DE3933315C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft eine Zellverarbeitungseinrichtung
nach dem Anspruch 1 zum Konzentrieren von Zellen, z. B.
von Zellen, die einem Patienten entnommen, kultiviert und
zur Rückführung zu dem Patienten behandelt worden sind.
Es ist bekannt, Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten
aus dem Blut eines Patienten zu entfernen, diese in einem
Kulturmedium zu vermehren, die kultivierten Zellen zu ernten
und die Zellen von dem Kulturmedium und den Stoffwechselpro
dukten zu trennen, bevor die Zellen einem Patienten zurückge
führt werden, wie es z. B. beschrieben wird von Muul, Linda,
M., et al., "Large scale production of human lymphokine-activa
ted killer cells for use in adoptive immunotherapy", Journal
of Immunological Methods, Vol. 88 (1986), S. 265-275; Muul,
Linda, M., et al., "Development of an automated closed
System for generation of human lymphokine-activated killer
(LAK) cells for use in adoptive immunotheraphy", Journal
of Immunological Methods, Vol. 101 (1987), S. 171-181.
Bei solchen Verfahren ist eine Zentrifuge des Typs 2991
(IBM) der Cobe Laboratories, Inc. verwendet worden, um
die Zellen von dem Kulturmedium und den Stoffwechselprodukten
vor der Rückführung der Zellen zu einem Patienten zu trennen.
Die Zellen werden mehreren Zentrifugierungsvorgängen unterwor
fen, wobei zwischen den Zentrifugierungsvorgängen nach
dem die Zellen konzentriert worden sind, eine Spülungslösung
zugeführt wird. Die Verwendung der Zentrifuge mit der Bezeich
nung 2991 zum Konzentrieren und Waschen von anderen Zellarten
wird beschrieben bei Gilmore, M.J.M.L., et al., "A Technique
for the Concentration of Nucleated Bone Marrow Cells for
in vitro Manipulation or Cryopreservation Using the IBM
2991 Blood Gell Processor", Vol. 45, Vox Sang. (1983),
S. 294-302; Wooten, M.J. et al., "Use and Analysis of Saline
Washed Red Blood Cells", Vo. 16, No. 5, Transfusion (1976)
S. 464-468.
Einrichtungen zur Verarbeitung von Zellen in einer Zellsus
pension mit einer Zentrifuge und einer Membrantrenneinrich
tung, die eine Membran enthält, welche eine zellfreie Flüs
sigkeit, nicht jedoch die Zellen durch die Membran hin
durchtreten läßt, sind aus US-PS 46 80 025 und EP-A1 01 56 496
bekannt. Bei den bekannten Einrichtungen wird das einem
Spender entnommene Blut zunächst in einer Zentrifuge in
Blutkörperchen und Plasma getrennt und dann das Plasma ei
ner Membrantrenneinrichtung zur weiteren Bearbeitung zuge
führt. So wird bei der US-PS 46 80 025 das einem Spender
entnommene Blut erst in einer Zentrifuge zentrifugiert und
dann das so erhaltene, an Blutplättchen angereicherte
Plasma in einer Membrantrenneinrichtung in ein an Blut
plättchen angereichertes Konzentrat und ein von Blutplätt
chen befreites Plasma getrennt. Dagegen wird bei der
EP-A1 01 56 496 die in einer Zentrifuge von den Blutkörperchen
abgetrennte Plasmakomponente in einer Membrantrenneinrich
tung in eine Fraktion mit hochmolekularen Bestandteilen und
eine Fraktion mit niedermolekularen Bestandteilen aufge
trennt. In den bekannten Vorrichtungen wird somit das Voll
blut mit allen seinen Bestandteilen zuerst der Zentrifuge
zum Trennen zugeführt, was den Nachteil hat, daß die Blut
zellen verhältnismäßig lang der Zentrifugalkraft ausgesetzt
werden müssen, was zu deren Schädigung führen kann.
Die Aufgabe der Erfindung ist es somit, eine Einrichtung
der vorausgesetzten Art so auszubilden, daß die für das
Konzentrieren notwendige Zeit und die Zeit, während der die
Zellen der Zentrifugalkraft ausgesetzt sind, wesentlich
verkürzt werden. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung,
wenn einem Patienten entnommene, kultivierte und dann dem
Patienten zurückgeführte Zellen, wie Lymphozyten verarbei
tet werden sollen.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß
in Richtung des Strömungsweges der zu verarbeitenden Zell
suspension die Membrantrenneinrichtung vor der Zentrifuge
angeordnet ist und dort die Zellsuspension zunächst aufkon
zentriert und dann erst das auf diese Weise erhaltene Vor
konzentrat der Zentrifuge zugeführt wird (vgl. Patentanspruch 1). Aus diese Weise
wird die Zeitdauer für das Konzentrieren und während der
die Zellen der Zentrifugalkraft ausgesetzt sind, wesentlich
verkürzt.
Diese Lösung mag im nachhinein zwar einfach erscheinen, sie
ist durch den Stand der Technik nach den beiden oben disku
tierten Druckschriften jedoch durchaus nicht nahegelegt.
Bei beiden dort beschriebenen Einrichtungen nämlich geht es
darum, bestimmte Bestandteile des Blutplasmas abzutrennen.
Dazu ist es notwendig, das Blutplasma zunächst von den üb
rigen Bestandteilen, also den Blutkörperchen des Vollbluts
abzutrennen, wozu jeweils eine Zentrifuge verwendet wird.
Bei den bekannten Einrichtungen wäre es also unmöglich, das
Vollblut zunächst in einer Membrantrenneinrichtung in rote
Blutkörperchen und Blutplasma zu trennen und dann durch
Zentrifugieren die gewünschten Bestandteile aus dem Blut
plasma zu entfernen.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Un
teransprüchen gekennzeichnet.
Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung
anhand der Zeichnung erläutert.
Die Zeichnung zeigt ein hydraulisches Strömungsdiagramm
der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Verarbeitung einer
Zellsuspension.
In der Figur ist eine Einrichtung 10 dargestellt zur Verarbei
tung von Lymphozyten, die in Kulturbeuteln 12 kultiviert
werden. Die Kulturbeutel 12, ein Vorspülungssalzlösungsbeutel
14 und ein Spülsalzlösungsbeutel 16 sind über eine Leitung
17 mit einer aus einer Schlauchpumpe bestehenden Zellsuspensionspumpe 18 verbunden.
Klemmen 20, 22 und 24 kontrollieren die Strömung von den
Kulturbeuteln 12, dem Vorspülungssalzlösungsbeutel 14 bzw.
dem Spülungssalzlösungsbeutel 16. An dem Auslaß der Zellsuspen
sionspumpe 18 ist ein Druckfühler 30 angeschlossen, um
dort den Druck zu messen.
Ein Siebvorfilter 32 ist zwischen dem Auslaß der Zellsuspen
sionspumpe 18 und dem Einlaß 33 einer Hohlfasermembrantrennein
richtung 34 geschaltet. Die Membrantrenneinrichtung 34
ist im Handel
erhältlich. Sie enthält in der Membran Hohlfasern aus Poly
acrylnitril mit einem molekularen Abschneidegewicht von 50 000
bis 55 000. Die Membrantrenneinrichtung 34 hat eine hohe
Permeabilität für Wasser und kleine Moleküle, jedoch eine
sehr kleine Permeabilität für Proteine und Teilchen mit
Zellabmessungen. Deren Einlaß 33 und Auslaß 35 stehen über
jeweilige Verteiler mit dem Inneren der Hohlfasern in Verbin
dung. Permeatanschlüsse 42 und 44 stehen mit dem Bereich
außerhalb der Fasern in dem äußeren Gehäuse der Einrichtung
34 in Verbindung. Eine Umgehungsleitung 36 und eine Klemme
38 auf dieser sind dem Vorfilter 32 parallel geschaltet.
Der Auslaß 35 der Membrantrenneinrichtung 34 ist über eine
Leitung 37 mit dem Einlaß eines Zentrifugenvorratsbeutels
40 verbunden. Der Permeatanschluß 42 ist versperrt und
der Permeatanschluß 44 ist über eine Abflußleitung 46 mit
einem Abflußbeutel 48 verbunden. Ein Druckfühler 50 ist
an die Leitung 46 angeschlossen, um den Druck in dieser
zu messen. Eine Abflußpumpe 52 ist in die Leitung 46 geschal
tet, um das Abpumpen in den Abflußbeutel 48 zu steuern.
Eine Umgehungsleitung 54 ist zwischen den Auslaß 35 der
Membrantrenneinrichtung 34 und die Abflußleitung 46 geschal
tet. Eine Klemme 56 wird verwendet, um die Strömung von
dem Permeatanschluß 44 zu steuern, und eine Klemme 58 wird
verwendet, um die Strömung durch die Leitung 54 zu steuern.
Der Auslaß des Zentrifugenvorratsbeutels 40 ist über eine
Strömungsleitung 62 mit einem Zentrifugensammelbeutel 60
verbunden, der in einer rotierenden Trommel 64 einer Zentrifu
ge 67
angeordnet ist. Eine Waschleitung 66
wird verwendet, um eine weitere Flüssigkeitsquelle mit
dem Zentrifugensammelbeutel 60 zu verbinden, und eine Überlauf
leitung 68 wird verwendet, um überschüssige Flüssigkeit
in den Abflußbeutel 48 zu befördern.
Beim Betrieb werden die einem Patienten entnommenen lympho
zytischen Zellen in den Beuteln 12 für beispielsweise drei
oder vier Tage kultiviert. Nachdem der Kultivierungsvor
gang abgeschlossen worden ist, wird die Einrichtung 10
dazu verwendet, die kultivierten Zellen vor deren Rückführung
zu dem Patienten zu verarbeiten.
Die Klemme 22 wird geöffnet und die Lösung im Vorspülungssalz
lösungsbeutel 14 wird durch die Pumpe 18, das Filter 32
die Leitung 36 und das Innere der Hohlfasern in der Membran
trenneinrichtung 34 gepumpt, um die Schaltung vorzuspülen
und in der Trenneinrichtung 34 enthaltenes Glycerol heraus
zuspülen. Die Klemmen 59 und 56 werden geschlossen, so
daß die Vorspülungslösung durch die Leitungen 54 und 46
zum Abfallbeutel 48 fließt, wobei der die Leitung 46 bildende Schlauch zu dieser
Zeit nicht in die Pumpe 52 eingelegt ist. Während eines
Teils der Vorspülung ist die Klemme 56 offen und die Klemme
58 geschlossen, um das Volumen in der Trenneinrichtung
34 außerhalb der Hohlfasern vorzuspülen.
Nachdem die Schaltung vorgespült ist, wird die Leitung
46 in die Pumpe 52 eingelegt, die Klemme 22 geschlossen
und die Klemme 20 geöffnet, so daß die kultivierten Zellen
in der Suspension in den Beuteln 12 mittels der Pumpe 18
durch die Schaltung gepumpt werden können. Die Klemme 58
wird geschlossen und die Klemme 59 wird geöffnet. Zuvor
strömt die Vorspülungslösung in der Schaltung durch die
Leitungen 54 und 46 in den Abflußbeutel 48. Danach fließt
die konzentrierte Zellsuspension von der Membrantrenneinrich
tung 34 in den Zentrifugenvorratsbeutel 40 und von dort
zum Beutel 60 in der Zentrifugentrommel 64.
Die Zellsuspensionspumpe 18 pumpt die Zellsuspension in
die Membrantrenneinrichtung 34 und die Abflußpumpe 52 zieht
die zellfreie Flüssigkeit durch die Hohlfasermembranen
und pumpt sie in den Abflußbeutel 48. Die Differenz zwischen
den Pumpraten der Zellsuspensionspumpe 18 und der Abflußpumpe
52 entspricht der Rate, mit der die konzentrierte Zellsuspen
sion zu dem Zentrifugenvorratsbeutel 40 geliefert wird.
Um den besten Wirkungsgrad zu erhalten, ist diese Rate
ungefähr gleich der Rate, mit der die Flüssigkeit in der
Zentrifuge 67 verarbeitet wird. Bei der Verarbeitung in
dem Zentrifugensammelbeutel 60 werden die interessierenden kulti
vierten Zellen konzentriert und die überschüssige Flüssigkeit
durch die Leitung 68 abgegeben. Das Filter 32 kann verwendet
werden, um Zellklümpchen zu entfernen, welche die Fasern
der Trenneinrichtung 34 verstopfen könnten. Die Umgehungslei
tung 36 wird verwendet, wenn eine Filtration im Filter 32
nicht nötig ist oder wenn das Filter 32 verstopft ist.
Der Druck wird stromabwärts der Zellsuspensionspumpe 18
mit einem Druckfühler 30 überwacht und mit einem Druckfühler
50 in der Abflußleitung 46.
Nachdem die Zellsuspensions-Kulturbeutel 12 geleert worden sind,
wird die Klemme 24 geöffnet und die Klemme 20 geschlossen,
um zu bewirken, daß die Spülsalzlösung von dem Beutel 16
fließt, während die Pumpen 18 und 52 weiterpumpen, um die
noch in der Schaltung befindliche Zellsuspension zu konzentrie
ren und zu dem Zentrifugenvorratsbeutel 60 zu befördern.
Die Pumpen pumpen weiter, bis ausreichend Spülsalzlösung
durch die Hohlfasern der Trenneinrichtung 34 getreten ist.
Nachdem die Zellen und die Spülsalzlösung zu dem Zentrifugensammel
beutel 60 transportiert und dort weiter konzentriert worden
sind, wird eine Waschlösung aus der Waschleitung 66 zugeführt,
um die Nährlösung und die Stoffwechselprodukte der in dem
Beutel 60 gesammelten Zellen zu entfernen, wie es bei den
herkömmlichen Prozeduren üblich ist. Die Zellen werden
dann wieder in eine Suspension übergeführt und dem Patienten
infundiert, ebenso wie bisher üblich.
Durch die Vorkonzentration in der Membrantrenneinrichtung 34
wird die zum Sammeln bzw. "Ernten" der Zellen benötigte
Zeit wesentlich verkürzt und auch die Beanspruchung der
gesammelten Zellen durch das Zentrifugieren herabgesetzt.
Gemäß weiteren Ausführungsbeispielen können andere Membran
trenneinrichtungen verwendet werden, beispielsweise mit
größeren maximalen Porengrößen bis zu 0,5 Mikron. Lymphozyten
haben üblicherweise Durchmesser mit mehr als 10 Mikron.
Bei solchen Einrichtungen werden Proteine nicht zurückgehal
ten, wie es bei der Membrantrenneinrichtung 34 des oben beschriebenen
Ausführungsbeispiels der Fall ist.
Claims (6)
1. Einrichtung zur Verarbeitung von Zellen in einer Zellsuspen
sion mit
einer Membrantrenneinrichtung (34), die zur Aufnahme der Zellsuspension geschaltet ist und eine Membran enthält, welche eine zellfreie Flüssigkeit, nicht jedoch die Zellen durch die Membran hindurchtreten läßt, sowie einen Auslaß (35) für eine konzentrierte Zellsuspension, und mit
einer Zentrifuge (64, 67) stromabwärts der Membrantrennein richtung (34), die zur Aufnahme der konzentrierten Zellsuspen sion von dem Auslaß (35) geschaltet ist.
einer Membrantrenneinrichtung (34), die zur Aufnahme der Zellsuspension geschaltet ist und eine Membran enthält, welche eine zellfreie Flüssigkeit, nicht jedoch die Zellen durch die Membran hindurchtreten läßt, sowie einen Auslaß (35) für eine konzentrierte Zellsuspension, und mit
einer Zentrifuge (64, 67) stromabwärts der Membrantrennein richtung (34), die zur Aufnahme der konzentrierten Zellsuspen sion von dem Auslaß (35) geschaltet ist.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Filter
(32) stromaufwärts eines Einlasses (33) der Membrantrennein
richtung (34), um die Zellsuspension vor dem Einströmen in die
Membrantrenneinrichtung (34) zu filtern.
3. Einrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch eine Umge
hungsleitung (36) um das Filter (32) und eine Klemmeinrichtung
(38) auf dieser, um wahlweise die Strömung durch die Umgehungs
leitung (36) zu blockieren.
4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet
durch einen mit dem Einlaß (33) der Membrantrenneinrichtung
(34) verbundenen Behälter (14) für eine Vorspülungslösung.
5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet
durch einen Behälter (12) für die Zellsuspension stromaufwärts
der Membrantrenneinrichtung (34).
6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet
durch einen Druckfühler (30) stromaufwärts der Membrantrennein
richtung (34).
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