DE3933315A1 - Zellverarbeitungseinrichtung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Zellverarbeitungseinrichtung nach dem Anspruch 1 zum Konzentrieren von Zellen, z. B. von Zellen, die einem Patienten entnommen, kultiviert und zur Rückführung zu dem Patienten behandelt worden sind.

Es ist bekannt, Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten aus dem Blut eines Patienten zu entfernen, diese in einem Kulturmedium zu vermehren, die kultivierten Zellen zu ernten und die Zellen von dem Kulturmedium und den Stoffwechselpro­ dukten zu trennen, bevor die Zellen einem Patienten zurückge­ führt werden, wie es z. B. beschrieben wird von Muul, Linda, M., et al., "Large scale production of human lymphokine-activa­ ted killer cells for use in adoptive immunotherapy", Journal of Immunological Methods, Vol. 88 (1986), S. 265-275; Muul, Linda, M., et al., "Development of an automated closed system for generation of human lymphokine-activated killer (LAK) cells for use in adoptive immunotheraphy", Journal of Immunological Methods, Vol. 101 (1987), S. 171-181. Bei solchen Verfahren ist eine Zentrifuge des Typs 2991 (IBM) der Cobe Laboratories, Inc., verwendet worden, um die Zellen von dem Kulturmedium und den Stoffwechselprodukten vor der Rückführung der Zellen zu einem Patienten zu trennen. Die Zellen werden mehreren Zentrifugierungsvorgängen unterwor­ fen, wobei zwischen den Zentrifugierungsvorgängen nach dem die Zellen konzentriert worden sind, eine Spülungslösung zugeführt wird. Die Verwendung der Zentrifuge mit der Bezeich­ nung 2991 zum Konzentrieren und Waschen von anderen Zellarten wird beschrieben bei Gilmore M.J.M.L., et al., "A Technique for the Concentration of Nucleated Bone Marrow Cells for in vitro Manipulation or Cryopreservation Using the IBM 2991 Blood Cell Processor", Vol. 45, Vox Sang. (1983), S. 294-302; Wooten, M.J. et al., "Use and Analysis of Saline Washed Red Blood Cells", Vo. 16, No. 5, Transfusion (1976), S. 464-468.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Zellen in einer Suspension durch eine Membrantrennvorrichtung geführt, in der die zellfreie Flüssigkeit durch eine Membran hindurch­ tritt, um die Zellen vorzukonzentrieren, bevor diese in einer Zentrifuge konzentriert werden. Dadurch wird die zum Konzentrieren der Zellen notwendige Zeit wesentlich verkürzt und die Beanspruchung der Zellen durch das Zentrifu­ gieren vermindert.

Gemäß bevorzugten Ausführungsbeispielen
werden Pumpen verwendet, um die Zellsuspension in die Membrantrenneinrichtung zu pumpen und die zellfreie Flüssigkeit von der Membrantrenneinrichtung zu entfernen;
kann die Zellsuspension gefiltert werden bevor sie in die Membrantrenneinrichtung geführt wird;
sind ein Beutel mit Vorspülungslösung, ein Behälter für die Zellsuspension und eine Drucküberwachungsein­ richtung stromaufwärts der Membrantrenneinrichtung vorgesehen;
ist ein Zentrifugenbehälterbeutel zwischen dem Auslaß der Membrantrenneinrichtung und der Zentrifuge vorgesehen;
ist eine mit einer Abflußpumpe verbundene Abflußleitung vorgesehen, um dieser die zellfreie Flüssigkeit zuzuführen, und
ist eine Umgehungsleitung zwischen die Abflußlei­ tung und den Auslaß der Membrantrenneinrichtung angeschlos­ sen.

Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung erläutert.

Die Zeichnung zeigt ein hydraulisches Strömungsdiagramm der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Verarbeitung einer Zellsuspension.

In der Figur ist eine Einrichtung 10 dargestellt zur Verarbei­ tung von Lymphozyten, die in Kulturbeuteln 12 kultiviert werden. Die Kulturbeutel 12, ein Vorspülungssalzlösungsbeutel 14 und ein Spülsalzlösungsbeutel 16 sind über eine Leitung 17 mit einer Schlauchpumpe 18 für die Zellsuspension verbunden. Klemmen 20, 22 und 24 kontrollieren die Strömung von den Kulturbeuteln 12, dem Vorspülungssalzlösungsbeutel 14 bzw. dem Spülungssalzlösungsbeutel 16. An dem Auslaß der Zellsuspen­ sionspumpe 18 ist ein Druckfühler 30 angeschlossen, um dort den Druck zu messen.

Ein Siebvorfilter 32 ist zwischen dem Auslaß der Zellsuspen­ sionspumpe 18 und dem Einlaß 33 einer Hohlfasermembrantrennein­ richtung 34 geschaltet. Die Hohlfasertrenneinrichtung 34 ist unter der Handelsbezeichnung PAN 200 von Asahi, Japan erhältlich. Sie enthält in der Membran Hohlfasern aus Poly­ acrylnitril einem molekularen Abschneidegewicht von 50 000 bis 55 000. Die Membrantrenneinrichtung 34 hat eine hohe Permeabilität für Wasser und kleine Moleküle, jedoch eine sehr kleine Permeabilität für Proteine und Teilchen mit Zellabmessungen. Deren Einlaß 33 und Auslaß 35 stehen über jeweilige Verteiler mit dem inneren der Hohlfasern in Verbin­ dung. Permeatanschlüsse 42 und 44 stehen mit dem Bereich außerhalb der Fasern in dem äußeren Gehäuse der Einrichtung 34 in Verbindung. Eine Umgehungsleitung 36 und eine Klemme 38 auf dieser sind dem Vorfilter 32 parallel geschaltet.

Der Auslaß 35 der Membrantrenneinrichtung 34 ist über eine Leitung 37 mit dem Einlaß eines Zentrifugenvorratsbeutels 40 verbunden. Der Permeatanschluß 42 ist versperrt und der Permeatanschluß 44 ist über eine Abflußleitung 46 mit einem Abflußbeutel 48 verbunden. Ein Druckfühler 50 ist an die Leitung 46 angeschlossen, um den Druck in dieser zu messen. Eine Abflußpumpe 52 ist in die Leitung 46 geschal­ tet, um das Abpumpen in den Abflußbeutel 48 zu steuern. Eine Umgehungsleitung 54 ist zwischen den Auslaß 35 der Membrantrenneinrichtung 34 und die Abflußleitung 46 geschal­ tet. Eine Klemme 56 wird verwendet, um die Strömung von dem Permeatanschluß 44 zu steuern, und eine Klemme 58 wird verwendet, um die Strömung durch die Leitung 54 zu steuern. Der Auslaß des Zentrifugenvorratsbeutels 40 ist über eine Strömungsleitung 62 mit einem Zentrifugensammelbeutel 60 verbunden, der in einer rotierenden Trommel 64 einer Zentrifu­ ge 67 (einer Zentrifugevom Typ 2991 der Cobe Laboratories, Inc., nicht gezeigt) verbunden ist. Eine Waschleitung 66 wird verwendet, um eine weitere Flüssigkeitsquelle mit dem Zentrifugensammelbeutel 60 zu verbinden, und eine Überlauf­ leitung 68 wird verwendet, um überschüssige Flüssigkeit in den Abflußbeutel 48 zu befördern.

Beim Betrieb werden die einem Patienten entnommenen lympho­ zytischen Zellen in den Beuteln 12 für beispielsweise drei oder vier Tage kultiviert. Nachdem der Kultivierungsvor­ gang abgeschlossen worden ist, wird die Einrichtung 10 dazu verwendet, die kultivierten Zellen vor deren Rückführung zu dem Patienten zu verarbeiten.

Die Klemme 22 wird geöffnet und die Lösung im Vorspülungssalz­ lösungsbeutel 14 wird durch die Pumpe 18, das Filter 32 die Leitung 36 und das Innere der Hohlfasern in der Membran­ trenneinrichtung 34 gepumpt, um die Schaltung vorzuspülen und in der Trenneinrichtung 34 enthaltenes Glycerol heraus­ zuspülen. Die Klemmen 59 und 44 werden geschlossen, so daß die Vorspülungslösung durch die Leitungen 54 und 46 zum Abfallbeutel 48 fließt, wobei der Schlauch 46 zu dieser Zeit nicht in die Pumpe 52 eingelegt ist. Während eines Teils der Vorspülung ist die Klemme 56 offen und die Klemme 58 geschlossen, um das Volumen in der Trenneinrichtung 34 außerhalb der Hohlfasern vorzuspülen.

Nachdem die Schaltung vorgespült ist, wird die Leitung 46 in die Pumpe 52 eingelegt, die Klemme 22 geschlossen und die Klemme 20 geöffnet, so daß die kultivierten Zellen in der Suspension in den Beuteln 12 mittels der Pumpe 18 durch die Schaltung gepumpt werden können. Die Klemme 58 wird geschlossen und die Klemme 59 wird geöffnet. Zuvor strömt die Vorspülungslösung in der Schaltung durch die Leitungen 54 und 46 in den Abflußbeutel 48. Danach fließt die konzentrierte Zellsuspension von der Membrantrenneinrich­ tung 34 in den Zentrifugenvorratsbeutel 40 und von dort zum Beutel 60 in der Zentrifugentrommel 64.

Die Zellsuspensionspumpe 18 pumpt die Zellsuspension in die Membrantrenneinrichtung 34 und die Abflußpumpe 52 zieht die zellfreie Flüssigkeit durch die Hohlfasermembranen und pumpt sie in den Abflußbeutel 48. Die Differenz zwischen den Pumpraten der Zellsuspensionspumpe 18 und der Abflußpumpe 52 entspricht der Rate, mit der die konzentrierte Zellsuspen­ sion zu dem Zentrifugenvorratsbeutel 40 geliefert wird. Um den besten Wirkungsgrad zu erhalten, ist diese Rate ungefähr gleich der Rate, mit der die Flüssigkeit in der Zentrifuge 67 verarbeitet wird. Bei der Verarbeitung in dem Zentrifugenbeutel 60 werden die interessierenden kulti­ vierten Zellen konzentriert und die überschüssige Flüssigkeit durch die Leitung 68 abgegeben. Das Filter 32 kann verwendet werden, um Zellklümpchen zu entfernen, welche die Fasern der Trenneinrichtung 34 verstopfen könnten. Die Umgehungslei­ tung 36 wird verwendet, wenn eine Filtration im Filter 32 nicht nötig ist oder wenn das Filter 32 verstopft ist. Der Druck wird stromabwärts der Zellsuspensionspumpe 18 mit einem Druckfühler 30 überwacht und mit einem Druckfühler 50 in der Abflußleitung 46.

Nachdem die Zellsuspensionsbeutel 12 geleert worden sind, wird die Klemme 24 geöffnet und die Klemme 20 geschlossen, um zu bewirken, daß die Spülsalzlösung von dem Beutel 16 fließt, während die Pumpen 18 und 52 weiterpumpen, um die noch in der Schaltung befindliche Zellsuspension zu konzentrie­ ren und zu dem Zentrifugenvorratsbeutel 60 zu befördern. Die Pumpen pumpen weiter bis ausreichend Spülsalzlösung durch die Hohlfasern der Trenneinrichtung 34 getreten ist. Nachdem die Zellen und die Spülsalzlösung zu dem Zentrifugen­ beutel 60 transportiert und dort weiter konzentriert worden sind, wird eine Waschlösung aus der Waschleitung 66 zugeführt, um die Nährlösung und die Stoffwechselprodukte der in dem Beutel 60 gesammelten Zellen zu entfernen, wie es bei den herkömmlichen Prozeduren üblich ist. Die Zellen werden dann wieder in eine Suspension übergeführt und dem Patienten infundiert, ebenso wie bisher üblich.

Die Vorkonzentration in der Membrantrenneinrichtung 34 wird die zum Sammeln bzw. "Ernten" der Zellen benötigte Zeit wesentlich verkürzt und auch die Beanspruchung der gesammelten Zellen durch das Zentrifugieren.

Gemäß weiteren Ausführungsbeispielen können andere Membran­ trenneinrichtungen verwendet werden, beispielsweise mit größeren maximalen Porengrößen bis zu 0,5 Mikron. Lymphozyten haben üblicherweise Durchmesser mit mehr als 10 Mikron. Bei solchen Einrichtungen werden Proteine nicht zurückgehal­ ten; wie es mit der oben beschriebenen Einrichtung PAN 200 der Fall ist.

Claims (7)

1. Einrichtung zur Verarbeitung von Zellen in einer Zellsuspen­ sion mit
einer Membrantrenneinrichtung (34), die zur Aufnahme der Zellsuspension geschaltet ist und eine Membran enthält, welche eine zellfreie Flüssigkeit, nicht jedoch die Zellen durch die Membran hindurchtreten läßt, sowie einen Auslaß (35) für eine konzentrierte Zellsuspension, und
eine Zentrifuge (64, 67) stromabwärts der Membrantrenneinrichtung (34), die zur Aufnahme der konzentrier­ ten Zellsuspension von dem Auslaß (35) geschaltet ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Pumpen (18, 52) zum Steuern der Strömung der Zellsuspension durch die Membrantrenneinrichtung (34) auf einer Seite einer Membran und der Strömung der zellfreien Flüssigkeit von der anderen Seite der Membran, um einen Durchtritt der zellfreien Flüssigkeit durch diese zu bewirken.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Filter (32) stromaufwärts eines Einlasses (33) der Membrantrenneinrichtung (34), um die Zellsuspension vor dem Einströmen in die Membrantrenneinrichtung (34) zu filtern.

4. Einrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch eine Umgehungsleitung (36) um das Filter (32) und eine Klemmein­ richtung (38) auf dieser, um wahlweise die Strömung durch die Umgehungsleitung (36) zu blockieren.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeich­ net durch einen mit dem Einlaß (33) der Membrantrenneinrich­ tung (34) verbundenen Behälter (14) für eine Vorspülungslösung.

6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeich­ net durch einen Behälter (12) für die Zellsuspension stromauf­ wärts der Membrantrenneinrichtung (34).

7. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, gekenn­ zeichnet durch einen Druckfühler (30) stromaufwärts der Membrantrenneinrichtung (34).