DE4011730A1

DE4011730A1 - Elektrophoresevorrichtung vom fluoreszenzerfassungstyp

Info

Publication number: DE4011730A1
Application number: DE4011730A
Authority: DE
Inventors: Hideki Kambara; Tetsuo Nishikawa; Tomoaki Sumitani; Keiichi Nagai; Yoshitoshi Ito
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1989-04-12
Filing date: 1990-04-11
Publication date: 1990-10-18
Anticipated expiration: 2010-04-12
Also published as: DE4011730C2; US5062942A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenz erfassungstyp und insbesondere eine Elektrophoresevorrichtung vom Mehrfahrb- Fluoreszenzerfassungstyp bzw. Vielfarb-Fluoreszenzerfassungstyp. Im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung eine Elektrophoresevorrichtung vom Vielfarb- Fluoreszenzerfassungstyp, die vorzugsweise geeignet ist zum Bestimmen einer DNA- Basensequenz einer DNA oder dergl. auf eine Art und Weise, daß eine Vielzahl von Fluorophoren unterschiedlicher Emissionswellenlängen verwendet werden, um die Fragmente der DNA oder dergl. vielfarbig zu markieren, und daß jeder der fluoreszierenden Lichtstrahlen der DNA-Fragmente, die nach der Elektrophorese trennung emittiert werden, erfaßt wird.

Eine herkömmliche Technik zum Bestimmen der DNA-Basensequenz ist die Autoradiographie, bei der ein radioaktiv isotopes Element zum Markieren verwendet wird. Es besteht jedoch ein neuer Trend dahingehend, eine Technik zu verwenden, wobei fluoreszierende Markierungen verwendet werden, um die DNA- Fragmente optisch und automatisch zu erfassen, um die DNA-Basensequenzen automatisch zu bestimmen. Diese Technik verwendet ein Verfahren, wobei die vier DNA-Fragmente unterschiedlicher Anschlußgattung bzw. technischer Spezies bzw. endständiger Basen mit jeweiligen Fluorophoren unterschiedlicher Emissions wellenlängen markiert werden und die DNA-Fragmente durch Gel-Elektrophorese separiert werden. Die DNA-Fragmente werden von einem Laserstrahl auf bzw. in die Migrationspfade bzw. Verschiebungswege bzw. Wanderbahnen bestrahlt. Die emittierten Fluoreszenzlichtstrahlen werden von einem Detektor mit vier Bandpaßfiltern empfangen, bei denen die Übertragung bzw. der Durchgang für die jeweiligen emittierten Wellenlängen maximal ist. Ein herkömmlicher Detektortyp wird verwendet, so daß ein Photomultiplizierer mit vier Bandpaßfiltern auf einer rotierenden Platte in Synchronismus mit einem abtastenden bzw. scannenden Laserstrahl bewegt wird (siehe "Nature", Bd. 321, 1986, S. 674-679).

Es ist eine alternative Technik dokumentiert, bei der ein Laserstrahl auf eine elektrophoretische Platte, die ausgerichtet ist, bzw. auf einer Linie ausgerichtet ist, angelegt ist, und die Abbildung der emittierten Fluoreszenzlichtzeile wird durch ein Prisma in Spektren aufgeteilt, die wiederum von einem hochsensiblen zweidimensio nalen Detektor erfaßt werden (siehe US-PS 48 32 815).

Es ist wichtig, die hohe Empfindlichkeit des zuvor erwähnten Fluoreszenzlicht detektors zu erreichen. Bei dem Fluoreszenzmeßsystem, bei dem der Detektor abgetastet bzw. gescannt wird mit bzw. durch Scannen des Bestrahlungslichtes unter Verwendung eines Rotationsfilters, wird der Anteil bzw. die Proportion der Meßzeit α für einen Meßpunkt des Gels ausgedrückt durch

α = ^d/₄ l,

wobei l eine Länge eines Meßbereiches und d eine Breite des bestrahlenden Laserstrahls angibt. Im allgemeinen ist α kleiner als oder gleich 10^-3, wenn d = 0,2 bis 0,3 mm und l länger als oder gleich 100 mm ist.

Dies ist dahingehend nachteilig, daß es zu einer Empfangslichtmenge so wenig wie bzw. weniger als ¹/₁₀₀₀ der kontinuierlichen Lichtbestrahlung und des Erfassungs verfahrens führt, was in einer zu geringen Empfindlichkeit resultiert.

Andererseits werden bei der Technik, bei der ein Laserstrahl in eine Seitenend fläche des flach aufgebrachten Gels bzw. Flachbettgels kommt, um jeden Meßpunkt kontinuierlich zu bestrahlen, die erhaltenen Fluoreszenzlichtabbildungen über ein Prisma in Spektren aufgeteilt, die wiederum von einem zweidimensionalen Detektor erfaßt werden, wobei die Lichtempfangsmenge hoch und die oben erwähnte Schwierigkeit beseitigt ist. Die Lichtaufteilungsgenauigkeit ist jedoch zu gering, um eine hochpräzise DNA-Basengattung zu identifizieren. Das heißt, daß bei dieser Technik die Fluoreszenzspektren zu breit sind, so daß die emittierten Wellenlängen der Fluorophore nur um etwa 20 nm bei maximalen Wellenlängen getrennt werden. Es ist demgemäß auf nachteilige Weise schwierig, die Fluoreszenzlicht strahlen ausreichend zur Erfassung zu trennen, die unter weiten festgelegten Winkeln von den Emissionspunkten der Fluoreszenzlichtabbildungen emittert sind.

Wie oben erwähnt, sind die herkömmlichen Techniken nachteilig, da keine Anstrengungen hinsichtlich höherer Empfindlichkeit und hochpräziser Wellenlängen trennung unternommen sind.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, die obenerwähnten Schwierigkeiten zu beseitigen und eine Elektrophoresevorrichtung vom Vielfarb- Fluoreszenzerfassungstyp zu schaffen, die in der Lage ist, DNA's mit hoher Präzision und hoher Empfindlichkeit zu trennen und zu erfassen.

Als Ergebnis ihrer Studien fanden die Erfinder heraus, daß die oben genannte Aufgabe ausgezeichnet erreicht wird dadurch, daß eine Fluoreszenzlichtabbildung, die erhalten wird durch Anlegen eines Laserstrahls auf eine Elektrophorese- Trennplatte, in eine Vielzahl von virtuellen Abbildungen aufgeteilt wird, dann die einzelnen aufgeteilten Abbildungslichtstrahlen über Bandpaßfilter wellenlängen selektiert werden und diese sich ergebenden Abbildungen auf einen Detektor für geeignete Trennung und Detektion fokussiert werden. Die Erfinder setzten ihre Studie auf der Basis dieser neuen Erkenntnis fort und vervollständigten die vorliegende Erfindung.

Daher umfaßt die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenz erfassungstyp zumindest eine Gelplatte zur Elektrophoresetrennung, eine Anregungs laser-Strahlquelle zum Emittieren von Fluoreszenzlicht, einen Fluoreszenzlicht detektor zum Erfassen des emittierten Fluoreszenslichtes, und die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung aufweist eine Abbildungsaufteilungsein richtung für eine lineare Fluoreszenzlichtabbildung, die erhalten wird durch Anlegen eines Laserstrahls auf eine geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophorese trennung, Bandpaßfilter unterschiedlicher Durchgangswellenlängen, die in ihrer Anzahl der Anzahl der von der Abbildungsaufteilungseinrichtung unterteilten Abbildungen entsprechen, und eine optische Einrichtung zum Fokussieren der einzelnen Fluoreszenzlinienabbildungen unterschiedlicher Transmissionswellenlängen, die durch die jeweiligen Bandpaßfilter gebildet werden auf den Fluoreszenzlicht detektor.

Bei einer praktischen Konstruktion der erfindungsgemäßen Elektrophoresevor richtung vom Fluoreszenzerfassungstyp wird die Lagerstrahlbestrahlung auf die geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophoresetrennung auf ein Flachbettgel der Gelplatte zur Elektrophoresetrennung gerichtet und geht durch dieses durch, und zwar parallel zu der Gelplatte zur Elektrophoresetrennung durch die Seitenendfläche der Gelplatte, und eine Fluoreszenzlicht-Lichtabbildung, die durch die Laserbestrahlung erhalten wird, ist entlang eines Weges des Laserstrahls in dem Flachbettgel ausgerichtet.

Die Abbildungsaufteilungsvorrichtung kann aufweisen ein Prisma oder Prismen, die dem laserstrahl-bestrahlten Abschnitt und/oder dem Fluoreszenzlicht empfangenden Abschnitt hinzugefügt wird, bzw. werden; oder eine Vielzahl von Reflektions spiegeln, die parallel zu einer Achse eines Laserstrahls in der Gelplatte zur Elektrophoresetrennung angeordnet bzw. ausgerichtet sind; oder zumindest eine Vielzahl von Linsen unterschiedlicher optischer Achsen oder eine Linse, die in Fragmente unterschiedlicher optischer Achsen aufgeteilt ist, und die auf einem Pfad vorgesehen sind bzw. ist, in dem Fluoreszenzlicht, welches von einem Laserstrahl bestrahlenden Abschnitt der Gelplatte zur Elektrophoresetrennung emittiert wird, zu der Fokussierposition auf dem Fluoreszenzlichtdetektor kommt. Die Abbildungs aufteilungseinrichtung kann ein zusätzliches Prisma oder einen Spiegel enthalten zum Aufteilen der Fluoreszenzlichtabbildung auf einen Weg bzw. Pfad, auf dem Fluoreszenzlicht bzw. Lichtstrahlen, die von einen Laserstrahl abstrahlenden Abschnitt der Gelplatte zur Elektrophoresetrennung in die Fokussierposition des Fluoreszenzlichtdetektors kommen, und zwar um die Abbildungsaufteilungsfunktion der obigen Abbildungsaufteilungseinrichtung zu unterstützen.

Die Vielzahl von Linsen bzw. Objekten unterschiedlicher optischer Achsen, die zuvor erwähnt wurden, können vorgesehen sein durch Überlappen von zwei oder vier rechteckförmigen Kondensorlinsen in vertikaler Richtung, wobei ihre längeren Seiten horizontal liegen.

Bezüglich des Vorsehens der einzelnen Linse, die in Fragmente mit abweichenden optischen Achsen aufgeteilt ist, wie zuvor erwähnt, kann z. B. eine kreisförmige Kondensorlinse radial in zwei oder vier Fragmente auf einer Linie oder auf Linien unterteilt werden, die durch einen Mittelpunkt derselben gezogen sind, und die Fragmente können integriert bzw. zusammengesetzt werden, wobei jedes Fragment um ein bis zwei Grad gegenüber einer Ebene mit rechten Winkeln zu der optischen Achse der Originallinse geneigt wird.

Um die Abbildungsaufteilungsfunktion bzw. Abbildungstrennfunktion der Abbildungs aufteilungseinrichtung zu realisieren, kann z. B. das zusätzliche Prisma oder der zusätzliche Spiegel folgendermaßen angeordnet bzw. ausgelegt sein. Zwei Spiegel von 10 mm auf 100 mm sind an ihren längeren Seitenkanten in dem Zustand miteinander verbunden, daß die Spiegel von einer Ebene um etwa 1 Grad abweichen. Der so integrierte Spiegel kann in eine Position 5 bis 10 mm hinter dem Laserstrahl abstrahlenden Abschnitt gesetzt werden. Das Prisma mit 150 Grad Scheitelpunkt bzw. das Prisma mit 150 Grad Scheitelwinkel kann in eine Position 20 mm vor dem Laserstrahl bestrahlten Teil gesetzt werden, wobei seine Kante parallel zu dem bestrahlten Abschnitt ist.

Wenn die Abbildungsaufteilungseinrichtung eine Vielzahl von Reflexionsspiegeln umfaßt, werden die Bandpaßfilter unterschiedlicher Transmissionswellenlängen, die in ihrer Anzahl der Anzahl der Reflexionsspiegel entsprechen, auf den jeweiligen Fluoreszenzlichtpfaden von den Reflexionsspiegeln vorgesehen, und zwar auf Fokussierpositionen auf einem Fluoreszenzlichtdetektor.

Vorzugsweise sind die Vielzahl von ebenen Reflektionsspiegeln auf einem Umfang einer Ellipse angeordnet, die einen Punkt des Laserstrahls innerhalb der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation als einen Mittelpunkt hat.

Zur praktischen Anwendung bzw. Verwendung kann die Vielzahl von Reflektions spiegeln z. B. auf eine solche Weise angeordnet sein, daß vier Spiegel mit 10 mm auf 100 mm an ihren längeren Seitenkanten verbunden bzw. geklebt sind, wobei die vier Spiegel auf einer Biegelinie angeordnet sind, um die Ellipse zumindest virtuell zu berühren.

Weiterhin kann die Abbildungstrennung- bzw. -aufteilung vollzogen werden unter Verwendung eines Prismas, um die Aufgabe der vorliegenden Erfindung zu lösen. Zunächst wird die durch Anlegen des Laserstrahls auf die Platte zur Elek trophoreseseparation erhaltene Fluoreszenzabbildung in eine Vielzahl von virtuellen Abbildungen unter Verwendung eines Primas aufgeteilt. Jede der aufgeteilten virtuellen Abbildungen wird dann bezüglich der Wellenlänge durch Bandpaßfilter aufgespalten bzw. getrennt, um die Abbildung auf den Detektor zu fokussieren, um die getrennten Abbildungen zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe zu erfassen.

In diesem Fall umfaßt die Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp zumindest eine Gelplatte zur Elektrophoreseseparation, eine Laserstrahlquelle und einen Fluoreszenzlichtdetektor mit einem Prisma, das eine Vielzahl von Licht nach außen führenden Ebenen hat, um eine Fluoreszenzlicht-Linienabbildung aufzuteilen bzw. zu trennen, die erhalten wird durch Anlegen eines Laserstrahls an eine geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation, und ein optisches System zum einzelnen Fokussieren einer Vielzahl der Fluoreszenzlinienabbildungen auf den Fluoreszenzlichtdetektor, wobei die Fluoreszenzlinienabbildungen durch die Vielzahl der Licht nach außen führenden Ebenen des Prismas aufgeteilt sind.

Das optische System hat ein Bandpaßfilter mit einzelnen unterschiedlichen Transmissionswellenlängen, das auf jeweiligen entsprechenden Pfaden der aufgeteilten Abbildungslichtstrahlen vorgesehen ist, die aus der Vielzahl der Licht nach außen leitenden Ebenen des Prismas herauskommen.

Das Prisma kann auf praktische Weise derart gebildet sein, daß - wie in der Zeichnung beispielhaft gezeigt - es ein Polyeder sein kann, der symmetrisch zu einem Abschnitt ist, der Kanten bzw. Ecken eines mittleren Spitzenpunktes bzw. -winkels oder ein polyederartiges Trapezoid enthält, welches symmetrisch zu einem Mittelabschnitt ist.

Das Prisma muß aus einem Material mit hohem Lichtbrechungsindex hergestellt sein, wie BaF01, LaF3 oder SF3 Glas, und zwar insbesondere bei der erfindungs gemäßen Elektrophoresevorrichtung vom Vielfarb-Fluoreszenzerfassungstyp.

Das Prisma kann vorzugsweise derart positioniert sein, daß zumindest eine Ecke bzw. Kante des Prismas in einer Ebene liegt, die die Fluoreszenzlicht-Linien abbildungen enthält, die als das Ergebnis von einer Laserstrahlbestrahlung auf eine geeignete Position der Platten zur Elektrophoreseseparation erhalten werden, und einen Mittelpunkt der Fokussierposition des Fluoreszenzlichtdetektors enthält und parallel ist zu den Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen, oder andererseits derart, daß das Prisma nach oben und unten bezüglich einer Ebene symmetrisch ist, die die Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen enthält, die als Ergebnis einer Laserstrahlbestrah lung auf eine geeignete Position der Platten zur Elektrophoreseseparation erhalten werden, und ein Mittelpunkt der Fokussierposition des Fluoreszenzlichtdetektors und ein Spitzenpunkt des Prismas ist im Mittelpunkt parallel mit den Fluoreszenzlicht- Linienabbildungen. Das Prisma kann in jeder Position zwischen der Elektrophorese platte und dem Bandpaßfilter vorgesehen sein.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann geeignet derart gelöst werden, daß die Elektrophoresevorrichtung vom Vielfarb-Fluoreszenzerfassungstyp, Einrichtungen zur Abbildungsaufteilung und Wellenlängenselektion der Fluoreszenzlicht-Abbildung teilweise enthalten können eine zylindrische konvexe Linse und eine zylindrische konkave Linse, wobei die mit einem breiten Winkel von der Fluoreszenzlicht abbildung emittierten Fluoreszenzlichtstrahlen unter Verwendung der zylindrischen konvexen Linse kondensiert bzw. gebündelt werden können und auf die Licht empfangsebene über die zylindrische konkave Linse fokussiert werden können.

In diesem Falle umfaßt die Elektrophoresevorrichtung vom Vielfarb-Fluoreszenz erfassungstyp zumindest eine Gelplatte zur Elektrophoreseseparation, eine Laserstrahlquelle und einen Fluoreszenzlichtdetektor und ist dadurch gekennzeichnet, daß Einrichtungen zur Abbildungsaufteilung und Wellenlängenselektion der Fluoreszenzlicht-Abbildung aufweisen eine zylindrische konvexe Linse, eine zylindrische konkave Linse und ein Bandpaßfilter.

Auch in diesem Fall, da die praktisch verwendete Einrichtung zur Abbildungsauf teilung, z. B. das Bandpaßfilter, ein unterteiltes Filter mit mehreren Ebenen sein kann, d. h., ein Prisma mit mehreren Ebenen mit einem Bandpaßfilterfilm auf jeder Licht nach außen leitenden Ebene oder auf den Abschnitten der Lichteinfallebene, die den jeweiligen Licht nach außen leitenden Ebenen entspricht, kann hierdurch eine Abbildungsaufteilung erzielt werden. In diesem Zusammenhang kann das unterteilte Filter mit mehreren Ebenen zwischen der zylindrischen konvexen Linse und einer Fokussierlinse vorgesehen sein. Weiterhin ist es vorzuziehen, daß Ebenen des unterteilten Filters mit mehreren Ebenen Bereiche haben, die derart bezüglich der Größe sind bzw. Abmessungen haben, daß die Mengen des sie passierenden Fluoreszenzlichtes im wesentlichen gleich sein können.

Als ein weiteres Beispiel der Einrichtung zur Abbildungsaufteilung umfaßt die zylindrische konvexe Linse eine Vielzahl von unterteilten zylindrischen konvexen Linsen, wodurch die Fluoreszenzlicht-Abbildung unterteilt werden kann.

Weiterhin ist es vorzuziehen, daß, um die Lichtemission von anderen Abschnitten als dem Emissionspunkt durch Laserbestrahlung vor beeinflußter Messung zu bewahren, ein Schlitz parallel zu den Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen zwischen einem Emissionspunkt der Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen und einer zylindrischen konvexen Linse vorgesehen ist, um die oberen und unteren Teile der Fluoreszenz lichtstrahlen abzuschneiden, bzw. abzublocken, die von dem Emissionspunkt emittiert werden, der höher oder niedriger ist als bestimmte Winkel.

Weiterhin ist es vorzuziehen, daß eine Schlitzbreite schmaler gemacht wird als ein Abschnitt bzw. Intervall von virtuellen Objektpositionen.

Für den Fall, daß die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung vom Fluo reszenzerfassungstyp verwendet wird als Elektrophoresevorrichtung vom Vielfarb- Fluoreszenzerfassungstyp zur Trennung und Erfassung von vielfarb-markierten Proben, ist die Trennungs- und Erfassungsprobe, die zum Wandern bzw. Versetzen in der Platte zur Elektrophoreseseparation verwendet wird, eine vielfarb-markierte Probe. Die Fluorophore, die zum Vielfarbmarkieren verwendet werden sind FITC (Fluorescein-Isothiocynad) mit 515 nm Emissionswellenlänge, NBD-F (4-Fluor-7- Nitrobenzofurazan) mit 540 nm Emissionswellenlänge, TRITC (Tetramethylrhoda min-Isothiocyanat) mit 573 nm Emissionswellenlänge und Texas Red mit 610 nm Emissionswellenlänge.

Die Bandpaßfilter, das im Zusammenhang mit dem Vielfarbmarkieren verwendet wird, ist ein dielektrisches Mehrlagenfilter oder dergleichen mit 20 bis 40 nm Transmissionswellenlängenbreite, wobei die zentrale Wellenlänge derselben mit der Emissionswellenlänge zusammenfällt. Es kann auch eine Kombination eines dielektrisch bedampften Mehrlagenfilters mit einem Farbglasfilter sein.

Der verwendete Fluoreszenzlichtdetektor ist normalerweise ein zweidimensionaler Fluoreszenzlichtdetektor.

Als Proben zur Trennung und Erfassung, die bei der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp verwendet werden, können DNA's oder RNA's angezeigt bzw. verwendet sein, deren Basissequenzen zu bestimmen sind. Es können auch Proteine oder dergl. gezeigt sein. Weiterhin kann die Vorrichtung als Diagnosevorrichtung für menschliche Gene verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp kann - wie zuvor beschrieben - am bevorzugtesten verwendet werden als Elektrophorese vorrichtung vom Mehrfarb-Fluoreszenzerfassungstyp. Sie kann auch verwendet werden für die Erfassung von einfarbigen Fluoreszenzen. In diesem Fall bietet die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp ebenfalls einen Vorteil dahingehend, daß eine genaue Trennung und Erfassung erreicht werden kann, da die möglichen Meßfehler aufgrund von Veränderungen der Meßbedingungen wie Fluktuation der Laserstrahl-Bestrahlung der Elektrophoresevor richtung vom Fluoreszenzerfassungstyp kompensiert werden können. Dies kann mit einem kombinierten Bandpaßfilter geschehen, welches derart ausgewählt ist, daß eine Fluoreszenzlicht-Linienabbildung z. B. in zwei Abbildungen unterteilt wird, von denen eine verwendet wird zur Messung eines Spitzenwertes des Fluoreszenzlichtes und die anderen verwendet wird, um spezifische Lichtstrahlen niedriger Wellenlängen zu messen.

Wie zuvor erläutert, wird erfindungsgemäß die Fluoreszenzabbildung, die erhalten wird durch Anlegen des Laserstrahls auf die Platte zur Elektrophoreseseparation zunächst in eine Vielzahl von virtuellen Abbildungen durch die Abbildungsauf teilungseinrichtung unterteilt, die aufweist den Reflexionsspiegel, eine Vielzahl von Linsen unterschiedlicher optischer Achsen, die unterteilte Linse mit optischen Achsen, die voneinander abweichen, ein Prisma oder dergl. Dann gehen die einzelnen unterteilten Abbildungslichtstrahlen durch den Wellenlängendispersions prozeß des Bandpaßfilters, um auf den Detektor zur erforderlichen Separation und Detektion fokussiert zu werden.

Weiterhin sind erfindungsgemäß die Einrichtungen zum Unterteilen der Fluoreszenz abbildung und Trennen der Wellenlängen teilweise aus der zylindrischen konvexen Linse und der zylindrischen konkaven Linse gemacht. Die Fluoreszenzlichtstrahlen, die mit weiten Winkeln von den Fluoreszenzlichtabbildungen emittiert werden, können über die zylindrische konvexe Linse gebündelt bzw. konzentriert werden und über die zylindrische konkave Linse auf die Lichtrezeptionsebene fokussiert werden. Dies bedeutet, daß die Fluoreszenzlichtstrahlen, die mit weiten fest stehenden Winkeln von dem Emissionspunkt jeder Fluoreszenzlichtabbildung emittiert werden, in weitem Maße bzw. extensiv verwendet werden können. Die Fluoreszenzlichtstrahlen, die von den Geräten abbildungsaufgeteilt und wellenlängen selektiert wurden, werden auf unterschiedliche Positionen des zweidimensionalen Detektors oder dergl. fokussiert. Diese Signale können verarbeitet werden, um hohe Empfindlichkeiten der Messungen der DNA-Fragmente zu liefern.

Im folgenden wird im Detail einer der Fälle beschrieben, bei dem das Prisma als abbildungsaufteilende Einrichtung verwendet wird. In der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp wird die Kante von der Spitze des Mittelteils des Prismas vorzugsweise überlappend auf den Linienemissions teil gelegt, so daß er in Richtung auf den Abstrahlungsteil von der Pupille der Lichtrezeptionslinse zeigt. Die Lichtstrahlen, die die oberen und unteren Teile des Prismas passieren, können als zwei Abbildungen auf dem zweidimensionalen Detektor fokussiert werden, und wenn sie von unterschiedlichen Punkten und zur gleichen Zeit emittiert werden, können sie nach oben und unten wellenlängen dispiersiert werden. Die zwei Lichtstrahlen, die aus den jeweiligen Teilen des Prismas herauskommen, passieren die unterschiedlichen Filter in Richtung auf den Detektor. Die Signale, deren Wellenlängen nicht aneinander liegen, werden zur Trennung und Detektion durch das Durchleiten durch die Filter zugelassen, die unterschiedlich gemäß dem oberen und unteren Teil sind, durch die die Lichtstrahlen passieren. Die Signale mit großer Wellenlängendifferenz werden zur Dispersion und Detektion durch das Prisma zugelassen.

Daher kann bei Verwendung irgeneiner der abbildungsaufteilenden Einrichtungen, die zuvor erwähnt wurden, die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp die Fluoreszenzlichtstrahlen unterschiedlicher Emissions wellenlängen mit hoher Genauigkeit und gleichzeitig ohne Zeitteilung bzw. Zeitversatz trennen und detektieren, das heiß auf eine Art, daß die Messungen hinsichtlich der Zeit nicht unterteilt werden müssen.

Demgemäß kann die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise verwendet werden zum Bestimmen der Basensequenz der vielfarbfluoreszenzmarkierten DNA- Fragmente.

Darüber hinaus bietet die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp eine große Menge an Rezeptionslicht für eine hohe Empfindlichkeit, da die bestrahlten Teile kontinuierlich über die Seitenfläche bestrahlt werden und der zweidimensionale Detektor den ganzen bestrahlten Bereich zur gleichen observieren kann.

Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit der Zeichnung, wobei

Fig. 1 eine Kombination aus Blockdiagrammen, teilweiser Schnittansicht und teilweise perspektivischer Ansicht ist, die die Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform zeigt, bei der ein Spiegel verwendet wird;

Fig. 2 eine Schnittansicht des optischen Systems der in Fig. 1 gezeigten Elektrophoresevorrichtung ist;

Fig. 3a eine Kombination aus Blockdiagramm, teilweiser Schnittansicht und teilweise perspektivischer Ansicht der Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, bei der eine Vielzahl von Linsen unterschiedlicher optischer Achsen verwendet werden;

Fig. 3b eine Draufsicht und eine Schnittansicht der vielfach unterteilten Linse mit abweichenden optischen Achsen zeigt;

Fig. 4 eine Kombination aus Blockdiagramm und teilweiser Schnittansicht der Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, bei der ein Prisma verwendet wird;

Fig. 5 eine Schnittansicht des optischen Systems der in Fig. 4 gezeigten Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp ist;

Fig. 6 eine Schnittansicht des optischen Systems der Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, bei der ein Prisma mit vielen Ebenen verwendet wird;

Fig. 7 eine schematische Ansicht der Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenz erfassungstyp in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist, bei der zylindrischen Linsen verwendet werden;

Fig. 8 eine Schnittansicht des optischen Systems in der Fig. 7 gezeigten Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp ist;

Fig. 9 eine Drauf- und eine Seitenansicht des vierfach unterteilten Filters zeigt, welches in dem in Fig. 8 gezeigten optischen System verwendet wird; und

Fig. 10 eine schematische Ansicht ist, die eine abbildungsfokussierte Charak teristik des optischen Systems mit dem vierfach unterteilten Filter zeigt.

Beispiel 1

Unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 wird eine erste erfindungsgemäße Ausführungsform im folgenden beschrieben.

Ein Laserstrahl 4, der von einer Argonlaserquelle 3 mit 400 nm Wellenlänge und 10 mW Ausgangsleistung erzeugt wird, wird auf ein Flachbettgel bzw. Slabgel bzw. Plattengel 2 aus Polycrylamid mit 6% Konzentration angelegt bzw. gerichtet, welches zwischen zwei Lagen von Glasplatten oder Quarzplatten 1 gehalten ist, die um 0,3 mm voneinander beabstandet sind und 300 mm auf 200 mm auf 5 mm messen, wobei der Laserstrahl über die Seitenendfläche auf das Slabgel 2 gerichtet ist. Es ist anzumerken, daß die Konzentration des Polyacrylamid im folgenden als seine gesamte monomere Konzentration in Gewichtsprozent pro Volumen (g/ml) angegeben wird. Ein bestrahlter Teil 17 ist als ein Punkt in einer Schnittansicht von Fig. 2 gezeigt.

Die DNA-Proben, die mit vier Arten von Farbfluorophoren für die jeweiligen vier Anschlußgattungen markiert sind, werden in Probeninjektionslöcher bzw. -vertiefungen (nicht gezeigt) auf der Oberseite des Slabgels eingeführt und wandern nach unten. Dort können eine Vielzahl von Migrationswegen bzw. -bahnen angeordnet sein. In diesem Fall kann der Laserstrahl 4 jedoch alle Migrations bahnen bestrahlen. Ein Fluoreszenzlichtstrahl wird mit der Bestrahlung des bestrahlten Teils 17 emittiert. Bei einem der herkömmlichen Verfahren, bei denen eine einfarbige Fluoreszenzmarkierung verwendet wird, um die Anschlußgattung durch einen Unterschied bezüglich der Migrationsbahn zu identifizieren, wird eine Fluoreszenzlicht-Intensitätsveränderung über der Zeit derart beobachtet, daß die Fluoreszenzlicht-Abbildungen auf einen Liniensensor oder einen zweidimensionalen Detektor über eine Linse fokussiert werden, der ein Filter zum Abschneiden des Anregungslichtes hat. Die vier verwendeten farbigen Fluorophore sind FITC, NBD- F, TRITC und Texas Red, wie zuvor erwähnt. An Stelle dieser kann auch ein Fluorophor aus einem metallischen Komplex verwendet werden. In diesem Beispiel, wo vier farbige Fluorophore verwendet werden, sind vier rechteckige Spiegel 5 mit 1 cm Höhe und 10 cm Breite in einer Position hinter der Elektrophoreseplatte 2 positioniert, die dem zweidimensionalen Detektor 9 gegenüberliegt, um die Fluoreszenz-Linienabbildungen zu reflektieren, so daß vier virtuelle Abbildungen von der Detektorseite betrachtet werden können. Die vier Spiegel 5 sind in einer Positionen auf einem Umfang einer Ellipse mit 20 cm Hauptachse angeordnet, wobei die Mittelpunkte derselben an einem Punkt einer Pupille der Linse 7 und einem Abschnitt des Gels liegen, das mit dem Laserstrahl bestrahlt wird, so daß die Abstände von dem Detektor zu den vier virtuellen Abbildungen zueinander gleich sind. Die vier virtuellen Abbildungen werden auf den zweidimensionalen Detektor 9 über die Linse 7 als vier Linien fokussiert. Dort sind vier Bandpaßfilter 8 mit 515 nm, 573 nm, 540 nm und 610 nm Übertragungs- bzw. Transmissions wellenlängen angeordnet, die den jeweiligen vier Fluorophoren vor der Fokussier position entsprechen, um die virtuellen Abbildungen über die Wellenlänge zu selektieren bzw. zu trennen. Alternativerweise können die Bandpaßfilter an einer Stelle zwischen den Spiegeln und dem zweidimensionalen Detektor 9 positioniert sein anstelle des Ortes rechts vor dem zweidimensionalen Detektor. Die von dem zweidimensionalen Detektor überwachten Abbildungen sind vier Linien 14, wie sie auf einem Monitor 13 gezeigt sind. Diese Linien sind Signale, die von den Fluorophoren unterschiedlicher Wellenlängen gegeben werden; das heißt, die Signale kommen von den DNA-Fragmenten mit unterschiedlichen Anschlußgattungen. Die Abszisse des Monitors repräsentiert eine seitliche Richtung der Elektrophoreseplatte. Die Signale in der gleichen Position der Abszisse der vier Linienabbildungen sind Information der Proben, die in der gleichen Migrationsbahn enthalten sind. Die Signale können miteinander verglichen werden, um die Anschlußgattung zu bestimmen.

Fig. 2 erläutert die Details eines optischen Systems der vorliegenden Ausführungs form. Die Fluoreszenzlichtstrahlen, die von vier Spiegeln 5 reflektiert werden, können die virtuellen Abbildungen auf dem Umfang einer Ellipse bilden, deren Mittelpunkt in der Pupille der Linse ist.

Es gibt einen Streifenreflexionsspiegel 15 mit 1 mm Breite, der durch einen Aufdampfungsprozeß auf die Glasplatten auf der Seite eingepaßt bzw. aufgebracht ist, die in Kontakt mit dem Slabgel ist, um so die Menge von empfangenen Licht zu erhöhen und zur gleichen Zeit zu verhindern, daß die Fluoreszenzlichtstrahlen des bestrahlten Abschnitts direkt in den Lichtempfangssektor kommen. Der Reflexionsspiegel hat eine Fläche, die ausreicht, um die gesamten Lichtstrahlen zu reflektieren, die den Lichtempfangssektor erreichen können. Alternativerweise kann er an einer Stelle zwischen dem Detektor und der Migrationsplatte angeordnet sein. Es kann auch mit einem Spiegel kombiniert sein, der ein Prisma hat, um den Lichtpfad einzustellen.

In der Figur ist gezeigt: der Spiegel 6 zum Abschneiden bzw. Ausblenden des Anregungslichtes, eine Steuereinheit 10, eine Datenverarbeitungseinheit 11 und ein Display 12.

Beispiel 2

Im folgenden wird unter Bezugnahme auf Fig. 3a eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben. Ein Laserstrahl 4, der von einer Argonlaserquelle 3 mit 400 nm Wellenlänge und 10 mW Ausgangsleitung erzeugt wird, wird auf ein Slabgel 2 aus Polyacrylamid mit 6% Konzentration gerichtet, welches zwischen zwei Lagen von Glasplatten oder Quarzplatten 1 gehalten ist, die 300 mm auf 200 mm auf 5 mm messen und 0,3 mm voneinander beabstandet sind, und zwar über eine Seitenendfläche der Anordnung. Ein bestrahlter Abschnitt 17 ist in einer Schnittansicht als ein Punkt angedeutet, wie in dem Fall von Fig. 2. DNA-Proben, die mit vier Arten von farbigen Fluorophoren für jeweilige vier Anschlußgattungen markiert sind, werden in Probeninjektionsbohrungen (nicht gezeigt) auf der Oberseite des Slabgels injiziert und wandern nach unten. Eine Lage einer elektrophoretischen Platte kann normalerweise zwanzig bis dreißig Migrationsbahnen halten bzw. enthalten. Der Laserstrahl 4 kann alle Migrations bahnen zur gleichen Zeit bestrahlen. Ein Fluoreszenzlichtstrahl wird mit der Bestrahlung von dem bestrahlten Teil 17 emittieren.

Die mit den vier Fluorophoren markierten DNA-Fragmente werden gemäß deren Länge bzw. Weg auf unterschiedlichen Migrationsbahnen für die jeweiligen Proben getrennt. Die DNA-Fragmente können Fluoreszenzlichtstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge gemäß der Arten von Anschlußgattungen emittieren, wenn sie durch den Abschnitt passieren, auf den der Laserstrahl gerichtet ist. Die emittierten Lichtstrahlen können entlang der bestrahlten Fläche als Linienabbildungen gesehen werden. Wenn die Fluoreszenzlichtstrahlen unter Verwendung eines Prismas in Spektren aufgeteilt bzw. getrennt werden, können die jeweiligen Signale nicht hinreichend getrennt werden aufgrund der zu geringen Wellenlängendispersion. Bandpaßfilter sind vorteilhaft zum Trennen der Fluoreszenzlichtwellenlängen. In dieser Ausführungsform wird - wie in Fig. 3a gezeigt - eine Einrichtung 7 ₂ mit vier Linsen unterschiedlicher optischer Achsen verwendet, um die Abbildungen aufzuteilen, um eine vierfache Fluoreszenzabbildung zu erhalten, wobei eine Bandpaßfiltereinrichtung 8 ₃ in eine Position vor oder hinter den Linsen 7 ₂ gesetzt wird. Die Einrichtung 7 ₂ mit vier Linsen besteht aus vier rechteckigen Linsen, die parallel angeordnet sind, wobei ihre Längskanten miteinander verbunden sind derart, daß die optischen Achsen voneinander unterschiedlich sind.

Das Bandpaßfilter 8 ₃, das in dieser Ausführungsform verwendet wird, ist ein Mosaikfilter, welches aus einem mehrlagigen dielektrischen Material wie das für das zuvor erwähnte Bandpaßfilter hergestellt ist. Alternativerweise kann das Bandpaßfilter 8 ₃ vor die jeweiligen Linsen der Einrichtung 7 ₂ mit vier Linsen gesetzt werden.

Die auf dem zweidimensionalen Detektor überwachten Abbildungen sind gleich der einen, die durch das Bezugszeichen 14 gezeigt wird.

Abschnitte, bzw. Teile, die jeweiligen zu überwachenden Linien entsprechen, werden ausgelesen und durch eine Lichtintensitäts-Korrekturberechnung kompensiert, um Lichtintensitätsveränderungen der jeweiligen DNA-Fragmente zu erhalten.

Alternativerweise kann die Einrichtung 7 ₂ aus vier Linsen, die aus vier Linsen unterschiedlicher optischer Achsen besteht, wie es in Fig. 3 gezeigt ist, durch eine unterteilte Linseneinrichtung ersetzt werden wie die, die in Fig. 3b gezeigt und derart hergestellt ist, daß eine Linse radial in vier Linsenfragmente unterteilt ist, die wieder zusammengesetzt werden, wobei deren optische Achsen voneinander abweichen. In diesem Fall muß die Bandpaßfiltereinrichtung gemäß der Struktur der unterteilten Linse radial hergestellt sein. Zusätzlich kann zum Unterteilen der Abbildung in dieser Ausführungsform ein Reflektionsspiegel oder ein Prisma zusammen mit der zuvor erwähnten unterteilten Linse verwendet werden.

Beispiel 3

Unter Bezugnahme auf die Fig. 4 und 5 wird eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nun beschrieben. Fig. 4 ist eine schematische Ansicht der Elektrophoresevorrichtung gemäß der vorliegenden Ausführungsform. Das optische System ist im Schnitt gezeigt. Ein Argonlaser von 400 nm Wellenlänge und 10 mW Ausgangsleistung wird auf ein Slabgel 102 aus Polyacrylamid mit 6% Konzen tration, welches zwischen zwei Lagen aus Glasplatten 101 gehalten ist, die um 0,3 mm voneinander beabstandet sind und 300 mm auf 200 mm auf 5 mm messen, über die Seitenendfläche der Anordnung gerichtet. Ein bestrahlter Abschnitt 103 ist als ein Punkt in der Schnittansicht gezeigt. Licht, welches von dem bestrahlten Teil nach oben weggeht, wird über ein oberes Prisma 104 gebrochen und dann über eine Linse 106 auf eine untere Seite eines zweidimensio nalen Detektors 109 fokussiert. Andererseits wird Licht, welches nach unten geht, über ein unteres Prisma 105 gebrochen und dann über die Linse 106 auf eine obere Seite des zweidimensionalen Detektors 109 fokussiert. In dieser Ausführungs form sind DNA-Fragmente als Proben zur Fluoreszenzerfassung fluoreszenzmarkiert mit Fluorophoren vier unterschiedlicher Wellenlängen entsprechend den vier Arten von Anschlußgattungen, wobei die Fluorophore FITC (Fluorescein Isothiocyanat) mit 515 nm Emissionswellenlänge, NBD-F (4-Fluor-7-nitrobenzofurazan) mit 540 nm Emissionswellenlänge, TRITC (Tetramethylrhodaminisothiocyanat) mit 573 nm Emissionswellenlänge und Texas Red mit 610 nm Emissionswellenlänge sind. Demgemäß werden vier Lichtstrahlen der zuvor erwähnten Wellenlängen von dem Emissionspunkt emittiert und über die Prismen gestreut bzw. dispersiert. Das gestreute Licht kann - wie in Fig. 5 gezeigt - vier Linien (vier Punkte in der Schnittansicht) auf der oberen und auf der unteren Seite produzieren. Die Bezugszeichen 115 bzw. 115′, 116 bzw. 116′, 117 bzw. 117′ und 118 bzw. 118′ zeigen jeweils Abbildungen mit gleicher Wellenlänge an, und zwar entsprechend den Lichtstrahlen bzw. Lichtbündeln, die das obere und das untere Prisma passieren. Insbesondere deuten die Bezugszeichen 115 und 115′ Lichtabbildungen an, die von Texas Red emittiert werden, 116 und 116′ solche, die von TRITC, 117 und 117′ solche, die von NBD-F und 118 und 118′ solche, die von FITC emittiert werden. In diesem Beispiel können die Lichtabbildungen 115 und 116 und die Lichtabbildungen 117 und 118 nicht hinreichend durch Wellenlängendispersion mittels des Prismas jeweils voneinander unterschieden bzw. identifiziert werden aufgrund der geringen Wellenlängenunterschiede. Die Lichtabbildungen 115 und 117 und die Lichtabbildungen 116 und 118 können jedoch jeweils voneinander gut unterschieden bzw. identifiziert werden. Die obere Seite 107 des Bandpaßfilters hat zwei Transmissionswellenlängen, nämlich 515 nm und 573 nm, und die untere Seite 108 hat zwei Übertragungswellenlängen, nämlich 540 nm und 610 nm, wodurch eine Identifizierung von vier Farben ermöglicht ist. Fig. 5 erläutert die vorangegangenen Ausführungen. Wenn die Filter nicht vorgesehen sind, wobei ein Filter 119 zum Abschneiden des Anregungslichtes vorgesehen ist, wird der zweidimensionale Detektor acht Linien überwachen bzw. aufzeigen; benachbarte Linien derselben können jedoch noch nicht deutlich voneinander getrennt werden. Wenn die Filter 107 und 108 angebracht bzw. vorgesehen sind, können die vier Linien zur Erfassung voneinander getrennt werden. (Siehe obere rechte Ansicht von Fig. 5 und das Monitorbild von Fig. 4.) Die über die vier Fluoreszenzlicht- Abbildungen erhaltenen Signale können unabhängig unter Zuhilfenahme von einer bis drei horizontalen Abtast- bzw. Scanninglinien des zweidimensionalen Detektors ausgelesen werden. Die erhaltenen Signale können zur Bestimmung der DNA- Basensequenzen unter Verwendung einer Datenverarbeitungseinheit 111 in Information über vier Anschlußgattungen der DNA-Fragmente gewandelt werden.

In dieser Ausführungsform sind die Prismen 104 und 105 einstückig ausgebildet, wobei eine schmale Spitze derselben einen Winkel α von 30 Grad bildet. Das für die Prismen verwendete Material ist BaF Glas. Die Spitzen der Prismen sind derart bestimmt, daß Licht, welches durch einen dicken Abschnitt des Prismas 104 passiert, gebrochen werden kann, um unterhalb einer unteren Kante der Linse 106 zu passieren. Dies ermöglicht, daß das Licht bzw. die Lichtstrahlen unter einem festgelegten Winkel, den die Linse "sieht", in die Linse eintreten kann.

Alternativerweise können in dieser Ausführungsform die Prismen 104 und 105 in einer anderen Position zwischen der Elektrophoreseplatte und dem zweidimensiona len Detektor angeordnet sein.

In Fig. 4 sind eine Steuereinheit 110, ein Monitor 113 und Linienabbildungen 114 gezeigt.

Beispiel 4

Fig. 6 zeigt ein Beispiel, bei dem eine polyedrische Prismeneinrichtung verwendet wird. Licht, welches von einem Emissionspunkt 103 emittiert, kann durch ein oberes Prisma 104 oder ein unteres Prisma 105 geleitet werden und kann auf unterschiedliche Positionen eines zweidimensionalen Detektors 109 über eine Linse 106 fokussiert werden. Wenn sowohl das obere Prisma 104 als auch das untere Prisma 105 - wie gezeigt - zwei Oberflächen unterschiedlichen Winkels haben, wird das Licht, welches durch das obere und das untere Prisma passiert, auf den Detektor 109 mit jeweils zwei Abbildungen fokussiert, was insgesamt vier Abbildungen ergibt. Obwohl sich die Anzahl der Abbildungen erhöht, wird ein fester Gesamtlicht-Empfangswinkel größer, wenn man auf die Prismen sieht, und somit wird sich die Menge des Lichts für jede erfaßte Fluoreszenzlicht-Abbildung kaum verändern, verglichen mit dem Fall, wo keine Prismen verwendet werden. Es sind Filter 120 unterschiedlicher Transmissionswellenlängen an jeweiligen abbildungsfokussierten Positionen oder rechts hinter den Prismen 104, 105 angeordnet, um die Wellenlängen zu separieren, um Signale zu erfassen. Wenn Bandpaßfilter eine scharfe Trennung bzw. ein scharfes Abschneiden der Übertragungswellen bzw. -signale bieten, können sie die Wellenlängen mit höherer Genauigkeit trennen als die Prismen, die diese Signale zum Trennen nach Wellenlänge streuen. Das für die Prismen in dieser Ausführungsform verwendete Material ist BK5. Die Winkel 121 und 122 der Prismen betragen 15 bzw. 30 Grad.

Beispiel 5

Unter Bezugnahme auf die Fig. 7 bis 10 wird nun eine fünfte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Die in dieser Ausführungsform verwendeten markierenden Fluorophore sind Texas Red mit 605 nm Emissionswellenlänge und drei Arten von Phthalocyanin fluorophoren mit 680 nm, 703 nm und 725 nm Emissionswellenlängen. Zum Anregen des ersteren Fluorophors wird ein He-Ne-Laser 201 mit 543 nm Wellenlänge verwendet und zum Anregen der letzteren drei wird ein He-Ne-Laser 202 mit 633 nm Wellenlänge verwendet. Das von den beiden Lasern abgestrahlte Licht kann durch Spiegel 203 und 204 überlagert werden, um einen Laserstrahl 235 zu bilden. Der Laserstrahl 235 kann dann über eine Linse (nicht gezeigt) fokussiert werden und eine Gelplatte zur Elektrophorese (Slabgel) 205 über eine Seitenendfläche derselben bestrahlen. Das Slabgel ist 0,3 mm dick und wird von Quarz- oder Glasplatten 206 gehalten. Das Slabgel mit einer Breite von 200 mm wird in seinem Mittelabschnitt mit 120 mm Breite zur Analyse verwendet. Das von dem bestrahlten Teil emittierte Fluoreszenzlicht wird durch einen Schlitz 231 geleitet und dann werden seine Komponenten nach oben und unten gestreut und rechtwinklig zu dem Bestrahlungslaserstrahl über eine konvexe zylindrische Linse 207 in parallele Lichtstrahlen konzentriert. Da die konvexe zylindrische Linse 207 einen festen Lichtempfangswinkel achtmal in Richtung nach oben und unten vergrößert, liefert sie eine hohe Empfindlichkeit. Der Schlitz 231 mit 5 mm Abständen wird in eine Position 5 mm weg von dem Licht emittierenden Abschnitt gesetzt. Dies verhindert, daß durch Streulicht emittierte Fluoreszenz die Messung beeinflußt. Die von dem Streulicht emittierte Fluoreszenz tritt auf, wenn eine große Menge von markierter DNA wandert und andere Abschnitte passiert als den, auf den der Laserstrahl gerichtet ist. Ein Streulicht-Abschneidefilter 208 ist vorgesehen, aufweisend ein Farbglasfilter und einen Totalreflexionsspiegel für das Licht mit Anregungswellenlängen, was nur das von den vier Arten von Fluoropho ren emittierte Fluoreszenzlicht passieren läßt. Das Fluoreszenzlicht, welches pasiert, wird räumlich hinsichtlich der Wellenlängen selektiert, um über ein vierfach unterteiltes Mehrebenenfilter 209 auszutreten, welches vier Ebenen zum Austritt von Licht hat, die auf den jeweiligen unterschiedlichen Ebenen liegen, die in Fig. 8 gezeigt sind. Alternativerweise kann das Mehrebenenfilter 209 durch eine Vielzahl von zylindrischen Linsen ersetzt werden, die oben und unten mit unterschiedlichen Vertikalwinkeln angeordnet sind. Das getrennte Fluoreszenzlicht wird richtungsmäßig über eine zylindrische konkave Linse 210 kompensiert, so daß vertikale Fokussierpositionen derselben mit horizontalen Positionen derselben ausgerichtet werden können. Dann werden sie auf einen zweidimensionalen Detektor 212 über eine fokussierende Linse 211 fokussiert. Die Linse 211 ist vom Typ CF25L von Fuji Optical Instrument Inc.′s mit 25 mm Brennweite und 0,85 F. Das vierfach unterteilte Filter 209, wie es in den Fig. 8 und 9 gezeigt ist, ist derart aufgebaut, daß die Licht nach außen leitende Ebene in vier Ebenen unterteilt ist. Jede Ebene hat ein Bandpaßfilter aus einem dielektrischen Mehrlagenfilm einer bestimmten Transmissionswellenlänge aufgedampft, die sich voneinander unterscheiden. Die Aufteilung der Licht nach außen leitenden Ebene ist derart ausgelegt, daß 5 mm oder mehr Intervalle von virtuellen Abbildungen geschaffen werden. Die zylindrische konvexe Linse 207, die in dieser Ausführungs form verwendet wird, hat 22 mm Brennweite, ist 22 mm hoch (vertikale Breite) und 120 mm breit (horizontale Breite), um einen Parallelstrahl mit 22 mm vertikaler Breite zu liefern. Bezüglich der vertikalen Komponenten des Fluoreszenz lichts werden die Fluoreszenzlichtstrahlen rechtwinklig zu dem Filter über die zylindrische konvexe Linse 207 gemacht, um eine höhere Filtergenauigkeit zu liefern.

Das unterteilte Filter 209 ist 30 mm lang und 30 mm breit oder ausgelegt, einen Kreis mit 30 mm Durchmesser zu umgeben. Bereiche bzw. Flächen der unterteilten Filter, über die das Licht passieren kann, sind derart eingestellt, daß die Menge an Licht, die durch die Filterebenen passiert, virtuell gleich sein kann. Die Breite der Filterabschnitte des unterteilten Filters ist, gemessen unterhalb dessen Spitzen, 10 mm, 5 mm, 5 mm und 10 mm, wie es in Fig. 9 gezeigt ist. Jede Ebene des unterteilten Filters ist ausgelegt, um parallel zu den jeweiligen Emissionslinien zu sein. Da nicht jede Filterebene auf der gleichen Ebene liegt, zeigt der zweidimen sionale Detektor 212 vier Fluoreszenzlinienabbildungen. Eine Abweichung x von jeder Fluoreszenzlinienabbildung von dem Ursprung hängt von einem Winkel R, der zwischen den benachbarten, Licht nach außen leitenden Ebenen des Filters besteht, und einem Abstand l von dem Objekt 218 zu dem Filter ab. Die Abweichung x kann unter Zuhilfenahme eines Diffraktionsindexes n etwa ausgedrückt werden zu x = l tan (n - 1) R. Das durch die jeweiligen Ebenen 227, 228, 229 und 230 geleitete Fluoreszenzlicht wird - wie in Fig. 10 gezeigt - nach außen in Ausbreitungsrichtung geändert wie angedeutet durch die Lichtpfade 223, 224, 225 und 226. Das Licht wird dann fokussiert, als wenn Objektpunkte bei den Positionen 219, 220, 221 und 222 bestehen würden. In dieser Ausführungsform ist, da l = 150 mm und R = 4 Grad, die resultierende Abweichung x = 6 mm. Da die Intervalle bzw. Abstände des Schlitzes 231 gleich 5 mm sind, werden die durch die Filterebenen geleiteten Abbildungen nicht mit ihren peripheren Satellitenabbildungen bzw. Nebenabbildungen überlagert, so daß die Messung nicht beeinflußt wird. Das heißt, die Winkel, die zwischen der Fluoreszenzlicht- Auffallebene des unterteilten Filters zu den Licht nach außen leitenden Ebenen gebildet werden, werden zu 6 Grad, 2 Grad, 2 Grad bzw. 6 Grad gewählt, gemessen von deren Spitze, so daß vier Linien mit Intervallen von 6 mm Abstand jeweils beobachtet werden, die für die Objektpunktposition berechnet werden. Die von einem Bildfokussiersystem erhaltenen Abbildungen, das einen Vergrößerungs faktor von ¹/₈ hat, können 0,7 mm voneinander beabstandet auf einem Lichtempfangsgerät R von Hamamatsu Photonix Inc. beobachtet werden, welches welches eine Integration eines Bildverstärkers und eines CCD's ist, wie es durch vier Linien 217 auf dem Monitor angedeutet ist, was in Fig. 7 gezeigt ist. Diese Leistungsfähigkeit ist gleich etwa 25 Vertikalkanaltrennungen, was genug ist zur Trennung und Erfassung der Abbildungen.

Als Material für das unterteilte Filter 209, welches die aufgedampften Filme hat, wird ein Glas mit einer geringen Wellenlängendispersion verwendet oder einem großen ν d, z. B. BK-7 oder dergleichen. Eine große Wellenlängendispersion führt auf nachteilige Weise zu dicken, zu beobachtenden Abbildungslinien.

Die vier Linienabbildungs-Signale werden geeignet in Basissignale für die jeweiligen Proben durch eine Erfassungsschaltung 213 und eine Datenverarbeitungseinheit 124 gewandelt und an eine Ausgangseinheit 215 ausgegeben.

In den Figuren vergebene Bezugszeichen und Symbole bezeichnen im wesentlichen identische Teile oder Einrichtungen.

Wie aus der obigen Beschreibung deutlich ersichtlich, werden erfindungsgemäß zunächst eine Abbildungsunterteilungseinrichtung wie ein Spiegel, Prisma oder Linsen mit unterschiedlichen optischen Achsen verwendet zum Bilden bzw. Herstellen einer Vielzahl von Fluoreszenzlicht-Abbildungen, und jede Abbildung wird auf ein Lichtrezeptionsgerät fokussiert, wenn es durch jeweilige Filter geleitet ist, die unterschiedliche Emissionswellenlängen des zu übertragenden Lichtes identifizieren bzw. durchlassen. Diese Technik kann die Signale von den vielfarbmarkierten DNA-Fragmenten mit hoher Präzision bei simultanen Messungen identifizieren. Dies erlaubt eine Trennung und Detektion oder Bestimmung der DNA-Basenfrequenz mit einer höheren Empfindlichkeit und höheren Genauigkeit.

Weiterhin kann der im wesentlichen feste Lichtrezeptionswinkel durch Abbildungs unterteilung, nicht durch Zeitunterteilung, erfindungsgemäß größer gemacht werden. Das Licht bzw. die Lichtstrahlen von den vierfarbig fluoreszenzmarkierten Objekten kann unter Verwendung einer zylindrischen konvexen Linse gemessen werden, ohne daß die Lichtmenge abnimmt.

Bei der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp sind keine beweglichen Teile wie Rotationsfilter vorgesehen, was eine etwaige Besorgnis bezüglich des mechanischen Betriebs auslöscht. Herkömmlicherweise ist das Herstellen eines großen Bandpaßfilters schwierig, bei der vorliegenden Erfindung kann das Filter jedoch klein gemacht werden, da es als unterteiltes Filter in der Nähe der fokussierenden Linse vorgesehen ist.

Claims

1. Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp, aufweisend zumindest

(i) eine Gelplatte (2, 102, 205) zur Elektrophoreseseparation,
(ii) eine Anregungslaserstrahlquelle (3, 201, 202) zum Emittieren von Fluoreszenzlicht durch Anregen von Fluorophoren, die eine Probe markieren, und
(iii) einen Fluoreszenzlichtdetektor (9, 109, 212) zum Erfassen des emittierenden Fluo reszenzlichtes;

dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine abbildungsunterteilende Einrichtung für eine Fluoreszenzlichtabbildung hat, die erhalten wird durch Anlegen eines Laserstrahls (4, 235) an die Gelplatte (2, 102, 205) zur Elektrophoresesepara tion, eine Wellenlängenauswahleinrichtung für Licht bzw. Lichtstrahlen hat, die den aufgeteilten Abbildungen entsprechen, und eine optische Einrichtung hat zum Fokussieren auf den Fluoreszenzlichtdetektor (9, 109, 212) von Fluoreszenzlicht-Abbildungen, die durch die Abbildungsunterteilungseinrichtung und die Wellenlängenauswahleinrichtung gelaufen sind.

2. Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp, aufweisend zumindest

(i) eine Gelplatte (2, 102, 205) zur Elektrophoreseseparation,
(ii) eine Anregungslaser-Strahlquelle (3, 201, 202) zum Emittieren von Fluoreszenzlicht durch Anregen von Fluorophoren, die eine Probe markieren, und
(iii) einen Fluoreszenzlichtdetektor (9, 109, 212) zum Erfassen des emittierten Fluo reszenzlichts;

dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine abbildungs unterteilende Einrichtung (5, 7 ₂, 104, 105, 209) einer Fluoreszenzlicht- Linienabbildung hat, die erhalten wird durch Anlegen eines Laserstrahls auf eine geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation, und Bandpaßfilter (8, 8 ₃, 107, 108, 120, 227-230) unterschiedliche Transmissions wellenlängen hat, entsprechend den jeweiligen Abbildungen, die von der Abbildungsunterteilungseinrichtung unterteilt sind, und die gleiche Anzahl haben wie die unterteilten Abbildungen, und eine optische Einrichtung hat zum Fokussieren auf den Fluoreszenzlichtdetektor (9, 109, 212) der einzelnen Fluoreszenz-Linienabbildungen, die von der Abbildungsunterteilungsein richtung unterteilt sind und erzeugt durch die jeweiligen Bandpaßfilter, wodurch sie aus unterschiedlichen Transmissionswellenlängen bestehen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, in der die Laserstrahl-Bestrahlung auf die geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation von einer Seitenendfläche der Gelplatte in Richtung auf ein Slabgel gerichtet ist und das Slabgel der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation parallel zu der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation durchdringt, und eine Fluoreszenzlicht-Linien abbildung, die erhalten wird durch Laserbestrahlung, wird entlang eines Weges emittiert, den der Laserstrahl in dem Slabgel einnimmt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, in der die Abbildungsunterteilungseinrichtung aufweist eine Vielzahl von Reflektionsspiegeln, die parallel zu einer Achse eines Laserstrahls in der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation angeordnet sind, und in der die Bandpaßfilter unterschiedlicher Transmissionswellenlängen, die in der Anzahl der Anzahl der Reflektionsspiegel gleich sind, auf jeweiligen Wegen vorgesehen sind, die das Fluoreszenzlicht bzw. die Fluoreszenzlicht strahlen, die von den Reflektionsspiegeln reflektiert werden, auf fokussierende Positionen eines Fluoreszenzlichtdetektors führen.

5. Vorrichtung nach Anspruch 2, in der die Vielzahl von Reflektionsspiegeln auf einem Umfang einer Ellipse angeordnet sind, deren einer Mittelpunkt auf einem laserbestrahlten Abschnitt des Gels zur Elektrophoreseseparation liegt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 2, in der die Abbildungsunterteilungseinrichtung aufweist zumindest eine Vielzahl von Linsen unterschiedlicher optischer Achsen oder eine Linse, die in Fragmente mit unterschiedlichen optischen Achsen unterteilt ist, und die auf einem Weg vorgesehen ist, auf dem sich Fluo reszenzlicht, welches von einem laserbestrahlten Abschnitt der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation emittiert, ausbreitet in Richtung auf die fokussierende Position des Fluoreszenzlichtdetektors.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, in der ein zusätzliches Prisma oder ein zusätzlicher Spiegel zur Unterteilung der Fluoreszenzlicht-Abbildung vorgesehen ist auf einem Pfad, auf dem sich Fluoreszenzlicht, welches von einem laserstrahlbestrahlten Abschnitt der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation emittiert, in Richtung auf eine Fokussierposition auf dem Fluoreszenzlicht detektor ausbreitet.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, in der der Fluoreszenzlichtdetektor ein zweidimensonaler Detektor ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, in der die Elektrophoreseseparation vom Fluoreszenzerfasssungstyp eine Vorrichtung zum Separieren und Detektieren von DNA's oder RNA's ist.

10. Elektrophoresevorrichtung zum Fluoreszenzerfassungstyp, aufweisend zumindest

(i) eine Gelplatte (102) zur Elektrophoreseseparation,
(ii) eine Anregungslaser- Strahlquelle zum Emittieren von Fluoreszenzlicht durch Anregen von Fluorophoren, die eine Probe markieren, und
(iii) einen Fluoreszenzlicht detektor (109) zum Erfassen des emittierten Fluoreszenzlichtes,

dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung aufweist ein Prisma (104, 105) mit einer Vielzahl von Licht nach außen leitenden Ebenen zum Unterteilen einer Fluoreszenzlicht-Linienabbildung, die erhalten wird durch Anlegen eines Laserstrahls auf eine geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophoresesepa ration, und mit einem optischen System zum einzelnen Fokussieren auf den Fluoreszenzlichtdetektor (109) einer Vielzahl der Fluoreszenz-Linienabbildungen, die durch die Vielzahl von Licht nach außen leitenden Ebenen des Prismas unterteilt sind.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, in der die Laserbestrahlung auf die geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation von einer Seitenendfläche der Gelplatte in Richtung auf ein Slabgel gerichtet ist und das Slabgel der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation parallel zu der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation durchdringt, und wobei eine Fluoreszenzlicht- Linienabbildung, die erhalten wird durch Laserbestrahlung, entlang eines Weges emittiert wird, entlang dessen sich der Laserstrahl in dem Slabgel ausbreitet.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10, in der das optische System ein Bandpaßfilter einzelner unterschiedlicher Transmissionswellenlängen hat, das auf jeweiligen entsprechenden Pfaden des unterteilten Abbildungslichtes vorgesehen ist, welches sich aus der Vielzahl von Licht nach außen leitenden Ebenen des Prismas ausbreitet.

13. Vorrichtung nach Anspruch 10, in der die Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp eine Elektrophoresevorrichtung vom Vielfarb- Fluoreszenzerfassungstyp ist und die Separations- und Erfassungsprobe zum Wandern in der Platte zur Elektrophoreseseparation eine vielfarbig markierte Probe ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 10, in der zumindest eine Kante des Prismas in einer Ebene ist, die die Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen enthält, die erhalten werden als Ergebnis einer Laserstrahlbestrahlung auf eine geeignete Position der Platten zur Elektrophoreseseparation, und einen Mittelpunkt der Fokussierposition des Fluoreszenzlichtdetektors enthält und parallel ist zu den Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen.

15. Vorrichtung nach Anspruch 10, in der das Prisma nach oben und unten bezüglich einer Ebene symmetrisch ist, die die Fluoreszenzlicht-Linien abbildungen enthält, die als Ergebnis einer Laserstrahl-Bestrahlung auf eine geeignete Position der Platten zur Elektrophoreseseparation erhalten werden, und einen Mittelpunkt der Fokussierposition auf den Fluoreszenzlichtdetektor enthält, und eine Spitze des Prismas im Mittelpunkt parallel ist zu den Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen.

16. Elektrophoresevorrichtung vom Fluoreszenzerfassungstyp, aufweisend zumindest

(i) eine Gelplatte (205) zur Elektrophoreseseparation,
(ii) eine Anregungs laser-Strahlquelle (201, 202) zum Emittieren von Fluoreszenzlicht durch die Anregung von Fluorophoren, die eine Probe markieren, und
(iii) einen Fluoreszenzlichtdetektor (212) zum Erfassen des emittierten Fluoreszenzlichts,

dadurch gekennzeichnet, daß Geräte zum Abbildungsaufteilen und Wellenlän genselektieren der Fluoreszenzlichtabbildung aufweisen eine zylindrische konvexe Linse (207), eine zylindrische konkave Linse (210) und ein Bandpaßfilter (227, 228, 229, 230).

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, in der die Laserstrahlbestrahlung auf die geeignete Position der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation von einer Seitenendfläche der Gelplatte in Richtung auf ein Slabgel gerichtet ist und ein Slabgel der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation parallel zu der Gelplatte zur Elektrophoreseseparation durchdringt, und wobei eine Fluo reszenzlicht-Linienabbildung, die erhalten wird durch Laserbestrahlung, entlang eines Pfades emittiert wird, entlang dessen sich der Laserstrahl in dem Slabgel ausbreitet.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16, in der das Bandpaßfilter ein unterteiltes Mehrebenenfilter ist, durch das die Fluoreszenzlicht-Abbildung unterteilt wird.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, in der das unterteile Mehrebenenfilter vorgesehen ist zwischen der zylindrischen konvexen Linse und einer fokussierenden Linse.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, in der Ebenen des unterteilten Mehr ebenenfilters Flächen haben, die derart bemessen sind, daß sie passierende Fluoreszenzlichtmengen im wesentlichen gleich sein können.

21. Vorrichtung nach Anspruch 16, in der die zylindrische konvexe Linse aufweist eine Vielzahl von unterteilten zylindrischen konvexen Linsen, durch die die Fluoreszenzlicht-Abbildung unterteilt werden kann.

22. Vorrichtung nach Anspruch 16, in der ein Schlitz parallel zu den Fluoreszenz licht-Linienabbildungen vorgesehen ist zwischen einem Emissionspunkt der Fluoreszenzlicht-Linienabbildungen und einer zylindrischen konvexen Linse, um obere und untere Teile des Fluoreszenzlichts abzuschneiden, die von dem Emissionspunkt höher oder niedriger als bestimmte Winkel emittiert werden.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, in der eine Breite des Schlitzes schmaler gemacht wird als ein Intervall von virtuellen Objektpositionen.