DE3933315C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Zellverarbeitungseinrichtung nach dem Anspruch 1 zum Konzentrieren von Zellen, z. B. von Zellen, die einem Patienten entnommen, kultiviert und zur Rückführung zu dem Patienten behandelt worden sind.

Es ist bekannt, Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten aus dem Blut eines Patienten zu entfernen, diese in einem Kulturmedium zu vermehren, die kultivierten Zellen zu ernten und die Zellen von dem Kulturmedium und den Stoffwechselpro­ dukten zu trennen, bevor die Zellen einem Patienten zurückge­ führt werden, wie es z. B. beschrieben wird von Muul, Linda, M., et al., "Large scale production of human lymphokine-activa­ ted killer cells for use in adoptive immunotherapy", Journal of Immunological Methods, Vol. 88 (1986), S. 265-275; Muul, Linda, M., et al., "Development of an automated closed System for generation of human lymphokine-activated killer (LAK) cells for use in adoptive immunotheraphy", Journal of Immunological Methods, Vol. 101 (1987), S. 171-181. Bei solchen Verfahren ist eine Zentrifuge des Typs 2991 (IBM) der Cobe Laboratories, Inc. verwendet worden, um die Zellen von dem Kulturmedium und den Stoffwechselprodukten vor der Rückführung der Zellen zu einem Patienten zu trennen. Die Zellen werden mehreren Zentrifugierungsvorgängen unterwor­ fen, wobei zwischen den Zentrifugierungsvorgängen nach dem die Zellen konzentriert worden sind, eine Spülungslösung zugeführt wird. Die Verwendung der Zentrifuge mit der Bezeich­ nung 2991 zum Konzentrieren und Waschen von anderen Zellarten wird beschrieben bei Gilmore, M.J.M.L., et al., "A Technique for the Concentration of Nucleated Bone Marrow Cells for in vitro Manipulation or Cryopreservation Using the IBM 2991 Blood Gell Processor", Vol. 45, Vox Sang. (1983), S. 294-302; Wooten, M.J. et al., "Use and Analysis of Saline Washed Red Blood Cells", Vo. 16, No. 5, Transfusion (1976) S. 464-468.

Einrichtungen zur Verarbeitung von Zellen in einer Zellsus­ pension mit einer Zentrifuge und einer Membrantrenneinrich­ tung, die eine Membran enthält, welche eine zellfreie Flüs­ sigkeit, nicht jedoch die Zellen durch die Membran hin­ durchtreten läßt, sind aus US-PS 46 80 025 und EP-A1 01 56 496 bekannt. Bei den bekannten Einrichtungen wird das einem Spender entnommene Blut zunächst in einer Zentrifuge in Blutkörperchen und Plasma getrennt und dann das Plasma ei­ ner Membrantrenneinrichtung zur weiteren Bearbeitung zuge­ führt. So wird bei der US-PS 46 80 025 das einem Spender entnommene Blut erst in einer Zentrifuge zentrifugiert und dann das so erhaltene, an Blutplättchen angereicherte Plasma in einer Membrantrenneinrichtung in ein an Blut­ plättchen angereichertes Konzentrat und ein von Blutplätt­ chen befreites Plasma getrennt. Dagegen wird bei der EP-A1 01 56 496 die in einer Zentrifuge von den Blutkörperchen abgetrennte Plasmakomponente in einer Membrantrenneinrich­ tung in eine Fraktion mit hochmolekularen Bestandteilen und eine Fraktion mit niedermolekularen Bestandteilen aufge­ trennt. In den bekannten Vorrichtungen wird somit das Voll­ blut mit allen seinen Bestandteilen zuerst der Zentrifuge zum Trennen zugeführt, was den Nachteil hat, daß die Blut­ zellen verhältnismäßig lang der Zentrifugalkraft ausgesetzt werden müssen, was zu deren Schädigung führen kann.

Die Aufgabe der Erfindung ist es somit, eine Einrichtung der vorausgesetzten Art so auszubilden, daß die für das Konzentrieren notwendige Zeit und die Zeit, während der die Zellen der Zentrifugalkraft ausgesetzt sind, wesentlich verkürzt werden. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn einem Patienten entnommene, kultivierte und dann dem Patienten zurückgeführte Zellen, wie Lymphozyten verarbei­ tet werden sollen.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß in Richtung des Strömungsweges der zu verarbeitenden Zell­ suspension die Membrantrenneinrichtung vor der Zentrifuge angeordnet ist und dort die Zellsuspension zunächst aufkon­ zentriert und dann erst das auf diese Weise erhaltene Vor­ konzentrat der Zentrifuge zugeführt wird (vgl. Patentanspruch 1). Aus diese Weise wird die Zeitdauer für das Konzentrieren und während der die Zellen der Zentrifugalkraft ausgesetzt sind, wesentlich verkürzt.

Diese Lösung mag im nachhinein zwar einfach erscheinen, sie ist durch den Stand der Technik nach den beiden oben disku­ tierten Druckschriften jedoch durchaus nicht nahegelegt. Bei beiden dort beschriebenen Einrichtungen nämlich geht es darum, bestimmte Bestandteile des Blutplasmas abzutrennen. Dazu ist es notwendig, das Blutplasma zunächst von den üb­ rigen Bestandteilen, also den Blutkörperchen des Vollbluts abzutrennen, wozu jeweils eine Zentrifuge verwendet wird. Bei den bekannten Einrichtungen wäre es also unmöglich, das Vollblut zunächst in einer Membrantrenneinrichtung in rote Blutkörperchen und Blutplasma zu trennen und dann durch Zentrifugieren die gewünschten Bestandteile aus dem Blut­ plasma zu entfernen.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Un­ teransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung erläutert.

Die Zeichnung zeigt ein hydraulisches Strömungsdiagramm der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Verarbeitung einer Zellsuspension.

In der Figur ist eine Einrichtung 10 dargestellt zur Verarbei­ tung von Lymphozyten, die in Kulturbeuteln 12 kultiviert werden. Die Kulturbeutel 12, ein Vorspülungssalzlösungsbeutel 14 und ein Spülsalzlösungsbeutel 16 sind über eine Leitung 17 mit einer aus einer Schlauchpumpe bestehenden Zellsuspensionspumpe 18 verbunden. Klemmen 20, 22 und 24 kontrollieren die Strömung von den Kulturbeuteln 12, dem Vorspülungssalzlösungsbeutel 14 bzw. dem Spülungssalzlösungsbeutel 16. An dem Auslaß der Zellsuspen­ sionspumpe 18 ist ein Druckfühler 30 angeschlossen, um dort den Druck zu messen.

Ein Siebvorfilter 32 ist zwischen dem Auslaß der Zellsuspen­ sionspumpe 18 und dem Einlaß 33 einer Hohlfasermembrantrennein­ richtung 34 geschaltet. Die Membrantrenneinrichtung 34 ist im Handel erhältlich. Sie enthält in der Membran Hohlfasern aus Poly­ acrylnitril mit einem molekularen Abschneidegewicht von 50 000 bis 55 000. Die Membrantrenneinrichtung 34 hat eine hohe Permeabilität für Wasser und kleine Moleküle, jedoch eine sehr kleine Permeabilität für Proteine und Teilchen mit Zellabmessungen. Deren Einlaß 33 und Auslaß 35 stehen über jeweilige Verteiler mit dem Inneren der Hohlfasern in Verbin­ dung. Permeatanschlüsse 42 und 44 stehen mit dem Bereich außerhalb der Fasern in dem äußeren Gehäuse der Einrichtung 34 in Verbindung. Eine Umgehungsleitung 36 und eine Klemme 38 auf dieser sind dem Vorfilter 32 parallel geschaltet.

Der Auslaß 35 der Membrantrenneinrichtung 34 ist über eine Leitung 37 mit dem Einlaß eines Zentrifugenvorratsbeutels 40 verbunden. Der Permeatanschluß 42 ist versperrt und der Permeatanschluß 44 ist über eine Abflußleitung 46 mit einem Abflußbeutel 48 verbunden. Ein Druckfühler 50 ist an die Leitung 46 angeschlossen, um den Druck in dieser zu messen. Eine Abflußpumpe 52 ist in die Leitung 46 geschal­ tet, um das Abpumpen in den Abflußbeutel 48 zu steuern. Eine Umgehungsleitung 54 ist zwischen den Auslaß 35 der Membrantrenneinrichtung 34 und die Abflußleitung 46 geschal­ tet. Eine Klemme 56 wird verwendet, um die Strömung von dem Permeatanschluß 44 zu steuern, und eine Klemme 58 wird verwendet, um die Strömung durch die Leitung 54 zu steuern. Der Auslaß des Zentrifugenvorratsbeutels 40 ist über eine Strömungsleitung 62 mit einem Zentrifugensammelbeutel 60 verbunden, der in einer rotierenden Trommel 64 einer Zentrifu­ ge 67 angeordnet ist. Eine Waschleitung 66 wird verwendet, um eine weitere Flüssigkeitsquelle mit dem Zentrifugensammelbeutel 60 zu verbinden, und eine Überlauf­ leitung 68 wird verwendet, um überschüssige Flüssigkeit in den Abflußbeutel 48 zu befördern.

Beim Betrieb werden die einem Patienten entnommenen lympho­ zytischen Zellen in den Beuteln 12 für beispielsweise drei oder vier Tage kultiviert. Nachdem der Kultivierungsvor­ gang abgeschlossen worden ist, wird die Einrichtung 10 dazu verwendet, die kultivierten Zellen vor deren Rückführung zu dem Patienten zu verarbeiten.

Die Klemme 22 wird geöffnet und die Lösung im Vorspülungssalz­ lösungsbeutel 14 wird durch die Pumpe 18, das Filter 32 die Leitung 36 und das Innere der Hohlfasern in der Membran­ trenneinrichtung 34 gepumpt, um die Schaltung vorzuspülen und in der Trenneinrichtung 34 enthaltenes Glycerol heraus­ zuspülen. Die Klemmen 59 und 56 werden geschlossen, so daß die Vorspülungslösung durch die Leitungen 54 und 46 zum Abfallbeutel 48 fließt, wobei der die Leitung 46 bildende Schlauch zu dieser Zeit nicht in die Pumpe 52 eingelegt ist. Während eines Teils der Vorspülung ist die Klemme 56 offen und die Klemme 58 geschlossen, um das Volumen in der Trenneinrichtung 34 außerhalb der Hohlfasern vorzuspülen.

Nachdem die Schaltung vorgespült ist, wird die Leitung 46 in die Pumpe 52 eingelegt, die Klemme 22 geschlossen und die Klemme 20 geöffnet, so daß die kultivierten Zellen in der Suspension in den Beuteln 12 mittels der Pumpe 18 durch die Schaltung gepumpt werden können. Die Klemme 58 wird geschlossen und die Klemme 59 wird geöffnet. Zuvor strömt die Vorspülungslösung in der Schaltung durch die Leitungen 54 und 46 in den Abflußbeutel 48. Danach fließt die konzentrierte Zellsuspension von der Membrantrenneinrich­ tung 34 in den Zentrifugenvorratsbeutel 40 und von dort zum Beutel 60 in der Zentrifugentrommel 64.

Die Zellsuspensionspumpe 18 pumpt die Zellsuspension in die Membrantrenneinrichtung 34 und die Abflußpumpe 52 zieht die zellfreie Flüssigkeit durch die Hohlfasermembranen und pumpt sie in den Abflußbeutel 48. Die Differenz zwischen den Pumpraten der Zellsuspensionspumpe 18 und der Abflußpumpe 52 entspricht der Rate, mit der die konzentrierte Zellsuspen­ sion zu dem Zentrifugenvorratsbeutel 40 geliefert wird. Um den besten Wirkungsgrad zu erhalten, ist diese Rate ungefähr gleich der Rate, mit der die Flüssigkeit in der Zentrifuge 67 verarbeitet wird. Bei der Verarbeitung in dem Zentrifugensammelbeutel 60 werden die interessierenden kulti­ vierten Zellen konzentriert und die überschüssige Flüssigkeit durch die Leitung 68 abgegeben. Das Filter 32 kann verwendet werden, um Zellklümpchen zu entfernen, welche die Fasern der Trenneinrichtung 34 verstopfen könnten. Die Umgehungslei­ tung 36 wird verwendet, wenn eine Filtration im Filter 32 nicht nötig ist oder wenn das Filter 32 verstopft ist. Der Druck wird stromabwärts der Zellsuspensionspumpe 18 mit einem Druckfühler 30 überwacht und mit einem Druckfühler 50 in der Abflußleitung 46.

Nachdem die Zellsuspensions-Kulturbeutel 12 geleert worden sind, wird die Klemme 24 geöffnet und die Klemme 20 geschlossen, um zu bewirken, daß die Spülsalzlösung von dem Beutel 16 fließt, während die Pumpen 18 und 52 weiterpumpen, um die noch in der Schaltung befindliche Zellsuspension zu konzentrie­ ren und zu dem Zentrifugenvorratsbeutel 60 zu befördern. Die Pumpen pumpen weiter, bis ausreichend Spülsalzlösung durch die Hohlfasern der Trenneinrichtung 34 getreten ist. Nachdem die Zellen und die Spülsalzlösung zu dem Zentrifugensammel­ beutel 60 transportiert und dort weiter konzentriert worden sind, wird eine Waschlösung aus der Waschleitung 66 zugeführt, um die Nährlösung und die Stoffwechselprodukte der in dem Beutel 60 gesammelten Zellen zu entfernen, wie es bei den herkömmlichen Prozeduren üblich ist. Die Zellen werden dann wieder in eine Suspension übergeführt und dem Patienten infundiert, ebenso wie bisher üblich.

Durch die Vorkonzentration in der Membrantrenneinrichtung 34 wird die zum Sammeln bzw. "Ernten" der Zellen benötigte Zeit wesentlich verkürzt und auch die Beanspruchung der gesammelten Zellen durch das Zentrifugieren herabgesetzt.

Gemäß weiteren Ausführungsbeispielen können andere Membran­ trenneinrichtungen verwendet werden, beispielsweise mit größeren maximalen Porengrößen bis zu 0,5 Mikron. Lymphozyten haben üblicherweise Durchmesser mit mehr als 10 Mikron. Bei solchen Einrichtungen werden Proteine nicht zurückgehal­ ten, wie es bei der Membrantrenneinrichtung 34 des oben beschriebenen Ausführungsbeispiels der Fall ist.

Claims (6)

1. Einrichtung zur Verarbeitung von Zellen in einer Zellsuspen­ sion mit
einer Membrantrenneinrichtung (34), die zur Aufnahme der Zellsuspension geschaltet ist und eine Membran enthält, welche eine zellfreie Flüssigkeit, nicht jedoch die Zellen durch die Membran hindurchtreten läßt, sowie einen Auslaß (35) für eine konzentrierte Zellsuspension, und mit
einer Zentrifuge (64, 67) stromabwärts der Membrantrennein­ richtung (34), die zur Aufnahme der konzentrierten Zellsuspen­ sion von dem Auslaß (35) geschaltet ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Filter (32) stromaufwärts eines Einlasses (33) der Membrantrennein­ richtung (34), um die Zellsuspension vor dem Einströmen in die Membrantrenneinrichtung (34) zu filtern.

3. Einrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch eine Umge­ hungsleitung (36) um das Filter (32) und eine Klemmeinrichtung (38) auf dieser, um wahlweise die Strömung durch die Umgehungs­ leitung (36) zu blockieren.

4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch einen mit dem Einlaß (33) der Membrantrenneinrichtung (34) verbundenen Behälter (14) für eine Vorspülungslösung.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch einen Behälter (12) für die Zellsuspension stromaufwärts der Membrantrenneinrichtung (34).

6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch einen Druckfühler (30) stromaufwärts der Membrantrennein­ richtung (34).