsstellen (Sterne).

Clonierung des EHV-1 gp13-Gens in ein Vaccinia-Virus-Donor plasmid. Ein früh/später Vaccinia-Virus-Promotor, H6, wurde für die Expression fremder Gene in Geflügelpockenvirusvekto ren verwendet (41, 42). Dieses Promotorelement korrespondiert mit den DNA-Sequenzen unmittelbar stromaufwärts des offenen Leserahmens H6 im Vaccinia-HindIII-H-Fragment (31).

Wie in Fig. 3 gezeigt, wurden zum Mutieren und zum Inserie ren des H6-Promotors in pSD467VC die Oligonucleotide H6SYN Oligos A-D synthetisiert. Die Sequenz von H6SYN-Oligos A-D ist die folgende, wobei die modifizierten Basen unterstri chen und die Restriktionsstellen angegeben sind:

Die unterstrichenen Basen geben eine Modifikation der nati ven H6-Promotorsequenz an.

Die doppelsträngige DNA mit einer Gesamtlänge von 130 bp, die sich durch Aneinanderlagern der H6SYN-Oligos A-D bil dete, wurde durch Elektroelution aus einem Agarosegel gerei nigt und mit den 0,5 kb SmaI/HindIII- und 3,1 kb BglII/HindIII-Fragmenten, die aus pSD467VC abgeleitet waren, ligiert. Im resultierenden Plasmid, pTP15 (184) ist das In itiationscodon ATG in CCC als Teil der SmaI-Stelle verän dert, der sich unmittelbar eine PstI-Stelle anschließt. Ein NsiI-Linker, 5'-TGCATGCATGCA-3', (New England Biolabs, Bebverly, Ma) wurde in die SmaI-Stelle von pTP15 inseriert, um das Plasmid pNSI zu erzeugen.

Ein EHV-1 EcoRI/NarI-Fragment, in dem die EcoRI-Stelle 120 bp stromaufwärts des ATG-Initiationscodons liegt, und in dem die NarI-Stelle 23 bp stromaufwärts des TAG-Terminationsco dons von EHV-1 gp13 liegt, wurde in den Phagen M13mp19 clo niert, um den rekombinanten Phagen M13EcoRNar zu erzeugen. Durch Anwendung Oligonucleotid-gerichteter Mutagenese (17) wurde eine NsiI-Stelle eingeführt durch Verändern der Se quenz TTGCCT (Basen 130-135 in Fig. 2) im EHV-1 gp13-Gen in ATGCAT. Das EcoRI/NarI-Fragment des mutierten Phagen M13EcoRNar wurde in die EcoRI/NarI-Stellen in pUC8 cloniert, wodurch das Plasmid pNSIEN erzeugt wurde.

Zwei 42-mere Oligonucleotide wurden synthetisiert, die die nachstehend aufgeführte Sequenz besitzen, wobei Restrik tionsstellen aufgeführt sind:

In diesem Oligonucleotid schließt sich an das Terminations codon (TAG) unmittelbar ein früher Vaccinia-Transkriptions- Terininator (ATTTTTAT) an. Das durch Aneinanderlagern des 42- mer Paares erhaltene doppelsträngige DNA-Fragment enthält ein NarI adhäsives Ende, dem sich das 3'-Ende der das EHV-1 gp13 Gen codierenden Sequenz ebenso anschließt, wie ein frü hes Vaccinia-Transkriptions-Terminationssignal (45), eine PstI-Stelle und ein adhäsives NdeI-Ende. Dieses Fragment wurde zwischen die NarI/NdeI-Stellen von pNSIEN inseriert, wodurch pNSIENPN erzeugt wurde (Fig. 3).

Das NsiI/PstI-Fragment aus pNSIENPN wurde isoliert und in die NsiI/PstI-Stellen des Plasmids pNSI cloniert, wodurch das Plasmid pVHA6g13NsiI erzeugt wurde (Fig. 3). pVHA6g13NsiI wurde gespalten in der EcoRV-Stelle des H6-Pro motors und in der NsiI-Stelle, die nahe des Beginns des EHV-1 gp13-Gens eingeführt worden war. Dieses Vektorfragment wurde mit Mungobohnen-Nuclease stumpfendig gemacht. Es wur den zwei komplementäre 32-mer Oligonucleotide synthetisiert, die die Sequenz besitzen, die nachfolgend zusammen mit Re striktionsstellen aufgeführt ist:

Diese Oligonucleotide wurden aneinandergelagert und mit dem Vektorfragment pVHA6g13NsiI ligiert, um das Plasmid pVHA6g13 herzustellen, das eine genaue Verbindung am ATG-Initiations codon (in der 32-mer Sequenz unterstrichen) des H6-Promotors und des EHV-1 gp13-Gens enthält (Fig. 3).

Mit vP425 infizierte Zellen wurden mit pVHA6g13 transfi ziert, um die Vaccinia-Rekombinante vp4383 zu erzeugen, die das EHV-1 gp13-Gen enthält (Fig. 3).

Konstruktion von Vaccinia-Virus-Rekombinanten

Verfahren zur Transfektion von mit einem Rettungs-Vaccinia- Virus infizierten Gewebekulturzellen mit rekombinanten Do norplasmiden und die Identifizierung von Rekombinanten durch in situ-Hybridisierung auf Nitrocellulosefiltern wurden, wie früher beschrieben, durchgeführt (25, 28). Zur Konstruktion von vP425, in der das E. coli β-Galactosidasegen die HA-co dierenden Vaccinia-Sequenzen ersetzt, wurde die Plasmid-DNA (25 µg pSD466VCBGA in HeBS (16)) in VERO-Zellen elektropu riert (BioRad Gene Pulser, Kapazitanz 960, 200 Volt). Zel leinzelschichten unterhalb der Konfluenz wurden mit 10 pfu/Zelle vP410 1 Stunde vor der Verwendung infiziert. Die infizierten Zellen wurden mit Trypsin geerntet und vor der Elektroporation mit HeBS gewaschen. Die Zellen wurden 24 Stunden bei 37°C in MEM + 5% fötalem Rinderserum inkubiert, geerntet, und die Virusnachkommenschaft wurde auf VERO-Ein zelzellschichten plattiert. Rekombinante β-Galactosidase ex primierende Viren wurden als blaue Plaques in Gegenwart des Substrates X-gal aufgefunden (9, 24). Um ein rekombinantes Vaccinia-Virus zu erzeugen, bei dem das EHV-1 gp13-Gen das β-Galactosidasegen in vP425 ersetzte, wurde in ähnlicher Weise vorgegangen, außer daß das Donorplasmid pVHA6g13 und der Rettungs-Virus vP425 waren. Die Vaccinia-Rekombinante vP483, die EHV-1 gp13 enthielt, wurde als farbloser Plaque in Gegenwart von X-gal nachgewiesen und durch DNA-Hybridi sierung nach der Plaquereinigung über drei Cyclen als die richtige Rekombinante bestätigt.

Expression des EHV-1 gp13-Gens auf der Oberfläche von Zel len, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP483 infi ziert waren.

BSC-40-Zellen wurden auf 22 mm Glasdeckgläsern in 35 mm Schalen mit 5 × 10⁵-Zellen/Schale ausgesät. Bei ungefähr 80% Konfluenz wurden die Zellen mit 2 pfu/Zelle infiziert. Nach einer 1-stündigen Adsorptionszeit wurde das Virusinocu lum entfernt und MEM + 2% fötales Rinderserum zugegeben. 20 Stunden nach der Infektion wurden die Deckgläschen mit Phos phat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, die 0,2% BSA und 0,1% NaN₃ enthielt (PBS+) und 0,1 ml des monoclonalen anti-gp13-Antikörpers, 14 Hz (3) ausgesetzt, der eins zu tau send in PBS+ verdünnt war. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer feucht gehaltenen Kammer wurden die Zellen dreimal in PBS+ gewaschen. Diese Prozedur wurde mit Fluorescein- Isothiocyanat konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG wiederholt. Schließlich wurden die Zellen 20 Minuten in 2%igem Paraform aldehyd in PBS fixiert. Die Deckgläschen wurden in 80% Gly cerin in PBS gebracht, die 3% n-Propylgallat enthielt, und die Fluoreszenz wurde mit einem Mikroskop beobachtet.

Das aus der DNA-Sequenz vorhergesagte Protein hat die typi schen Eigenschaften, die charakteristisch für ein sich über die Membran erstreckendes Glykoprotein sind (14). In einer produktiven EHV-1-Infektion wird dieses gp13-Glykoprotein in die verschiedenen Membransysteme der Zelle eingebaut und wird in die cytoplasmatische Membran transportiert und ist auf der äußeren Oberfläche der infizierten Zelle nachweis bar. Zusätzlich ist EHV-1 gp13 ein Bestandteil des EHV-1 Vi rions. Es wurden deshalb Immunfluoreszenzuntersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob das durch die Vaccinia-Vi rus-Rekombinante vP483 exprimierte EHV-1 gp13 sich in ähnli cher Weise auf der cytoplasmatischen Membran der infizierten Zelle darstellt. Spezifische monoclonale anti-gp13-Antikör per, denen Fluorescein konjugierte Ziegen-anti-Maus-IgG nachfolgten, brachten eine starke Membran-Immunfluoreszenz in vP483-infizierten Zellen, nicht aber in mit dem Vaccinia- Virus vP410 infizierten Zellen. Dies legt nahe, daß das vom rekombinanten Vaccinia-Virus vP483 exprimierte EHV-1 gp13 sich so auf der cytoplasmatischen Membran präsentierte, wie man es für die authentische Synthese eines sich über die Membran erstreckenden Glykoproteins erwartet.

Immunpräzipitation von EHV-1 gp13-Produkten, die von mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP483 infizierten Zellen syn thetisiert wurden.

Zwei Millionen Zellen, die eine konfluente Einzelschicht in einer 60 mm Schale bildeten, wurden mit 10 pfu/Zelle infi ziert. Die Inoculation wurde in methioninfreiem Medium vor genommen. Nach der Adsorptionsperiode wurde das Inoculum entfernt und 2 ml methioninfreies Medium, das 20 µCi/ml ³⁵S- Methionin enthielt, wurden zugegeben. Das Fortschreiten der Infektion wurde 24 Stunden zugelassen. Dann wurden die Zel len lysiert durch Zugabe von 1 ml 3 × Puffer A, der 3% NP- 40, 30 mM Tris pH 7,4, 450 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,03% Natri umazid und 0,6 mg/ml PMSF enthielt. Die lysierten Zellen und der Überstand wurden geerntet, auf dem Vortex gemischt und durch 15 Minuten Zentrifugation bei 10000 g geklärt.

Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Katalog Nr. 17.0780.01) wurde als eine 1 : 1-Aufschlämmung in 1X Puffer A zubereitet. Ein Ratten-anti-Maus-Konjugat (Boehringer Mann heim, Katalog Nr. 605 500) wurde 1 : 100 in der Aufschlämmung verdünnt und unter 4-stündigem vorsichtigen Schütteln bei Raumtemperatur an die Kügelchen gebunden. Die Kügelchen wur den dann sorgfältig 6 mal mit je 1 ml Puffer A gewaschen, um nicht gebundenes Konjugat zu entfernen. Dann wurde ein für gp13 spezifischer monoclonaler Antikörper 4 Stunden bei Raumtemperatur an die Kügelchen gebunden. Die überschüssigen Antikörper wurden durch sorgfältiges Waschen entfernt. 1 ml des geklärten infizierten Zellysats wurde durch Inkubation mit Protein A-Sepharosekügelchen, an die normales Mausserum gebunden worden war, vorgereinigt. Diese Kügelchen wurden durch Zentrifugation entfernt. 1 ml des geklärten vorgerei nigten Lysates wurden dann mit 100 µl der Kügelchen ge mischt, an die der spezifische monoclonale Antikörper gebun den worden war. Dieses Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtem peratur vorsichtig geschüttelt. Die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation entfernt und viermal sorgfältig in 1X Puffer A und zweimal in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4, der 0,2 M LiCl und 2 M Harnstoff enthielt, gewaschen. Der Antikörper- Antigen-Komplex wurde dann durch die Zugabe von 50 µl 2x Laemmli-Aufbrechlösung (60, 195) von den Kügelchen abgelöst und auseinandergerissen. Vor der Elektrophorese wurde die Probe dann 5 Minuten gekocht.

Zwei Produkte mit ungefähr 44 und 47 kDa, die etwas kleiner als das vorhergesagte primäre Translationsprodukt (51 kDa) sind und ein größeres Produkt mit ungefähr 90 kDA, das im Einklang mit einer vollständig glykosylierten Form des EHV-1 gp13-Genproduktes ist, lassen sich nachweisen. Aus mit Vaccinia-Virus infizierten Kontrollzellen wurden keine äquivalenten Polypeptide präzipitiert.

Beispiel 2 Konstruktion von Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp14 exprimieren Ersatz des M2L-Gens in Vaccinia-Virus durch das E. coli β- Galactosidasegen.

Um die EHV-1 gp14-codierenden Sequenzen in einen Vaccinia- Virus-Vektor zu inserieren, wurde das rekombinante Vaccinia- Virus vP485, das das E. coli LacZ-Gen exprimiert, konstru iert. Die Substitution der LacZ-codierenden Sequenzen im re kombinanten Virus vP458 durch EHV-1 gp14 codierende Sequen zen erlaubt die Verwendung eines Blau-nach-Farblos-Plaque- Screening-Systems zur Identifizierung rekombinanter EHV-1 gp14 enthaltender Viren (9, 24) in Gegenwart von X-gal, einem chromogenen Substrat der β-Galactosidase. Ferner wurde ein Insertionsort für EHV-1 gp14 neben dem in Beispiel 13 für die Insertion von EHV-1 gp13 in Beispiel 1 verwendeten dele tierten Hämagglutinin-Ort im M2L-Ort von HindIII M herge stellt, mit der Absicht, Vaccinia-Virus-Rekombinante zu konstruieren, die sowohl EHV-1 gp14 als auch EHV-1 gp13 ex primieren. Im Vaccinia HindIII M-Fragment wurde die gesamte codierende Sequenz des M2L-Gens entfernt und durch das die β-Galactosidase codierende E. coli LacZ-Gen ersetzt. Die Clonierungsschritte zur Konstruktion von vP458 sind in Fig. 4 schematisch dargestellt.

Wie in Fig. 4 gezeigt, liegt ein offener von rechts nach links bezüglich des Vaccinia-Genoms gelesener offener Le serahmen, der ein mutmaßliches Protein mit 220 Aminosäuren codiert, ganz innerhalb des HindIII M-Fragments des Vacci nia-Virus-Stammes Copenhagen links der einzigen BglII- Stelle. Der Konvention entsprechend (31) wurde dieses Gen, das unmittelbar rechts von M1L (58) liegt, mit M2L bezeich net. Deletionsuntersuchungen am Vaccinia (WR)-Genom, die sich nach links von der einzigen BglII-Stelle in das HindIII-Fragment M erstrecken (57), zeigen, daß die im HindIII M links der BglII-Stelle enthaltenen codierenden Vaccinia-Sequenzen für die Replikation des Virus in Gewebe kultur nicht essentiell sind.

Um die Verwendung des M2L-Bereichs als Insertionsort für fremde Gene zu erleichtern, wurde der Plasmidvektor pMP409DVC, in dem die gesamte M2L-codierende Sequenz durch eine BglII-Stelle ersetzt war, wie folgt hergestellt. pSD409VC, das aus dem in die HindIII-Stelle von pUC8 clo nierte Copenhagen Vaccinia HindIII M-Fragment besteht, wurde mit BamHI/BglII gespalten und mit sich selbst ligiert, wo durch das rechte Ende von HindIII M entfernt und die BglII- Stelle zerstört wurde. Das resultierende Plasmid, pMP409BVC, wurde mit SohI linearisiert, das innerhalb des M2L-offenen Leserahmens schneidet, und 2 Minuten einem Bal-31 Exo nucleaseverdau unterworfen. Unter Verwendung des syntheti schen 49 mer

die BglII-Stelle ist unterstrichen) wurde eine Mutagenese mit der resultierenden DNA durchgeführt (19). In dem mutage nisierten Plasmid, pMP409DVC, sind die M2L-codierenden Se quenzen von der Position +3 bis zum Ende des offenen Le serahmens deletiert. Das G des Initiationscodons ATG wurde zu einem C geändert, um eine einzig vorkommende BglII-Stelle (AGATCT) an der Deletions-Verbindung zu schaffen.

In die einzig vorkommende BglII-Stelle von pMP409DVC wurde ein 3,2 kb BglII/BamHI (partiell)-Fragment cloniert, das 3,1 kb des E. coli β-Galactosidasegens zwischen den BamHI-Stel len von pMV1871 (34) unter der Transkriptionskontrolle des späten 11 kDA- 0,1 kb Vaccinia-Promotors (7) steht. Ein rekombinantes Plasmid, das die 11 kDA-Promotor/β-Galactosi dasegen-Kassette in einer Rechts-nach-links-Orientierung be züglich der flankierenden Vaccinia-Arme und des -Genoms von Vaccinia enthält, wurde mit pMP409DVCBG bezeichnet. pMP409DVCBG wurde als Donorplasmid zur Rekombination mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Rettungs-Vaccinia-Virus vP410 verwendet. Die neue, mit vP458 bezeichnete Vaccinia-Rekom binante, die das in den M2L-Deletionsort inserierte β-Galac tosidasegen exprimiert, wurde unter Verwendung des chromoge nen X-gal-Substrates entdeckt (9, 24) und durch wiederholte Plaque-Clonierung gereinigt.

Clonierung des EHV-1 gp14-Gens.

Wie in Fig. 5 gezeigt, erstreckt sich die EHV-1 gp14 codie rende Sequenz über die Verbindung zwischen den BamHI-Re striktionsfragmenten a und i (3). Die EHV-1-DNA-Fragmente BamHI-a (21,3 kb) und i (7,1 kb) (59) wurden aus Agarosege len isoliert. Das Plasmid pUC (BamHI-i) wurde durch Inserie ren des EHV-1-BamHI-i-Fragmentes in die BamHI-Stelle des Plasmids pUC8 konstruiert. Das EHV-1-BamHI-a-Fragment wurde mit EcoRI gespalten und in pUC8, das mit EcoRI/BamHI gespal ten worden war, ligiert. Das Plasmid pUC(BamHI-a/EcoRI) ent hält eine 10 kb EHV-1 BamHI/EcoRI-Insertion. Bei Zugrundele gung der berichteten Fragmentgrößebestimmungen (59) sind die DNA-Sequenzen in dieser Insertion denen des BamHI-i-Fragmen tes im EHV-1-Genom benachbart.

Nucleotidsequenzanalyse.

Unter Verwendung der verschiedenen Subclone der Plasmide pUC (BamHI-a/EcoRI) und pUC (BamHI-i) wurde eine Nucleotidse quenzanalyse durchgeführt. Die Sequenzierung des Plasmids pUC (BamHI-a/EcoRI) wurde an der BamHI-Stelle begonnen, weil das EHV-1 gp14-Gen sich über die BamHI-a/i-Verbindung er streckt (3). Die Orientierung des Plasmids pUC (BamHI-i) wurde durch Restriktionsenzymspaltung bestimmt. Da festge stellt wurde, daß der der EcoRI-Stelle in pUC (BamHI-i) nächstgelegene EHV-1-BamHI-Terminus die BamHI-Stelle an der BamHI-a/i-Verbindung ist, wurde die Sequenzierung des Frag ments von diesem BamHI-Ende her begonnen.

Sequenzdaten für beide Stränge wurden, wie in Beispiel 1 be schrieben, erhalten. Die die EHV-1 gp14 codierende Sequenz enthaltende Nucleotidsequenz des 3351 bp-Fragments ist in Fig. 6 gezeigt. Die Numerierung am linken und am rechten Rand bezieht sich auf die Aminosäure- bzw. auf die Nuclein säuresequenz. Die mutmaßlichen CAT- und TATA-Boxen sind unterstrichen. Aminosäuren im Signal- und im Membran-über spannenden Bereich sind ebenfalls unterstrichen, und ein Pfeil zeigt eine potentielle Signalpeptidspaltstelle an. Die dreizehn die Consensus-Sequenz (Asn-X-Ser/thr) verwendenden potentiellen Glykosylierungsstellen sind durch einen Stern gekennzeichnet.

Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen sich von den Nucleo tidpositionen 300 bis 3239 erstreckenden von links nach rechts relativ zum EHV-1-Genom gelesenen offenen Leserahmen, d. h. das ATG-Startcodon befand sich im BamHI-a/EcoRI-Frag ment und das Stopp-Codon TAA befand sich im BamHI-i-Fragment (3, 59).

Mutmaßliche Transkriptions-Regulationssignale wurden im Be reich 5'-seitig des ATG-Initiationscodons in Position 300 gefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz AATATAT (Nucleotide 148 bis 155) wurde 70 Nucleotide stromabwärts von der mut maßlichen CAT-Box in Position 71 bis 77, die die Sequenz GGTCAAT besaß, festgestellt. Ein Polyadenylierungssignal, AATAAA (Nucleotide 3251 bis 3256) wurde 8 Nucleotide stromabwärts des TAA-Terminationscodons (Nucleotide 3240 bis 3242) festgestellt. Neun der elf Nucleotide in der Sequenz 5'-TCCTGCGCGCA-3' (Nucleotide 218 bis 228) sind mit der 18S ribosomalen RNA-Sequenz 3'-AGGAAGGCGT-5' (61) komplementär und können als Ribosomenbindungsstelle dienen.

Analyse der EHV-1 gp14-Struktur.

Der offene Leserahmen EHV-1 gp14 codiert 980 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 2109,8 kDa. Eine Ana lyse der Aminosäuresequenz enthüllt eine Anzahl membranasso ziierten Glykoproteinen gemeinsamer Merkmalen. Ein sich von den Aminosäuren 58 bis 99 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird vorgeschlagen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz han delt (Fig. 6). Ein ungewöhnliches Merkmal des EHV-1 gp14- Genproduktes ist es, daß der langen hydrophoben Signalse quenz eine lange hydrophile Sequenz vorangeht. Dieses Cha rakteristikum ist ebenfalls für das Pseudorabies-Virus (PRV) gII- (62) und für das Rinder-Herpesvirus 1 (BHV-1) gI-Gen (63) beobachtet worden, die beide ebenfalls HSV gB-Homologe sind. Es wird angenommen, daß ein hydrophober, aus 45 Amino säuren bestehender Bereich (Aminosäuren 826 bis 870) als transmembrane Ankerdomäne funktioniert. Die hydrophile Cyto plasmadomäne enthält 110 Aminosäuren.

Es gibt elf Asn-X-Thr/Ser- (wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann) Stellen für potentielle N-verknüpfte Gly kosylierung (64). Es ist ein ungewöhnliches Merkmal, daß es ebenfalls zwei potentielle Glykosylierungsstellen in der cy toplasmatischen Domäne gibt (Fig. 6).

Ein Hydrophilizitäts-Diagramm der EHV-1 gp14 codierenden Se quenz ist in Fig. 7 gezeigt. Der hydrophobe Index von EHV-1 gp14 ist nach dem Verfahren von Kyte und Doolittle (65) mit einem Fenster von sieben Aminosäuren und ohne Angleichung berechnet worden. Punkte unterhalb der horizontalen Linie repräsentieren Gebiete einer höheren Hydrophobizität, und zeigen damit potentielle Signal- und/oder sich über Membran erstreckende Bereiche an. Die Charakteristika eines Membran überspannenden Glykoproteins einschließlich der Signal- und Ankerelemente und des langen, der Signalsequenz vorangehen den hydrophilen Bereichs finden sich bei der EHV-1 gp14 co dierenden Sequenz.

Bestimmung der Lage der antigenen Determinante, die durch den monoclonalen anti-EHV-1 gp14-Antikörper, 3F6, erkannt wird.

λgt11-Expressionsvektoren und monoclonale Antikörper waren bei der Identifizierung der EHV-1-DNA-Sequenzen, die die Haupt-EHV-1-Glykoproteine (3) codieren, nützlich. Es wurde gezeigt, daß der Rekombinante λgt11, 4a1, ein EHV-1 gp14- Epitop exprimiert, das durch den spezifischen monoclonalen Antikörper 3F6 (3) erkannt wird. Um die Identität dieses Epitops zu bestimmen, wurde die EHV-1-DNA-Seguenz, die in 4a1 enthalten war, sequenziert und mit der DNA-Sequenz der EHV-1 gp14 codierenden Sequenz verglichen (Fig. 6). Zur Se quenzierung des DNA-Fragments, das mit dem durch den mono clonalen anti-EHV-1 gp14-Antikörper 3F6 erkannte (3) EHV-1 gp14-Epitop im rekombinanten λgt11, 4a1, korrespondiert, wurde 4a1 mit EcoRI gespalten und das EHV-1-Fragment auf Agarosegelen isoliert und in die EcoRI-Stelle von pUC8 li giert. DNA-Sequenzierung wurde, wie vorstehend beschrieben, mit den universellen M13 Vorwärts- und Rückwärts-Primern durchgeführt.

Die Nucleotidsequenz-Anordnung zeigte, daß sich dieses Epitop innerhalb des 66 Aminosäurebereichs befand, der dem von 107 (Thr) bis 172 (Val) des abgeleiteten primären Trans lationsproduktes entsprach. Das Epitop befindet sich deshalb innerhalb des aminoterminalen Bereichs der abgeleiteten EHV-1 gp14-Oberflächendomäne.

Vergleich der EHV-1 gp14-Aminosäuresequenz mit anderen Her pesvirus-Glykoproteinen.

Der Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des EHV-1-gp14- Gens enthüllt eine ausgedehnte Homologie mit den Glykopro teinen anderer Herpesviren. So ist EHV-1 gp14 homolog mit gII von PRV (62), gI von BHV-1 (63) gII von Varicella zoster-Virus (VZV) (66), gB von Herpes simplex-Virus (HSV) (67, 71, 72), genauso wie mit den Glykoproteinen in Epstein- Barr-Virus (EBV) (68) und menschlichem Cytomegalovirus (HCMV) (10).

Oligonucleotidgesteuerte Mutagenese des 5'-Terminus der EHV-1 gp14 codierenden Sequenz.

Wie wiederum Fig. 5 zeigt, wurde das Plasmid Blue (KpnI/BamHI) durch Inserieren eines KpnI/BamHI-Fragments aus pUC (BamHI-a/EcoRI) in das Plasmid Bluescript SK+, das mit KpnI/BamHI gespalten worden war, erzeugt. Oligonucleotidge steuerte Mutagenese wurde nach einem modifizierten Verfahren nach Kunkel (17) durchgeführt unter Verwendung Uracil ent haltender DNA-Matrizen des Plasmids Blue (KPNI/BamHI), das in dem dut^- ung^- Wirts E. coli-Stamm CJ236 produziert wurde. In dem mutagenisierten Plasmid wurde eine NsiI-Stelle in den Codons 1 und 2 des EHV-1 gp14-Gens erzeugt durch das Verän dern der Sequenz ATG/TCC (Met/Ser) zu ATG/CAT (Met/His). Die mutierte Sequenz wurde durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert. Das KpnI/BamHI-Fragment aus der Mutante wurde in mit KpnI/BamHI gespaltenes pUC18 transferiert, wodurch das Plas mid pUC (KpnI/BamHI) erzeugt wurde.

Das Plasmid pUCg14, das das gesamte EHV-1 gp14-Gen mit der NsiI-Stelle-Mutation enthielt, wurde konstruiert durch Inse rieren des EcoRI/BamHI-Fragments aus pUC (KpnI/BamHI) in mit EcoRI/BamHI gespaltenes pUC (BamHI/PstI), einem 3,9 kb Sub clon von pUC (BamHI-i).

Konstruktion des chimären Donorplasmids pVM2LH6g14.

pMP409DVC wurde mit BglII gespalten und mit der syntheti schen doppelsträngigen DNA ligiert, die den in Beispiel 1 beschriebenen, von Restriktionsstellen flankierten (früh/spät) Vaccinia-Promotor H6 enthielt. Restriktionsstel len für NsiI, SacI, PstI und EcoRI wurden unmittelbar stromabwärts durch endogene Initiationscodons im H6-Promotor erzeugt. Die Polylinkersequenz in pMG11 stromabwärts des H6- Promotors lautet ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. Der einzigen NsiI-Stelle, die das (unterstrichene) H6-Initia tionscodon enthält, folgen unmittelbar einzig vorkommende SacI-, PstI- und EcoRI-Stellen.

Das dem EHV-1-DNA-Bereich stromaufwärts des EHV-1 gp14 In itiationscodons enthaltende EcoRI /NsiI-DNA-Fragment von pUCG14 wurde das EcoRI/NsiI-Fragment des Plasmids pMG11 er setzt, wodurch das Plasmid pMRHg14 erzeugt wurde, das den rechten Arm von Vaccinia HindIII M, den H6-Promotor und die gesamte Länge des EHV-1 gp14-Gens enthält. Das HpaI/PstI- EHV-1-gp14 enthaltende Fragment aus dem Plasmid pMRHg14 wurde in das Vektorplasmid pMG11, das mit HpaI/PstI gespal ten war, transferiert, womit das Plasmid pVM21H6g14 erzeugt wurde. pVM2LH6g14 enthält die gesamte EHV-1 gp14 codierende Sequenz (mit - wie angedeutet - dem zweiten von TCC (Ser) nach CAT (His) veränderten Codon und mit ungefähr 1,2 kb EHV-1 DNA stromabwärts des EHV-1 gp14-Gens) unter der Kon trolle des H6-Promotors, inseriert in einer Rechts-nach- Links-Orientierung relativ zu den bezüglich des Vaccinia-Ge noms flankierenden Vaccinia-Sequenzen, die die Insertion des EHV-1 gp14-Gens in den M2L-Ort leiten.

Die Rekombination wurde unter Verwendung des Rettungs-Virus vP458 und des Donorplasmids pVM2LH6g14 durchgeführt. Farblose Plaques wurden gepickt und auf die Anwesenheit von EHV-1 gp14 codierenden Sequenzen hin untersucht unter Ver wendung einer spezifischen ³²P-markierten EHV-1 gp14-Sonde. Nach wiederholter Plaque-Clonierung wurde die Vaccinia-Re kombinante mit vP577 bezeichnet.

Verkürzung der EHV-1 gp14 hydrophilen Leader-Sequenz.

Unter Verwendung von Varianten der vorstehend beschriebenen Mutagenese- und Clonierungsmanipulationen wurde das chimäre Donorplasmid pVM2LH6g14-1 konstruiert. Zur Erzeugung von pVM2LH6g14-1, bei dem die Codons 2 bis 34 von EHV-1 gp14 de letiert und vier Codons substituiert sind, wurde eine in vitro-Mutagenese (17) an Plasmid Blue (KpnI/BamHI) durchge führt, wodurch eine NsiI-Stelle in den Codons 32 bis 34 statt in den Codons 1 und 2 erzeugt wurde. Mit dem NsiI/BamHI-Fragment von dem eben erzeugten Blue (KpnI/BamHI)-Plasmid wurde das NsiI/BamHI-Fragment in pVM2LH6g14 substituiert. Multiple NsiI-Linker (New England BioLabs, Beverly, MA) wurden in die NsiI-Stelle ligiert, um das Start-ATG in das richtige Raster mit der übrigen EHV-1 gp14 codierenden Sequenz zu bringen. Das schließlich erhal tene Plasmid, pVM2LH6g14-1, enthält die Sequenz ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT.... die Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala.... codiert, wobei GCT (Ala) das Codon 35 von EHV-1 gp14 ist. Der Rest von pVM2LH6g14-1 ist mit dem in pVM2LH6g14 iden tisch.

Die Vaccinia-Rekombinante vP613 wurde durch Rekombination mit dem Rettungsvirus vP458 und dem Donorplasmid pVM2LH6g14- 1 erhalten.

Beispiel 3 Konstruktion der Vaacinia-Virus-Rekombinanten vP633 und vP634, die jedes der beiden Herpesvirus-Glykoproteine gp13 und gp14 exprimieren

Um Vaccinia-Rekombinante zu exprimieren, die sowohl das gp13 als auch das gp14 EHV-1-Glykoprotein exprimieren, wurde eine Rekombination durchgeführt mit entweder vP577 oder vP613 als Rettungsvirus und dem Donorplasmid pVHA6g13 (beschrieben in Beispiel 1), das das EHV-1 gp13-Gen unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors im HA-Deletionsort von Vaccinia inse riert enthält. Die Insertion von EHV-1 gp13-Sequenzen in re kombinante Viren wurde durch in situ DNA-Hybridisierung identifiziert (25,28). Die Rekombination von pVHA6g13 mit der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP577 (die EHV-1 gp14 in voller Länge enthält) erzeugt die Doppel-Vaccinia-Virus-Re kombinante vP633; Rekombination mit vP613 (die das verkürzte EHV-1 gp14 enthielt), erzeugte die Doppel-Vaccinia-Rekom binante vP634. Die Vaccinia-Virus-Doppelrekombinanten vP633 und vP634 wurden Plaque-cloniert, und das Vorhandensein der beiden EHV-1 gp13 und gp14 codierenden Sequenzen wurde durch DNA-Hybridisierungsanalyse und durch Expressionstests bestä tigt (siehe unten).

Immunpräzipitation der in Vaccinia-Virus-Rekombinanten ex primierten EHV-1 gp13- und gp14-Glykoproteine.

Zur Beurteilung der EHV-1 gp13- und gp14-Glykoproteine, die durch die Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimiert wurden, wurden VERO-Zellen mit den Rekombinanten infiziert, die Pro teine metabolisch ³⁵S-Methionin markiert und, wie in Bei spiel 1 beschrieben, immunopräzipitiert. Der spezifische mo noclonale Antikörper gegen EHV-1 gp13 (4H7) oder gegen EHV-1 gp14 (3F6) (3) wurde in einer 1 : 1000-fachen Verdünnung 4 Stunden bei Raumtemperatur gebunden. Die Proben wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 10%-igen Poly mergel ungefähr 6 Stunden bei 30 mA (konstante Stromstärke) analysiert. Es wurden Autoradiogramme angefertigt.

Von entweder uninfizierten VERO-Zellen oder VERO-Zellen, die mit dem Kontroll-Vaccinia-Virus vP452 (184), das Hämaggluti nin minus ist, wurden durch den spezifischen monoclonalen anti-EHV-1 gp13-Antikörper 14 Hz (3) oder durch den spezifi schen monoclonalen anti-EHV-1 gp14-Antikörper 3F6 (3) keine nennenswerten Produkte immunpräzipitiert. Radioaktiv mar kierte EHV-1 gp13-Produkte wurden durch den monoclonalen An tikörper 14H7 aus VERO-Zellen präzipitiert, die infiziert waren mit vP483, einer Vaccinia-Rekombinanten, die nur EHV-1 gp13 exprimiert, oder den Vaccinia-Virus-Doppelrekombinan ten, die sowohl EHV-1 gp13 und entweder intaktes (vP633) oder verkürztes (vP634) gp14 exprimieren. Es lassen sich zwei Produkte mit ungefähr 44 und 47 kDa nachweisen, die et was kleiner als das vorhergesagte primäre Translationspro dukt (51 kDa) sind und ein größeres Produkt mit ungefähr 90 kDA, das sich in Einklang mit einer vollständig glykosylier ten Form des EHV-1 gp13 Genproduktes befindet. Es ist bemer kenswert, daß die Qualität und Quantität der Expression von EHV-1 gp13 durch die Coexpression einer der EHV-1 gp14-For men in den Vaccinia-Doppel-Rekombinanten vP633 und vP634 nicht beeinflußt wird.

VERO-Zellen wurden mit vP633, vP634, vP613 bzw. vP577 infi ziert und eine Immunpräzipitation wurde mit dem spezifischen monoclonalen anti-EHV-1 gp14-Antikörper 3F6 (3) durchge führt. Mit vP633 (das gp14 in voller Länge plus gp13 enthielt) und mit vP577 (das gp14 in voller Länge enthielt) wurden Hauptbanden bei ungefähr 34, 47, 60-64 und 90 kDa be obachtet; während mit vP634 (das das verkürzte gp14 plus gp13 enthält) und mit vP613, das das verkürzte gp14 enthält, wurden Hauptbanden bei 34, 47, 57, 72-82 und 116 kDa beob achtet. Wieder ließen sich keine nennenswerten Unterschiede in der Synthese von irgendeiner Form von EHV-1 gp14 während der Coexpression mit EHV-1 gp13 beobachten.

Immunfluoreszenzanalyse der von den rekombinanten Vaccinia- Viren synthetisierten Produkte EHV-1 gp13 und gp14.

Immunfluoreszenz von mit rekombinantem Vaccinia-Virus infi zierten VERO-Zellen wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt unter Benutzung von entweder EHV-1 gp13- oder gp14-spezifischem monoclonalen Antikörper.

EHV-1 gp13 ließ sich genauso leicht auf der Oberfläche von VERO-Zellen nachweisen, die mit den Vaccinia-Rekombinanten vP483, vP633 und vP634 infiziert waren, wie auch intern nach Acetonfixierung. In vP410, vP577 oder vP613 infizierten Zel len war keine nennenswerte interne oder Oberflächen-Immunre aktivität gegen gp13-spezifischen Antikörper zu beobachten. Die Expression von EHV-1 gp14 ließ sich in Aceton fixierten VERO-Zellen leicht nachweisen, die mit den Vaccinia-Rekom binanten vP577, vP613, vP633 und vP634 infiziert waren. In vP410 oder vP483 infizierten Zellen ließ sich keine nennens werte interne Immunfluoreszenz mit gp14 spezifischen Anti körpern beobachten. Unter Verwendung des gp14-spezifischen monoclonalen Antikörpers 3F6, wurde eine schwache Oberflä chen-Immunfluoreszenz in Zellen beobachtet, die mit vP613 oder vP634 infiziert worden waren, die die verkürzte Form von EHV-1 gp14 exprimieren, und es wurde mit den rekombinan ten Vaccinia-Viren vP577 und vP633, die das EHV-1 gp14-Gen in der vollen Länge exprimieren (vgl. ebenfalls Beispiel 89) keine nennenswerte Oberflächenantwort gegenüber der Kon trolle mit den Viren vP410 und vP483 erhalten.

Beispiel 4 Immunisierung von Meerschweinchen mit der Vaccinia-Rekom binante vP483

Um die Immunogenität des von der Vaccinia-Rekombinanten vP483 exprimierten Pferde-Herpesvirus gp13-Gens zu bestim men, wurden Meerschweinchen mit dem Virus inoculiert, und es wurde auf die Anwesenheit von serumneutralisierenden Anti körpern sowohl gegen das Vaccinia-Virus als auch das Pferde- Herpesvirus getestet.

15 Meerschweinchen mit einem Gewicht von ungefähr 450 g wur den in fünf Gruppen unterteilt. Eine Gruppe erhielt 1 ml der Vaccinia-Rekombinanten (10⁸TCID₅₀/ml) am Tag 0, denen am Tag 21 ein 1 ml Booster durch subkutane Inoculation folgte. Die zweite Gruppe erhielt ähnliche Inoculationen, aber mit dem Vaccinia vP452 (10⁸TCID₅₀/ml). Die dritte Gruppe blieb un vakziniert. Allen Meerschweinchen wurde vor der ersten Vak zinierung und an den Tagen 21 und 35 Blut entnommen. Es wur den Seren bereitet und auf die Anwesenheit von neutralisie renden Antikörpern sowohl gegen Vaccinia als auch gegen EHV- 1 (Stamm Kentucky) unter Verwendung von 50 TCID₅₀ des Virus auf Schweinehodenzellen getestet.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, ruft die EHV-1 gp13- Vaccinia-Re kombinante vP483 eine offensichtliche Serokonversion in Meerschweinchen hervor. Mit Vaccinia-Virus erhaltene serum neutralisierende Titer sind in Klammern in Tabelle 1 aufge führt. Sowohl Vaccinia als auch EHV-1-Serum neutralisierende Antikörper sind 21 Tage nach der primären Inoculation nach weisbar, und eine signifikante Zunahme des Titers der serum neutralisierenden Antikörper erhält man 2 Wochen nach einer zweiten Inoculation des Virus am Tag 21. Es wird darauf hin gewiesen, daß die Vaccinia-neutralisierenden Serumtiter, die in Meerschweinchen erhalten wurden, die mit dem EHV-1 gp13 exprimierenden rekombinanten Virus inoculiert waren, signi fikant höher lagen (t = 7,2) als die aus dem mit dem Vaccinia- Virus vP452 inoculierten Meerschweinchen.

Tabelle 1

Serumneutralisierende Antikörper, die in Meerschweinchen vorhanden waren, die entweder mit einer Vaccinia-Rekombinan ten, die EHV-1 gp13 exprimiert, oder mit dem Kontroll-Vacci nia-Virus vP452 inoculiert waren

Beispiel 5 Immunisierung von Meerschweinchen mit den Vaccinia-Rekom binanten vP577 und vP613

Zur Beurteilung ihrer Immunantwort gegen das durch die Vac cinia-Rekombinanten vP577 und vP613 exprimierte EHV-1 gp14 wurden Meerschweinchen immunisiert. Meerschweinchen, die un gefähr 450 g wogen, erhielten auf subkutanem Weg am Tag 0 und am Tag 21 je 1 ml 10⁵ TCID₅₀ der Vaccinia-Rekombinanten vP577 oder, alternativ, vP613. Es wurde an den Tagen 0, 21 und 35 Meerschweinchen Blut entnommen, Seren bereitet und auf EHV-1-Antikörper hin getestet. Neutralisationstests wur den mit Schweinehodenzellen gegen 50 TCID₅₀ des EHV-1-Virus, Stamm Kentucky, vorgenommen. Unter Verwendung eines anti- IgG-(H) Peroxydasekonjugats wurden die Vaccinia-Antikörper mittels ELISA getitert.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Es wurde keine serumneutralisierende Aktivität gegen EHV-1 in Meerschwein chen erhalten, die mit der Vaccinia-Rekombinanten vP577 im munisiert waren, die die volle Länge des EHV-1 gp14-Gens enthielt (Ergebnisse nicht gezeigt). Andererseits wurden Meerschweinchen, die mit der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP613 inoculiert waren, die ein verkürztes EHV-1 gp14-Gen exprimierte, ähnliche Spiegel EHV-1 serumneutralisierender Antikörper induziert (Tabelle 2) wie es die Vaccinia-Rekom binante vP483 tat, die EHV-1 gp13 exprimierte (Tabelle 1). Obwohl die EHV-1 serumneutralisierenden Antikörper 3 Wochen nach der ersten Vakzinierung nachweisbar waren, wurde ein signifikant höherer Spiegel 2 Wochen nach der zweiten Immu nisierung beobachtet (Tabelle 2). In allen immunisierten Tieren wurde eine Immunantwort beobachtet, wenn man durch ELISA auf Vaccinia-Antikörper testete.

Tabelle 2

Serumneutralisierende Antikörper, die in Meerschweinchen vorhanden sind, die mit einer Vaccinia-Rekombinanten, die EHV-1 gp14 exprimiert, inoculiert sind

Beispiel 6 Schutz vakzinierter Hamster gegen EHV-1-Infektion

Um die Wirksamkeit der EHV-1 gp13 exprimierenden Vaccinia- Rekombinanten vP483 zu beurteilen, wurde Hamstern eine pri märe oder eine primäre plus Hilfs-Vakzinierung verabreicht, und sie wurden parallel mit einer nicht-inoculierten Kon trollgruppe oder einer Gruppe, die zweimal mit dem Kontroll- Vaccinia-Virus vP452 inoculiert war, einer Infektion durch einen intraperitoneal verabreichten Hamster-adaptierten Ken tucky-Stamm von EHV-1 ausgesetzt.

Vierzig syrische Hamster (40 Tage alt, Gewicht zwischen 55 und 65 g) wurden in vier Gruppen unterteilt. Gruppe A er hielt eine einzige subkutane (1 ml) Inoculation mit der Vac cinia-Rekombinanten vP483 von 10⁸, 10⁶ 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002004090565 00004 99880oder 10⁴ TCID₅₀ mit fünf Tieren pro Dosis. Gruppe B wurde mit vP483 am Tag 0 vakziniert, dem ein Booster am Tag 14 nachfolgte. Die (1 ml) primären- und Booster-Dosen wurden den Gruppen von 5 Tieren subkutan verabreicht, wobei 10⁸, 10⁶ oder 10⁴ TCID₅₀ verwen det wurden. Gruppe C bestand aus 5 Hamstern und erhielt 2 subkutane Injektionen von Vaccinia vP452 (10⁸ TCID₅₀ pro In jektion) an den Tagen 0 und 14. Fünf Hamster in Gruppe D wurden als unvakzinierte Kontrollen belassen. Allen Hamstern wurde auf intraperitonealem Weg 14 Tage nach der letzten Im munisierung 200 LD₅₀ eines Hamster-adaptierten Kentucky- Stammes von EHV-1 verabreicht. Überlebende wurden 7 Tage nach der Behandlung mit dem Erreger gezählt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Alle unvakzi nierten und mit dem Vaccinia vP452-Virus vakzinierten Ham ster verendeten innerhalb von 5 Tagen nach der Behandlung mit dem Erreger.

Tabelle 3

Schutz von Hamstern, die mit EHV-1 gp13 exprimierendem re kombinantem Vaccinia vakziniert sind, gegen EHV-1-Infektion

Eine signifikante Höhe des Schutzes gegen EHV-1-Erreger wurde in Hamstern beobachtet, die mit dem rekombinanten Vac cinia vP483, das EHV-1 gp13 exprimiert, vakziniert waren. In der Stärke des Schutzes wurden keine signifikanten Unter schiede bei Hamster beobachtet, die entweder mit einer pri mären Dosis oder mit einer primären und einer zusätzlichen Booster-Dosis immunisiert waren. Die Schutzdosis (PD₅₀) war ähnlich; PD₅₀ = 6,32 log₁₀ für die primäre und 6,12 log₁₀ für die primäre plus Booster-Dosis. Nichtsdestoweniger wurde ein 100%-iger Schutz nur in der Gruppe beobachtet, die zwei mal die Dosis von 10⁸ TCID₅₀ vom rekombinanten Virus er hielt.

Zur Bestimmung der Wirksamkeit des Schutzes eines rekom binanten Vaccinia-Virus, das EHV-1 gp14 alleine oder in Kom bination mit EHV-1 gp13 exprimiert, wurden Untersuchungen durchgeführt, bei denen vakzinierte Hamster einem Erreger ausgesetzt wurden. Zwanzig 1 Tage alte syrische Hamster, von denen jeder ungefähr 60 g wog, wurden subkutan mit 1 ml eines Kontroll-Vaccinia-Virus oder mit den rekombinanten Vaccinia-Viren vP483, vP577, vP613, vP633 und vP634 inocu liert, die EHV-1 gp13 und/oder gp14 exprimieren. Einer pri mären Vakzinierung folgte am Tag 14 eine Vakzinierung mit einer identischen Vakzinierungsdosis (pfu/ml (log₁₀)). Alle Hamster, einschließlich der nicht-inoculierten Kontrollen, wurden 14 Tage nach der letzten Immunisierung mit einer in traperitonealen Injektion von 200 LD₅₀ des EHV-1 Hamster adaptierten Kentucky-Stamms infiziert. Die Überlebenden von einer Gruppe aus fünf wurden 14 Tage nach der Infektion, dem Tag, an dem das Experiment beendet wurde, bestimmt. Die In oculums-Dosis, die einen 50%-igen Schutz der Hamster ergibt, berechnet sich als log₁₀ TCID₅₀/ml Inoculum.

Wie in Tabelle 4 gezeigt, war die Vaccinia-Virus-Rekom binante vP577, die EHV-1 gp14 in voller Länge exprimiert, nicht in der Lage, Hamster mit einer berechneten PD₅₀ ≦ 9,0 log₁₀ gegen eine Infektion zu schützen. Andererseits gab das durch die Vaccinia-Rekombinante vP613 exprimierte verkürzte EHV-1 gp14-Gen einen guten Schutz gegen die Infektion (Ta belle 4). Der berechnete PD₅₀ ist etwas besser (5, 2) als der mit der EHV-1 gp13 exprimierenden Vaccinia-Rekombinante vP483 (6, 1) erhaltene. Die Coexpression von EHV-1 gp13 und gp14, gleichgültig, ob es sich um das gp14-Gen mit voller Länge oder um das verkürzte gp14-Gen im Vaccinia-Virus-Re kombinanten vP633 bzw. vP634 handelte, ergab überraschender weise eine signifikant gesteigerte schützende Wirkung ver glichen mit der Wirksamkeit der einzeln exprimierten EHV-1- Glykoproteine. Somit war die Menge des Virusinoculums zur Erreichung eines 50%igen Schutzes der vakzinierten Hamster signifikant verringert, wenn EHV-1 gp13 und gp14 in dersel ben Vaccinia-Virus-Rekombinanten coexprimiert wurden.

Tabelle 4

Schutz von Hamstern, die mit den Vaccinia-Rekombinanten vak ziniert sind, die EHV-1 gp13 und/oder gp14 exprimieren, ge gen eine EHV-1-Infektion

Beispiel 7 Konstruktion von Vogel-Pockenvirus-Rekombinanten, die das Pferde-Herpesvirus gp13-Glykoprotein exprimieren

Wie in Fig. 8 gezeigt, wurde pVHA6g13 als Quelle für das EHV-1 gp13-Gen verwendet. Um den DNA-Abschnitt, der das ge samte EHV-1 gp13-Gen enthält, zu isolieren, wurde pVHA6g13 mit NruI und HindIII gespalten. Durch diese Spaltung wurde ein Fragment mit ungefähr 1,8 kb erzeugt, das 28 bp des 3'- Endes des Vaccinia-Virus H6-Promotors, das gesamte EHV-1 gp13-Gen und ungefähr 410 bp Vaccinia-Virus-Sequenzen ent hält. Das 1,8 kb NruI/HindIII-Fragment wurde isoliert zum Inserieren in die Vogelpocken-Insertionsvektoren pFPCV2 und pCPCV1.

Der Geflügelpocken-Virus(FP)-Insertionsvektor pFPCV2 liefert ein Vehikel zur Erzeugung von Rekombinanten, die fremde Gene in einem nicht essentiellen Bereich des FP-Genoms beherber gen, der mit f7-Ort bezeichnet wird. pFPCV2 wurde von pRW731.13 abgeleitet. Das Plasmid pRW731.13 enthält ein FP- genomisches PvuII-Fragment mit ungefähr 5,5 kb, das zwischen die beiden PvuII-Stellen von pUC9 inseriert ist. Zuerst wurde eine multiple Clonierungssequenz (MCS) in die einzige HincII-Insertionsstelle innerhalb dieses genomischen 5,5 kb PvuII FP-Fragments ligiert. Die MSC wurde durch Aneinan derlagern der Oligonucleotide CE4

und CE5

erhalten. Das die MCS enthaltende Plasmid wurde mit pCE11 bezeichnet.

pFeLV1A ist ein Abkömmling des Vaccinia-Insertionsvektors pTP15 (184) (Fig. 3), in dem das Katzen-Leukämievirus (FeLV)-env-Gen (192) in die PstI-Stelle stromabwärts des H6- Promotors inseriert ist. Um die 2,4 kb Expressions-Kassette in einem FP-Vektor zu transferieren (Fig. 8) wurden die H6/FeLV env-Sequenzen durch Spaltung mit BglII und partielle Spaltung mit PstI aus pFeLV1A ausgeschnitten. Die BglII- Stelle befindet sich an der 5'-Grenze der H6-Promotorse quenz. Die PstI-Stelle liegt 420 bp stromabwärts des Trans lations-Terminationssignals des offenen Leserahmens für das FeLV-Hüllglykoprotein.

Die 2,4 kb H6/FeLV env-Sequenz wurde in mit BamHI und PstI gespaltenes pCE11 inseriert. Dieses Plasmid wurde mit pFeLVF1 bezeichnet. Das Plasmid pFeLVF1 wurde dann mit PstI gespalten, um die FeLV env-Sequenzen zu entfernen. Das re sultierende Plasmid, das den Vaccinia-Virus H6-Promotor in nerhalb von pCE11 enthält, wurde mit pFPCV1 bezeichnet. Zur Entfernung von nicht-relevanten Sequenzen wurden unter Ver wendung des Oligonucleotids FPCV1

die Sequenzen 5'-seitig des Promotors mutagenisiert (19), um das Plasmid pFPCV1 herzustellen. Zur Entfernung der SphI- Stelle, die ein ATG enthält, wurde der Bereich 3'-seitig des Promotors (multiple Clonierungsstelle) mit dem Oligonucleo tid FPCV3 mutagenisiert.

Das resultierende Plasmid wurde mit pFPCV2 bezeichnet.

Das vorstehend definierte 1,8 kb NruI/HindIII EHV-1 gp13- Fragment wurde in das durch Spaltung aus pFPCV2 abgeleitete 8,0 kb NruI/HindIII-Fragment inseriert. Dieses 8,0 kb NruI/HindIII-Fragment enthielt den 5'-Teil des Vaccinia-Vi rus-H6-Promotors (100 bp), die FP-flankierenden Sequenzen (4,8 kb stromaufwärts und 1,5 kb stromabwärts von der Inser tionsstelle) und 2,4 kb von pUC (BRL, Bethesda, MD). Eine Ligation dieser beiden Fragmente ergab die Bildung eines 9,8 kb-Plasmids, das mit pFPEHV13A bezeichnet wurde.

Das Plasmid pFPEHV13A wurde dann mit KpnI und HindIII ge spalten, um ein ungefähr 600 bp-Fragment zu entfernen. Die ses Fragment enthielt den am meisten 3'-seitig gelegenen Be reich des EHV-1 gp13-Gens (200 bp) und den 410 bp Vaccinia- Virus-DNA-Abschnitt. Das 600 bp KpnI/HindIII-Fragment wurde durch ein aus pNSIENPN (Fig. 3) abgeleitetes 200 bp-Fragment wie folgt ersetzt. Eine PstI-Spaltung von pNSIENPN lineari sierte das Plasmid. Die PstI-Termini wurden durch T4-DNA-Po lymerase (New England Biolabs, Beverly, Ma) in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) stumpfendig gemacht. Das stumpfendige Fragment wurde dann mit HindIII-Linkern (BRL, Bethesda, MD) ligiert. Nach einer Spaltung mit HindIII wurde das lineari sierte Plasmid mit KpnI gespalten, wodurch sich ein 200 bp- Fragment ergab, das den 3'-Teil des EHV-1 gp13-Gens, die mit dem Terminationscodon (TAG) korrespondierende Sequenz und das Sequenzmotiv TTTTTNT, das als ein frühes Vaccinia-Virus- Transkriptions-Terminationssignal bekannt ist (45), enthielt. Das rekombinante Plasmid wurde mit pFPEHV13B be zeichnet, und wurde bei der in vitro-Rekombination zur In sertion des unter dem H6-Promotor stehenden EHV gp13-Gens in den f7-Ort des FP-Genoms verwendet. Das rekombinante Geflü gelpockenvirus wurde als vFP44 bezeichnet.

Wie aus Fig. 9 hervorgeht, wurde pFPEHV13B ebenfalls zur Er zeugung eines 1,4 kb NruI/HindIII-Fragments zum Inserieren in pCPCV1 verwendet. Das Plasmid pCPCV1 enthält den Vacci nia-Virus H6-Promotor in der einzigen EcoRI-Stelle des geno mischen 3,3 kb PvuII-Kanarienpockenvirus-Fragments. Dieses Insertionsplasmid erlaubt die Insertion fremder Gene in den C3-Ort des CP-Genoms. pCPCV1 war von pRWT64.2 abgeleitet, das ein genomisches 3,3 kb PvuII CP-Fragment in dem pUC-Vek tor inseriert, enthielt. pRW764.2 wurde durch Spaltung mit EcoRI linearisiert. Dieses Fragment wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) stumpfendig gemacht. Die Vaccinia-Virus H6-Promotorsequenzen und ein 3'-seitig des Promotors gelege ner multipler Clonierungsbereich wurden durch Spaltung mit KpnI/HpaI aus pFBCV1 ausgeschnitten. Dieses 200 bp-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) stumpfendig gemacht und in das linearisierte stumpfen dige Plasmid pRW764.2 inseriert. Das resultierende Plasmid wurde mit pCPCV1 bezeichnet. Das Plasmid pCPCV1 wurde mit NruI und HindIII gespalten, und das 5,8 kb-Fragment wurde isoliert, um es mit dem oben beschriebenen EHV gp13 enthal tenden 1,4 kb-Fragment zu ligieren. Das resultierende Plas mid wurde mit pCPEHV13A bezeichnet. Dieses Plasmid wurde in in vitro-Rekombinationsexperimenten zur Insertion des unter der Kontrolle des H6-Promotors stehenden EHV gp13-Gens in den C3-Ort des CP-Genoms verwendet. Das rekombinante Kana rienpockenvirus wurde mit vCP48 bezeichnet.

Anschließend an die in vitro-Rekombination wurde das das EHV-1 gp13-Gen enthaltende rekombinante Vogelpockenvirus durch einen Standardplaque-Hybridisierungstest identifi ziert. Positive Plaques wurden durch 3 Runden Plaque-Isolie rung gereinigt und anschließend einer Hybridisierungsanalyse unterworfen. Die Rekombinanten wurden als vFP44 und vCP48 für die FP- bzw. die CP-Rekombinanten bezeichnet. Beide Re kombinanten wurden mit einem monoclonalen Antiserum gegen EHV-1 gp13 unter Verwendung eines Protein A-β-Galactosidase- Immun-Screening-Tests analysiert. Die Ergebnisse bewiesen, daß entweder mit vFP44 oder vCP48 infizierte CEF- und VERO- Zelleinzelschichten das EHV-1 gp13 an der Oberfläche der vi rusinfizierten Zellen exprimieren.

Beispiel 8 Beurteilung weiterer Vaccinia-Virus-Rekombinanter, die unmo difizierte und modifizierte Versionen des Gens von Pferde- Herpesvirus 1 exprimieren, das das Glykoprotein gp14 codiert

Konstruktion und Beurteilung eines weiteren rekombinanten Vaccinia-Virus, das EHV-1 gp14 exprimiert. Die EHV-1 gp14 enthaltenden Konstruktionen (Beispiel 2) wurden auf dreier lei Weise modifiziert: (a) Verändern der Länge der EHV-1 gp14 Leader-Sequenz; (b) Entfernung überschüssiger EHV-1 DNA 3'-seitig des Gens und (c) für die Auswertung ein Inserieren der modifizierten Versionen des EHV-1 gp14-Gens in ein Vac cinia-Virus-vP293-Wirtsbereichs-Selektionssystem (69).

Das EHV-1 gp14-Genprodukt enthält eine ungewöhnlich lange Leader-Sequenz. Es wird vermutet, daß die lange hydrophobe Sequenz, die sich von Aminosäure 58 bis 99 erstreckt, die Signalsequenz ist. Diesem Bereich geht eine lange hydrophile Sequenz voran. Eine ähnlich lange Leader-Sequenz ist auch für die beiden anderen Homologen, Pseudorabies-Virus gII (62) und Rinder-Herpesvirus 1 gI (63), festgestellt worden.

Modifikation des 5'-Endes von EHV-1 gp14.

Um den Einfluß der Länge der Leader-Sequenz von EHV-1 gp14 auf die weitere Verarbeitung, das Auftreten und die immuno logische Wirksamkeit des im rekombinanten Vaccinia-Virus ex primierten gp14-Produktes zu untersuchen, wurden durch ein Modifizieren der früheren EHV-1 gp14 enthaltenden Konstruk tionen Plasmide in der nachfolgenden Weise konstruiert, die das EHV-1 gp14-Gen mit drei unterschiedlichen Längen der Leader-Sequenz enthielten.

Wie aus Fig. 10 hervorgeht, enthält das Plasmid pVM2LH6g14 (Beispiel 2) die gesamte EHV-1 gp14 codierende Sequenz unter der Kontrolle des H6-Promotors, inseriert in dem M2L-Dele tionsort von Vaccinia Copenhagen. In pVM2LH6g14 ist die Ami nosäure Nr. 2 des EHV-1 gp14-Gens ein His statt des nativen Ser. Um die Aminosäure 2 in Ser zu ändern, wurde pVM2LH6g14 in den Codons 1-2 (Met/His) mit NsiI (Erkennungssequenz ATGCAT) gespalten. Eine Mutagenese wurde durchgeführt (19) unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN240

Das resultierende Plasmid pMP14M enthält das gesamte EHV-1 gp14-Gen mit dem nativen Codon (Ser) in Position 2.

Abgesehen von einer Verkürzung der Leader-Sequenz und einer Einführung von vier aus den synthetischen NsiI-Linkern her geleiteten Codons ist das Plasmid pVM2LH6g14-1 (Beispiel 2) identisch mit pVM2LH6g14. In pVM2LH6g14-1 lautet die Sequenz des 5'-verkürzten Endes des EHV-1 gp14-Gens ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT . . . die Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala . . . codiert, wobei GCT (Ala) Codon 35 von EHV-1 gp14 ist. pVM2LH6g14-1 wurde auf zweierlei Weise durch Mutagenese mo difiziert (19). Um eine Version des gp14-Gens herzustellen, die ungefähr auf dasselbe Ausmaß verkleinert ist wie pVM2LH6g14-1, die der nativen gp14-Sequenz aber mehr gleicht, wurde pVM2LH6g14-1 in den Codons 1-2 mit NsiI ge spalten. Eine Mutagenese wurde durchgeführt unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN241

In dem resultierenden Plasmid pMP14M-34 beginnt die EHV-1 gp14 codierende Sequenz mit ATG/AGT/GTC/CCA . . .Met/Ser/Val/Pro. . ., wobei CCA (Pro) die Aminosäure 36 von EHV-1 gp14 ist. Das EHV-1 gp14-Gen enthält eine NaeI- Stelle (GCCGGC) bei den Codons 61-63 (Lys/Pro/Ala). Um eine stärker verkleinerte Version des EHV-1 gp14-Gens herzu stellen, wurde pVM2LH6g14-1 mit NaeI linearisiert, an schließend mit NsiI gespalten und das Vektorfragment aus einem Agarosegel isoliert. Eine Mutagenese wurde durchge führt unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN243

In dem resultierenden Plasmid pMP14M-63 beginnt die EHV-1 gp14-codierende Sequenz mit ATG/GCA . . . Met/Ala. . ., wobei GCA (Ala) die Aminosäure 63 des nativen EHV-1 gp14 ist.

Entfernung irrelevanter EHV-1-DNA.

In allen vorstehend diskutierten EHV-1 gp14 enthaltenden Plasmiden folgen den EHV-gp14 codierenden Sequenzen ungefähr 1200 bp EHV-1-DNA. Das Terminationscodon (TAA) für das gp14- Gen liegt innerhalb einer DraI-Stelle (TTTAAA). Zum Entfer nen überschüssiger EHV-1-DNA wurde pMP14M-63 einer partiel len DraI-Spaltung unterworfen. Anschließend wurde die li nearisierte DNA aus einem Agarosegel isoliert und mit PstI gespalten, das an der Verbindung von EHV-1-DNA und dem stromabwärts liegenden flankierenden Vaccinia-Arm schneidet. Aus dem Agarosegel wurde eine 6,5 kb DraI/PstI-DNA-Bande isoliert. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN247 (5' AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA 3') und MPSYN248 (5' GCTCGAGTTAACAAAAATTT 3') wurden aneinandergelagert und mit dem 6,5 kb-Fragment ligiert. In dem resultierenden Plas mid pMP14M-63P folgt den EHV-1 gp14 codierenden Sequenzen unmittelbar eine die Termination der frühen Vaccinia- Transkription spezifizierende Sequenz (45), der ein Polylin kerbereich (die Restriktionsstellen HpaI, XhoI, PstI enthal tend) und der linke aus HindIII M abgeleitete flankierende Vaccinia-Arm folgt.

Insertion des H6-Promotor/EHV-1 gp14-Gens in ein pHES/vP293- Selektionssystem.

In allen vorstehend diskutierten, das EHV-1 gp14 enthalten den Plasmiden steht das EHV-1 gp14-Gen unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors, und ist in dem M2L-Deletionsort des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen inseriert. Da der M2L- Insertionsort innerhalb eines größeren Bereichs des Genoms liegt, der sich deletieren läßt (69), wurde die Verlegung der H6-Promotor/EHV-1 gp14-Expressions-Kassette in eine po tentiell stabilere Insertionsstelle untersucht. Als vorbe reitender Schritt wurden die EHV-1 gp14-Genkonstruktionen, die unterschiedliche Längen der Leadersequenz enthielten, in das auf WR pHES/vP293 basierende Wirtsbereichs-Selektions system (69) überführt, um eine schnelle Erzeugung von Vacci nia-Rekombinanten für die vergleichende Auswertung zu ermög lichen.

Das Plasmid pHES-4 enthält den Vaccinia H6-Promotor, dem ein Polylinkerbereich und das Human-Wirtsbereichsgen KIL (70) folgt, wobei sie alle zwischen die WR-Vaccinia-Arme, die eine 21,7 kb Deletion (69) flankieren, inseriert sind. pHES- 4 enthält zwei NruI-Stellen, eine innerhalb des H6-Promotors und eine innerhalb der flankierenden Vaccinia-Sequenzen. pHES-4 wurde durch eine partielle Spaltung mit NruI lineari siert, und die Bande, die eine linearisierte DNA mit voller Länge enthielt, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Diese linearisierte DNA wurde im Polylinkerbereich in der XhoI- Stelle gespalten. pMP14M-63P enthält zwei NruI-Stellen, eine innerhalb des H6-Promotors und die andere innerhalb der EHV- 1 gp14 codierenden Sequenzen, 0,2 kb vom 3'-Ende des Gens. pMP14M-63P wurde mit NruI linearisiert und anschließend mit XhoI gespalten. Ein 2,8 kb NruI (partiell)/XhoI-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment enthält einen Teil des H6-Promotors, dem die Form des modifizierten EHV-1 gp14-Gens folgt, die die kürzeste Version der Leader- Sequenz enthält. Das aus pMP14-63P abgeleitete, den H6-Pro motor/EHV-1 gp14 enthaltende 2,8 kb-Fragment wurde mit dem aus pHES-4 abgeleiteten NruI (partiell)/XhoI-Vektorfragment ligiert. Das resultierende Plasmid pHES-MP63 enthält die H6- Promotor/EHV-1 gp14-Gen-Kassette, ohne nicht relevante EHV- 1-DNA. Um die H6-Promotor/EHV-1 gp14 5'-Enden, die Leader- Sequenzen mit voller Länge oder mit einer mäßigen Verkürzung enthielten, wurden die Plasmide pMP14M und pMP14M-34 mit NruI gespalten und die 2,8 kb bzw. 2,7 kb-Bande wurde aus Agarosegelen isoliert. pHES-MP63 wurde einer partiellen NruI-Spaltung unterzogen und ein 7,2 kb-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das 7,2 kb-Vektorfragment ent spricht pHES-MP63, von dem das dem H6-Promotor/EHV-1 gp14 5'-Ende enthaltende 2,6 kb NruI-Fragment entfernt worden war. Das aus pHES-MP63 abgeleitete 7,2 kb NruI (partiell)- Vektorfragment wurde mit dem 2,8 kb NruI-Fragment aus pMP14M ligiert, wodurch pHES-MP1 erzeugt wurde. Das aus pHES-MP63 abgeleitete 7,2 kb NruI (partiell)-Vektorfragment wurde ebenfalls mit dem 2,7 kb NruI-Fragment aus pMP14M-34 lig iert, womit pHES-MP34 erzeugt wurde. Die zur Erzeugung der Plasmide pHES-MP63, pHES-MP1 und pHES-MP34 führenden Clonie rungsschritte sind schematisch in Fig. 10 dargestellt.

Die Plasmide pHES-MP1, pHES-MP34 und pHES-MP63 wurden als Donorplasmide zur Rekombination mit vP293 (69) verwendet, um die rekombinanten Vaccinia-Viren vP753 bzw. vP765 oder vP721 zu erzeugen. Die rekombinante Nachkommenschaft wurde auf menschlichen MRC-5-Zellen selektioniert.

Auswertung der auf vP293 basierenden Vaccinia-Virus-Rekom binanten, die das EHV-1 gp14-Gen exprimieren.

Um zu bestimmen, ob die drei Formen des EHV-1 gp14 Genpro duktes, das in den rekombinanten Vaccinia-Viren vP753, vP765 und vP721 exprimiert wurde, auf der Oberfläche von infizier ten Zellen vorhanden waren, wurden VERO-Zelleinzelschichten mit den drei EHV-1 gp14 enthaltenden rekombinanten Vaccinia- Viren infiziert. Infizierte Zelleinzelschichten wurden auf Oberflächenimmunfluoreszenz unter Verwendung des monoclona len EHV-1 gp14 spezifischen Antikörpers 3F6 analysiert. Es ergab sich eine positive Oberflächenimmunfluoreszenz für Zellen, die mit allen drei Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP753, vP765 und vP721 infiziert worden waren. Dies zeigt, daß das korrekte Transportieren des EHV-1 gp14-Genprodukts in Vaccinia-infizierten Zellen durch ein Variieren der Länge der Leader-Sequenz nicht beeinflußt wird.

Um die von den drei EHV-1 gp14 enthaltenden Vaccinia-Virus- Rekombinanten exprimierten EHV-1 gp14-Genprodukte zu ver gleichen, wurden MRC-5-Zellen mit vP753, vP765 und vP721 in fiziert, und die Proteine wurden metabolisch mit ³⁵S-Methio nin markiert. Mit den radioaktiv markierten Zellysaten wur den unter Verwendung des monoclonalen EHV-1 gp14 spezifi schen Antikörpers 3F6-Immunpräzipitationen durchgeführt.

Die immunpräzipitierten Proteine aus Zellen, die mit vP753, vP765 und vP721 infiziert worden waren, ließen sich vonein ander nicht unterscheiden und waren äquivalent zu den immun präzipitierten Proteinen von vP613, der EHV-1 gp14 enthal tenden Vaccinia-Rekombinanten, die aus dem Plasmid pVM2LH6g14-1 hergestellt war. Diese Ergebnisse zeigen, daß die in diesen rekombinanten getesteten Variationen in der Länge der EHV-1 gp14-Leader-Sequenz die korrekte Weiterver arbeitung des Genproduktes weder verbesserten noch behinder ten.

Um die Wirksamkeit des Schutzes durch Vaccinia-Virus, das die verschiedenen Formen von EHV-1 gp14 exprimiert, auszu werten, wurden Hamster mit unterschiedlichen Dosierungen von vP753, vP765 und vP721 inoculiert und mit dem Hamsteradap tierten EHV-1 Stamm-Kentucky infiziert. Alle drei EHV-1 gp14 enthaltenden Vaccinia-Rekombinanten haben eine Schutzwirkung mit einem log₁₀ PD₅₀ von 6,2 oder besser. Unterschiede des Schutzes unter den drei Vaccinia-Virus-Rekombinanten sind statistisch nicht signifikant.

Im Gegensatz zu vP577 zeigt eine nachfolgende Vaccinia-Vi rus-Rekombinante, die ebenfalls durch Rekombination zwischen pVM2LH6g14 und vP458 erzeugt war, ein identisches EHV-1 gp14 Immunpräzipitationsmuster zu dem mit vP613, vP753, vP765 und vP721 beobachteten und exprimierte des EHV-1 gp14-Protein auf der Oberfläche der infizierten Zellen genauso wie diese EHV-1 gp14 exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Viren.

Die genannten Ergebnisse legen nahe, daß das in der Vacci nia-Virus-Rekombinanten vP577 exprimierte EHV-1 gp14 defekt ist und der Defekt wahrscheinlich während der Rekombination zwischen dem Donorplasmid pVM2LH6g14 und dem Vaccinia-Virus vP458 auftrat.

Beispiel 9 Nucleotidsequenz von drei neuen Genen von Pferde-Herpesvirus Typ 1 und Expression in Vaccinia-Virus-Rekombinanten

Um das gp17/18 codierende EHV-1-Gen zu identifizieren und zu isolieren, wurde vor seiner Expression in einem rekombinan ten Vaccinia-Virus der größte Teil des U_S-Bereiches des EHV- 1-Genoms sequenziert, und die verschiedenen auf diesem DNA- Fragment gefundenen offenen Leserahmen wurden exprimiert. Drei neue von der S-Komponente codierte EHV-1-Gene wurden identifiziert und analysiert: EHV-1 gD, das gemäß der Se quenzierung Homologie mit den Produkte der HSV gD- und PRV gp50-Gene aufwies, EHV-1 gp63, das Homologie mit den Produk ten der HSV US7- und PRV gp63-Gene aufwies und EHV-1 gE, das Homologie mit den Produkten der HSV gE- und PRV gI-Gene auf wies. Alle drei Gene wurden einzeln oder zusammen in ein Wirtsbereichs-Selektionssystem des Vaccinia-Stammes Copenha gen für schnelle Expressionsuntersuchungen cloniert. Die mit einem anti-EHV-1-Kaninchenserum erhaltene Immunfluoreszenz zeigte die Expression von spezifischen EHV-1-Produkten auf.

Clonierung des EHV-1 BamHI D-Fragments.

Da das EHV-1 gp17/18-Gen auf der S-Komponente des EHV-1-Ge noms lag (3), wurde das BamHI D-Fragment, das den größten Teil des U_S-Bereichs ausmachte (59) isoliert und cloniert. Genomische EHV-1 DNA des Stammes Kentucky D wurde mit BamHI gespalten. Das 11,0 kb BamHI D-Fragment wurde aus einem Aga rosegel (Geneclean, Bio101, Inc., La Jolla, CA) isoliert und in das Plasmid pIBI24 cloniert, wodurch sich das Plasmid pEHVBamHID ergab. Von diesem Fragment wurde eine Restrik tionskarte abgeleitet (Fig. 11).

Identifizierung der DNA-Sequenzen, die EHV-1 gD, gp63 und gE codieren.

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden für beide Stränge Nucleotidsequenzdaten aus einer Reihe von Subclonen des in pIBI24 subclonierten BamHI D-Fragments erhalten. Die Sequen zen der Verbindungen zwischen aufeinanderfolgenden Fragmen ten wurden auf dem Ausgangsclon pEHVBamHID überprüft. Bei allen Sequenzdatenanalysen wurde das Softwarepaket PC/GENE (Intelligenetics Inc., Mountain View, CA) verwendet.

DNA-Sequenzanalyse der EHV-1 gD- gp63- und gE-Gene.

Die DNA-Sequenzanalyse des 6402 bp-Bereichs, der vom (den größten Teil des einzigen kurzen Bereichs darstellenden) BamHI D-Fragments sequenziert worden war, offenbarte das Vorhandensein von mindestens drei vollständigen alle auf dem gleichen Strang zu lesenden offenen Leserahmen. Diese Se quenz ist in Fig. 12 als nach rechts gerichteter 5'-nach-3'- Strang angegeben. Die Basen-Zusammensetzung ist 50,44% G + C.

Der erste offene Leserahmen (ORF1) erstreckt sich von den Nucleotidpositionen 971 bis 2176. Mutmaßliche Transkrip tions-Regulationssignale wurden in dem Bereich 5'-seitig des höchstwahrscheinlichen ATG-Initiationscodons in Position 971 aufgefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz TATATTAA (Nucleo tide 871 bis 878) wurde 60 Nucleotide stromabwärts einer mutmaßlichen CAT-Box mit der Sequenz TGACAAT in den Positio nen 811 bis 817 aufgefunden. Ein Polyadenylierungssignal (AATAAA) wurde stromabwärts des TAA-Terminationscodons (Nucleotide 2177 bis 2179) nicht gefunden. Sieben von zehn Nucleotiden in der Sequenz 5' TCCCTTCGCC 3' (Nucleotide 890 bis 899) sind zur ribosomalen 185 RNA-Sequenz 3' AGGAAGGCGT 5' (61) komplementär und können als Ribosomen bindungsstelle dienen. Es ist ein Abtast-Modell vorgeschla gen worden, nach dem eukaryontische mRNAs die Translation initiieren (151). Die Hauptregel dieses Modells ist die, daß Ribosomen an das 5' -Ende der mRNA binden und das mRNA-Mole kül linear abtasten. Eine Festlegung auf die Transla tionsinitiation findet normalerweise am ersten 5'-proximalen ATG-Codon statt, obwohl Ausnahmen gefunden wurden (152). Ein Purin in der Position -3 ist für die Translationsinitiation essentiell, und die Translation wird durch ein C in den Po sitionen -1 und -2 stimuliert, wenn der Rest der Sequenz suboptimal ist (155). Der Sequenzzusammenhang um das ange nommene Initiationscodon AGCATGT (Nucleotide 968 bis 974) weist sich als ein funktioneller Sequenzzusammenhang für die Translationsinitiation eukaryontischer mRNA aus. Es gibt zwei weitere mögliche ATG-Initiationscodons, die sich in den Positionen 989 bis 991 bzw. 992 bis 994 befinden. Die Umge bung dieser beiden Codons CTTATGATGG weist sich nicht als funktionsfähig zur Translationsinitiation aus. Der EHV-1- ORF1 codiert 402 Aminosäuren mit einem berechneten Moleku largewicht von 45239 Dalton.

Analyse der Proteinstruktur des EHV-1-ORF1.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz offenbart eine Reihe mem branassoziierten Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich von Aminosäure 1 bis 26 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird angenommen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz han delt. Es wird vorausgesagt, daß ein hydrophober aus 24 Ami nosäuren (Aminosäuren 351 bis 374) bestehender hydrophober Bereich als transmembrane Anker-Domäne funktioniert. Es gibt vier Asn-X-Thr/Ser- (wobei X jeder Aminosäure außer Prolin sein kann) Stellen für eine potentielle N-verknüpfte Glyko sylierung (157). Das Hydrophobizitätsprofil der Aminosäure sequenz des EHV-1-ORF1 ist in Fig. 13 gezeigt. Die Charakte ristiken eines Membran-überspannenden Glykoproteins, ein schließlich der Signal- und Anker-Elemente, sind klar be stimmt. Es wird vorausgesagt, daß die am meisten hydrophoben Bereiche am N- und nahe des C-Terminus die Signalsequenz bzw. den Transmembran überspannenden Bereich des Glykopro teinmoleküls darstellen.

Vergleich der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF1 mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des mutmaßlichen EHV-1-ORF1-Proteins offenbart eine signifikante Homologie mit Glykoproteinen anderer Herpesviren. So weist das EHV-1- ORF1-Protein eine Ähnlichkeit mit PRV gp50 (95) und HSV-1 gD (79,160) auf.

Der zweite offene Leserahmen (ORF2) erstreckt sich von der Nucleotidposition 2287 bis zur Nucleotidposition 3525. In dem Bereich 5'-seitig des ATG-Initiationscodons in der Posi tion 2287 wurde keine mutmaßliche Transkriptions-Regula tionssequenz gefunden. Ein AATAAA-Polyadenylierungssignal wurde stromabwärts des TGA-Terminationscodons (Nucleotide 3526 bis 3528) nicht gefunden, es liegen aber zwei poten tielle YGTGTTYY-Polyadenylierungssignale (180) ungefähr 40 und 70 bp stromabwärts von diesem Terminationscodon. Diese Sequenzumgebung und das vermutete Initiationscodon GCTATGG befindet sich in Übereinstimmung mit Kozak's Regeln (151, 155). Es gibt mindestens zwei weitere mögliche ATG-Initia tionscodons in den Positionen 2305 bis 2307 und 2332 bis 2334, aber die Sequenzumgebung dieser beiden Codons (GGGATGT und TCTATGG) weist sie nicht als funktionsfähig zur Transla tionsinitiation aus. Der EHV-1-ORF2 codiert ein 413 Amino säure-Polypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht von 45431 Dalton.

Analyse der Proteinstruktur von EHV-1-ORF2.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz offenbart eine Anzahl membranassoziierter Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich von den Aminosäuren 1 bis 22 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird vermutet, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt (obwohl die Computertrefferzahl für die mutmaßliche Score-Spaltstelle niedrig war). Es wird vorausgesagt, daß ein aus 32 Aminosäuren bestehender hydrophober Bereich (Po sitionen 315 bis 346) als transmembrane Anker-Domäne funk tioniert. Es gibt sieben Asn-X-Thr/Ser-Stellen für die po tentielle N-verknüpfte Glykosylierung. Eine Hydrophobizi tätsgrafik der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF2 ist in Fig. 14 gezeigt. Die Charakteristiken eines membranüberspannenden Glykoproteins einschließlich der Signal- und Ankerelemente sind klar definiert. Es wird vorausgesagt, daß die beiden am meisten hydrophoben Bereiche am N- und nahe des C-Terminus die Signalsequenz bzw. den transmembranüberspannenden Bereich des Glykoproteinmoleküls darstellen.

Vergleich der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF2 mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des EHV-1-ORF2 offenbart eine signifikante Homologie mit den Glykoproteinen anderer Herpesviren. So ist das EHV-1-ORF2-Protein homolog mit PRV gp63 (80), VZV gpIV (181) und HSV-1 US7 (79).

Der dritte offene Leserahmen (ORF3) erstreckt sich von den Nucleotidpositionen 3796 bis 5451. Mutmaßliche Transkrip tions-Regulationssignale wurden im Bereich 5'-seitig des ATG-Initiationscodons in der Position 3796 gefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz GTTTAAA (Nucleotide 3705 bis 3711) lag 50 Nucleotide stromabwärts der mutmaßlichen CAT-Box in den Positionen 3649 bis 3654, die die Sequenz GCAATG auf wies. Stromabwärts des TGA-Terminationscodons (Nucleotide 5452 bis 5454) wurde kein eindeutiges Polyadenylierungs signal gefunden. Der Sequenzzusammenhang um das vorgeschla gene Initiationscodon herum, ACAATGG, ist in Übereinstimmung mit Kozak's Regeln (151, 155). Der EHV-1-ORF3 codiert ein 552 Aminosäure-Polypeptid mit einem berechneten Molekularge wicht von 61493 Dalton.

Analyse der Proteinstruktur des EHV-1-ORF3.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz offenbarte eine Anzahl membranassoziierter Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich über die Aminosäuren 1 bis 23 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird angenommen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt. Es wird vorausgesagt, daß ein hydrophober aus 38 Aminosäuren bestehender Bereich (Positionen 404 bis 437) als transmembrane Anker-Domäne funktioniert. Es gibt fünf Asn-X- Thr/Ser-Stellen für die potentielle N-verknüpfte Glykosylie rung. Ein Hydrophobizitätsdiagramm der Aminosäuresequenz des EHV-1 ORF3 ist in Fig. 15 gezeigt. Die Charakteristiken eines Membran-überspannenden Glykoproteins einschließlich der Signal- und Ankerelemente sind klar definiert. Es wird vorausgesagt, daß die beiden am meisten hydrophoben Bereiche am N- und nahe des C-Terminus die Signalsequenz bzw. den Transmembran-überspannenden Bereich des Glykoproteinmoleküls darstellen.

Vergleich der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF3 mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäure-Zusammensetzung des EHV-1-ORF3- Proteins enthüllt eine signifikante Homologie mit den Glyko proteinen anderer Herpesviren. So ist das EHV-1-ORF3-Protein homolog mit PRV gI (80), VZV gE (181) und HSV-1 gE (79).

Konstruktion eines auf dem Vaccinia-Virus Copenhagen basie renden Wirtsbereichs-Selektionssystems.

Es wurde ein auf dem Vaccinia-Virus Copenhagen basierendes Wirtsbereichs-Selektionssystem ähnlich dem WR-pHES/vP293 Wirtsbereichs-Selektionssystem (69) konstruiert.

Bei der Copenhagen-Vaccinia-Virus-Deletionsmutante vP668 werden 12 Gene vom Bereich, der sich von HindIII C bis HindIII K erstreckt, deletiert, einschließlich der beiden Human-Wirtsbereichsgene KIL (70) und C7L, einem Gen, das auf HindIII C kartiert. vP668 ist nicht in der Lage, auf menschlichen MRC-5-Zellen zu wachsen. Mitglieder der COPCS- Plasmidserien enthalten das C7L-Gen innerhalb der flankie renden Vaccinia-Arme, was die Rekombination mit vP668 und die Wiederherstellung der Fähigkeit des Virus, wieder auf MRC-5-Zellen zu wachsen, ermöglicht. Die Fähigkeit der re kombinanten Vaccinia-Nachkommenschaft, die durch Rekombina tion unter Verwendung des vP668/COPCS-Wirtsbereichs-Selek tionssystems erzeugt wurde, auf menschlichen MRC-5-Zellen Plaques zu bilden, stellte ein Verfahren zur schnellen Iden tifizierung dieser Rekombinanten bereit. Das Plasmid pCOPCS657 enthält einen synthetischen H6-Vaccinia-Promotor, dem ein Polylinker-Clonierungsbereich zur Insertion fremder Gene folgt. Dem Polylinkerbereich folgen Stoppcodons und ein Vaccinia-Transkriptions-Terminationssignal (45).

Clonierung des EHV-1 gD-Gens in pCOPCS657.

Wie in Fig. 16 gezeigt, wurde das Plasmid pEHVBamHID mit HindIII gespalten, und ein EHV-1 gD enthaltendes 1240 bp HindIII-DNA-Fragment wurde aus einem Agarosegel (Geneclean, Bio10, Inc., La Jolla, CA) isoliert und unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase repariert. Das repa rierte Fragment wurde dann mit dem mit SmaI gespaltenen Plasmid pCOPCS657 ligiert. Das resultierende Plasmid, pJCA006, besitzt ein ATG-Initiationscodon ungefähr 10 bp vom H6-Promotor entfernt (Fig. 16).

Clonierung des EHV-1 gp63-Gens in pCOPCS657.

Das Plasmid pEHVBamHID wurde mit HindIII, EcoRI und PvuII gespalten und das 1300 bp HindIII-PvuII-DNA-Fragment, das EHV-1 gp63 enthielt, wurde aus einem Agarosegel isoliert und mit Klenow repariert. Das reparierte Fragment wurde dann mit dem mit SmaI gespaltenen Plasmid pCOPCS657 ligiert. Das re sultierende Plasmid mit EHV-1 gp63 in der korrekten Orien tierung relativ zum H6-Promotor wurde mit pJCA008 bezeichnet (Fig. 16).

Clonierung des EHV-1 gE-Gens in PCOPCS657.

Das Plasmid pEHVBamHID wurde mit AatII und ApaI gespalten, und ein EHV-1 gE enthaltendes 2630 bp AatII-ApaI-DNA-Frag ment wurde aus einem Agarosegel isoliert und mit Klenow re pariert. Das reparierte Fragment wurde dann in das mit SmaI gespaltene Plasmid pCOPCS657 inseriert. Das resultierende Plasmid mit dem EHV-1 gE-Gen in der richtigen Orientierung relativ zum H6-Promotor wurde mit pJCA007 bezeichnet (Fig. 16).

Clonierung des EHV-1 gd-gp63-Fragments in pCOPCS657.

Wie aus Fig. 17 hervorgeht, wurde pEHVBamHID mit EcoRI und PvuII gespalten, und das 1832 bp EcoRI-PvuII-DNA-Fragment (A) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pJCA006 wurde mit ClaI und EcoRI gespalten und das 1450 bp ClaI- EcoRI-DNA-Fragment (B) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pCOPCS657 wurde mit ClaI und SmaI gespalten und das 3700 bp ClaI-SmaI-DNA-Fragment (C) wurde aus einem Aga rosegel isoliert. Die Fragmente A, B und C wurden dann mit einander ligiert und das resultierende Plasmid wurde mit pJCA009 bezeichnet (Fig. 17).

Clonierung des EHV-1 gD-gp63-gE-Fragments in pCOPCS657.

Das Plasmid pEHVBamHID wurde mit EcoRI und SacII gespalten und das 4240 bp EcoRI-SacII-DNA-Fragment (D) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Fragment D wurde dann mit den Frag menten B und C ligiert (s. oben) unter Zugabe von dNTPs, um die Reparatur der Verbindung SacII-SmaI zu gewährleisten. Das resultierende Plasmid wurde mit pJCA010 bezeichnet (Fig. 17).

Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP773, vP803, vP809, vP810 und vP822, die die EHV-1 U_S-offenen Leserahmen exprimieren.

Um schnell die Expression der vorstehend beschriebenen offe nen Leserahmen zu überprüfen, wurde unter Verwendung des COPCS-Wirtsbereichs-Selektionssystems eine Reihe von rekom binanten Vaccinia-Viren konstruiert. Die drei durch die Se quenzanalyse identifizierten offenen Leserahmen wurden ent weder einzeln oder zusammen ("doppelt" und "dreifach") in das Plasmid pCOPCS657 cloniert (Fig. 16, 17). Die resul tierenden Plasmide wurden dann verwendet für die Rekombina tion mit der Vaccinia-Rekombinante vP668 als Rettungsvirus.

Die aus diesen Rekombinationen erhaltenen verschiedenen re kombinanten Vaccinia-Viren sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Die Vaccinia-Rekombinante vP773 wurde aus einer Rekombina tion erhalten, die mit dem Donorplasmid pJCA006, das das EHV-1 gD-Gen enthielt, durchgeführt wurde. Die Vaccinia-Re kombinante vP822 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem das EHV-1 gp63-Gen enthaltenden Donorplasmid pJCA008 durchgeführt wurde. Die Vaccinia-Rekombinante vP803 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem das EHV-1 gE- Gen enthaltenden Donorplasmid pJCA007 durchgeführt wurde. Die Vaccinia-Rekombinante vP809 wurde aus einer Rekombina tion erhalten, die mit dem das EHV-1 gD-gp63-Fragment ent haltenden Donorplasmid pJCA009 durchgeführt wurde, und die Vaccinia-Rekombinante vP810 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem das EHV-1 gD-gp63-gE-Fragment enthal tenden Donorplasmid pJCA010 durchgeführt wurde (Tabelle 5).

Immunfluoreszenzanalyse der EHV-1-ORF1-(gD), ORF2-(gp63) und ORF3-(gE) Produkte, die durch einzel- oder vielfachre kombinante Vaccinia-Viren synthetisiert waren.

Immunfluoreszenz von mit rekombinanten Vaccinia-Virus-infi zierten VERO- und MRC-5-Zellen wurde, wie in Beispiel 1 be schrieben, unter Verwendung des polyclonalen anti-EHV-1-spe zifischen Kaninchenserums R5935 (1 : 200) durchgeführt (Ta belle 6).

Tabelle 5

Bezeichnung der Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die EHV-1 gD-, gE- und gp63-Gene exprimieren

Tabelle 6

Immunfluoreszenz von mit rekombinanten Vaccinia-Virus-infi zierten Zellen, die unter Verwendung des anti-EHV-1-Kanin chenserums R5935 durchgeführt wurde

Beispiel 10 Immunologische Beurteilung der einzelnen oder in Kombination von Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimierten Pseudorabies- Virus-Glykoproteinen gpII, gpIII und gp50 in Mäusen und Schweinen

In diesem Beispiel wurden der Vaccinia-Virus-Stamm Copenha gen und seine Derivate vP419, vP415 und vP456 (184) verwen det.

Clonieren der PRV-Gene, die gpII, gpIII und gp50 codieren.

Das PRV NIA₃-Virus (182) wurde auf NIL₂-Zellkulturen (183) vermehrt. Die Zelltrümmer wurden durch 30 Minuten Zentrifu gation bei 3000 xg aus dem Überstand entfernt. Die Virions wurden durch 60 Minuten Zentrifugation in einem 45 Ti Beck man-Rotor bei 40000 UpM durch ein 40% (Gew./Vol.) Saccha rosekissen gereinigt. Anschließend wurde eine Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen 30-50%igen (Gew./Vol.) Saccharose-Gradienten vorgenommen (SW25 Beckman-Rotor 5 Stunden bei 23000 UpM). Bandierte Virions wurden gesammelt, mit TNE-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 150 mM NaCl und 10 mM EDTA) verdünnt und 1 Stunde bei 30000 UpM in einem SW40 Beckman-Rotor sedimentiert. Das virale Sediment wurde in TE- Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM EDTA) resuspendiert und durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (Gew./Vol.) und Proteinase K bis 100 mg/ml lysiert. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Lysat einmal mit Phenol : Chloroform (1 : 1) und einmal mit Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in Wasser aufgenommen. Nach der vollständigen Spaltung mit BamHI wurden die Fragmente in die BamHI-Stelle von pBR322, das zuvor mit alkalischer Phospha tase aus Kälberdarm (CIAP) behandelt worden war, cloniert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation des kompeten ten E. coli-Stammes NM522 (20) verwendet.

Wie aus den Fig. 18 und 20 zu ersehen ist, liegt die das gpII-Gen codierende DNA-Sequenz im BamHI-Fragment 1 und in den SalI-Subfragmenten 1A und 1B des PRV-Genoms (62, 94). Das mit pPR9.25 bezeichnete Plasmid, das das PRV-BamHI-Fragment 1 in der BamHI-Stelle von pBR322 inseriert, enthielt, wurde mit NcoI gespalten. Die resultierende DNA-Spaltung wurde auf einem 0,8% Agarosegel fraktioniert, und ein 6,2 kb NcoI- DNA-Fragment wurde unter Anwendung des Gene Clean®-Verfah rens (Bio101, Inc. La Jolla, CA) gereinigt und anschließend in die NcoI-Stelle von mit CIAP behandelten pBR328 (Boehrin ger Mannheim, Biochemicals, Indianapolis, IN) inseriert. Das resultierende Plasmid pPR2.15 wurde mit SphI gespalten und auf einem Agarosegel fraktioniert. Die 2,7 und 1,8 kb-Frag mente wurden gereinigt und zur Herstellung der Plasmide pPR1 und pPR2 (Fig. 18) in die mit Phosphatase behandelte SphI- Stelle von pUC18 und in den M13-Phagen inseriert. Die Nucleotidsequenz wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen offenen Leserahmen mit 2742 bp, der 913 Aminosäuren codierte. Wie erwartet (62), war eine signifikante Aminosäurehomologie mit HSV-1 gB zu beobachten. Zur Vereinfachung der Beschreibung der Clo nierungsmanipulation zur Expression von PRV gpII in Vacci nia-Virus-Vektoren sind die DNA-Sequenz des PRV gpII-offenen Leserahmens mit zusätzlichen 5'- und 3'-nicht-codierenden Sequenzen in Fig. 19 gezeigt.

Wie aus den Fig. 20 und 21 hervorgeht, liegt die das PRV- Glykoprotein gpIII codierende DNA-Sequenz in den BamHI-Frag menten 2 und 9 des PRV-Genoms (96). Das Plasmid pPR9.9, das das BamHI-Fragment 2 inseriert in die BamHI-Stelle von pBR322 enthält (Fig. 20), wurde mit BamHI und SphI gespal ten. Das Plasmid pPR7.5, das das BamHI-Fragment 9 inseriert in die BamHI-Stelle von pBR322 enthielt, wurde mit NcoI und BamHI gespalten. Die aus beiden Spaltungen resultierende DNA wurde auf einem Agarosegel fraktioniert. Das 2,35 kb SphI- BamHI-Fragment und das 1,1 kb NcoI-BamHI-Fragment wurden gereinigt und in die mit Phosphatase behandelten EcoRI-SphI- Stellen von IBI25 (Fig. 20) unter Verwendung des phosphory lierten NcoI-EcoRI-Linkers MRSYN21/MRSYN22 ligiert.

Ein mit pPR17 bezeichnetes Plasmid wurden isoliert, das ein 3450 bp SphI-NcoI-Fragment enthielt, das das vollständige PRV gpIII-Gen enthielt (Fig. 20). Die Nucleotidsequenz wurde aus doppelsträngigen mit Alkali denaturierten Plasmidmatri zen und aus einzelsträngigen Matrizen nach der Clonierung in den Phagen M13 erhalten. Die DNA-Sequenzanalyse enthüllte einen offenen Leserahmen von 1440 bp, der 479 Aminosäuren codierte (Fig. 21). Wie früher berichtet (96), wurde eine signifikante Homologie mit HSV gC beobachtet.

Fig. 22 und 23 entsprechend liegt die das PRV-Glykopro tein gp50 codierende DNA-Sequenz in dem BamHI-Fragment 7 des PRV-Genoms (95). Das Plasmid pPR7.1 (Fig. 22), das das PRV- BamHI-Fragment 7 inseriert in die BamHI-Stelle von pBR322 enthielt, wurde mit StuI und NdeI gespalten und mit Mungo bohnen-Nuclease behandelt. Das 1,7 kb-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert, und in die HincII-Stelle von mit Phosphatase behandeltem IBI25 inseriert. Dieses Plasmid, pPR22 (Fig. 22), enthält das gesamte pRV gp50-Gen. Die Be stimmung der Nucleotidsequenz offenbarte einen 1215 bp-offe nen Leserahmen, der 404 Aminosäuren codierte (Fig. 23). Wie früher berichtet (95), wurde eine signifikante Homologie mit HSV-1 gD beobachtet.

Clonierung der gpII, gpIII und gp50 codierenden PRB-Gene in Vaccinia-Virus-Insertionsdonor-Plasmide.

Das 1060 bp PRV SphI-NheI-Fragment von pPR1 (Fig. 18A) wurde aus einem Agarosegel isoliert und in die BamHI-SphI-Stellen von pIBI25 nach Behandlung mit CIAP zur Erzeugung des Plas mids pPR6 (Fig. 18A) inseriert unter Verwendung des phospho rylierten BamHI-NheI-Linkers MRSYN1/MRSYN2

pPR6 wurde mit HindIII und ApaI gespalten und mit CIAP be handelt. Die ApaI-Stelle liegt 32 bp stromabwärts des ATG- Initiationscodons von PRV gpII (Fig. 19). Ein doppelsträngi ges DNA-Fragment wurde durch Aneinanderlagern des Paares synthetischer phosphorylierter Oligonucleotide MESYN3/MRSYN4 erhalten. Dieses Fragment enthält die den Vaccinia-H6-Promo tor von der EcoRV-Stelle bis zum unterstrichenen ATG spezi fizierende DNA, an die sich unmittelbar PRV gpII codierende Sequenzen anschließen.

Die synthetische DNA wurde mit dem 3920 bp HindIII-ApaI- Fragment, das aus pPR6 abgeleitet war, ligiert, um das Plas mid pPR9 zu erzeugen (Fig. 18A).

Das Plasmid pPR9 wurde mit BamHI und NheI gespalten, mit CIAP behandelt und unter Verwendung eines phosphorylierten BamHI-SphI-Linkers

mit einem aus pPR1 erhaltenen 1640 bp SpHI-NheI-Fragment li giert, um das Plasmid pBR12 zu erhalten (Fig. 18A, 18B).

Das 1030 bp HincII-SphI-Fragment aus pPR2 (Fig. 18A) wurde aus einem Agarosegel isoliert und in die mit Phosphatase be handelten HincII-SphI-Stellen von pUC18 inseriert. Das re sultierende Plasmid pPR10 wurde mit HindIII und NaeI gespal ten und mit CIAP behandelt. Die NaeI-Stelle liegt 44 bp stromaufwärts des TAG-Terminationscodons (Fig. 19). Ein durch Aneinanderlagern des Paares der phosphorylierten syn thetischen Oligonucleotide MRSYN9/MRSYN10

erhaltene doppelsträngige DNA wurde mit dem aus pPR10 abge leiteten 3720 bp NaeI-HindIII-Fragment ligiert, um das Plas mid pPR11 zu erzeugen.

Die unterstrichenen Sequenzen beziehen sich auf das PRV gpII-Terminationscodon und auf ein frühes Vaccinia-Trans kriptions-Terminationssignal (45). Das 770 bp SphI-HincII- Fragment aus pPR2 wurde aus einem Agarosegel gereinigt und unter Verwendung des phosphorylierten BamHI-SphI-Linkers (MRSYN7/MRSYN8 in die BamHI-HincII-Stelle von mit CIAP behandeltem pPR11 inseriert, um pPR13 zu erzeugen ( Fig. 18A, 18B). Das mit EcoRI und SphI gespaltene und mit CIAP behandelte pPR12 wurde unter Verwendung des phosphory lierten HindIII-EcoRI-Linkers (MRSYN19/MRSYN20

mit einem isolierten aus pPR13 abgeleiteten 990 bp HindIII- SphI-Fragment ligiert, um das Plasmid pPR15 zu erzeugen (Fig. 18B).

Das mit HindIII-EcoRV gespaltene 2780 bp-Fragment aus pPR15 wurde mit Mungobohnen-Nuclease behandelt, aus einem Agarose gel gereinigt und zur Erzeugung des Plasmids pPR18 (Fig. 18B) inseriert in das Plasmid pTP15 (184) (Fig. 3), das mit XmaIII-EcoRV gespalten und mit Mungobohnen-Nuclease und CIAP behandelt worden war. In pPR18 ist PRV gpII mit dem synthe tischen Vaccinia-H6-Promotor im Vaccinia-Hämagglutinin-De letionsort verknüpft. Dieses Plasmid wurde zur Transfektion von Vaccinia-Virus-infizierten Zellen verwendet, um die Vac cinia-Rekombinanten vP534, vP644, vP621 und vP692 zu erhal ten, die das PRV gpII-Gen enthalten (siehe unten).

Das PRV gpIII-Gen wurde so manipuliert, daß es unter der Kontrolle des frühen Vaccinia-Viruspromotors µ (siehe unten) steht, der im Vaccinia HindIII-B-Fragment liegt. Unter An wendung ortsspezifischer Mutagenese wurde in PRV gpIII durch Änderung der Sequenz CGC (Basen 192-194) (Fig. 21) zu ATG eine NsiI-Stelle und durch Ändern der Sequenz GTGACGT zu TTCTAGA (Basen 1632-1638) (Fig. 21) eine XbaI-Stelle einge führt. Dazu wurde vom Plasmid pPR17 unter Verwendung des Helfer-Phagen R408 (Stratagene, La Jolla, CA) (185) eine einzelsträngige DNA erzeugt. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung der beiden gereinigten phosphorylier ten synthetischen Oligonucleotide MRSYN5 und MRSYN6

und die Selektion in dem E. coli dur^- ung^--Stamm CJ236 (IBI, New Haven, CT) (17, 186) durchgeführt.

Durch diese Mutationen wurde das Plasmid pPR28 erzeugt. Das Plasmid pPR28 wurde mit NsiI und XbaI gespalten und mit Mun gobohnen-Nuclease behandelt. Ein 1440 bp-Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt und in die BglII-HpaI-Stellen von pSD47BVC (Fig. 20, 24) nach Behandlung mit Mungobohnen- Nuclease und CIAP inseriert. Mit Vaccinia-Virus infizierte Zellen wurden mit dem Plasmid pPR24 transfiziert, um die Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP604, vP644, vP691 und vP692 zu erzeugen, die das PRV gpIII-Gen enthalten (siehe unten), PRV gp50 wurde so behandelt, daß es unter der Kontrolle des frühen/mittleren Vaccinia-Viruspromotors I3L (187) steht. Unter Anwendung ortsspezifischer Mutagenese wurde in gp50 durch Ändern der Sequenz CCTGCCAGCGC (Basen 177-187) (Fig. 23) zu ATGCATTTAAT eine NsiI-Stelle und durch Ändern der Se quenz CCTCCGCAGTACCGG bei den Basen 1404-1418 (Fig. 23) zu AATTTTTATAGATCT eine BglII-Stelle eingeführt. Früher be schriebene Mutageneseverfahren (17, 185, 186) wurden zur Er zeugung des Plasmids pPR29 aus pPB22 angewandt unter Verwen dung der gereinigten phosphorylierten synthetischen Oligo nucleotide MRSYN12 und MRSYN13 (Fig. 22).

pPR29 wurde mit NsiI gespalten, mit Mungobohnen-Nuclease be handelt und partiell mit BglII gespalten, um ein 1290 bp Fragment zu erzeugen. Das Plasmid pMP13PP (Fig. 22, 25) wurde mit EcoRI gespalten, mit Mungobohnen-Nuclease und dann mit BamHI behandelt, um ein den Vaccinia I3L-Promotor ent haltendes 140 bp-Fragment zu erzeugen. Die 1290 und 140 bp- Fragmente wurden aus Agarosegelen gereinigt und in die mit Phosphatase behandelte BglII-Stelle von pMP409DVC (Fig. 4, 22) ligiert. Das resultierende Plasmid pPR26 wurde in eine Rekombination zur Herstellung der Vaccinia-Virus-Rekom binanten vP591, vP621, vP691 und vP692 verwendet, die das gp50-Gen enthalten (siehe unten).

Konstruktion der Vaccinia-Rekombinanten, die die PRV-Glyko proteine gpII, gpIII und gp50 einzeln oder in Kombinationen exprimieren.

Um die Immunogenität und den relativen Betrag dieser drei PRV-Glykoproteine (gpII, gpIII und gP50) zum Schutz immuni sierter Tiere gegen eine Infektion mit virulentem PRV abzu schätzen, wurde eine Serie von Vaccinia-Rekombinanten kon struiert, die die drei PRV-Glykoproteine alleine oder in Kombination exprimieren.

Wie aus Fig. 24 ersichtlich, wurde das rekombinante Vacci nia-Virus v2533, das das β-Galactosidasegen exprimiert, wie folgt konstruiert: Ein 1 kb-Bereich innerhalb des Vaccinia HindIII-Fragments B, der die SalI F/I-Verknüpfung des Copen hagen-Genoms überspannt, enthält, wie durch "Southern blot"- Analyse (189) gezeigt, eine DNA-Homologie mit dem hämorrha gischen (µ)-Gen des Kuhpockenvirus (188). Das µ-Gen codiert ein Polypeptid, das eine Ähnlichkeit mit Serinprotease-Inhi bitoren aufweist und das biologisch verantwortlich für die hämorrhagische Pockenbildung durch das Virus auf der chorio allantoinen Membran ist. Die DNA-Sequenz des Copenhagen-Ge noms offenbarte, daß das µ-Gen-Äquivalent vielfache Raster verschiebungs-Mutationen enthielt und biologisch nicht funk tionsfähig war. Das Plasmid pSD419VC (184) (Fig. 24) enthält den linken Anteil des µ-Bereichs. Das Plasmid pSD422VC, das das Copenhagen-SalI-Fragment I in pUC8 cloniert enthält, enthält den Rest des µ-Bereichs. Um links liegende uner wünschte Vaccinia-Sequenzen zu beseitigen, wurden pSD419VC mit NcoI und SmaI gespalten, mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase stumpfendig gemacht und re-ligiert, woraus sich das Plasmid pSD476VC ergab (Fig. 24). Das Plasmid pSD422VC wurde mit HpaI und NruI gespalten, und ein ungefähr 0,3 kb-Fragment, das unmittelbar rechts des µ-Bereichs liegt, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde in mit HincII (das SalI-Stellen erkennt) gespaltenes pSD476VC ligiert, wodurch sich das Plasmid pSD477VC ergab. Um die β-Galactosidase unter der Kontrolle des µ-Promotorbe reichs des Vaccinia-Virus Copenhagen zu exprimieren, wurden synthetische 22mere/20mere Oligonucleotide hergestellt. Die Sequenz des 22meren/20meren mit den angegebenen Restrik tionsstellen und dem unterstrichenen ATG-Initiationscodon lauten wie folgt:

Das aneinandergelagerte 22mere/20mere Gemisch wurde in mit ClaI und HincII gespaltenes pSD477VC ligiert, wodurch sich das neue Plasmid pSD479VC (Fig. 24) ergab. Ein 3,1 kb BamHI- Fragment, das die E. coli-β-Galactosidase codierende Sequenz aus pMC1871 (34) ohne das Initiationscodon und den Promotor enthielt, wurde in mit BamHI gespaltenes pSD479VC ligiert. Das resultierende Plasmid, das das LacZ-Gen in der korrekten Orientierung unter der Kontrolle des Copenhagen µ-Promotors enthielt, wurde mit pSD479VCBG bezeichnet. Dieses Inser tions-Donor-Plasmid wurde in Vaccinia-Virus vP410 (184) re kombiniert. Ein rekombinantes Vaccinia-Virus wurde auf der Basis der Bildung blauer Plaques in Gegenwart des chromoge nen Substrates X-gal (9, 24) identifiziert, Plaque-cloniert und mit vP533 bezeichnet (Fig. 24).

Zur Konstruktion eines Vektorplasmids für die Insertion von fremden Genen wurden die synthetischen 42mere/40mere Oligo nucleotide hergestellt.

Das aneinandergelagerte 42mere/40mere-Gemisch wurde in mit ClaI und HincII gespaltenes pSD477VC ligiert, wodurch sich das neue Plasmid pSD478VC ergab (Fig. 24). Dieses Plasmid enthält ungefähr 0,3 kb Vaccinia-Sequenzen auf jeder Seite des Multiclonierungsbereichs, der den µ-codierenden Bereich des Vaccinia-Stammes Copenhagen vollständig ersetzt. pSD478VC wurde zur Erzeugung von pPR24 (Fig. 20), das die PRV gpIII-codierenden Sequenzen enthält und von den Vacci nia-Rekombinanten vP604, vP644, vP691 und vP692 verwendet.

Entsprechend Fig. 25 enthält das Plasmid pMP419 ein aus dem Vaccinia HindIII-Fragment I stammendes den I3L-Promotor ent haltendes 850 bp BamHI-Fragment inseriert in die BamHI- Stelle von pUC8 (Fig. 25). Das I3L-Promotorelement ent spricht DNA-Sequenzen stromaufwärts des I3L-offenen Leserah mens im Vaccinia HindIII-Fragment I (187) und ist früher verwendet worden, um fremde Gene in Vaccinia-Virus-Rekom binanten zu exprimieren (27, 190). pMP419 wurde in seiner einzigen ClaI-Stelle innerhalb der I3L-codierenden Sequenzen linearisiert und einem Ba131-Verdau unterworfen. An schließend wurde mit EcoRI gespalten und durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase stumpfe Enden erzeugt. Das resultierende Plasmid pMP419-5 (Fig. 25) ent hält verknüpft mit einer EcoRI-Stelle die I3L-Promotorse quenzen stromaufwärts des Nucleotids -8. Das Promotorelement wurde als ein EcoRI-MspI-Fragment aus pMP419-5 isoliert, in das mit EcoRI-ClaI gespaltete pUC13C, einem pUC13-Derivat, das ClaI-Linker in der SmaI-Stelle enthält, inseriert. Das resultierende Plasmid pMP13PP (Fig. 22, 25) enthält die I3L-Promotorsequenzen von Position -126 bis Position -8, denen eine EcoRI-Stelle in Position -8 folgt.

Das durch den Vaccinia I3L-Promotor angetriebene PRV gp50 wurde in dem M2L-Deletions-Plasmidvektor pMP409DVC inseriert (Fig. 4), wodurch sich pPR26 ergab (Fig. 22). pPR26 wurde zur Erzeugung der Vaccinia-Rekombinanten vP591, vP621, vP691 und vP692 verwendet.

Isolieren rekombinanter Vaccinia-Viren.

Rekombinante Vaccinia-Viren, die die PRV-Gene enthielten, wurden wie vorstehend beschrieben identifiziert und gerei nigt. Rekombinante Vaccinia-Viren, die die drei PRV-Glyko proteine gpII, gpIII und gp50 allein oder in Kombination ex primieren, sind in Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7

Bezeichnung der Vaccinia-Pirus-Rekombinanten, die die PRP- Glykoproteine gpII, gpIII und gp50 exprimieren

In vitro-Beurteilung der PRV-Glykoproteine, die durch die Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimiert werden.

Die PRV-Glykoproteine gpII, gpIII und gp50 sind typische mit den membranartigen Strukturen von PRV infizierten Zellen as soziierte Glykoproteine und sind außerdem Bestandteile des Virus. anti-gpII, anti-gpIII und anti-gp50 spezifische mono clonale Antikörper, denen Fluorescein-konjugierte Ziegen anti-Maus-IgG folgten, ergaben eine starke Oberflächenim munofluoreszenz auf mit rekombinanten Vaccinia-Viren infi zierten Zellen, nicht aber in mit Wildtyp-Vaccinia-Virus in fizierten Zellen.

In vivo-Einschätzung des immunogenen Potentials der PRV-Gly koproteine gpII, gpIII und gp50, die durch Vaccinia-Virus- Rekombinanten in Maus und Schwein exprimiert wurden.

Um die relative Immunogenität der drei durch Vaccinia-Virus- Rekombinanten exprimierten PRV-Glykoproteine abzuschätzen, wurden in die Pfote von Mäusen 50 bis 100 µl verschiedener Dosen rekombinanter Viren inoculiert. 14 Tage nach der Immu nisierung wurden die Mäuse auf intraperitonealem Wege mit 10 LD₅₀ des virulenten PRV-Kojnock-Stammes infiziert. In vorbe reitenden Experimenten war gezeigt worden, daß jedes der PRV-Glykoproteine wirksam im Schutz inoculierter Mäuse gegen eine virulente PRV-Infektion ist. In einer ausgedehnteren Serie von Experimenten, bei denen über 500 Mäuse verwendet wurden, wurde die Wirksamkeit der PRV-Glykoproteine expri mierenden Vaccinia-Rekombinanten abgeschätzt. Die Vakzinie rungsdosis, die zu einem Schutz von 50% der infizierten Mäuse führte (PD₅₀) wurde errechnet und die Ergebnisse die ser Studien sind in Tabelle 8 gezeigt. Die rekombinanten Vaccinia-Viren, die die PRV-Glykoproteine gpII, gp50 und gpIII einzeln exprimieren, erzeugen errechnete PD₅₀-Werte von 6,4 bzw. 5,4 und 5,8 (log₁₀). Wenn die Glykoproteine in Kombination exprimiert werden, errechnen sich bessere PD₅₀- Werte. Die PRV gpII plus gp50 exprimierenden Vaccinia-Rekom binante erzeugte einen PD₅₀-Wert von 3,3, während die PRV gp50 plus gpIII exprimierende Vaccinia-Rekombinante einen im wesentlichen ähnlichen PD₅₀-Wert (3,6) ergab. Offensichtlich wirksamer ist die die PRV-Glykoproteine gpII plus gpIII ex primierende Rekombinante, bei der man einen PD₅₀ von 1,5 er hält. Die Coexpression aller drei PRV-Glykoproteine gpII, gpIII und gp50 in einem rekombinanten Vaccinia-Virus liefert keinen PD₅₀-Wert, der signifikant niedriger liegt als die Werte, die mit den rekombinanten Viren erhalten wurden, die die drei PRV-Glykoproteine einzeln exprimieren. Die erhöhte Wirksamkeit, die man mit der Vaccinia-Rekombinanten, die gpII und gpIII exprimiert, erhält, ist im Vergleich mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus, das die Gene einzeln expri miert, ähnlich den Ergebnissen, die in Beispiel 6 für die Coexpression der Pferde-Herpesvirus-Glykoproteine gp13 und gp14 beschrieben wurden.

Tabelle 8

Potenz der Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die die Pseudora bies-Virus-Glykoproteine gp50, gpII und gpIII exprimieren

Obwohl die Maus ein interessantes Modellsystem zur Bewertung der PRV-Glykoprotein-Immunogenität bereitstellen kann, ist die Haupt-Zielart für das PRV-Vakzin das Schwein. Deshalb wurde zur Beurteilung der Gültigkeit des rekombinanten Vac cinia-Virus-Verfahrens im Schwein das folgende Experiment durchgeführt. Ferkel mit ungefähr 25 kg wurden mit 2 ml der Kombinationen der PRV-Glykoproteine gpII, gpIII und gp50 ex primierenden Vaccinia-Rekombinanten intramuskulär inocu liert. Das Virus-Inoculum wurde in PBS verdünnt. 35 Tage nach dieser Inoculation wurden die Ferkel durch eine intra nasale Injektion (1 ml in jedes Nasenloch) einer Suspension mit dem virulenten PRV-Isolat NIA3 infiziert. Die Wirksam keit der Vakzinierung wurde durch vergleichende Messung der Gewichtszunahme von vakzinierten und Kontroll-Ferkeln 7 Tage nach der Infektion bewertet. Der relative Gewichtszuwachs errechnet sich aus dem täglichen mittleren prozentualen Ge wichtszuwachses, der in vakzinierten Schweinen zu beobachten war, abzüglich des täglichen mittleren prozentualen Ge wichtszuwachses unvakzinierter Kontrollschweine. Der normale Gewichtszuwachs von Schweinen unter ungestörten Bedingungen ist größer als 1,1 kg. Wie durch die Ergebnisse in Tabelle 9 gezeigt, ist die Gewichtsentwicklung während der 7-tägigen Periode nach der PRV-Infektion in vakzinierten Ferkeln stark gesteigert gegenüber dem mit Wildtyp-Virus inoculierten Kon trollsatz. Eine einzige Inoculation mit den Vaccinia-Virus- Rekombinanten ergibt einen signifikanten Schutz gegen einen Gewichtsverlust nach einer Infektion mit virulentem PRV.

Tabelle 9

Bewertung der Vaccinia-Rekombinanten, die Kombinationen der PRV-Glykoproteine gp50, gpII und gpIII in Ferkeln exprimie ren

Die Verfügbarkeit von Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die die drei Haupt-PRV-Glykoproteine einzeln oder in Kombination ex primieren, bieten eine Reihe von Vorteilen, PRV-Infektionen zu kontrollieren: (a) Ein nennenswerter Vorteil ist es, daß die rekombinanteen Vaccinia-Viren als Vakzinierungsmittel lediglich eine begrenzte Anzahl der PRV-Gene exprimieren und es deshalb kein begleitendes Risiko einer Reversion eines attenuierten PRV-Vakzinstammes in eine virulente Form gibt und deshalb keine fortlaufende Einführung von PRV-Virus in die Umgebung stattfindet; (b) da durch die rekombinanten Vaccinia-Virus-PRV-Vakzinkandidaten nur eine begrenzte An zahl von PRV-Antigenen exprimiert wird, gestattet dies die Unterscheidung von vakzinierten gegenüber natürlich infi zierten Tieren, da aus anderen PRV-Antigenen bestehende Diagnosemittel zur Unterscheidung zwischen vakzinierten und natürlicherweise infizierten Tieren zusammengestellt werden könnten; und (c) solche rekombinanten Vakzine könnten nütz lich sein für das Durchbrechen der natürlichen vertikalen Transmission von PRV von der Muttersau zur Nachkommenschaft. Dies ließe sich erreichen durch die Vakzinierung der träch tigen Sau mit einer Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die einen diskreten Satz von PRV-Glykoproteinen exprimiert. Maternale Immunität sollte die Nachkommenschaft gegen PRV-Infektion schützen. Die Nachkommenschaft ihrerseits könnte dann mit einer Vaccinia-Virus-Rekombinanten vakziniert werden, die noch eine andere von der zur Vakzinierung der Sau verwende ten verschiedene Konfiguration von PRV-Antigenen exprimiert. Dies ist ein möglicher Weg, um die maternale Immunität zu durchbrechen. Ein anderes Vorgehen bezüglich des Sachver halts der maternalen Immunität würde es sein, die PRV-Glyko proteine, in welcher Kombination auch immer, in einem voll ständig heterologen Vektor zu exprimieren. Dies wird er reicht durch die Konstruktion von Vogelpockenvirus-Rekom binanten, die PRV-Glykoproteine exprimieren. Die Nützlich keit von Vogelpockenvirus-Rekombinanten, deren natürlicher Wirtsbereich auf Vogelarten beschränkt ist, bei der Vakzi nierung von Nicht-Vogelarten ist beschrieben (41). Somit sind zwei Vorgehensweisen bezüglich des Sachverhalts einer durch die maternale Immunität herbeigeführten Barriere ver fügbar: (1) Die Vektoren und (2) die Konstellation der von diesen Vektoren exprimierten Antigene.

Beispiel 11 Vogelpockenvektoren, die das Pseudorabies-Virus Glykoprotein gpII exprimieren

Unter früher beschriebenen Bedingungen (41, 42) wurden Kana rienpockenviren vermehrt auf primären Hühnerembryofibrobla sten (CEF), die aus 10 bis 11 Tage alten Embryo enthaltenden Eiern abgeleitet waren, die von SPAFAS, Inc. (Norwich, CT) bezogen wurden. Nach dem Verfahren von Joklik (191) wurde das Virus von Wirtszellverunreinigungen durch Saccharose- Gradienten-Zentrifugation gereinigt. Schweinenieren-(PK-1-) Zellen wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC #CL101) bezogen.

Konstruktion einer Kanarienpocken-Virusrekombinanten, die das Pseudorabies-Virus gpII-Glykoorotein exprimiert.

Fig. 26 entsprechend wurde das Plasmid pPR15 (Fig. 18) als Quelle des PRVgpII-Gens verwendet. Zum Isolieren des DNA-Ab schnittes, der das gesamte PRVgpII-Gen enthält, wurde pPR15 mit EcoRV und HindIII gespalten. Durch diese Spaltung wurde ein Fragment mit ungefähr 2,8 kb erzeugt, das 21 bp des 3'- Endes des Vaccinia-Virus-(VV) H6-Promotors und das gesamte PRVgpII-Gen enthält. Das 2,8 kb EcoRV/HindIII-Fragment wurde für die Insertion in pFPCV2 (Fig. 8, 26) isoliert.

Das (vorstehend definierte) 2,8 kb EcoRV/HindIII-Fragment wurde in das 8,0 kb pFPCV2-Fragment inseriert, das sich aus der vollständigen Spaltung mit HindIII und einer partiellen Spaltung mit EcoRV herleitet. Die Ligation dieser beiden Fragmente ergab die Bildung eines 10,8 kb-Plasmids, das mit pFPPRVII bezeichnet wurde.

Das Plasmid pFPPRVII wurde gemäß Fig. 27 verwendet, um ein 2,8 kb NruI/HindIII-Fragment für die Insertion in pCPCV1 (Fig. 9) zu erzeugen. Das pCPCV1-Plasmid enthält den VV H6- Promotor in der einzigen EcoRI-Stelle innerhalb des genomi schen 3,3 kb PvuII-CP-Fragments. Dieses Insertionsplasmid erlaubt die Insertion fremder Gene in den C3-Ort des CP-Ge noms. Das Plasmid pCPCV1 wurde mit NruI und HindIII gespal ten, und das 5,8 kb-Fragment wurde für die Ligation mit dem vorstehend definierten 2,8 kb-Fragment isoliert. Das resul tierende Plasmid wurde mit pCPPRVII bezeichnet.

Der Hauptselektionsmarker, E. coli-Xanthinguanin-Phosphori bosyltransferase (Eco gpt) wurde in pCPPRVII als Wachstums selektionsmittel für CP/PRVgpII-Rekombinante inseriert. Frü here Berichte haben die Verwendung von Eco gpt als selek tierbaren Marker bei der Erzeugung rekombinanter Pockenviren beschrieben (193, 194). Das Eco gpt-Gen wurde aus dem Plasmid pSV2gpt (ATCC #37145) erhalten. Das 670 bp BglII/DraI-Frag ment, das das Eco gpt-Gen enthält, wurde von diesem Plasmid isoliert und in die BglII/SmaI-Stelle von pSD486VC inse riert. Das resultierende Plasmid pGPT-1 enthält das Eco gpt- Gen zwischen den flankierenden Armen des VV µ-Gens und unter der Transkriptionsregulation des µ-Promotors. Das Plasmid pSD486VC wurde aus pSD478VC (Fig. 24) auf folgende Weise ab geleitet. pSD478VC wurde mit EcoRI im MCR gespalten, in einer Klenow-Standard-Reaktion in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) aufgefüllt und re-ligiert, um pSD478 E^- VC herzu stellen. Dieses Plasmid wurde mit HpaI und BamHI gespalten und die aneinandergelagerten Oligonucleotide HEM 5 (5'- GATCCGATTCTAGCT-3') und HEM 6 (5'-AGCTAGAATCG-3') wurden zur Herstellung von pSD486VC inseriert.

Die Spaltung von pGPT-1 mit NcoI und EcoRI setzte ein 1,0 kb-Fragment frei, das das Eco gpt-Gen (670 bp) und den VV-µ- Promotor (330 bp) enthielt. Die NcoI- und EcoRI-Enden wurden in Gegenwart von 0,5 mM dNTPs unter Verwendung des Klenow- Fragmentes der E. coli DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. An das stumpfendige Fragment wurden HindIII-Linker (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) angeheftet. Die DNA wurde mit HindIII gespalten und das 1,0 kb-Fragment aus einem Agarosegel wiedergewonnen. Dieses 1,0 kb HindIII-Frag ment wurde dann in die HindIII-Stelle von pCPPRVII inse riert. Das resultierende Plasmid, das die Eco gpt- und PRVgpII-Gene, in einer Schwanz-zu-Schwanz-Konfiguration mit einander verknüpft, enthielt, wurde mit pCPPRVII gpt be zeichnet. Dieses Plasmid wurde in in vitro-Rekombinationsex perimenten zur Insertion in den C3-Ort des CP-Genoms verwen det. Die Selektionierung von Rekombinanten, die das Eco gpt- Gen enthielten, wurde in Gegenwart von 100 µg/ml Mycophenol säure vorgenommen, und die Eco gpt-positiven Rekombinanten wurden anschließend durch Plaque-Hybridisierungsanalyse auf die Anwesenheit des PRVgpII-Gens abgesucht. Eco gpt- und PRV gpII-positive Plaques wurden über drei Cyclen einer Plaque- Isolierung gereinigt, und saubere Populationen wurden mit einem hohen Titer aufgezogen und mit pCP55 bezeichnet. "Southern blot"-Analysen bestätigten, daß diese beiden Gene tatsächlich genetisch in diesen CP-Rekombinanten miteinander verknüpft sind. Die CP-Rekombinante wurde mit vCP55 bezeich net.

Immunfluoreszenz von vCP55-infizierten Zellen.

Es wurden Immunfluoreszenz-Untersuchungen durchgeführt, um die zelluläre Lokalisierung des in vCP55-infizierten Zellen exprimierten PRV gpII-Gens zu zeigen. CEF- oder PK-1-Zellen wurden auf 22 mm Glasdeckgläschen in 35 mm Schalen mit 5 × 10⁵-Zellen pro Schale ausgesät. CEF- und PK-1-Zellen wurden entweder mit vCP55 oder mit dem CP-Elternvirus infi ziert. Infektionen und Inkubationen für den Immunfluores zenztest wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt unter Verwendung des 1 : 100 in PBS+-verdünnten monoclonalen Antikörpers 75N10.

Die infizierten Zellen wurden sowohl auf interne als auch auf Oberflächenexpression hin analysiert. In keinem der mit vCP55-infizierten Zellsysteme wurde eine signifikante Ober flächenexpression von gpII beobachtet. Eine interne Expres sion des gpII-Genproduktes ließ sich jedoch sowohl im vCP55- infizierten CEF- als auch in PK-1-Zellen beweisen. Die in ternen Fluoreszenzsignale in beiden Zelltypen wurden in Gra nula im perinuclearen Bereich der infizierten Zellen lokali siert. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das durch CP expri mierte PRVgpII in den Golgi-Komplex, nicht aber in die Plas mamembran transportiert wird. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von den Ergebnissen, die erhalten wurden mit dem von Vaccinia-Virus exprimierten gpII, das auf der Oberfläche in fizierter Zellen nachgewiesen wurde.

Immunpräzipitation von PRVgpII aus CEF- und PK-1-infizierten Zellen.

Die Expression des PRVgpII-Genprodukts durch vCP55 wurde durch Immunpräzipitation von Lysaten der infizierten Zellen analysiert. Zelleinzelschichten wurden mit 5 pfu/Zelle infi ziert. Der Immunpräzipitationstest wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers 75N10 durchgeführt.

Die mit Kaninchen-anti-PRV-Serum gefällten Hauptpolypep tidarten von infizierten CEF- und PK-1-Zellen wandern mit apparenten Molekulargewichten von ungefähr 120 kDa, 67 kDa und 58 kDa. Diese Polypeptide stellen die Vorstufe bzw. pro teolytisch prozessierte Formen des in PRV infizierten Zellen nachgewiesenen PRVgpII dar, die über Disulfidverknüpfungen komplexiert sind (86, 101, 196). In kleinerer Menge vorhandene Arten mit apparenten Molekulargewichten von ungefähr 26 kDa wurden ebenfalls beobachtet, und sie könnten weitere proteo lytische Prozessierungsereignisse bei gpII in diesen mit der CP/PRV-Rekombinanten infizierten Zellen widerspiegeln. Aus Lysaten von Kontroll-CP-Virus-infizierten Zellen und uninfi zierten Zellen wurden keine äquivalenten Polypeptide präzi pitiert.

Untersuchung der Schutzwirkung.

Die Fähigkeit von vCP55, eine Schutz-Immunantwort gegen eine Infektion mit lebendem PRV hervorzurufen, wurde im Maus- System analysiert. Mäuse wurden in der Pfote mit 50 bis 100 µl-Proben, die verschiedene in Tabelle 10 aufgeführte Mengen von vCP55 enthielten, inoculiert. 14 Tage nach der Immuni sierung erhielten die Mäuse eine 16fache LD₅₀ des PRV- Kojnock-Stammes auf intraperitonealem Wege. 14 Tage nach der Infektion, als das Experiment beendet wurde, wurden die Überlebenden ausgezählt. Wie in Tabelle 10 gezeigt, schützte die Inoculation von Mäusen mit einer einzigen Dosis von 10^6,85 TCID₅₀ acht von zehn Mäusen vor einer tödlichen PRV- Infektion. Die niedrigeren getesteten vCP55-Mengen gewährten keinerlei Schutz. Eine Infektion mit lebendem PRV tötete sieben von acht nicht-vakzinierten Mäusen. Aus den in Ta belle 10 gezeigten Ergebnissen wurde eine PD₅₀ (50% Schutz dosis) von 10^6,16 für die vCP55-Rekombinante berechnet.

Die Wirksamkeit von vCP55 als Immunisierungsmittel gegen eine Infektion mit lebendem PRV wurde ebenfalls in der Zielart, dem Ferkel, bewertet. Fünfzehn, beinahe 25 kg wie gende Ferkel wurden in drei Gruppen unterteilt. Sowohl die vCP55-Gruppe als auch die CP-Elternvirusgruppe erhielten je zwei Inoculationen (2 ml entsprechend 2 × 10⁸ TCID₅₀) an den Tagen 0 und 28 auf intramuskulären Weg. Fünf Ferkel wurden als nicht-vakzinierte Kontrolle behalten. Allen Ferkeln wurde über den intranasalen Weg am Tag 35 der pathogene PRV- Stamm NIA3 verabreicht. Die Wirksamkeit wurde durch Verglei chen der Gewichtsentwicklung der vCP55-vakzinierten und der Kontrollschweine während der sieben Tage nach der Infektion verfolgt. Die Gewichtsentwicklung werden als Delta GMQR- Werte (in Kilogramm) = mittlerer prozentualer GMQR der vac cinierten Ferkel - mittlerer prozentualer GMQR der unvakzi nierten Ferkel berechnet.

In der unvakzinierten Gruppe verendeten alle Ferkel der PRV- Virus-Infektion (zwei am Tag fünf, zwei am Tag sechs und eines am Tag sieben). In der mit Wildtyp-Virus (CP) inoculierten Gruppe verendeten vier der fünf Ferkel der Infektion (drei am Tag sechs, eins am Tag sieben). Alle Ferkel der vCP55 vakzinierten Gruppe überlebten die PRV- Infektion und gediehen.

Bei den Ferkeln, die mit dem das PRVgpII-Glykoprotein expri mierenden vCP55 inoculiert worden waren, wurde ein nennens wertes Ausmaß des Schutzes gegen eine Infektion mit lebendem PRV beobachtet (Tabelle 11). vCP55-vakzinierte Tiere wiesen einen signifikanten Nettogewichtszuwachs während der Zeit des Experiments auf, während die beiden Kontrollgruppen einen signifikanten Gewichtsverlust in dem der PRV-Infektion folgenden Zeitraum aufwiesen. Außerdem wurden in der vCP55- vakzinierten Gruppe keine Todesfälle beobachtet, während eine 80%ige bis 100%ige Mortalitätsrate nach der Infektion mit lebendem PRV mit den Kontrollgruppen festgestellt wurde.

Tabelle 10

Wirksamkeit von vCP55 in Mäusen

Tabelle 11

Schutz vakzinierter (vCP55)-Ferkel gegen eine PRP-Infektion, der durch Mortalitätsrate und Gewichtszuwachs bestimmt wurde

Beispiel 12 PRV gI-Glykoproteine exprimierende Vaccinia-Rekombinanten

Der Copenhagen-Stamm von Vaccinia-Virus und die davon abge leiteten Rekombinanten wurden in dem vorliegenden Beispiel verwendet.

Clonierung des PRVgI-Gens in Donorplasmide von Kanarien pocken und Vaccinia-Virus.

Es wird auf Fig. 28 Bezug genommen. Das das PRVgI-Gen (NIA3- Stamm) enthaltende Plasmid pGPI wurde von Rhône Merieux, Lyon, Frankreich, erhalten. Das gI-Gen (Bezug zur Sequenz (80)) wurde aus diesem Plasmid isoliert und stromabwärts des synthetischen Vaccinia H6-Promotors (69) cloniert. Dies wurde durch die Clonierung des 2330 bp XhoI-NcoI (partiell)- Fragments von pGPI in das 6400 bp XhoI-NcoI-Fragment von pGBC2 erreicht. (pGBC2 wurde durch Clonierung des HSV2-gB- Gens in das 3200 bp BglII-Fragment von pRW764.5 erzeugt. pRW764.5 wurde durch Clonierung eines 0,8 kb PvuII-Fragments der Kanarienpocken-DNA in das 2360 bp PvuII-Fragment von pUC18 konstruiert.) Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pPGI2 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gI-Gens ausgerichtet. Dies wurde er reicht durch Clonierung der Oligonucleotide PRVL5

und PRVL6

in das 5900 bp EcoRV-AlwNI (partiell)-Fragment von pPGI2. Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pPGI3 bezeichnet.

Nicht relevante PRV gI 3'-nicht-codierende Sequenzen wurden dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleo tide PRVL3

und PRVL4

in das 5200 bp SacI-AatII (partiell)-Fragment von pPGI3 er reicht. Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pPGI6 bezeichnet.

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gI-Gen wurde dann in ein Vaccinia-Virus-Donorplasmid cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonierung des 1750 bp NruI-BamHI-Frag ments von pPGI6 in das 5000 bp NruI-BamHI-Fragment von pBP14. (pBP14 enthält das Rinder-Leukämie-Virus-gag-Gen un ter der Kontrolle des synthetischen Vaccinia H6-Promotors im Vaccinia-Vektorplasmid pSD494VC. pSD494VC ist ein Subclon des Vaccinia-Virus Copenhagen HindIII-A-Fragmentes, in dem die Vaccinia-Gen codierende Sequenz, die eine Homologie mit Kuhpocken ATI-Gen aufweist (210), durch einen Polylinkerbe reich ersetzt ist.) Das setzt das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gI-Gen zwischen die Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Sequenzen, die das ATI-Gen flankieren. Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pPGI7 be zeichnet.

Das rekombinante Vaccinia-Virus vP717 wurde durch Transfek tion von mit vP410 infizierten Zellen mit pPGI7 erzeugt.

Konstruktion von vP717.

Das gI-Gen von PRV wurde in einem Vaccinia-Virus-Vektor clo niert. Die zur Konstruktion dieser vP717-Vaccinia-Virus-Re kombinanten verwendete Strategie ist in Fig. 28 skizziert. Das in vP717 enthaltene PRV gI-Gen ist zwischen die Vacci nia-Virussequenzen cloniert, die das ATI-Gen flankieren, und es verwendet den frühen/späten Vaccinia-Virus-Promotor H6 (41, 42, 69).

Immunfluoreszenz der PRV-codierten Polypeptide auf vP717-in fizierten Zellen.

In PRV infizierten Zellen wird gI auf der Plasmamembran ex primiert. Immunfluoreszenzuntersuchungen von vP717-infizier ten Zellen mit dem PRV gI-spezifischen monoclonalen Antikör per 42M17 zeigt, daß das in diesen Zellen produzierte PRV- codierte Polypeptid auch auf der Plasmamembran exprimiert wird.

Bewertung von vP717 in Mäusen.

Eine in vivo-Bewertung von vP717 in Mäusen erbrachte unter Verwendung von Standardverfahren einen Schutz gegen PRV-In fektion (Tabelle 12).

Tabelle 12

Bewertung der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP717, die PRV gpI in Mäusen exprimiert

Beispiel 13 Expression der Herpes simples-Virus Typ 2-Glykoproteine gB, gC und gD in Vaccinia-Virus-Rekombinanten entweder einzeln oder in Kombinationen

Das in diesem Beispiel verwendete HSV2 (Stamm g) (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) (ATCC #VR734) wurde in VERO-Zellen (ATCC #CCL81) vermehrt und durch Zentrifuga tion auf einem Saccharose-Gradienten (197) gereinigt.

Clonieren des HSV2 gB-Gens in Vaccinia-Virus-Donorplasmide.

Die Nucleotidsequenz des HSV2 gB-Gens ist früher beschrieben worden (116). Bezug nehmend auf Fig. 29 wurde ein 12 kb BglII-Fragment, das das HSV2 gB-Gen enthielt, aus genomi scher HSV2 (Stamm G)-DNA isoliert und in die BamHI-Stelle von pUC19 inseriert, wodurch das Plasmid pJ4 erzeugt wurde.

Das gB-Gen wurde dann zwischen flankierende Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Arme cloniert. Das wurde durch die Clonierung des 2700 bp SstII-SacI (partiell)-Fragmentes von pJ4 in das SstII-SacI-Fragment von pMP409DVC3 cloniert. (pMP409DVC3 ist ein Abkömmling von pMP409DVC (184) (Fig. 4), in dem die BglII-Stelle durch einen Polylinkerbereich ersetzt ist.) Dies setzt das gB-Gen zwischen die Vaccinia-Sequenzen, die das M2L-Gen flankieren. Das durch diese Manipulation er zeugte Plasmid wird mit pGB1 bezeichnet.

An das 3'-Ende des gB-Gens wurde dann im Raster ein Termina tionscodon hinzugefügt. Dies wurde durch das Clonieren der Oligonucleotide GBL3 5'-CTAATAG-3' und GBL4 5'- GATCCTATTAGAGCT-3' in das 6300 bp BamHI-SacI (partiell)- Fragment von pGB1 erreicht. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGB2 bezeichnet.

Der H6-Promotor wurde dann stromaufwärts des gB-Gens clo niert. Dies wurde durch die Clonierung des 370 bp BglII- Fragments von pBLVH14 erreicht, das den H6-Promotor in der BglII-Stelle von pGB2 enthielt (pBLVH14 enthält das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende Rinderleukämievirus- Hüllgen im Vaccinia HA-Deletionsort). Das durch diese Mani pulation erzeugte Plasmid wird mit pGB3 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gB-Gens ausgerichtet. Dies wurde er reicht durch Clonieren der Oligonucleotide GBL1

und GBL2

in das 6300 bp SstII-EcoRV (partiell)-Fragment von pG83. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGB5 bezeichnet. Im Plasmid pGB5 ist das HSV gB-Gen unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors in den M2L-Deletionsort von Vaccinia inseriert. Da der M2L-Insertionsort innerhalb eines größeren Bereichs des Genoms, den man deletieren kann, liegt, wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gB-Gen in eine andere Deletionsstelle in einem anderen Vaccinia-Virus- Donorplasmid cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 2800 bp BglII-BamHI-Fraqments von pGB5 in die BglII-Stlle von pSD513VCVQ erreicht. (pSD513VCVQ ist ein Subclon des Copen hagen-Vaccinia-Virus HindIII J-Fragments, in dem die das Thymidinkinase (TK)-Gen codierende Sequenz durch einen Poly linkerbereich ersetzt ist.) Damit ist das unter der H6-Pro motorkontrolle stehende gB-Gen zwischen die Vaccinia-Virus- Sequenzen gesetzt, die das TK-Gen flankieren. Das auf diesem Weg erzeugte Plasmid wird mit pGB6 bezeichnet.

Clonieren des HSV2 gC-Gens in Vaccinia-Virus-Donorplasmide.

Die Nucleotidsequenz des HSV2 gC-Gens ist früher bestimmt worden (117). Fig. 30 entsprechend wurde aus der genomischen HSV2 (Stamm G)-DNA ein das HSV2 gC-Gen enthaltendes 2900 bp SalI-Fragment isoliert und in die SalI-Stelle von pIBI25 in seriert, um das Plasmid pGC3 zu erzeugen.

Das gC-Gen wurde dann zwischen die flankierenden Vaccinia- Virus (Copenhagen)-Arme cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 2900 bp XhoI-BamHI-Fragments von pGC3 in die XhoI-BamHI-Stelle von pGC2. pGC2 wurde durch Clonieren des 370 bp BglII-Fragments von pBLVH14 erzeugt, das den Vacci nia-Virus H6-Promotor in der BglII-Stelle von pSD486VC enthielt. pSD486VC ist ein Subclon des Copenhagen-Vaccinia- Virus-HindIII-B-Fragments, in dem die codierende Sequenz des µ-Gens durch einen Polylinkerbereich ersetzt ist. Damit ist das gV-Gen zwischen die Vaccinia-Virus-Sequenz, die das µ- Gen flankiert, gesetzt. Das auf diesem Weg erzeugte Plasmid wird mit pGC5 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gC-Gens ausgerichtet. Dies wurde er reicht durch Clonieren der Oligonucleotide GCL1

und GCL2

in das 5400 bp NruI-SfiI-Fragment von pGCS. Das auf diesem Wege erzeugte Plasmid wird mit pGC10 bezeichnet.

Die nicht relevante 3'-nicht-codierende Sequenz wurde dann aus pGC10 beseitigt. Dies wurde erreicht durch Rezirkulari sierung des mit E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) behandelten 4900 bp SalI-SmaI (partiell)-Fragments von pGC10. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGC11 bezeichnet.

Von pGC11 wurde dann zusätzlich 3'-nicht-codierende Sequenz beseitigt. Dies wurde erreicht durch Clonieren des Oligo nucleotids GCL3 5'-CTAGGGCC-3' in das 4900 bp XbaI-ApaI (partiell)-Fragment von pGC11. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit pGC12 bezeichnet. im Plasmid pGC12 ist das HSV gC-Gen unter der Kontrolle des H6-Promotors in den µ-De letionsort von Vaccinia inseriert. Da der µ-Insertionsort innerhalb eines größeren deletierbaren Bereiches des Genoms liegt, wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors ste hende gC-Gen in die ATI-Insertionsstelle in einem Vaccinia- Virus-Donorplasmid cloniert. Das wurde erreicht durch Clo nieren des 1550 bp NruI-BamHI-Fragments von pGC12 in das 5000 bp NruI-BamHI-Fragment von pBP14. Damit wird das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gC-Gen zwischen die Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Sequenzen, die das ATI-Gen flan kieren, gesetzt. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGC13 bezeichnet.

Clonieren des HSV2 gD-Gens in Vaccinia-Virus-Donorplasmide.

Die Nucleotidsequenz des HSV2 gD-Gens ist früher bestimmt worden (118). Fig. 31 entsprechend wurde aus der genomischen DNA von HSV2 (Stamm G) ein das HSV2 gD-Gen enthaltendes 7,5 kb XbaI-Fragment isoliert und in die XbaI-Stelle von pIBI25 inseriert, womit das Plasmid pGD1 erzeugt wurde.

Das gD-Gen wurde dann stromabwärts des H6-Promotors zwischen flankierende Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Arme cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 1500 bp DraI-PstI-Frag ments von pGD1 in die SmaI-PstI-Stelle von pTP15 (184) (Fig. 3). Damit wird das gD-Gen stromabwärts des H6-Promotors und zwischen die Vacciniasequenzen, die das HA-Gen flankieren, gesetzt. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGD2 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gD-Gens ausgerichtet. Dies wurde er reicht durch Clonieren der Oligonucleotide GDL1

und GDL2

in das 5100 bp EcoRV-AhaII(partiell)-Fragments von pGD2. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGD5 bezeichnet.

Dann wurde nicht relevante 3'-nicht-codierende Sequenz ent fernt. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleo tide GDL3 5'-

und GDL4 5'-

in das 4800 bp NaeI-PstI-Fragment von pGD5. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGD7 bezeichnet.

5'-seitig des H6-Promotors wurde dann eine zusätzliche Se quenz hinzugefügt. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 150 bp BglII-EcoRV-Fragments von pGB6 (Fig. 30) in das 4800 bp BglII-EcoRV-Fragment von pGD7. Das auf diese Weise er zeugte Plasmid wird mit pGD8 bezeichnet.

Konstruktion rekombinanter Vaccinia-Viren.

Die zum Clonieren der HSV2 gB-, gc- und gD-Gene in Vaccinia- Virus verwendete Strategie ist in den Fig. 29 bzw. 30 und 31 skizziert. Alle Konstruktionen verwenden den frühen/spä ten Vaccinia-Virus-Promotor H6 (41, 42, 184). Jedes HSV2-Gen ist jedoch in einer unterschiedlichen Stelle des Vaccina-Vi rus-Genoms codiert. Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gB-Gen ist zwischen die das M2L-Gen flankierende Sequenz (vP5699 oder die Sequenz, die das TK-Gen flankiert (vP734, vP775 und vP776) cloniert. Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gC-Gen ist zwischen die das µ-Gen flankierende Sequenz (vP579) oder die das ATI-Gen flankie rende Sequenz (vP748, vP776 und vP777) cloniert. Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gD-Gen ist zwischen die das HA-Gen flankierende Sequenz (vP570, vP761, vP775 und vP777 cloniert. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP569 wurde durch Transfektion von vP458-infizierten Zellen mit pGD5 er zeugt. vP734 wurde durch Transfektion von vP618-infizierten Zellen mit pGB6 erzeugt. vP579 wurde durch Transfektion von vP533-infizierten Zellen mit pGC11 erzeugt. vP748 wurde durch Transfektion von vP618-infizierten Zellen mit pGC13 erzeugt. vP570 wurde durch Transfektion von vP425-infizier ten Zellen mit pGB5 erzeugt. vP761 wurde durch Transfektion von vP618-infizierten Zellen mit pGD8 erzeugt.

vP425 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus (Copenha gen), aus dem das TK-Gen deletiert und das HA-Gen durch β- Galactosidase (Beispiel 1) (184) ersetzt worden war. vP458 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus (aus dem das TK-Gen deletiert und das M2L-Gen durch β-Galactosidase (Bei spiel 2) ersetzt worden war. vP533 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus, bei dem das TK-Gen deletiert und das µ-Gen durch β-Galactosidase ersetzt worden ist. vP618 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus, bei dem die TK-µ- und ATI-Gene deletiert worden sind.

Rekombinantes Vaccinia-Virus, das zwei HSV2-Glykoprotein- Gene enthielt, wurden ebenfalls konstruiert. vP775 enthält die gB- und gD-Gene, vP776 enthält die gB- und gC-Gene und vP777 enthält die gC- und gD-Gene. vP775 wurde durch Trans fektion von vP734-infizierten Zellen mit pGD8 erzeugt. vP776 wurde durch Transfektion von vP734-infizierten Zellen mit pGCl3 erzeugt. vP777 wurde durch Transfektion von vP748-in fizierten Zellen mit pGD8 erzeugt.

Ein drei HSV2-Glykoproteingene enthaltendes rekombinantes Vaccinia-Virus wurde ebenfalls konstruiert. vP812 enthält die gB-, gC- und gD-Gene von HSV-2. vP812 wurde durch Trans fektion von vP776-infizierten Zellen mit pGD8 erzeugt.

Immunfluoreszenz von HSV2-Glykoproteinen in mit rekombinan ten Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

In HSV2-infizierten Zellen werden gB, gC und gD (genauso wie andere HSV2-codierte Glykoproteine) in der Plasmamembran ex primiert. Immunfluoreszenzuntersuchungen, die an Zellen, die mit HSV2-Gene enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Viren durchgeführt wurden, zeigen, daß die HSV2-Polypeptide, die in den mit diesen rekombinanten Vaccinia-Viren infizierten Zellen produziert wurden, ebenfalls auf der Plasmamembran exprimiert werden.

Immunpräzipitation von HSV2-Glykoproteinen in Zellen, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus infiziert waren.

Das in HSV2-infizierten Zellen produzierte HSV2 gB-Glykopro tein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 117 kDa (198, 199). Zellen, die mit rekombinanten Vaccinia-Viren, die das HSV2 gB-Gen enthalten (vP569, vP734, vP775 und vP776) produzieren ebenfalls ein HSV2-codiertes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 117 kDa. Eine Immunprä zipitation von vP569-infizierten Zellen mit Antiseren gegen das gesamte HSV2-Virus präzipitiert zwei Hauptproteine mit Molekulargewichten von ungefähr 117 kDa und 110 kDa und in geringeren Mengen drei Proteine mit Molekulargewichten von 50 kDa, 45 kDa und 30 kDa. Eine Immunpräzipitation von vP734-, vP775- und vP776-infizierten Zellen präzipitiert zwei Hauptproteine mit ungefähren Molekulargewichten von 110 kDa und 90 kDa und fünf Proteine in geringeren Mengen mit Molekulargewichten von ungefähr 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa und 30 kDa.

Das in HSV2-infizierten Zellen produzierte HSV2 gC-Glykopro tein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 63 kDa (199, 200). Zellen, die mit den das HSV2 gC-Gen enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Viren vP579, vP748, vP776 und vP777) infiziert waren, produzierten ebenfalls ein HSV2-codiertes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 63 kDa. Eine Immunpräzipitation von vP579-, vP748-, vP776- und vP777-infizierten Zellen mit Antiseren gegen Gesamt-HSV2-Vi rus präzipitiert ein Hauptprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 65 kDA und ein Protein in kleinerer Menge mit einem Molekulargewicht von ungefähr 85 kDa. Kaninchenantise ren gegen Gesamt-HSV2-Virus wurden von DAKO Corporation (Santa Barbara, CA; Code Nr. B116) bezogen und in einer Ver dünnung von 1 : 100 verwendet.

Das in HSV2-infizierten Zellen produzierte HSV2-gD-Glykopro tein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 51 kDa (198, 199). Zellen, die mit den das HSV2 gd-Gen enthaltenden re kombinanten Vaccinia-Viren (vP570, vP761, vP775 und vP777) infiziert waren, produzierten ebenfalls ein HSV2-codiertes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 51 kDa. Eine Immunpräzipitation von mit vP570-, vP761-, vP775- und vP777-infizierten Zellen mit Antiseren gegen das Gesamt- HSV2-Virus präzipitiert ein Hauptprotein mit einem Moleku largewicht von ungefähr 48 kDa und zwei Nebenproteine mit Molekulargewichten von ungefähr 40 und 31 kDa.

In-vivo-Bewertung.

Alle die die verschiedenen HSV-Glykoprotein-Konstruktionen exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Viren schützen bei Ex perimenten, die denen von Paoletti et al. (26) beschriebenen ähnlich sind, immunisierte Mäuse gegen eine anschließende letale HSV-Infektion.

Beispiel 14 Expression des Rinder-Herpesvirus 1 eines Glykoproteins gI in Vaccinia-Virus-Rekombinanten Clonieren des BHV1 gI-Gens in Vaccinia-Virus-Donorplasmide.

Die Nucleotidsequenz des pHV1 gI-Gens ist früher veröffent licht worden (63). Im folgenden wird auf Fig. 32 Bezug ge nommen. Das das BHV1 gI-Gen (Straub-Stamm) enthaltende Plas mid pIBRS6 wurde von Rhône Mérieux, Lyon, Frankreich, bezo gen. Das 5'-Ende des gI-Gens wurde stromabwärts des H6-Pro motors (41, 42, 69) und zwischen die flankierenden Vaccinia- Virus (Copenhagen) Arme cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 540 bp SalI-PstI-Fragments von pIBRS6 in das 4400 bp SalI-PstI-Fragment von pGD5 erreicht (pGDB wurde durch Clo nieren des HSV2-gD-Gens in pTP15 (184) erzeugt (Fig. 3)). Damit wird das gI-Gen stromaufwärts des H6-Promotors und zwischen die HA-flankierenden Vaccinia-Arme gesetzt. Das auf diesem Wege erzeugte Plasmid wird mit pIBR2 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gI-Gens ausgerichtet. Dies wurde er reicht durch Clonieren der Oligonucleotide IBRL1 5'-

und IBRL2 5'-

in das 3800 bp NruI-SstII-Fragment von pIBR2. Das auf diesem Wege erzeugte Plasmid wird mit pIBR4 bezeichnet.

Dann wurde eine für die weiteren Manipulationen notwendige NcoI-Stelle erzeugt. Dies wurde durch Clonieren der Oligo nucleotide IBRL3 5'-CCATGGTTTAATGCA-3' und IBRL4 5'- TTAAACCATGGTGCA-3' in die PstI-Stelle von pIBR4 erreicht. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pIBR5 bezeich net.

Das 3'-Ende des gI-Gens wurde dann in pIBR5 cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 1740 bp Tth111I-NcoI- Fragments von pIBRS6 in das 3700 bp Tth111I-NcoI-Fragment von pIBR5. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pIBR7 bezeichnet.

Dann wurde eine für zukünftige Manipulationen notwendige BglII-Stelle erzeugt. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide IBRL5 5'-CATGGTTTAAGATC 49550 00070 552 001000280000000200012000285914943900040 0002004090565 00004 49431TC-3' und IBRL6 5'-CATGGAGATCTTAAAC-3' in die NcoI-Stelle von pIBR7. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pIBR8 bezeichnet.

Ein Teil der langen hydrophilen Leader-Sequenz des gI-Gens wurde dann deletiert (63). Dies wurde erreicht durch Clonie ren der Oligonucleotide, IBRL7 5'-

und IBRL8 5'-

in das 4400 bp NruI-ApaI (partiell)-Fragment von pIBR8. Da durch werden 132 bp der hydrophilen Leader-Sequenz elimi niert. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pIBR9 bezeichnet.

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende, verkürzte gI-Gen wurde dann in ein anderes Vaccinia-Virus-Donorplasmid cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 1700 bp NruI-BglII-Fragments von pIBR9 in das 4900 bp NruI-BamHI- Fragment von pBP14 (211). Das auf diese Weise erzeugte Plas mid wird mit pIBR10 bezeichnet.

Konstruktion rekombinanter Vaccinia-Viren.

Die zum Clonieren des BHV1 gI-Gens in Vaccinia-Virus verwen dete Strategie ist in Fig. 32 skizziert. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP637 wurde durch Transfektion von vP410-in fizierten Zellen mit pIBR7 erzeugt. vP724 wurde durch Trans fektion vP410-infizierter Zellen mit pIBRIO erzeugt. vP637 enthält das gesamte BHV1 gI-Gen. vP724 enthält ein gI-Gen, bei dem 132 bp der 5'-Signalsequenz (63) deletiert sind. Beide Konstruktionen verwenden den frühen/späten Vaccinia- Virus-Promotor H6 (41, 42, 184). Das gI-Gen in vP637 ist zwi schen die das HA-Gen flankierenden Sequenzen cloniert. Das gI-Gen in vP724 ist zwischen die das ATI-Gen flankierenden Sequenzen cloniert.

Immunfluoreszenz und Nachweis eines BHV1-codierten Polypep tids in mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

In BHV1-infizierten Zellen wird gI auf der Plasmamembran ex primiert. Die Immunfluoreszenzuntersuchungen von Zellen, die mit vP637 oder vP724 infiziert sind, zeigen, daß das in die sen Zellen produzierte BHV1-codierte Polypeptid auch auf der Plasmamembran exprimiert wird. Immunfluoreszenzuntersuchun gen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die monoclonalen BHV1-gI-spezifischen Antikörper 4203 und 5106 wurden verwendet (201).

Beispiel 15 Expression des Katzen-Herpesvirus-Glykoproteins gB in einer Vaccinia-Virus-Rekombinanten

In diesem Beispiel wurde der WR-Stamm von Vaccinia-Virus (202) verwendet. Das vom WR-Stamm abgeleitete rekombinante Vaccinia-Virus vP293 wurde als Rettungs-Virus verwendet (69).

Extraktion der FHV-1-DNA und Clonieren des FHV-1 3,2 kb SacI-SacI-Fragments

FHV-1-DNA wurde aus dem C O-Stamm extrahiert und gereinigt. Das FHV-1-DNA-Genom wurde mit EcoRI gespalten und in das Plasmid pBR322 nach Standardverfahren ligiert (20) Diese FHV-1-Bank wurde mit aus dem PRVgII- (62) und BHV-1 gB- (203) Genen abgeleiteten DNA-Sonden abgesucht. Nachfolgende Hybridisierungen mit Subclonen, die sich aus zwei in der Hy bridisierung als positiv gefundenen EcoRI-Clonen ableiteten, ermöglichten eine genauere Kartierung des FHV-1 gB-Gens. Ein 3,2 kb SacI-SacI-Fragment, das das FHV-1 gB-Gen enthielt, wurde in pUC18 cloniert, wodurch das Plasmid pFHVgBC erzeugt wurde.

Sequenzieren des FHV-1 gB-codierenden SacI-SacI-Fracsments.

Nucleotidsequenzdaten für beide Stränge wurden von pFHVgBC und pFHVgBC abgeleiteten Subclonen unter Verwendung der mo difizierten T7-Sequenase wie vorstehend beschrieben erhal ten.

Clonieren des FHV-1 gB-Gens in ein Vaccinia-Virus-Donorplas mid.

Wie aus Fig. 33 hervorgeht, wurde das FHV-1 gB-Gen cloniert in pHES4, einem der Plasmide, die für das Wirtsbereichs-Se lektionssystem im Vaccinia-Virusstamm WR entworfen waren (69) (Fig. 10). Dieses Plasmid enthält das Wirtsbereichsgen K1L, das der Deletionsmutante vP293 gestattet, auf menschli chen Zellen zu replizieren. Das FHV-1 gB-Gen wurde unmittel bar stromabwärts des synthetischen Vaccinia H6-Promotors (69) inseriert. Das Plasmid pFHVgBC wurde mit KpNI und SacI gespalten und das das FHV-1 gB enthaltende 3150 bp-Restrik tionsfragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und dann in das vorher mit KpnI und SacI gespaltene Plasmid pHES4 li giert. Das resultierende Plasmid wurde mit pJCA001 bezeich net (Fig. 33).

DNA-Sequenzanalyse des FHV-1 gB-Gens.

Wie aus Fig. 34 hervorgeht, offenbarte die DNA-Sequenzana lyse einen sich von den Nucleotidpositionen 337 bis 3177 er streckenden offenen Leserahmen. Im Bereich 5'-seitig des ATG-Initiationscodons in der Position 337 wurden mutmafiliche Transkriptions-Regulationssignale gefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz AAATATAT (Nucleotide 184 bis 191) wurde 80 Nucleotide stromabwärts einer mutmaßlichen CAT-Box mit der Sequenz GGTGAGTA gefunden. 50 Nucleotide stromabwärts des TAA-Terminationscodons (Nucleotide 3178 bis 3180) lag ein Polyadenylierungssignal AATAAA (Nucleotide 3251 bis 3256). Acht von elf Nucleotiden der Sequenz 5'-TCATTCTAGCA-3' (Nucleotide 200 bis 210) sind zu der 185 ribosomalen RNA-Se quenz 3'-AGGAAGGCGT-5' (61) komplementär und können als Ri bosomen-Bindungsstelle dienen. Es wurde ein Abtastmodell vorgeschlagen, nach dem eukaryontische mRNAs die Translation initiieren (151, 155). Die Sequenzumgebung um das angenom mene Initiationscodon ATCATGT (Nucleotide 334 bis 340) weist sich als ein funktionsfähiger Sequenzzusammenhang für die Initiation der Translation eukaryontischer mRNA aus. Der FHV-1 gB-offene Leserahmen codiert 947 Aminosäuren mit einem errechneten Molekulargewicht von 106,2 kDA. Der G-+ C-Gehalt ist 45,8%.

Analyse der Struktur des FHV-1 gB-Proteins.

Die Analyse der Aminosäuresequenz offenbarte eine Reihe mem branassoziierten Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich von den Aminosäuren 23 bis 73 erstreckender Bereich be sitzt ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil, und es wird angenommen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt (Fig. 34). Wie aus Fig. 35 hervorgeht, gibt es eine der langen hydrophoben Signalsequenz vorangehende 22 Amino säure lange hydrophile Sequenz. Dieses Charakteristikum ist ebenfalls für das Pseudorabies (PRV) gII-Gen (62), für das Rinder-Herpesvirus-1 (BHV-1) gI-Gen (63) und für die Pferde- Herpesvirus-1 (EHV-1) (71) und Pferde-Herpesvirus-4 (EHV-4) (72) gp14-Gene, die alle ebenfalls Homologe von HSV gB sind, festgestellt worden. Es wird vorhergesagt, daß ein aus 42 Aminosäuren (Aminosäuren 789 bis 831) bestehender hydropho ber Bereich als transmembrane Anker-Domäne funktioniert. Die hydrophile cytoplasmatische Domäne enthält 116 Aminosäuren. Es gibt 10 Asn-X-Thr/Ser-Stellen (wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann) für die potentielle N-verknüpfte Glykosylierung (64), wobei eine Stelle in der Signalsequenz liegt. Es gibt zwei aufeinanderfolgende und nahe zusammen liegende potentielle proteolytische Spaltstellen (Arg-Arg- Ser) (Positionen 504 bis 506 und 515 bis 518), die mit denen in PRVgII (94), VZV gPII und HCMV gB (71) und EHV-1 gP14 (71, 72) identisch sind. Das Hydrophobizitätsprofil der FHV-1 gB-Aminosäuresequenz ist in Fig. 35 gezeigt.

Vergleich der FHV-1 gB-Aminosäuresequenz mit anderen Herpes virus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des FHV-1 gB- Gens offenbart eine ausgedehnte Homologie mit Glykoproteinen anderer Herpesviren. So ist das FHV-1 gE mit PRVGII (62), BHV-1 gI (63), Varicella zoster-Virus (VZV) gII (66, 204), HSV-1 gB (67), HSV-2 gB (205), EHV-1 gp14 (71) genauso homo log wie mit Glykoproteinen im Epstein-Barr-Virus (EBV) (68, 206) und im menschlichen Cytomegalovirus (HCMV) (10).

Konstruktion der Vaccinia-Rekombinanten vP713, die das FHV-1 gB-Glykoprotein exprimiert.

Die FHV-1 gB-codierenden Sequenzen wurden in einem Vaccinia- Virus-Vektor inseriert, wobei das WR-Vaccinia-Virus-Wirtsbe reichs-Selektionssystem pHES4/vP293 (69) verwendet wurde. Die Fähigkeit der rekombinanten Vaccinianachkommenschaft, die durch Rekombination unter Verwendung des WR-Vaccinia-Vi rus vP293/pHES-Wirtsbereichs-Selektionssystems erzeugt wurde, auf menschlichen MRC-5-Stellen Plaques zu bilden, er laubt eine schnelle Identifizierung dieser Rekombinanten (69). Die Vaccinia-Virus-Rekombinante vP713 wurde durch mit dem Plasmid pJCA001 als Donorplasmid und vP293 als Rettungs- Virus durchgeführte Rekombination erhalten (Fig. 33).

Immunfluoreszenz des durch vP713 synthetisierten FHV-1 gB- Glykoproteins.

Immunfluoreszenz von durch das rekombinante Vaccinia-Virus vP713 infizierten VERO- oder MRC-5-Zellen wurde, wie in Bei spiel 1 beschrieben, durchgeführt unter Verwendung des spe zifischen anti-FHV-1 gB-Schafserums #2854. Es wurde eine Multiplizität der Infektion von zwei pfu pro Zelle verwen det. Als zweiter Antikörper wurde Esel-FITC-anti-Schafs-IgG verwendet.

FHV-1 gB war auf der Oberfläche von mit der Vaccinia-Rekom binanten vP713 infizierten Zellen genauso nachweisbar wie intern nach Acetonfixierung. In vP410-infizierten Kontroll zellen wurde keine nennenswerte interne oder Oberflächen-Im munreaktivität gegen FHV-1 gB beobachtet.

Immunpräzipitation des durch vP713 synthetisierten FHV-1 gB- Glykoproteins.

Zur Beurteilung des durch vP713 exprimierten FHV-1 gB-Glyko proteins wurden VERO-Zellen mit vP713 infiziert und die Pro teine metabolisch mit ³⁵S-Methionin markiert. Unter Verwen dung des spezifischen anti-FHV-1 gB-Schafserums #2854 wurden Immunpräzipitationen mit den radioaktiv markierten Zellysa ten durchgeführt.

Mit 2 × 10⁶-Zellen pro 60 mm Schalen ausgesäte VERO-Zell- Einzelschichten wurden mit einer niedrigen Infektionsmulti plizität von 0,1 pfu pro Zelle des Kontroll-(vP410) oder des rekombinanten Vaccinia-Virus vP713 infiziert. Die Immunprä zipitationen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben durchge führt.

Mit dem spezifischen anti-FHV-1 gB-Serum wurden weder aus den uninfizierten VERO-Zellen noch aus VERO-Zellen, die mit dem Kontroll-Vaccinia-Virus vP410 infiziert worden waren, nennenswerte Produkte immunpräzipitiert. FHV-1 gB-radioaktiv markierte Produkte wurden durch das Serum #2854 aus mit vP713-infizierten VERO-Zellen präzipitiert. Es wurden fünf vorherrschende metabolisch radioaktiv markierte Polypeptide spezifisch präzipitiert. Die beiden größeren Polypeptide mit apparenten Molekulargewichten von 115 kDa und 110 kDa könn ten mit den nicht-glykosylierten Vorläufer- und reifen Pro teinen (theoretische Größen 106 kDa bzw. 98 kDa) korrespon dieren. Eine große Bande mit 68 kDa könnte die beiden glyko sylierten Untereinheiten (69 kDa + 66 kDa) repräsentieren, die sich aus einer proteolytischen Spaltung einer glykosy lierten, hier fehlenden Vorstufe (163 kDa) ergeben. Drei kleinere präzipitierte Produkte (59, 53 und 48 kDa) korre spondieren mit keinem bekannten FHV-1 gB-Produkt und können Abbauprodukte darstellen.

Beispiel 16 Clonierung und Expression von Epstein-Barr-Virus-Glykopro tein in Bockenvirusvektoren Clonieren der EBV gp340- und gp220-Gene in das Vaccinia-Do norplasmid pMP409DVC.

In diesem Beispiel wurden die EBV-Gene aus dem EBV-Stamm B95-8 isoliert (207), die gp340- und gp220-Gene waren cDNA- Clone (die Plasmide pMLPgp340 bzw. pMLPgp220) und die gB-, gH- und BBRF3-Gene wurden aus einer BamHI-Genbank isoliert. Wie aus Fig. 36 hervorgeht, wurde ein 2100 bp XmaI-ClaI- Fragment auf dem Plasmid pMLPgp220 in mit XmaI-AccI gespal tenes M13mp18 cloniert. Der auf diese Weise erhaltene Phage wurde mit mp18gp220 bezeichnet (Fig. 36). Durch in vitro-Mu tagenese (17) unter Verwendung der Oligonucleotide CM4

und CM5

wurde das gp220-Gen modifiziert, um unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors exprimiert zu werden. Das das modifi zierte gp220-Gen enthaltende Plasmid wurde mit mp18gp220(5 + 4) bezeichnet (Fig. 36).

Das modifizierte gp220-Gen wurde in das Plasmid SP131NotI cloniert, das den vollständigen synthetischen H6-Promotor enthält (69). Dies wurde erreicht durch Clonieren des 2300 bp NarI-EcoRV-Fragments von mp18gp220(5 + 4) in das 2940 bp coRV-NarI-Fragment des Plasmids SP131NotI. Das resultie rende Plasmid wurde mit SP131gp220 bezeichnet (Fig. 36).

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gp340-Gen wurde durch Clonieren eines 2360 bp ScaI-XhoI-Fragments aus pMLPgp340 in das XhoI-ScaI (partiell)-gespaltene Plasmid SP131gp220 erhalten. Das resultierende Plasmid wurde mit SP131gp340 (Fig. 36) bezeichnet.

Die unter der Kontrolle des H6-Promotors stehenden gp340- und gp220-Gene wurden in das Vaccinia-Virus-M2L-Insertions ort-Plasmid pMP409DVC cloniert (Fig. 4; in Fig. 36, 40 wird dieses Plasmid mit MP409 bezeichnet). Dies wurde erreicht durch Clonieren des mit Mungobohnen-Nuclease behandelten 2800 bp NotI-Fragments aus dem Plasmid SP131gp340 und des mit Mungobohnen-Nuclease behandelten 2100 bp NotI-Fragments aus dem Plasmid SP131gp220 in die mit Mungobohnen-Nuclease behandelte BglII-Stelle des Plasmids pMP409DVC. Die resul tierenden Plasmide wurden mit 409H6340 bzw. mit 409H6220 be zeichnet (Fig. 36).

Clonieren des EBV gB-Gens in das Vaccinia-Virus-Donorplasmid pMP409DVC.

Mit Bezugnahme auf Fig. 37 wurde ein 3500 bp EcoRI-XmnI- Fragment des EBV-DNA-BamHI-A-Fragments (207), das das EBV gB-Gen enthielt, aus einer genomischen EBV-Bank isoliert und in das 2837 bp HincII-EcoRI-Fragment von pIBI25 cloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit p25gB bezeichnet (Fig. 37).

Durch in vitro-Mutagenese (17, 185) wurde unter Verwendung der Oligonucleotide EBVBM5

und EBVBM3

das gB-Gen adaptiert, damit es unter der Kontrolle des Vac cinia H6-Promotors exprimiert wird. Das resultierende Plas mid wurde mit p25gB(5 + 3) bezeichnet.

Das 2600 bp EcoRV-EcoRI-Fragment von p25gB(5 + 3) wurde in das 3300 bp EcoRV-EcoRI-Fragment von SP131 cloniert. Das resul tierende Plasmid wurde mit SP131gB bezeichnet (Fig. 37).

Das H6-Promotor-gB-Gen wurde dann in das Vaccinia-Virus-Do norplasmid pMP409DVC cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des mit Mungobohnen-Nuclease behandelten 2700 bp- HindIII-Fragments von SP131gB in die mit Mungobohnen- Nuclease behandelte BglII-Stelle von pMP409DVC. Das resultierende Plasmid wurde mit 409H6gB bezeichnet (Fig. 37).

Clonieren des EBV gH-Gens in das Vaccinia-Donorplasmid pSD486VC.

In der EBV-Bank der clonierten BamHI-Restriktionsfragmente ist der offene Leserahmen BXLF2 in den Fragmenten BamHI X und BamHI T enthalten (207). Wie in Fig. 38 gezeigt, wurde der vollständige offene Leserahmen BXLF2 durch Clonieren des 830 bp SmaI-BamHI-Fragments von BamHI X in das 2880 bp SmaI- BamHI von pIBI24 rekonstituiert; das resultierende Plasmid wurde mit 24gH5 bezeichnet. Das 1850 bp BamHI-HindIII-Frag ment von BamHI T wurde in das 3660 bp BamHI-HindIII-Fragment von 24gH5 cloniert. Das resultierende Plasmid, das das voll ständige gH-Gen enthält, wurde mit 24gH bezeichnet (Fig. 38).

Durch in vitro-Mutagenese (17, 185) wurde unter Verwendung der Oligonucleotide HM5(ACACAGAGCAACTGCAGATCTCCCGATTTCCCCTCT) HM4(GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCTGCG) und HM3(GCCAGGGTTTTCCCAGAGATCTGATAAAAACGACGGCCAGTG) das gH-Gen modifiziert, um unter der Kontrolle des frühen hämorrhagischen (µ) Vaccinia-Promotors exprimiert zu werden. Das Oligonucleotid HM4 wurde verwendet, um ein im gH-Gen enthaltendes frühes Vaccinia-Transkriptionsstoppsignal (45) zu entfernen. Das das modifizierte gH-Gen enthaltende Plas mid wurde mit 24gH(5 + 4 + 3) bezeichnet.

Wie aus Fig. 38 hervorgeht, ist der Vaccinia µ-Promotor in dem Plasmid pSD486 VC enthalten (Fig. 30). (In Fig. 38 wird das Plasmid mit SD486 bezeichnet. Das mit Mungobohnen- Nuclease behandelte 2130 bp BglII-Fragment von 24gH(5 + 4 + 3) wurde in die BglII-Stelle des mit Mungobohnen-Nuclease be handelten pSD486VC cloniert. Dieser letzte Clonierungs schritt stellt das gH-Gen unter die Kontrolle des Vaccinia- µ-Promotors. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit 486gH bezeichnet (Fig. 38).

Clonieren des offenen Leserahmens BBRF3 in das Vaccinia-Vi rus-Donorplasmid pCOPSC-5H.

Der vollständige offene Leserahmen BBRF3 ist im BamHI B- Fragment der EBV-DNA enthalten. Dieses Fragment wurde mit BspHI gespalten, mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Frag ment) behandelt und mit BglII gespalten. Die BglII-Stelle innerhalb des BamHI A-Fragments liegt 10 Basen vor dem Stoppcodon von BBRF3. Das 1230 bp BspHI-BglII-Fragment wurde isoliert und in das 4200 bp SmaI-BglII-Fragment des Plasmids pCOPSC-5H cloniert. (Das Plasmid pCOPCS-5H ist identisch mit dem Plasmid pCOPCS657 (Fig. 16).) Das auf diese Weise er zeugte Plasmid wurde mit COPSCEBVX bezeichnet.

Clonieren der EBV gp340- gB- und gH-Gene in das Vaccinia- Virus-Donorplasmid PSD513VCV0.

Das zur Erzeugung der Dreifach-EBV-Rekombinanten verwendete Vaccinia-Virus-Donorplasmid war das Plasmid pSD513VCVQ (Fig. 29). Dieses Plasmid enthält einen Subclon des Vaccinia-Vi rus-Copenhagen-HindIII-J-Fragmentes, in dem die das Thymi dinkinase-Gen codierende Sequenz durch einen Polylinkerbe reich ersetzt ist.

Im ersten Schritt wurde das vom µ-Promotor kontrollierte EBV gH-Gen in pSD513VCVQ cloniert. Genauer gesagt, wurde das 2300 bp SnaBI-BglII-Fragment von 486gH in das 4000 bp SmaI- BglII-Fragment von pSD513VCVQ cloniert. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit 513 UgH bezeichnet.

Danach wurde das vom H6-Promotor kontrollierte EBV gp340-Gen in 513gH cloniert. Genauer gesagt, wurde das mit Mungoboh nen-Nuclease behandelte 2800 bp NotI-Fragment von SP131gp340 in das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 6300 bp XhoI- PstI-Fragment von 513 UgH cloniert. Das auf diese Weise er zeugte Plasmid wurde mit 513UgH340H6 bezeichnet.

Dann wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende EBV gB-Gen in 510 UgH340H6 cloniert. Genauer gesagt, wurde das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 2700 bp HindIII- Fragment von SP131gp340 in das mit Mungobohnen-Nuclease be handelte 9100 bp BglII-Fragment von 513UgH340H6 cloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit 513gHgbgp340 bezeichnet (Fig. 39).

Konstruktion von rekombinantem Vaccinia-Virus.

EBV gp340 (Donorplasmid 409H6340), EBV gp220 (Donorplasmid 409H6220) und EBV gB (Donorplasmid 409H6gB) wurden in das Vaccinia-Virus vP458 (M2L-Stelle) hineinrekombiniert: Diese Einfach-Vaccinia-Virus-Rekombinanten werden mit vP474 bzw. mit vP480 und vP561 bezeichnet. EBV gH (Donorplasmid 486gH) wurde in das Vaccinia-Virus vP533 (µ-Insertionsstelle) hin einrekombiniert: Diese Einfach-Vaccinia-Virus-Rekombinante wird mit vP611 bezeichnet.

Schließlich wurde die gp340-, gb- und gH-enthaltende Drei fach-Vaccinia-Virus-Rekombinante durch Hineinrekombinieren des Donorplasmids 513gHgBgp340 in das Vaccinia-Virus vP617 in die Thymidinkinase-Insertionsstelle erhalten. Dieses re kombinante Virus wird mit vP712 bezeichnet. vP617 ist ein Copenhagen-Vaccinia-Virus, bei dem die Gene für TK, HA und ATI deletiert sind.

Immunfluoreszenz von EBV-Proteinen in mit rekombinanten Vac cinia-Virus infizierten Zellen.

Immunfluoreszenzuntersuchungen, die mit vP474- (gp340) und vP480- (gp220) infizierten Zellen unter Verwendung des mono clonalen Antikörpers F29-89 (165) durchgeführt wurden, zeig ten, daß EBV gp340- und EBV gp220-Proteine auf der Plasma membran exprimiert sind.

Mit vP611 (gH) infizierte Zellen zeigen bei Verwendung eines Human-Serums ein schwaches positives Signal auf der Plasma membran.

Schließlich wurde dasselbe Experiment mit vP712- (Dreifach- EBV-Vaccinia-Rekombinante) infizierten Zellen durchgeführt: Ein positives Signal auf der Plasmamembran wurde erhalten mit den monoclonalen Antikörpern F29-89 und NEA 9247 (gB- Spezifität, erhalten von DuPont).

Immunpräzipitation von EBV-Proteinen in mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

Das in EBV-infizierten Zellen produzierte EBV gp340-Glyko protein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 340 kDa (165). Zellen, die mit den rekombinanten Vaccina-Viren vP474 oder vP712 infiziert worden waren, produzieren ebenfalls ein EBV-codiertes Protein mit ungefähr 340 kDa (Immunpräzipita tion war mit dem monoclonalen Antikörper F29-89 durchgeführt worden). Das EBV gp220-Glykoprotein besitzt ein Molekularge wicht von 220 kDa (165). Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP480 infiziert worden waren, produzieren ein EBV-codiertes Protein mit ungefähr 220 kDa.

Das in EBV-infizierten Zellen produzierte EBV gB-Glykopro tein besitzt ein Molekulargewicht von 110 kDa bis 125 kDa mit einer Form der Vorstufe mit 93 kDa (206, 208). Zellen, die mit den rekombinanten Vaccinia-Viren vP561 oder vP712 infiziert worden waren, produzieren ein EBV-codiertes Haupt protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 125 kDa und vier Nebenproteine mit Molekulargewichten von ungefähr 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa und 45 kDa.

Das in EBV-infizierten Zellen produzierte EBV gH-Glykopro tein besitzt ein Molekulargewicht von 85 kDa mit einer Form der Vorstufe von 70 kDa (209). Zellen, die mit dem rekom binanten Virus vP611 infiziert worden waren, produzieren ein EBV-codiertes Protein mit ungefähr 85 kDa.

Immunisierung von Kaninchen mit EBV-Glykoproteine exprimie renden Vaccinia-Rekombinanten.

Kaninchen wurden mit vP474 (gp340) oder vP480 (gp220) oder vP561 (gB) oder vP611 (gH) oder vP712 (dreifach) immuni siert. Nach einer Nachimmunisierung wurden die Seren durch Immunfluoreszenz auf TPA-behandelten B95-8-Zellen getestet. Positive Signale wurden in jedem Fall erhalten. Eine in vitro neutralisierende Aktivität wurde bei Verwendung der gegen vP474 (gp340) verwendeten Seren gezeigt.

Beispiel 17 Clonierung und Expression von menschlichen Cytomegalovirus- Glykoprotein-Antigenen in Pockenvirus-Vektoren Clonieren des HCMV gB-Gens in das Vaccinia-Donorolasmid pMP409DVC.

Wie aus Fig. 40 hervorgeht, wurde das 4800 bp HindIII-BamHI- Fragment des HindIII D-Fragmentes der HCMV-DNA in das 2800 bp HindIII D-BamHI-Fragment des Plasmids pIBI24 cloniert. Durch in vitro-Mutagenese (17, 185) wurde unter Verwendung der Oligonucleotide CMVM5

und CMVM3

das HCMV gB-Gen modifiziert, damit es unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors exprimiert wird. Das modifizierte HCMV gB-Gen enthaltende Plasmid wurde mit 24CMVgB(5 + 3) be zeichnet (Fig. 40).

Als nächstes wurde das 2900 bp EcoRV-BamHI-Fragment von 24CMVgB(5 + 3) in das 3100 bp EcoRV-BglII-Fragment des Plas mids pSP131, das den synthetischen H6-Promotor (69) enthält, cloniert. Dieser Clonierungsschritt brachte das HCMV gB-Gen unter die Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors. Das resultie rende Plasmid wurde mit SP131gB bezeichnet.

Schließlich wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende HCMV gB-Gen in das Vaccinia-Donorplasmid pMP409DVC cloniert. Das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 3000 bp HindIII-Fragment von SP131gB wurde in die mit Mungobohnen- Nuclease behandelte BglII-Stelle von pMP409DVC cloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit 409CMVgB bezeichnet (Fig. 40).

Konstruktion von rekombinantem Vaccinia-Virus.

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende CMV gB-Gen im Plasmid 409CMVgB wurde in die M2L-Stelle des Rettungs-Vi rus vP458 inseriert. Das rekombinante Vaccinia-Virus wurde mit vP525 bezeichnet.

Immunfluoreszenz des CMV gB-Proteins in mit rekombinanten Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

Immunfluoreszenzuntersuchungen an mit vP525 infizierten Zel len zeigten bei Verwendung eines monoclonalen Antikörpers oder eines polyclonalen Meerschweinchen-Serums, daß HCMV gB auf der Plasmamembran exprimiert wird.

Immunpräzipitation von CMV gB in mit rekombinantem Vaccinia- Virus infizierten Zellen.

Das in CMV-infizierten Zellen produzierte CMV gB-Glykopro tein besitzt ein Molekulargewicht von 55 kDa mit einer Form der Vorstufe von 130 kDa (172). Zellen, die mit vP525 infi ziert worden waren, produzieren zwei CMV gB-codierte Pro teine mit ungefähr 130 kDa und 55 kDa.

Nucleotidsequenzen von HXLF1 und HXLF2.

Die HXLF-Genfamilie liegt auf dem HindIII X-Fragment der ge nomischen HCMV-DNA (172). Unter Verwendung spezifischer Oli gonucleotidprimer wurde die Nucleotidsequenz von HXLF1 und HXLF2 bestimmt (Fig. 41, 42). HXLF1 ist 648 Nucleotide lang und codiert ein Protein mit 215 Aminosäuren. HXLF2 ist 558 Nucleotide lang und codiert ein Protein mit 185 Amino säuren. Die Nucleotidsequenzen derselben Gene (HCMV-Stamm AD169) sind publiziert in (173) und Vergleichsstudien zeigen eine 99%-ige Homologie bezüglich HXLF1 und eine 96%-ige Ho mologie bezüglich HXLF2.

Immunisierung von Meerschweinchen mit Vaccinia-Rekombinan ten, die HCMV-Antigene exprimieren.

Drei Meerschweinchen wurden mit vP525 immunisiert. Nach ei ner Nachimmunisierung entwickelten die Tiere HCMV-neutrali sierende Antikörper (Haupttiter: 518). Interessanterweise lassen sich 50 bis 87% der neutralisierenden Aktivität von HCMV-seropositiven Humanseren durch vP525-infizierte Zellen durch Absorption entfernen. Dieses Ergebnis zeigt die poten tielle Wichtigkeit von HCMV gB als Untereinheits-Vakzin.

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Claims

1. Rekombinantes Pockenvirus, das in einem nicht essentiellen Bereich des Pockenvirus-Genoms und stromabwärts einer Promotorsequenz, die fähig ist, die Expression des von der DNA-Insertion codierten Proteins durch das rekombinante Virus in einem Wirt zu fördern, eine DNA- Insertion enthält, die ein Herpesvirus-Glykoprotein codiert, ausgewählt aus dem Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp13, einem wirksamen Bereich des Pferde-Herpesvirus-Glykoproteins gp14, der ein am N- Terminus verkürztes Glykoprotein gp14 mit einer Deletion der Aminosäure 2 bis zu einer beliebigen Aminosäure zwischen der Aminosäure 2 bis einschließlich der Aminosäure 62 ist, dem Pseudorabiesvirus-Glykoprotein gpII, dem Katzen-Herpesvirus- Glykoprotein gB und dem Epstein-Barr-Virus-Glykoprotein gp220, gB oder gH.

2. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, das als die DNA- Insertion eine sowohl das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp13 als auch einen wirksamen Teil des Pferde-Herpesvirus-Glykoproteins gp14 codierende DNA enthält und zur Expression dieser Glykoproteine in einem Wirt fähig ist.

3. Rekombinantes Pockenvirus, das in einem nicht essentiellen Bereich des Pockenvirus-Genoms und stromabwärts einer Promotorsequenz, die fähig ist, die Expression des von der DNA-Insertion codierten Proteins durch das rekombinante Virus in einem Wirt zu fördern, eine DNA- Insertion enthält, die sowohl das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp13 als auch das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp14 codiert.

4. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das rekombinante Pockenvirus ein rekombinantes Vaccinia-Virus ist.

5. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das rekombinante Pockenvirus ein rekombinantes Vogelpockenvirus ist.

6. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 5, wobei das rekombinante Vogelpockenvirus ein rekombinantes Geflügelpockenvirus oder ein rekombinantes Kanarienpockenvirus ist.

7. Zusammensetzung, die zur Induktion einer antigenen und/oder immunologischen Antwort in einem Wirtstier fähig ist, wenn es mit der Zusammensetzung inoculiert wird, wobei diese Zusammensetzung ein rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 im Gemisch mit einem Träger umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Herpesvirus-Glykoproteins durch In vitro-Infektion einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Virus, das zur Expression des Glykoproteins in der Wirtszelle fähig ist, wobei ein rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet wird.

9. Herpesvirus-Glykoprotein, erhalten durch Expression eines rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die In vivo-Expression ausgeschlossen ist, wobei das rekombinante Virus einen wirksamen Bereich des Pferde-Herpes-Glykoproteins gp14 gemäß der Definition in Anspruch 1 codiert.

10. Herpesvirus-Glykoprotein, erhalten durch die In vivo-Expression eines rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einer Wirtszelle wobei das rekombinante Virus einen wirksamen Bereich des Pferde-Herpes-Glykoproteins gp14 gemäß der Definition in Anspruch 1 codiert.

11. Inoculationskit zur Inoculation einer neugeborenen Nachkommenschaft und der Mutter dieser Nachkommenschaft zur Vermeidung einer maternalen Immunität in der Nachkommenschaft, wobei das Kit eine erste Vakzine zur Inoculation der Mutter vor der Niederkunft der Nachkommenschaft und eine zweite Vakzine zur Inoculation der neugeborenen Nachkommenschaft enthält, wobei die erste Vakzine ein erstes rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält, das bei der Inoculation der Mutter zur Expression des insertierten Herpesvirus-Glykoproteins fähig ist und wobei die zweite Vakzine ein zweites rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält, das bei der Inoculation der Nachkommenschaft zur Expression des insertierten Herpesvirus- Glykoprotein fähig ist, wobei das erste und zweite Herpesvirus- Glykoprotein gleich sind und das erste und zweite rekombinante Pockenvirus verschiedene rekombinante Pockenviren sind, die jedes zur Induktion einer immunologischen Antwort auf das gleiche erste und zweite Herpesvirus-Glykoprotein fähig sind.

12. Inoculationskit zur Inoculation einer neugeborenen Nachkommenschaft und der Mutter dieser Nachkommenschaft zur Vermeidung einer maternalen Immunität in der Nachkommenschaft, wobei das Kit eine erste Vakzine zur Inoculation der Mutter vor der Niederkunft der Nachkommenschaft und eine zweite Vakzine zur Inoculation der neugeborenen Nachkommenschaft enthält, wobei die erste Vakzine ein erstes rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält, das bei der Inoculation der Mutter zur Expression des insertierten Herpesvirus-Glykoproteins fähig ist und wobei die zweite Vakzine ein zweites rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält, das bei der Inoculation der Nachkommenschaft zur Expression des insertierten Herpesvirus- Glykoprotein fähig ist, wobei das erste und zweite Herpesvirus- Glykoprotein verschieden, aber vom gleichen Pathogen sind und das erste und zweite rekombinante Pockenvirus die gleichen rekombinanten Pockenviren sind, die jedes zur Induktion einer immunologischen Antwort auf das entsprechende Herpesvirus-Glykoprotein fähig sind.

13. Verwendung eines rekombinanten Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Kits nach Anspruch 11 oder 12.