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TECHNISCHER HINTERGRUND
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Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein Assayvorrichtungen und insbesondere solche Vorrichtungen,
die chromatographische Verfahren anwenden, um spezifische Bindungsassays
durchzuführen.
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt,
die mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien
verwenden, welche in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport
erleichternden Agens chromatographisch transportiert werden, wobei
das Agens ein meta-lösliches Protein
umfasst, das chemisch behandelt wurde, um es hydrophiler zu machen
als in seiner natürlichen
Form, wobei die Markierung zur Erzeugung visuell nachweisbarer Signale
befähigt
ist. Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren und Vorrichtungen
bereitgestellt, die mit kollodialen Partikeln markierte spezifische
Bindungsmaterialien verwenden, welche in Anwesenheit eines meta-löslichen
Proteins, das als den chromatographischen Transport erleichterndes
Agens wirkt, auf einem chromatographischen Medium antrocknen gelassen
werden, und die zur schnellen Wiederauflösung in Anwesenheit eines geeigneten
Lösungsmittels
wie etwa der Probe oder einem chromatographischen Transportlösungsmittel
fähig sind.
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Immunologische Assays sind erwiesenermaßen bei
einer Vielzahl von klinischen Anwendungen von großem Wert.
Solche Assays beruhen auf spezifischen Bindungsreaktionen zwischen
Immunoglobulinen (Antikörpern)
und Substanzen, die spezifische antigene Determinanten (Antigene)
aufweisen. Die Antikörper
binden selektiv an Ligandenmaterialien, die das Antigen aufweisen,
für das
sie spezifisch reaktiv sind, und sie sind in der Lage, den Liganden
von anderen Substanzen zu unterscheiden, der ähnliche Charakteristiken aufweist.
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Da die Ergebnisse von immunologischen
und anderen spezifischen Bindungsreaktionen oft nicht direkt beobachtbar
sind, sind verschiedene Verfahren zu deren indirekter Beobachtung
bereitgestellt worden. Solche Verfahren umfassen die Markierung
eines der Glieder des spezifischen Bindungspaares mit einem Radioisotop,
mit einem Chromophor, mit einem Fluorophor oder einer enzymatischen
Markierung. Radiomarkierungen, Chromophore und Fluorophore können mittels
der Verwendung von Strahlungsdetektoren, Spektrophotometern oder
mit dem bloßem
Auge nachgewiesen werden. Wenn die Glieder eines spezifischen Bindungspaares
mit einer Enzymmarkierung bezeichnet sind, kann ihre Anwesenheit
mittels enzymatischer Aktivierung eines Reaktionssystems nachgewiesen
werden, wobei eine Verbindung, wie etwa ein Farbstoff aktiviert
wird, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
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Es gibt drei gut bekannte Sorten
von immunologischen spezifischen Bindungsassays. Bei konkurrierenden
Bindungsassays konkurrieren markierte Reagenzien und unmarkierte
Analytverbindungen um Bindungszentren auf einem Bindungsmaterial.
Nach einer Inkubationszeitdauer werden ungebundene Substanzen weggewaschen,
und die Menge an markiertem Reagenz, das an das Zentrum gebunden
ist, wird mit Vergleichsmengen zur Bestimmung der Analytkonzentration
in der Probenlösung
verglichen. Eine zweite Sorte von immunologischem Assay ist als
Sandwichassay bekannt und umfaßt
allgemein das In-Kontakt-Bringen
einer Analytprobenlösung
mit einer Oberfläche,
die ein erstes Bindungsmaterial aufweist, das für den Analyten immunologisch
spezifisch ist. Nach einem Waschschritt wird eine Lösung, die
ein markiertes zweites Bindungsmaterial umfaßt, das gegenüber dem
Analyten, der nachgewiesen werden soll, spezifisch reaktiv ist, dann
dem Assay zugesetzt. Das markierte zweite Bindungsmaterial bindet
an allen Analyten, der seinerseits an das erste Bindungsmaterial
gebunden ist. Das Assaysystem wird dann einem Waschschritt unterworfen, um
alles markierte zweite Bindungsmaterial zu entfernen, das nicht
an den Analyten binden konnte. Die verbleibende Menge an markiertem
Material kann dann bestimmt werden und ist eine Anzeige für die Menge
an Analyt, der in der Probe vorhanden ist. Obwohl der Ausdruck Sandwichassay
oft verwendet wird, um immunologische Assays zu bezeichnen, bei
denen das erste und das markierte Reagenzmaterial beides Antikörper oder
beides Antigene sind, so daß das "Sandwich" die Form Antikörper/Antigen/markierter
Antikörper
aufweist, umfaßt
eine breitere Definition des Ausdrucks Sandwich-Typ-Assay ebenfalls
andere Sorten von Drei-Komponenten-Assays,
einschließlich
solchen, die manchmal als "indirekte
Sandwiches" bezeichnet
werden, welche von der Form Antigen/Antikörper/markierter (anti-Immunoglobulin)
Antikörper
sein können.
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Ein dritter Typ des immunologischen
Assays ist das Agglutinationsassay, daß beispielhaft durch gutbekannte
Assays auf Blutantigene und Serumtypen vertreten wird. Die immunologische
Reaktivität
zwischen Antikörpern
innerhalb des Serums und Antigenen, die von den Oberflächen der
roten Blutkörperchen
angeboten werden, wird durch die Ausbildung eines dreidimensionalen
vernetzten Netzwerkes von Antigen (roten Blutkörperchen) und Antikörpern angezeigt.
Die Agglutination der Mischung aus Serum/roten Blutkörperchen führt zu der
Ausbildung eines makroskopischen Pellets im Reagenzgefäß, das mit
dem bloßem
Auge beobachtet werden kann.
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Diese verschiedenen Immunoassyverfahren
wurden ursprünglich
als "Flüssigphasenassays" in Vorrichtungen
wie Reagenzgläsern
durchgeführt,
in denen die Antigen/Antikörperkonjugate
zentrifugiert und ausgefällt
wurden. Neuerdings sind Verfahren entwickelt worden, bei denen Antikörper oder
Antigene auf die Oberfläche
von Mikrotitervertiefungen aufgezogen werden, und die Reaktionen
in Lösung
in solchen Vertiefungen durchgeführt
werden. Es sind ebenfalls Verfahren entwickelt worden, um "Festphasenassays" durchzuführen, bei
denen die immunologischen Reaktionen in Lösung an festen Substraten durch
geführt
werden, einschließlich
solchen, welche poröse
oder faserige Materialien sind. Im Rahmen solcher Verfahren werden
poröse
Trägermaterialien
in Streifen oder in anderen Formen zugeschnitten, auf denen die
Antikörper
oder Antigene mittels Adsorption, Absorption oder kovalenter Bindung
immobilisiert werden. Probenmaterialien, die einen Analyten enthalten,
welcher gegenüber
dem immobilisierten Glied des Bindungspaares spezifisch reaktiv ist,
werden auf das – Trägermaterial
aufgegeben, wo der Analyt über
die Reaktion mit seinem korrespondierenden Bindungspaarglied immobilisiert
wird. Die nicht abreagierten Probenmaterialien, werden dann mittels eines
Waschschrittes entfernt, nach dem, im Falle eines Assays vom Sandwichtyp,
ein markiertes Reagenz auf das Trägermaterial aufgegeben wird,
das zur Reaktion mit und zur Immobilisierung durch den immobilisierten
Analyten befähigt
ist. Das Trägermaterial
wird dann gewaschen, damit die Anwesenheit des markierten Reagenzes,
und damit des Analyten, nachgewiesen werden kann.
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Abwandlungen solcher "Festphasenassays" sind bekannt, bei
denen einer oder mehrere Probenbestandteile oder Reagenzien mittels
chromatographischen Lösungsmitteltransportes
bewegt wird. Das U.S. Patent Nr. 4 168 146 von Grubb, et al. offenbart
poröse
Teststreifen, auf denen Antikörper
immobilisiert sind. Die Streifen werden dann mit abgemessenen Mengen
von wässerigen
Lösungen
in Kontakt gebracht, die den Antigenanalyten enthalten. Die Antigenmoleküle innerhalb
der Testlösung
wandern auf Grund der Kapillarwirkung durch den Teststreifen, da
aber die gebundenen Antikörper
die Wanderung der Antigene, für
die sie spezifisch sind, verzögern,
ist das Ausmaß der
Wanderung der Antigenmoleküle über einen
festgelegten Zeitraum eine Funktion der Antigenkonzentration in
der Testlösung.
Die Antigen enthaltenden Bereiche der diagnostischen Vorrichtung,
werden dann durch die Zugabe von Enzym oder von mit fluoreszentem
Chromophor markierten Antikörper
angezeigt.
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Das U.S. Patent Nr. 4 517 288 von
Giegel, et al. offenbart Verfahren zur Durchführung von Festphasenimmunoassays
auf inerten porösen
Materialien. Das Patent offenbart die immunologische Immobilisierung eines
Bindungsmaterials innerhalb einer besonderen Zone des porösen Materials
und das Aufbringen der Probe auf die Zone, die das immebilisierte
Bindungsmaterial enthält.
Ein enzymmarkiertes Indikatormaterial, das an den Analyten bindet,
wird dann auf die Zone aufgebracht, wobei es in einer Menge, die
zu der Menge an Analyt in der Zone in Beziehung steht, immobilisiert
wird. Es wird dann ein Lösungsmittel
in der Mitte der Zone aufgebracht, um ungebundenes markiertes Indikatormaterial
chromatographisch von der Zone zu entfernen, so daß die Menge
von markiertem Indikator, die in der Zone verbleibt, gemessen werden
kann.
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Für
die vorliegende Erfindung von Interesse sind die Offenbarungen der
U.S. Patente mit den Nrn. 4 094 647, 4 235 601 und 4 361 537 von
Deutsch, et al., die immunologische und andere Sorten von spezifischen Bindungsassays
betreffen, bei denen die Reagenzien durch chromatographischen Lösungsmitteltransport transportiert
werden. Gemäß einer
Ausführungsform
umfaßt
ein radiomarkiertes konkurrierendes Bindungsassaykit einen Streifen,
der zum Transport einer Entwicklungsflüssigkeit mittels Kapillarität befähigt ist,
wobei er einen ersten Bereich zur Aufnahme einer Probe, einen zweiten
Bereich, der mit einem ersten Reagenz imprägniert ist, das dazu befähigt ist,
von der Entwicklerflüssigkeit
transportiert zu werden, und einen dritten Bereich umfaßt, der
mit einem zweiten Reagenz imprägniert
ist. Zusätzlich
umfassen die Vorrichtungen einen Meßbereich und ein verzögerndes
Element, welches entweder das zweite Reagenz oder das Material des
Streifens sein kann. Das erste Reagenz ist zur Reaktion mit einem
Glied der Gruppe befähigt,
die aus (1) der Probe, (2) der Probe und dem zweiten Reagenz oder
(3) dem dritten Reagenz in Konkurrenz mit der Probe besteht, unter Ausbildung
eines Produktes in einer Menge, die von der zu bestimmenden Eigenschaft
abhängt.
Eine Probe wird mit dem ersten Bereich in Kontakt gebracht, und
der Streifen wird dann in die Entwicklerflüssigkeit eingetaucht, um den
Transport der Probe auszulösen
und dem ersten Reagenz zu ermöglichen,
das Reaktionsprodukt auszubilden. Das verzögernde Element verlangsamt
den Transport entweder des Produktes oder des ersten Reagenzes (dem
wandernden Reagenz), um die beiden räumlich von einander zu trennen,
und die Menge des wandernden Elementes wird dann im Meßbereich
gemessen.
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Die Patente von Deutsch, et al. betreffen
Verfahren, bei denen die Reagenzien, die sich auf dem chromatographischen
Material befinden, mit dem Probenmaterial und anderen Reagenzien
im Laufe des chromatographischen Transportes vermischt werden. Ein
solches Vermischen ist für
konkurrierende Bindungsassays nicht schädlich und kann sogar wünschenswert
sein. Es kann jedoch für
Bindungsassays vom Sandwichtyp unerwünscht sein, bei denen es notwendig
ist, den Kontakt zwischen nicht-Analyt-Probenmaterialien und markierten spezifischen
Bindungsreagenzien zu unterbinden.
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Für
die vorliegende Erfindung von Interesse ist die Offenbarung des
U.S. Patents Nr. 4 452 901 von Gordon, welche die Verwendung von
porösen
Nitrozelluloseträgern
zur Immobilisierung von Proteinen betrifft. Es wird offenbart, daß solche
Nitrozelluloseblätter
bei Immunoassayverfahren verwendet werden können, wenn die verbleibenden
Bindungskapazitäten
der Nitrozelluloseblätter
gesättigt
werden, indem sie einer Blockierungsbehandlung mit einer oder mehreren
Sorten von Proteinen unterzogen werden, welche von den immobilisierten
verschieden sind und nicht zu irgendeinem der später in dem Assay verwendeten
Antikörper kreuzreaktiv
sind.
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Von weiterem Interesse für den technischen
Hintergrund der vorliegenden Erfindung sind die Offenbarungen von
Gordon, Europäische
Patentanmeldung 63 810, veröffentlicht
am 3. November 1982, die Vorrichtungen zur Durchführung immunologischer
Assays betreffen. Die Vorrichtungen bestehen aus einem porösen festen
Träger,
der ein vorgebildetes Gitter begrenzter Adsorptionsbereiche von
Antigenen, Antikörpern
oder beiden enthält,
in denen die verbleibenden Adsorptionszentren auf dem Substrat mittels
proteinblockierenden Agenzien, wie etwa Rinderserumalbumin gesättigt werden.
Die porösen
festen Träger
sind aus einer Vielzahl von natürlichen
und synthetischen Polymeren und Derivaten ausgewählt, aber vorzugsweise werden
Nitrozelluloseblätter
von 0,1 mm Dicke mit einer Porengröße zwischen ungefähr 0,15 μm und ungefähr 15 μm verwendet.
Die Antigene oder Antikörper
werden auf den porösen
festen Träger
mittels direktem Kontakt aufgetragen, gefolgt von der Inkubation mit
blockierenden Agenzien. Die Assays zum Nachweis unbekannter Antigene
oder Antikörper
werden dann durchgeführt,
indem markierte Antikörper
verwendet werden, welche ebenfalls anti-Immunoglobulin Antikörper sein können.
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Für
die vorliegende Anmeldung ebenfalls von besonderem Interesse ist
die Offenbarung von Gordon, et al. in EP-A-0 262 328, welche Vorrichtungen
zur Durchführung
spezifischer Bindungsassays betrifft, die den sequenziellen chromatographischen
Transport von Analyt- und Reagenzmaterialien verwenden. Wasch- und Zugabeschritte
werden inhärent
durchgeführt,
und der flüssige "Mikrokreislauf" kann derart programmiert
werden, daß eine
Vielzahl von Mehrfachschrittverfahren durchgeführt werden und daß das vorzeitige
Vermischen von Probenmaterialien und Reagenzien vermieden wird.
Bevorzugte Blockierungslösungen
für die
Behandlung des Streifenmaterials umfassen 1%ig LB-Gelatine (Inotech,
Wohlen, Schweiz) in TBS-Lösung,
umfassend (0,15M NaCl, 0,02 Tris-HCl, pH 7,6) oder 3% Rinderserumalbumin
(BSA) Lösung
in physiologischer Kochsalzlösung.
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Insbesondere betrifft die Anmeldung
von Gordon, et al. die den sequenziellen Transport zum Gegenstand
hat, Vorrichtungen, welche einen Teststreifen für den Nachweis eines Analyten
in einer Probe umfassen, die einen Längenabschnitt chromatographischen
Materials umfassen, der die Kapazität zum schnellen chromatographischen
Lösungmitteltransport
nicht-immobilisierter
Reagenzien und reaktiver Probenbestandteile mittels eines ausgewählten chromatographischen
Lösungsmittels
aufweist. Der Streifen umfaßt
ein erstes Ende, an dem der chromatographische Transport einsetzt,
ein zweites Ende, an dem der chromatographische Transport endet,
und eine Mehrzahl von Bereichen, die zwischen den beiden Enden liegen.
Die Bereiche umfassen einen ersten Bereich (der mit einem ersten
Reagenz imprägniert
ist, das in dem Lösungsmittel
beweglich ist und zur Reaktion mit und zur Immobilisierung gegen
den Lösungsmitteltransport
durch den Analyten, wenn der Analyt in immobilisierter Form vorliegt,
befähigt
ist), einen zweiten Bereich (zur Aufnahme der Probe, von der angenommen
wird, daß sie
einen Analyten enthält)
und einen dritten Bereich (der sich stromabwärts des ersten Bereiches befindet,
und der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das gegen den Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist, und das zur selektiven Reaktion mit dem Analyten
befähigt
ist, so daß der
Analyt in einer immobilisierten Form in dem dritten Bereich erhalten
wird. Die Vorrichtung ist desweiteren dadurch gekennzeichnet, daß nachdem
die Probe in dem zweiten Bereich aufgenommen wurde und beim Eintauchen des
ersten Endes in das chromatographische Lösungsmittel die relative Mobilität des Analyten
und des ersten Reagenzes oder das Ortsverhältnis zwischen dem zweiten
und dem dritten Bereich derart ist, daß der Analyt indem dritten
Bereich angeordnet und gegen Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist, bevor das erste Reagenz den dritten Bereich erreicht,
wodurch interferierende Probenbestandteile und nicht-Analytbestandteile
der Probe, die mit den ersten Reagenz reaktiv sind, aus dem dritten
Bereich durch chromatographischen Lösungsmittelstransport vor dem
Transport des ersten Reagenzes zu dem dritten Bereich hin entfernt
werden. Die Anwesenheit des ersten Reagenzes, das in dem dritten
Bereich immobilisiert ist, kann mittels eines Enzyms, eines Radioisotops
oder mittels anderer Markierungen nachgewiesen werden. Die Vorrichtung
ist insbesondere zur Verwendung mit enzymmarkierten Reagenzien wie
Enzymsubstraten und Indikatorfarbstoffreagenzien geeignet, da diese
auf verschiedenen Bereichen des Streifens eingebaut und zu dem dritten
Bereich in einer geeigneten Reihenfolge durch den chromatographischen
Transport hintransportiert werden können.
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Von Interesse für die vorliegende Erfindung
sind solche Literaturstellen, welche die Verwendung von Dispersionen
kolloidaler Partikel in Immunologischen Assayverfahren betreffen.
Frens offenbart in Nature, 241, 20–23 (1973) Verfahren für die Herstellung
von monodispersen Goldsolen verschiedener Partikelgrößen mittels
der Reduktion von Goldchlorid mit wässerigem Natriumcitrat. Eine
Veränderung
in der Konzentration des Natriumcitrats während der Agglomerierung der
Partikel kann verwendet werden; um die Partikelgröße des resultierenden
Sols zu verändern.
Es sind Sole aus monodispersen Goldpartikeln offenbart, die Partikelgrößen aufweisen,
welche von 16 nm bis ungefähr
150 nm aufweisen und die Farben aufweisen, die von orange bis rot
bis hin zu violett in dem genannten Bereich aufweisen.
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Romano et al., Immunochemistry, 11,
Seite 521–22
(1974) offenbart die Markierung von Immunoglobulinen mit kolloidalen
Goldpartikeln zur Verwendung bei der Sichtbarmachung von Antigenen
von humanen roten Blutkörperchen
mittels der Elektronenmikroskopie. Das Gold,sol welches einen durchschnittlichen
Partikeldurchmesser von ungefähr
3 nm aufweist, hat eine Tendenz zum Ausflocken, aber es wird durch
die Anwesenheit entweder von Pferdeserum oder BSA stabilisiert.
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Geoghegan, et al., J. Immuno. Meth.,
34, 11–21
(1980) offenbart das Beschichten von kolloidalen Goldpartikeln mit
Immunoglobulinen zur Verwendung bei passiven Agglutinationsverfahren.
Die Literaturstelle (auf Seite 14) offenbart die Resuspension von
zentrifugierten Mischungen von goldmarkierten Immunoglobulinen mit
0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) (pH 7,2), enthaltend 1%ig Polyethylenglycol (PEG). Die Literaturstelle
verweist ebenfalls darauf, daß obwohl
die Goldproteinkomplexe während
des Zentrifugierens nicht aggregieren, es oft vorkommt, daß sie in
Gegenwart irgend eines reihenmäßig verdünnten Proteins
auf einer Mikrotiterplatte einer nicht-spezifischen Aggregation
unterworfen sind.
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Surek, et al., Biochem. and Biophys.
Res. Comm., 121, 284-289
(1984) offenbart die Verwendung von mit Protein A markierten kolloidalen
Goldpartikeln zum Nachweis von spezifischen Antigenen, die auf Nitrozellulosemembranen
immobilisiert sind. Gemäß dem Verfahren,
wird ein Elektrophoresegel auf ein Nitrozellulosefilter geblottet,
welches dann mit einer 2%igen Lösung
von BSA in PBS behandelt wird, um nicht-spezifische Bindung auszuschließen. Das
Filter wird dann mit verdünntem
Antiserum oder Preimmunserum behandelt und mit PBS-BSA 'gewaschen. Der Streifen
wird dann 30–60
Minuten mit Protein A inkubiert, das mit kolloidalem Gold konjugiert
ist und welches die Anwesenheit der gebundenen Antikörper nachweist. Überschüssige, ungebundene
kolloidale Goldpartikel werden dann mittels mehrerer kurzer Pufferwaschschritte
entfernt.
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Leuvering, offenbart im U.S. Patent
Nr. 4 313 734 die Verwendung von metallischen Solpartikeln als Markierungen
für die
in vitro Bestimmung immunologischer Bestandteile in einem wässerigen
Testmedium. Spezifisch offenbart werden Immunoassay-Testkits zum Nachweis
von Antigenen oder Antikörpern,
die einen oder mehrere markierte Bestandteile verwenden, die durch
die Kupplung des Bestandteils an Partikel einer wässerigen
Soldispersion eines Metalls, einer Metallverbindung oder von Polymerkernen,
die mit einem Metall oder einer Metallverbindung beschichtet sind,
und die eine Partikelgröße von wenigstens
5 nm aufweisen, erhalten wurden. Gemäß einem Beispiel wird ein Assay
für humanes
planzentales Laktogen (HPL) durchgeführt, bei dem Kaninchen-anti-HPL-Antikörper verwendet
werden, welche mit Goldpartikeln markiert worden sind. Unmarkierte
Kaninchen-anti-HPL-Antikörper werden
auf die Wände
einer Mikrotiterplatte aufgezogen, indem sie mit einer BSA-Lösung und
Phosphatpuffer inkubiert werden, zu der Merthiolat hinzugegeben
wurde. Standardlösungen
von HPL werden zu den Vertiefungen hinzugegeben und 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Eine Lösung,
die aus Kaninchen-anti-HPL-Antikörpern
besteht, welche mit Goldpartikeln konjugiert sind, die Durchmesser
zwischen 45 und 70 nm aufweisen, wird zu den Vertiefungen hinzugegeben
und wird über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden dann gewaschen
und die Lichtabsorption wird mit einem geringvolumigen Spektrophotometer
gemessen.
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Hsu, Anal. Biochem. 142, 221–225 (1984)
offenbart die Verwendung von Immunogoldmarkierungssystemen für Blottingimmunoassayverfahren,
bei denen Reihenverdünnungen
von gereinigtem Tabakmosaikvirus (TMV) in einem Polyacrylamidgel
einer Elektrophorese unterzogen werden und dann elektrisch auf Nitrozellulosefilterbögen transferiert
werden. Die Nitrozellulosebögen
werden gebacken, um die Bindung zu stabilisieren und sie werden
mit 5%igem Normalziegenserum oder in 0,05%ig Tween® 20
in PBS behandelt, um die nicht-spezifische Bindung von Antikörpern zu
blockiere. Das Filter wird dann über
Nacht bei 4°C
mit Kaninchen-anti-TMV-Antikörpern,
die in Blockierungslösung
verdünnt
sind, inkubiert, gefolgt von einem Waschschritt in PBS, und der
Antigen-Antikörperkomplex
wird dann nachgewiesen, indem das Filter mit goldmarkierten Ziegen-anti-Kaninchen-IgG in
Blockierungslösung
gesättigt
wird. Gemäß dem Verfahren
sind so geringe Mengen wie 8 ng des TMV Proteins bei ungefähr 30 minütigem Kontakt
mit goldmarkiertem IgG nachweisbar. Die Literaturstelle offenbart
ebenfalls, daß Agenzien
wie Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon und Rinderserumalbumin
die Stabilität
der Goldmarkierungen erhöhen
können.
Die Verwendung von Tween® 20 zur Verhinderung nicht-spezifischer Bindung
des Proteins auf Nitrozellulose wird offenbart, zusammen mit der
Beobachtung, daß 0,05
Tween® 20
in PBS bei dem Färbungsverfahren
verwendet werden kann, ohne die Spezifität des Gold-IgG-Komplexes zu
stören.
Von Normalziegenserum wird ausgesagt, daß es ein bevorzugtes Blockierungsagenz
im Lichte seiner Tendenz darstellt, Goldpartikel zu adsorbieren,
die von der Sonde während
der Lagerung dissoziieren.
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Moeremans, et al., Europäische Patentanmeldung
Nr. 158 746 offenbart die Verwendung von kolloidalen Metallpartikeln
als Markierungen bei Sandwichblot-Überschichtungsassays. Spezifische
Bindungsmaterialien, die spezifisch gegenüber dem nachzuweisenden Analyten
reaktiv sind, werden auf Nitrozellulosestreifen aufgebracht und
getrocknet. Die Proteinbindungsstellen auf dem Streifen werden dann
mittels Behandlung mit Rinderserumalbumin, Gelatine, Polyethylenglykol
oder Tween® 20
blockiert. Den Analyten enthaltendes Probenmaterial wird dann auf
den Streifen aufgebracht und 2 Stunden lang inkubiert. Der behandelte
Streifen wird gewaschen und luftgetrocknet und 2 Stunden mit einem
spezifischen Bindungsagenz inkubiert, das mit kolloidalen Metallpartikeln
markiert worden ist. Gemäß einem
Beispiel werden anti-Tubulinantikörper mittels mit
Goldpartikeln markierten Reagenzien nachgewiesen, die eine rosa-rötliche Farbe,
(Partikel von 20 nm) oder eine purpurartige Farbe (Partikel von
40 nm) hervorrufen. Von den Assays ist offenbart, daß sie eine
Empfindlichkeit in der Größenordnung
von 5 ng/μl
aufweisen.
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Von Interesse für die vorliegende Erfindung
ist die Offenbarung von Hoye J. Chromatog., 28, 379–384 (1967),
die die chromatographische Reinigung von Radiochemikalien betrifft.
Die Anwendung von Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie und
Hochspannungselektrophoreseverfahren werden offenbart, um Goldionen
mit unterschiedlichem Erfolg zu bewegen, aber sie sind allgemein
für den
Transport kolloidaler Goldpartikel ungeeignet.
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Die Verwendung von polymerisierten
Farbstoffmaterialien in kolloidaler Form für spezifische Bindungsassays
ist ebenfalls bekannt. Von Interesse für die vorliegende Anmeldung
ist die Offenbarung von Hirschfeld im U.S. Patent Nr. 4 166 105,
die markierte spezifische Bindungsreagenzien betrifft, die gegenüber spezifischen
Antigenen reaktiv sind, und die hergestellt werden, indem fluoreszierende
Farbstoffmoleküle
an analytspezifische Antikörper über Polymere
angebunden werden, welche reaktive funktionelle Gruppen umfassen. Ebenfalls
für die
vorliegende Anmeldung von Interesse ist die Offenbarung von Henry,
im U.S. Patent Nr. 4 452 886, welche spezifische Bindungsreagenzien
betrifft, welche Antigene oder Antikörper umfassen, die an ein wasserlösliches
Polymer gebunden sind, welches im wesentlichen aus zwischen 40 und
600 Chromophoren oder Fluoreszenzgruppen enthaltenden Monomeren
besteht.
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Yost et al., offenbart in der Europäischen Patentanmeldung
Nr. 298 368, welche gemäß Artikel
54(3) und (4) EPÜ Stand
der Technik ist, ein Immunoassay vom Sandwichtyp, bei dem eine Serumprobe
von anti-Trichinen-Antikörper
mit einer gepufferten Lösung
von mit kolloidalem Selen markierten Ziegen-anti-Schwein-Antikörper und
mit Casein vermischt wird und mit einem Nitrozellulosestreifen in
Kontakt gebracht wird, der eine einzelne Reaktionsstelle aufweist,
auf der Trichinenantigen immobilisiert worden ist.
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Mochnal et al. offenbart in der Europäischen Patentanmeldung
Nr. 250 137, die nach Artikel 54(3) und (4) EPÜ Stand der Technik ist, ein
Immunoassay vom Sandwichtyp, das einen Chromatographiepapierstreifen verwendet,
der eine untere Bande aufweist, die mit anti-hCG-Antikörper beschichtet
ist und eine Kontroll/Eichbande, die mit hCG beschichtet ist, wobei
eine Vollblutprobe auf den Streifen an einer Stelle zwischen der
unteren Bande und dem unteren Ende aufgetropft wird, und wobei der
Streifen dann in eine gepufferte Lösung von mit kolloidalem Gold
markiertem anti-hCG-Antikörper
und 4%ig Rinderserumalbumin eingetaucht wird. Mochnal et al. offenbart
desweiteren ein Immunoassay vom Sandwichtyp, das einen Chromatographiepapierstreifen
verwendet, der eine untere Bande aufweist, die mit Rubellaantigen
beschichtet ist und eine Kontroll/Eichbande, die mit human-IgG beschichtet
ist, wobei ein Ende des Streifens in eine gepufferte Lösung einer
Serumprobe und Rinderserumalbumin eingetaucht wird, und wobei der
Streifen dann in eine gepufferte Lösung von mit kolloidalem Gold
markiertem Mäuse
anti-human-Antikörper
und 3,8%ig Rinderserumalbumin überführt wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
verbesserte chromatographische Assayverfahren, Kits und Vorrichtungen
zur Verfügung,
die auf spezifischer Bindung beruhen. Gemäß einem Aspekt der Erfindung
wird ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer
Substanz in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes
umfasst:
- a) Bewirken eines Kontakts zwischen
der Probe und einem chromatographischen Medium, wobei das Medium
wenigstens eine Reaktionsstelle aufweist, die ein immobilisiertes
Reagenz einschließt,
das zur Bindung eines Glieds befähigt
ist, das aus der Gruppe gewählt
ist, die aus der Substanz und einem mittels kolloidaler Partikel
markierten Material besteht, das zur Erzeugung einer nachweisbaren
Antwort fähig
ist,
- b) chromatographisches Transportieren auf dem chromatographischen
Medium des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials in
Gegenwart eines den chromatographischen Transport erleichternden
Agens, das ein meta-lösliches
Protein umfasst, das chemisch behandelt wurde, um es stärker hydrophil
zu machen, als in seiner natürlichen
Form, wobei das Agens die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch
bindenden Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert und deren chromatographischen
Transport fördert,
wodurch wenigstens ein Teil des mittels kolloidaler Partikel markierten
Materials chromatographisch zu der Reaktionsstelle transportiert
wird, um an diese zu binden, und
- c) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels
kolloidaler Partikel markierten Material an der Reaktionsstelle
hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge
an Substanz in der Probe.
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In einer Ausführungsform dieses Verfahrens
umfasst das chromatographische Medium eine zweite Reaktionsstelle,
die ein zweites immobilisiertes Reagenz einschließt, das
dasselbe wie das erste immobilisierte Reagenz sein kann, oder das
von dem ersten immobilisierten Reagenz verschieden sein kann, und
das zur Bindung mit dem mittels kolloidaler Partikel markierten
Material fähig
ist, wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
- d) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels
kolloidaler Partikel markierten Material an der zweiten Reaktionsstelle
hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge
an Substanz in der Probe.
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Die vorliegende Erfindung bietet
weiter ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer
Substanz in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
- a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem chromatographischen
Medium, wobei das Medium wenigstens zwei Reaktionsstellen aufweist,
wobei die erste Reaktionsstelle eine getrocknete Lösung eines
mittels kolloidaler Partikel markierten Materials einschließt, in Gegenwart
eines meta-löslichen
Proteins, wobei das meta-lösliche
Protein die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden
Materialien und Reagenzien in Lösung
verhindert und deren chromatographischen Transport fördert, und
wobei die zweite Reaktionsstelle ein immobilisiertes Reagens einschließt, das
zur Bindung eines Glieds fähig
ist, das aus der Gruppe gewählt
ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten
Material besteht,
- sb) Solubilisieren des mittels kolloidaler Partikel markierten
Materials und chromatographisches Transportieren wenigstens eines
Teils des mittels kolloidaler Partikel markierten Materials an die
zweite Reaktionsstelle zur Bindung an diese, und
- c) Bestimmen der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels
kolloidaler Partikel markierten Material an der zweiten Reaktionsstelle
hervorgerufen wird, als eine Anzeige für die Anwesenheit oder Menge
an Substanz in der Probe.
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In einer Ausführungsform des Verfahrens umfasst
das chromatographische Medium eine dritte Reaktionsstelle, die ein
zweites immobilisiertes Reagenz einschließt, das dasselbe wie das erste
immobilisierte Reagenz sein kann, oder das von dem ersten immobilisierten
Reagenz verschieden sein kann, und das zur Bindung mit dem mittels
kolloidaler Partikel markierten Material fähig ist, wobei das Verfahren
den folgenden Schritt umfasst:
- d) Bestimmen
der nachweisbaren Antwort, die von dem mittels kolloidaler Partikel
markierten Material an der dritten Reaktionsstelle hervorgerufen
wird, als eine Anzeige für
die Anwesenheit oder Menge an Substanz in der Probe.
-
Die vorliegende Erfindung bietet
auch eine
Testvorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit oder
Menge einer Substanz in einer Probe mittels einer oder mehrerer
spezifischer Bindungsreaktionen, die folgendes umfasst:
ein
chromatographisches Medium mit Kapillarstruktur und der Fähigkeit
zum schnellen chromatographischen Lösungsmitteltransport eines
oder mehrerer nicht-immobilisierter Reagenzien und reaktiver Proben-Bestandteile
mittels eines ausgewählten
chromatographischen Lösungsmittels,
das folgendes umfasst:
eine erste Reaktionsstelle, die eine
getrocknete Lösung
eines mittels kolloidaler Partikel markierten Materials einschließt, in Gegenwart
eines meta-löslichen
Proteins, wobei das mittels kolloidaler Partikel markierte Material
zur schnellen Solubilisierung fähig
ist, und wobei das meta-lösliche
Protein die Aggregation und Inaktivierung der spezifisch bindenden
Materialien und Reagenzien in Lösung
verhindert und deren chromatographischen Transport in dem Lösungsmittel
fördert,
und
eine zweite Reaktionsstelle, die ein immobilisiertes Reagenz
einschließt,
das zur Bindung eines Glieds fähig ist,
das aus der Gruppe gewählt
ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten
Material besteht.
-
Außerdem bietet die vorliegende
Erfindung einen
Kit zur Verwendung in spezifischen Bindungsassays
zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer
Probe, der folgendes umfasst:
- (1) eine Lösung, die
ein mittels kolloidaler Partikel markiertes Material in Anwesenheit
eines den chromatographischen Transport erleichternden Agens umfasst,
das ein meta-lösliches
Protein umfasst, wobei das Agens die Aggregation und Inaktivierung
spezifisch bindender Materialien und Reagenzien in Lösung verhindert
und deren chromatographischen Transport fördert, und
- (2) ein chromatographisches Medium mit Kapillarstruktur und
der Fähigkeit
zum chromatographischen Lösungsmitteltransport
von nicht-immobilisierten Reagenzien und reaktiven Proben-Bestandteilen mittels
eines ausgewählten
chromatographischen Lösungsmittels,
das wenigstens eine Reaktionsstelle einschließt, die ein immobilisiertes
Reagenz einschließt,
das zur Bindung eines Glieds fähig
ist, das aus der Gruppe gewählt
ist, die aus der Substanz und dem mittels kolloidaler Partikel markierten
Material besteht.
-
Es ist herausgefunden worden, daß spezifische
Bindungsmaterialien, die mit kolloidalen Partikeln markiert sind,
wie etwa mit Gold, einem schnellen chromatographischen Transport
auf einem chromatographischen Medium mittels ausgewählter Lösungsmittel
und den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien unterworfen
werden können
wie oben erwähnt,
und daß die
Verwendung der Assayverfahren mit chromatographischem Lösungsmitteltransport
den Zeitraum, der für die
Bindungsreaktion eines mit kolloidalen Partikeln markierten Materials
mit seinem spezifischen Bindungspartner benötigt wird, im Vergleich mit
herkömmlichen
Verfahren wesentlich verkürzt.
Es ist ebenfalls herausgefunden worden, daß die Imprägnierung eines chromatographischen
Mediums mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsmaterialien aus
labilen Bindungsproteinen in Anwesenheit eines wässerigen Mediums, das meta-lösliche Proteine,
wie Casein enthält,
die schnelle Wiederauflösung
solcher mit kolloidalen Partikeln markierter Protein erlaubt, die auf
das chromatographische Medium in einer stabilen und geeigneten Form
für den
Transport entlang dem chromatographischen Medium zur Durchführung der
spezifischen Bindungsassayverfahren der Erfindung aufgetrocknet
worden sind.
-
Demgemäß liefert die Erfindung verbesserte
spezifische Bindungsassayvorrichtungen, Kits und Verfahren zur Bestimmung
der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer Probe. Die Assays,
welche die Markierungen aus kolloidalen Partikeln verwenden, liefern
ein visuell nachweisbares Signal und erfordern nicht die Verwendung
von Materialien wie Radioisotopen oder Enzymmarkierungen mit den
entsprechenden Erfordernissen an Nachweisausrüstungen oder der Zugabe von
Enzymkonjugaten und Indikatorfarbstoffen. Von der Erfindung werden
sowohl Mittel zur Durchführung
von Konkurrenzbindungs- als auch von Direktbindungsassays (Sandwichtypus)
zur Verfügung
gestellt. Es werden bevorzugte Assayverfahren und Kits zur Verfügung gestellt,
die dem Nachweis der Anwesenheit oder Menge einer Substanz in einer
Probe dienen, bei denen ein mit kolloidalen Partikeln markiertes
Material und ein den chromatographischen Transport erleichterndes
Agens wie oben erwähnt
mit der Probe vermischt werden. Ein chromatographisches Medium,
das ein oder mehrere Reaktionszentren umfaßt, die mit einem oder mehreren
Reagenzien imprägniert
sind, die für
die Durchführung des
Assays nützlich
sind, wird dann mit der Mischung aus Probe, aus mit kolloidalen
Partikeln markiertem Material und dem den chromatographischen Transport
erleichternden Agens in Kontakt gebracht, um die Probe und das markierte
Material chromatographisch entlang den chromatographischen Medium
zu transportieren, und um das gewünschte Assay durchzuführen.
-
Die Erfindung liefert ebenfalls Assayverfahren
und Vorrichtungen, bei denen markierte Materialien einschließlich von
mit kolloidalen Partikeln markierten Materialien in Gegenwart eines
meta-löslichen
Proteins auf eine Reaktionsstelle imprägniert und aufgetrocknet werden,
die sich auf einem chromatographischen Substratmaterial befindet.
Die chromatographischen Medien der Vorrichtungen können eine
oder mehrere zusätzliche
Reaktionsstellen umfassen, an denen chemische Reaktionen selbst
nicht stattfinden, aber an denen zusätzliche Materialien abgelegt
oder immobilisiert sein können,
oder an denen Analytsubstanzen, die Probenmaterialien enthalten,
abgelegt sein können.
Das chromatographische Medium wird mit einem chromatographischen
Lösungsmittel
in Kontakt gebracht, das die mit kolloidalen Partikeln markierten
spezifischen Bindungsmaterialien als auch die Probensubstanz und
die anderen wahlweise enthaltenen Materialien und Reagenzien auflöst und entlang
des Mediums transportiert. Die Affinität des immobilisierten spezifischen
Bindungsreagenzes ist derart, daß es wirksam das markierte
Material aus dem fließenden
Material herauszufangen vermag, derart, daß der markierte Bindungsbestandteil
in dem Bereich angereichert wird.
-
Ein wichtiger Vorteil wird von der
vorliegenden Erfindung insofern zur Verfügung gestellt, als daß die Bindungsaffinität des immobilisierten
Reagenzes derart sein kann, daß es
zum Einfangen einer markierten Komponente in dem fließenden chromatographischen
Strom derart befähigt
ist, daß die
markierte Bindungskomponente in der Einfangzone angereichert wird
und eindeutig von dem Hintergrundstrom von nicht konzentriertem
mit kolloidalen Partikeln markiertem Material unterscheidbar ist.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1a, 2a, 3a, 4a,
und 5a sind Frontansichten,
von fünf
verschiedenen Formen von Testvorrichtungen der vorliegenden Erfindung;
-
1b, 2b, 3b, 4b,
und 5b sind Querschnittsansichten
der Testvorrichtungen, die in den 1a, 2a, 3a, 4a,
und 5a jeweils gezeigt
sind, und die entlang der Linien 1b-1b, 2b-2b, 3b-3b, 4b-4b und
5b-5b genommen sind;
-
1c, 2c, und 3c sind Querschnittsansichten der Testvorrichtungen,
die jeweils in den 1a, 2a und 3a, gezeigt sind, die sich im Kontakt
mit einem Volumen an Probenmaterial und Indikatorlösung befinden;
-
4c und 5c sind Querschnittsansichten
der Testvorrichtungen, die jeweils in den 4a und 5a gezeigt
sind, in Kontakt mit einem Volumen an chromatographischem Lösungsmittel;
und
-
6 ist
eine Querschnittsansicht der Testvorrichtung nach 4a, die entlang der Linien 6-6 aufgenommen
ist.
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EINGEHENDE
BESCHREIBUNG
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Die vorliegende Erfindung liefert
verbesserte immunologische und andere auf spezifischer Bindung beruhende
chromatographische Assayverfahren, Kits und Vorrichtungen.
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Mit kolloidalen Partikeln markierte
spezifische Bindungsmaterialien sind hoch anfällig für Aggregation und sie sind
daher allgemein zum schnellen und wirksamen Transport entlang chromatographischen
Medien gemäß Assayverfahren,
die auf chromatographischem Lösungsmitteltransport
beruhen, unfähig.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß spezifische Bindungsmaterialien,
die mit kolloidalen Partikeln markiert sind und insbesondere mit
kolloidalen Partikeln, die größer als
ungefähr
1 nm im Durchmesser sind, die der Aggregation besonders leicht unterliegen,
einem schnellen chromatographischen Transport mittels ausgewählter Lösungsmittel
und den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien auf
einem chromatographischen Medium unterworfen werden können, wie
oben beschrieben. Obwohl die Materialien, die mit kolloidalen Partikeln
markiert sind und insbesondere solche, die einen geringeren als
einen Durchmesser von ungefähr
1 nm aufweisen, zum chromatographischen Transport ohne die Anwesenheit
des den chromatographischen Transport erleichternden Agens gemäß der vorliegenden
Erfindung fähig
sind, hilft die Verwendung solcher Agenzien beim schnellen chromatographischen
Transport aller mit kolloidalen Partikeln markierter Reagenzien
der Erfindung. Als verwandte Entdeckung ist herausgefunden worden,
daß der
chromatographische Lösungsmitteltransport
von mit kolloidalen Partikeln markierten Materialien den Zeitraum,
der für
die Bindungsreaktion solcher Materialien mit ihren spezifischen
Bindungspartnern benötigt
wird, verglichen mit herkömmlichen
Verfahren, wesentlich verkürzt.
Während
herkömmliche
Immunoassayverfahren, wie die von Leuvering, im U.S. Patent Nr.
4 313 734 die Inkubation von mit kolloidalen Partikeln markiertem
spezifischen Bindungsmaterialien von 1 Stunde bis über die
Nacht lang (16 Stunden) lehren liefern die chromatographischen Verfahren
der vorliegenden Erfindung allgemein die schnelle Vervollständigung
des Transportes und der spezifischen Bindungsreaktionen in weniger
als ungefähr
5 vorzugsweise weniger als ungefähr
2 Minuten.
-
Es ist darüberhinaus entdeckt worden,
daß mit
kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien
aus labilen Proteinen, die auf ein chromatographisches Medium in
der Anwesenheit ausgewählter meta-löslicher
Proteinmaterialien imprägniert
und aufgetrocknet sind, schnell durch die Zugabe von geeigneten
Lösungsmitteln
gelöst
werden und entlang dem chromatographischen Medium bei den Assayverfahren
der Erfindung transportiert werden können. Als eine Folge dieser
Entdeckung werden Vorrichtungen für auf spezifischer Bindung
beruhende Assays zur Verfügung
gestellt, bei denen mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische
Bindungsmaterialien in trockener stabiler Form in die Vorrichtung
eingebaut werden und nur das Probenmaterial und ein chromatographisches
Lösungsmittel
zur Durchführung
eines Assays zugegeben werden muß.
-
Gemäß der Erfindung können Kits
hergestellt werden und spezifische Bindungsassayverfahren können für die Analyse
eines Substrates in einer Probe gemäß einem Verfahren durchgeführt werden,
das eine Lösung
verwendet, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes Material
in der Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden
Agens umfaßt
wie oben erwähnt.
Das Verfahren verwendet ebenfalls ein chromatographisches Medium,
das Kapillarität
aufweist und die Fähigkeit
zum chromatographischen Lösungsmitteltransport
von nicht immobilisierten Reagenzien und von reaktiven Probenbestandteilen
mittels eines ausgewählten
chromatographischen Lösungsmittels,
wobei das chromatographische Medium eine Reaktionsstelle einschließt, einschließlich eines
immobilisierten Reagenzes, das zur Bindung eines Glieds befähigt ist,
das aus der Gruppe gewählt
ist, die aus der zu analysierenden Substanz und dem mit kolloidalen
Partikeln markierten Material besteht. Das Verfahren umfaßt (a) das
In-Kontakt-Bringen
der Probe, die analysiert werden soll, mit dem chromatographischen
Medium, (b) das chromatographische Transportieren von mit kolloidalen
Partikeln markiertem Material in der Anwesenheit eines den chromatographischen
Transport erleichternden Agens auf dem chromatographischen Medium
wie oben erwähnt,
wobei wenigstens ein Teil des mit kolloidalen Partikeln markierten
Materials chromatographisch zu der Reaktionsstelle transportiert
wird, um an diese zu binden und (c) das Bestimmen der nachweisbaren
Antwort, die von dem kolloidalen Material an der Reaktionsstelle
als Anzeige für
die Anwesenheit oder Menge der Substanz in der Probe hervorgerufen
wird.
-
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung kann die Affinität
des immobilisierten Reagenzes und die Konzentrationen der Reagenzien
und des Probenmaterials von einem Fachmann derart ausgewählt werden,
daß das
mit kolloidalen Partikeln markierte Material an der Reaktionsstelle
angereichert wird und gegenüber
den Hintergrundstrom von nicht angereichertem mit kolloidalen Partikeln
markiertem Material nachgewiesen werden kann. Wo dies nicht der
Fall ist, kann das chromatographische Medium einem Wasch- oder Spülschritt
unterzogen werden, um das nicht gebundene markierte Material zu
entfernen. Solche Waschschritte können ebenfalls inherent gemäß den Verfahren
der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 262 328 ausgeführt werden.
-
Es ist ebenfalls offensichtlich,
daß die
Probe, die analysiert werden soll, das mit kolloidalen Partikeln markierte
Material, das den chromatographischen Transport erleichternde Agens,
das chromatographische Lösungsmittel
und andere Lösungsmittel
und Reagenzien miteinander gemäß verschiedenen
möglichen
Kombinationen vor ihrem In-Kontakt-Bringen mit dem chromatographischen
Medium vermischt werden können, und
daß diese
Mischungen und verschiedene Bestandteile mit dem chromatographischen
Medium in verschiedenen Reihenfolgen in Kontakt gebracht werden
können,
wie dies für
den Fachmann offensichtlich ist. Es ist ferner offensichtlich, daß das chromatographische
Lösungsmittel
durch die Probe oder durch die Lösung,
die das mit kolloidalen Partikeln markierte Material enthält, ersetzt
werden kann, wo diese Materialien zum Transport des mit kolloidalen
Partikeln markierten Materials zu der Reaktionsstelle hin, an der
das Reagenz immobilisiert ist, befähigt sind. Es ist ebenfalls
offensichtlich, daß das
chromatographische Lösungsmittel
inhärent gemäß den Verfahren
nach der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 263 328 verwendet werden kann, um nicht abreagierte
markierte Materialien und andere nicht-immobilisierte Probenbestandteile
von der Reaktionsstelle, an der das Reagenz immobilisiert ist, herunter
zu waschen. Wenn das markierte Material mit dem chromatographischen
Medium an der Reaktionsstelle in Kontakt gebracht wird, an der das
Reagenz angeordnet ist, kann der chromatographische Lösungsmitteltransport
verwendet werden, um die Bindungsreaktion zwischen dem mit kolloidalen
Partikeln markierten Material und anderen spezifischen Bindungsreagenzien
zu beschleunigen, sowie auch um nicht immobilisiertes markiertes
Material aus dem Bereich herauszuwaschen.
-
Eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist diejenige, bei der die Indikatorlösung zusätzlich ein
den chromatographischen Transport erleichterndes Agens umfaßt und bei
der die Indikatorlösung
und die Probe vermischt und mit dem chromatographischen Medium in
Kontakt gebracht werden, um den chromatographischen Transport der
Analytsubstanz und des markierten spezifischen Bindungsmaterials
sicher zu stellen.
-
Gemäß anderen Ausführungsformen,
können
das Probenmaterial und das mit kolloidalen Partikeln markierte Material
mit einer oder mehreren Reaktionsstellen auf der Assayvorrichtung
stromaufwärts
der Reaktionsstelle, an der das Reagenz immobilisiert ist, in Kontakt
gebracht werden, und das chromatographische Medium wird mit dem
chromatographischen Lösungsmittel
in Kontakt gebracht, um die Probe und das markierte Material in
der Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden
Agens an die Reaktionsstelle zu transportieren, an der das zweite
Reagenz immobilisiert ist.
-
Es können Assays vom Sandwichtyp
gemäß dem Verfahren
durchgeführt
werden, bei dem das mit kolloidalen Partikeln markierte Material
zur Teilnahme an einer spezifischen Bindungsreaktion mit der Analytsubstanz
befähigt
ist. Konkurenzbindungsassayverfahren können ebenfalls durchgeführt werden,
wobei das mit kolloidalen Partikeln markierte Material zur Teilnahme
an einer spezifischen Bindungsreaktion mit dem immobilisierten Reagenz
befähigt
ist. Es können
Kits hergestellt werden, und das Verfahren kann ebenfalls durchgeführt werden,
wenn das chromatographische Medium eine zweite Reaktionsstelle umfaßt, die
mit einem zweiten Reagenz imprägniert
ist, das immobilisiert ist, um dem Lösungsmitteltransport entgegen
zu wirken, und das zur selektiven Reaktion mit dem mit kolloidalen
Partikeln markierten Material befähigt ist, um letzteres an der
zweiten Reaktionsstelle in eine immobilisierte Form zu überführen, wo
es nachgewiesen werden kann. Bei Assays vom Sandwichtyp wirkt die
Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material an
der zweiten Reaktionsstelle als Kontrolle und bestätigt die
Reaktivität
des ersten Reagenz. Bei Konkurenzbindungsassays zeigt die Anwesenheit
von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material an der zweiten
Reaktionsstelle das Ausmaß der
Konkurrenz zwischen der Analytsubstanz und dem immobilisierten Reagenz
an.
-
Andere Verfahren und Vorrichtungen
werden gemäß der Erfindung
zur Verfügung
gestellt, bei denen eine getrocknete Lösung eines meta-löslichen
Proteins und eines mit kolloidalen Partikeln markierten spezifisch
bindenden Materials auf dem chromatographischen Medium einer Assayvorrichtung
eingebaut ist, wobei solche trockenen Formen zur schnellen Wiederauflösung und
zum chromatographischen Transport entlang dem Medium mittels ausgewählten chromatographischen
Lösungsmitteln
befähigt
sind. Solche auf spezifischer Bindung beruhende Assayvorrichtungen
umfassen ein chromatographisches Medium, das Kapillarität aufweist,
und das die Fähigkeit
zum chromatographischen Lösungsmitteltransport
von einem oder mehreren nicht immobilisierten Reagenzien und reaktiven
Probenbestandteilen mittels eines ausgewählten chromatographischen Lösungsmittels
aufweist. Die Vorrichtungen umfassen eine erste Reaktionsstelle,
die mit der oben genannten getrockneten Lösung eines markierten Materials
in der Anwesenheit eines meta-löslichen
Proteins imrägniert
ist, wobei das markierte Material zur schnellen Wiederauflösung und
zum chromatographischen Transport in dem Lösungsmittel befähigt ist,
und die Vorrichtungen umfassen eine zweite Reaktionsstelle, an der
ein Reagenz immobilisiert ist, das zur Bindung mit einem Glied befähigt ist,
das aus der Gruppe gewählt ist,
die aus der Analytsubstanz und dem mit kolloidalen Partikeln markierten
Material besteht. Die Vorrichtung kann verwendet werden, indem (a)
die Probe mit dem chromatographischen Medium in Kontakt gebracht
wird, (b) das mit kolloidalen Partikeln markierte Material aufgelöst wird,
und indem wenigstens ein Anteil des mit kolloidalen Partikeln markierten
Materials chromatographisch zu der zweiten Reaktionsstelle transportiert
wird, um an diese zu binden, und (c) indem die nachweisbare Antwort
bestimmt wird, die von dem mit kolloidalen Partikeln markierten
Material an der zweiten Reaktionsstelle als Anzeige für die Anwesenheit
oder Menge der Substanz in der Probe hervorgerufen wird.
-
Es ist offensichtlich, daß die zu
analysierende Probe mit dem chromatographischen Lösungsmittel
vermischt werden kann und daß das
chromatographische Medium mit der Mischung der beiden in Kontakt
gebracht werden kann. Es ist desweiteren offensichtlich, daß das chromatographische
Lösungsmittel
durch die Probe ersetzt werden kann, wobei die Probe zum Auflösen des
immobilisierten ersten Reagenzes befähigt ist und sich selbst und
das mit kolloidalen Partikeln markierte erste Reagenz zu dem zweiten
Bereich hin chromatographisch zu transportieren vermag, an dem das
zweite Reagenz angeordnet ist.
-
Eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist diejenige, bei der das chromatographische
Lösungsmittel
durch die Probe ersetzt ist, welche zur Auflösung des getrockneten mit kolloidalen
Partikeln markierten Materials und zum Transport der Analytsubstanz
und des mit kolloidalen Partikeln markierten Materials zu der zweiten
Reaktionszone hin befähigt
ist, die das immobilisierte Reagenz enthält.
-
Es können Assays vom Sandwichtyp
gemäß dem Verfahren
durchgeführt
werden, bei dem das mit kolloidalen Partikeln markierte Material
zur Teilnahme an einer spezifischen Bindungsreaktion mit der Analytsubstanz
befähigt
ist. Konkurrenzbindungsassayverfahren können ebenfalls durchgeführt werden,
bei denen das mit kolloidalen Partikeln markierte Material zur Teilnahme
an einer spezifischen Bindungsreaktion mit dem immobilisierten Reagenz
befähigt
ist. Es können
Vorrichtungen hergestellt werden, und es können auch Verfahren durchgeführt werden,
bei denen das chromatographische Medium eine dritte Reaktionsstelle
umfaßt,
die mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem
Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit dem mit kolloidalen
Partikeln markierten Material befähigt ist, um das mit kolloidalen
Partikeln markierte Material an der dritten Reaktionsstelle, an
der es nachgewiesen werden kann, in eine immobilisierte Form zu überführen. Bei
Assays vom Sandwichtyp dient die Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln
markiertem Material an der dritten Reaktionsstelle als Kontrolle
und bestätigt
die Reaktivität
des markierten Materials. Bei Konkurrenzbindungsassays zeigt die
Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem Material an
der dritten Reaktionsstelle das Ausmaß der Konkurrenz zwischen der
Analytsubstanz und den markierten Reagenz an.
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Das Assayverfahren der Erfindung
kann ebenfalls mit kolloidalen Partikeln markierte spezifische Bindungsmaterialien,
die aus labilen Proteinen bestehen, verwenden, wobei die Proteinmaterialien
mit einem meta-löslichen
Protein in einem stabilen Zustand als getrocknete Lösung dem
chromatographischen Medium der Vorrichtung der Erfindung gelagert
werden und durch die Aufgabe eines geeigneten Lösungsmittels schnell löslich gemacht
werden können.
Das Verfahren zur Herstellung eines solchen chromatographischen
Mediums umfaßt
das Trocknen des mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen
Bindungsmaterials aus labilem Protein vorzugsweise unter einem Luftstrom,
auf einem chromatographischen Medium in Anwesenheit eines wässerigen
Mediums, das ein meta-löslichen
Protein umfaßt.
Das erhaltene Produkt umfaßt
ein chromatographisches Medium, auf dem ein mit kolloidalen Partikeln
markiertes spezifisches Bindungsmaterial, das aus labilem Protein
besteht, in Gegenwart eines wässerigen
Mediums, welches ein meta-löslichen
Protein enthält,
aufimprägniert
und aufgetrocknet ist. Das chromatographische Medium ist vorzugsweise
Papier oder Nitrozellulose. Das chromatographische Medium kann in
verschiedenen Formen, wie etwa Streifen vorliegen. Die wässerige
Lösung,
die das meta-löslichen
Protein, vorzugsweise Casein, enthält, kann wahlweise andere den chromatographischen
Transport erleichternde Agenzien wie Polyethylenglykol, Gelatine,
Rinderserumalbumin und Detergenzien umfassen.
-
"Mix and Run" – Assayvorrichtungen
(Sandwichtyp)
-
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden
Erfindung können
spezifische Bindungsassays gemäß "Mix and Run"-Vorgehensweisen
durchgeführt
werden, bei denen eine Indikatorlösung, die ein mit kolloidalen
Partikeln markiertes erstes spezifisches Bindungsreagenz, das in
einem den chromatographischen Transport erleichternden Agens gelöst ist wie
oben erwähnt,
umfaßt,
mit der Analytsubstanz, die die Probe enthält, vermischt wird. Die Assayvorrichtungen
gemäß der Erfindung
werden dann in die Mischung aus Probe und Indikatorlösung eingetaucht,
welche chromatographisch zu einem ersten Bereich hin transportiert
wird, wo ein zweites Reagenz immobilisiert worden ist. Gemäß einer
Ausführungsform
eines Assayverfahren, vom Sandwichtyp sind das erste und das zweite
Reagenz zur spezifischen Bindung mit dem Analyten befähigt. Bei
dieser Ausführungsform
bindet das markierte erste Reagenz an den Analyten, nach dem die
beiden vermischt wurden. Das Konjugat aus dem markierten ersten
Reagenz und dem Analyten wird dann der Immobilisierungsreaktion
mit dem zweiten Reagenz unterworfen, wodurch indem ersten Bereich
ein visuell nachweisbares Signal erzeugt wird. In Abwesenheit von
Analyt bindet das markierte erste Reagenz nicht an den Bereich,
und es wird dort kein Signal erzeugt. Es können alternative Assayverfahren
vom Sandwichtyp durchgeführt
werden, bei denen ein drittes Reagenz, das spezifisch gegenüber dem
markierten ersten Reagenz reaktiv ist, in einem zweiten Bereich
immobilisiert ist, um eine Kontrolle sicher zu stellen. Es werden
noch andere Assayverfahren vom Konkurrenztypus und Vorrichtungen
zur Verfüngung
gestellt, bei denen das immobilisierte zweite Reagenz spezifisch
gegenüber
sowohl dem Analyten als auch dem markierten ersten Reagenz reaktiv
ist, welche um die Bindung mit dem immobilisierten Reagenz konkurrieren.
-
Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen,
zeigen die 1a, 1b und 1c eine Testvorrichtung (10)
zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, die einen Abschnitt
einer gewissen Länge
eines chromatographischen Substratmaterials (11) umfaßt, das
ein erstes Ende (14) aufweist, an dem der chromatographische
Transport einsetzt und ein zweites Ende (15) an dem der
chromatographische Transport aufhört, und einen ersten Bereich
(13), der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist,
das entgegen dem Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit dem Analyten
befähigt
ist, so daß der
Analyt in eine immobilisierte Form überführt zu werden vermag. Die Vorrichtung
umfaßt
desweiteren einen inerten Trägerstreifen
(12), an dem das Stück
einer gewissen Länge
chromatographischen Materials (11) angebracht ist.
-
Gemäß einem Verfahren zur Verwendung
der Vorrichtung (10) wird eine Menge der zu testenden Probe
mit einer Indikatorlösung
vermischt, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz
und ein den chromatographischen Transport erleichterndes Agens wie
oben beschrieben umfaßt.
Die Menge und die Konzentration des den chromatographischen Transport
erleichternden Agens in der Indikatorlösung, die zu der Probe zugegeben
wird, ist derart ausgewählt,
daß sie
die Aggregation verhindert und für
einen schnellen chromatographischen Transport des mit kolloidalen
Partikeln markierten spezifischen Bindungsreagenzes sorgt. Bei "Mix and Run"-Assays vom Sandwichtyp
reagiert das markierte erste Reagenz derart, daß es spezifisch an den Analyten
bindet. Die Testvorrichtung (10) wird dann an ihrem ersten
Ende (14) in einen Behälter
(16) eingetaucht, der die Mischung aus Probe und Indikatorlösung (17)
enthält
und die Probe/Indikatorlösungsmischung,
die das erste markierte Reagenz/Analyt-Konjugat enthält, schreitet
durch das chromatographische Material (11) bis zum ersten
Bereich (13) hinfort. Das zweite spezifisch bindende Reagenz,
das in dem ersten Bereich (13) immobilisiert ist, ist ebenfalls
spezifisch gegenüber
dem Analyten reaktiv und reagiert mit dem Analyten oder mit dem
erstes Reagenz/Analyt-Konjugat, um dieselben in dem ersten Bereich
(13) zu immobilisieren. Der chromatographische Lösungsmitteltransport
ist jedoch derart, daß das
markierte erste Reagenz, das nicht an den Analyten konjugiert ist,
zusammen mit anderen Probenmaterialien und mit Materialien aus der
Indikatorlösung,
die nicht in dem ersten Bereich (13) immobilisiert werden,
von diesem Bereich wegtransportiert wird. Der chromatographische
Lösungsmitteltransport
hält an,
bis die Probe/Indikatorlösungsmischung erschöpft ist,
oder bis die Probe/Indikatorlösungsmittelfront
das zweite Ende (15) der Vorrichtung erreicht.
-
Der in einer Probe vorhandene Analyt
bindet an das markierte erste Reagenz und wird chromatographisch
zum ersten Bereich (13) hin transportiert, wo er durch
eine spezifische Bindungsreaktion mit einem zweiten Reagenz immobilisiert
wird. Wenn ausreichend Analyt in einer Probe vorhanden ist, ist
die Anzahl kolloidaler Partikel, die in dem ersten Bereich (13)
immobilisiert werden, derart, daß ein visuell nachweisbares
Signal hervorgerufen wird. Natürlich
wird, wenn kein Analyt in der Probe vorhanden ist, weder Analyt
noch markiertes erstes Reagenz in dem ersten Bereich immobilisiert,
und es wird kein Signal erzeugt.
-
"Mix and Run" – Assayvorrichtungen
(Konkurrenztyp)
-
Die Vorrichtung (10) gemäß 1 kann ebenfalls abgewandelt
werden, um spezifische Bindungsassays vom Konkurrenztyp durchzuführen. Insbesondere
kann das mit kolloidalen Partikeln markierte erste Reagenz ausgewählt sein,
um mit dem Analyten um die Bindung an das immobilisierte zweite
Reagenz zu konkurrieren. Unter Bezugnahme auf die Zeichnung zeigt
die 1 eine Testvorrichtung
zur Durchführung
von "Mix and Run" – Assays vom Konkurrenztyp.
Die Vorrichtung selbst und die Art des immobilisierten zweiten Reagenzes
sind bei dem Assay vom Konkurrenztyp dieselben wie bei dem Assay
vom Sandwichtyp. Der einzige Unterschied bei den Assaykits liegt
in der Art des mit kolloidalen Partikeln markierten ersten Reagenzmaterials.
Bei den Assaykits gemäß der Erfindung
vom Sandwichtyp ist das erste markierte Reagenz spezifisch gegenüber dem
Analyten reaktiv, während
bei Assays vom Konkurrenz-Typ das markierte erste Reagenz ein zu
spezifischer Bindung befähigtes
Analogon des zu untersuchenden Analyten ist und spezifisch gegenüber dem
immobilisierten zweiten Reagenz in Konkurrenz mit dem Analyten reaktiv
ist.
-
Gemäß einer Vorgehensweise zur
Verwendung der Vorrichtung (10) wird eine Menge der zu
testenden Probe mit einer Indikatorlösung vermischt, die ein mit
kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz in Anwesenheit eines
den chromatographischen Transport erleichternden Agens wie oben
erwähnt
umfaßt.
Die Testvorrichtung (10) wird dann an ihrem ersten Ende
(14) in einen Behälter
(16) eingetaucht, der mit der Mischung aus Probe und Indikatorlösung (17)
gefüllt
ist. Die Proben/Indikatorlösungsmischung,
die das markierte erste Reagenz und den Analyt enthält, schreitet
durch das chromatographische Substratmaterial (11) hinweg zum
ersten Bereich (13) hin fort. Das markierte erste Reagenz
und der Analyt konkurrieren dann um die Bindung an das zweite spezifische
Bindungsreagenz, das in dem ersten Bereich (13) immobilisiert
ist. Der chromatographische Lösungsmitteltransport
ist jedoch derart, daß Analyt
und mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenzmaterial,
die nicht spezifisch an das immobilisierte zweite Reagenz binden,
aus dem ersten Bereich (13) durch das chromatographische
Lösungmittel
entfernt werden. Der chromatographische Lösungsmitteltransport dauert
an, bis die Menge an Probe/Indikatorlösung erschöpft ist, oder bis die Lösungsfront
das zweite Ende (15) der Vorrichtung erreicht.
-
Die Menge an Analyt, die in der Probe
vorhanden ist, bestimmt die Menge an markiertem ersten Reagenz,
daß an
den ersten Bereich (13) bindet. Die Menge und/oder die
Bindungsaffinität
des markierten ersten Reagenzes kann eingestellt werden, um die
Menge an in der Probe vorhandenem Analyt zu bestimmen.
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Alternatives "Mix and Run" Sandwichassay
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung werden Assayvorrichtungen und Kits zur Durchführung von
Assays vom Sandwichtyp bereitgestellt, welche eine Kontrollfunktion
umfassen und welche ein positives oder negatives Signal zum Nachweis
eines besonderen Analyten liefern. Unter Bezugnahme auf die Zeichnung
zeigt die 2 eine Testvorrichtung
(20), die eine bestimmte Länge eines chromatographischen Substratmaterials
(21) umfaßt,
die ein erstes Ende (25) aufweist, an dem der chromatographische
Lösungsmitteltransport
einsetzt, und ein zweites Ende (26) an dem der chromatographische
Lösungsmitteltransport
endet. Die Vorrichtung umfaßt
ebenfalls einen ersten Bereich (23), der abgetrennt und
in zwei oder mehrere Flächenbereiche
aufgetrennt sein kann, und der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist,
das entgegen dem Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit dem Analyten
befähigt
ist, so daß der
Analyt in eine immobilisierte Form überführt wird. Die Vorrichtung (20)
umfaßt
ebenfalls einen zweiten Bereich (24), der mit einem dritten
Reagenz imprägniert
ist, das entgegen dem Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist, und das zur selektiven Reaktion mit dem mit kolloidalen
Partikeln markierten ersten Reagenz befähigt ist.
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Der erste und der zweite Bereich
(23) und (24) können derart geformt sein, daß sie ein
Signal von unterscheidbarer Form liefern, wenn einer, aber nicht
der andere, oder wenn beide ein immobilisiertes Reagenz umfassen.
Zum Beispiel sind die Formen des ersten und des zweiten Reakionsbereiches
(23) und (24) in 2 derart,
daß wenn
die Markierung in dem zweiten Bereich (24) immobilisiert
wird, nur ein Minuszeichen (–)
angezeigt wird. Wenn auf der anderen Seite die Markierung sowohl
in dem ersten Bereich (23) als auch in dem zweiten Bereich
(24) immobilisiert wird, wird ein Pluszeichen (+) angezeigt.
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Es wird bevorzugt, daß der erste
Bereich, der mit einem Reagenz imprägniert ist, das spezifisch
gegenüber
dem nachzuweisenden Analyten reaktiv ist, im wesentlichen senkrecht
zur Richtung des chromatographischen Flusses angeordnet ist. Der
Grund dafür
ist, daß der
Analyt und in folgedessen das markierte spezifische Bindungsreagenz
dazu neigen, eher an dem vorderen als an dem hinteren Rand des Bereiches
immobilisiert zu werden. Wenn ein länglicher Bereich in seiner
größeren Ausdehnung
parallel zur Richtung des chromatographischen Flusses angeordnet
ist, fängt
der vordere Anteil des Bereiches, die Mehrheit des Analyten ein,
was dazu führt,
daß das
hintere Ende nur wenig Analyt einfängt und daß das resultierende sichtbare Signal
eine Form hat, die leicht mißverstanden
werden kann. Wenn der erste Bereich rechtwinkelig zur Richtung des
chromatographischen Flusses angeordnet wird, wird ein stärkeres und
unterscheidungskräftigeres positives
Nachweissignal erzeugt.
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Gemäß einem Verfahren zur Verwendung
der Vorrichtung (20) wird eine Menge der zu testenden Probe
mit einer Indikatorlösung
vermischt, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz
in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden
Agens wie oben erwähnt
umfaßt.
Die Testvorrichtung (20) wird dann an ihrem ersten Ende
(25) in einen Behälter
(27) eingetaucht, der eine Mischung von Probe und Indikatorlösung (28)
enthält
und die Probe/Indikatorlösung,
die das markierte erste Reagenz/Analyt-Konjugat enthält, schreitet
durch das chromatographische Material (21) zu dem ersten
(23) und dem zweiten (24) Bereich hin fort. Das
immobilisierte zweite Reagenzmaterial in dem ersten Bereich (23)
ist gegenüber
dem Analyten spezifisch reaktiv und es immobilisiert den Analyten,
wie auch jegliches Analyt/markiertes erstes Reagenz – Konjugat.
Zusätzlich
ist das immobilisierte dritte Reagenzmaterial in dem zweiten Bereich
(24) gegenüber
dem markierten ersten Reagenz spezifisch reaktiv und immobilisiert
das erste Reagenz, wie auch jegliches Analyt/markiertes erstes Reagenz – Konjugat.
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Wenn in der Probe Analyt vorhanden
ist, bildet sich in der Mischung aus der Indikatorlösung und
der Probe ein Analyt/markiertes erstes Reagenz – Konjugat, und das Konjugat
wird sowohl in dem ersten (23) als auch in dem zweiten
(24) Bereich immobilisiert und infolge dessen wird gemäß einer
Ausführungsform
ein Pluszeichen (+) und ein positives Signal erzeugt. Wenn kein
Analyt oder weniger als eine Schwellenwertmenge in der Probe vorhanden
ist, reagiert das erste Reagenz mit dem dritten Reagenz in dem zweiten
Bereich (24) und wird in diesem Bereich immobilisiert,
wobei ein visuelles Signal erzeugt wird. Da kein Analyt vorhanden
ist, wird in dem ersten Bereich (23) nichts immobilisiert,
und es wird kein Signal erzeugt und infolgedessen erscheint nur
ein Minuszeichen (–),
wodurch die Abwesenheit von Analyt angezeigt wird. Die Anwesenheit
des Signals in dem zweiten Bereich (24), nicht aber in
dem ersten (23), zeigt zusätzlich zur Anzeige der Abwesenheit
von Analyt die Mobilität
des ersten markierten Reagenzes an und dient als Kontrolle bezüglich der
Nützlichkeit
der Assayvorrichtung.
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Alternatives "Mix and Run" Assay (Konkurrenztyp)
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung werden Assayvorrichtungen und Kits zur Durchführung eines "Mix and Run"-Assays vom Konkurrenztyp
zur Verfügung
gestellt, welche einen ersten Bereich umfassen, der mit einem zweiten
Reagenz imrägniert
ist, das spezifisch gegenüber
dem nachzuweisenden Analyten und dem mit kolloidalen Partikeln markierten
ersten Reagenz reaktiv ist, und welche einen oderer mehreren zweite
Bereiche umfassen, die mit einem dritten Reagenz imprägniert sind,
das gegenüber
dem markierten ersten Reagenz, nicht aber gegenüber dem Analyten spezifisch
reaktiv ist.
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Unter Bezugnahme auf die Zeichnung
zeigen die 3a, 3b und 3c eine Testvorrichtung (30)
zum Nachweis eines Analyten in einer Probenflüssigkeit (40). Die
Vorrichtung (30) umfaßt
eine bestimmte Länge eines
chromatographischen Substratmaterials (31) mit einem ersten
Ende (33), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport
einsetzt und mit einem zweiten Ende (34) (welches nicht
notwendigerweise das zweite physikalische Ende des Streifens ist),
an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport
endet. Die Vorrichtung (30) umfaßt desweiteren einen ersten
Bereich (35), der mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist,
das entgegen dem Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist und das zur selektiven Reaktion mit einem Glied
der Gruppe befähigt
ist, die aus dem Anaylten und einem mit kolloidalen Partikeln markierten
ersten Reagenz besteht. Stromabwärts
des ersten Bereiches (35) befindet sich der zweite Bereich
(36), der wahlweise mehr als einen Flächenbereich umfassen kann,
und welcher mit einem dritten Reagenz imprägniert ist, das entgegen dem
Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist, und das gegenüber
dem markierten ersten Reagenz, nicht aber gegenüber dem Analyten spezifisch
reaktiv ist. Die Vorrichtung umfaßt ebenfalls eine rechte Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(37) und eine linke Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(38), die den chromatographischen Materialfluß vom ersten
Ende (33) zu dem ersten Bereich (35) und dem zweiten
Bereich (36) hin konzentrieren. Die Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(37) und (38) verlängern desweiteren das chromatographische
Substratmaterial (31), indem sie einen ausgedehnten chromatographischen
Transportweg zum zweiten Ende (34) hin zur Verfügung stellen.
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Gemäß einem Verfahren zur Verwendung
der Vorrichtung (30) wird eine Menge der zu testenden Probe
mit einer Indikatorlösung
vermischt, die ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes Reagenz
in Anwesenheit eines den chromatographischen Transport erleichternden
Agens wie oben erwähnt
umfaßt.
Das erste Reagenz ist ein spezifisch bindendes Analogon des zu untersuchenden
Analyten und es ist spezifisch gegenüber dem immobilisierten zweiten
Reagenz in dem ersten Bereich (35) reaktiv. Die Testvorrichtung
(30) wird dann an ihrem ersten Ende (33) in einen
Behälter
(39) getaucht, der mit der Mischung (40) aus Probe
und Indikatorlösung
gefüllt
ist. Die Probe/Indikatorlösungs-Mischung,
die das markierte erste Reagenz und den Analyten enthält, schreitet
entlang dem chromatographischen Material (31) zu dem ersten
Bereich (35) hin fort. Das mit kolloidalen Partikeln markierte
erste Reagenz und der Analyt konkurrieren dann um die Bindung mit dem
zweiten spezifisch bindenden Reagenz, das in dem ersten Bereich
(35) immobilisiert ist. Der chromatographische Lösungsmitteltransport
verläuft
jedoch derart, daß Analyt
und markiertes erstes Reagenzmaterial, die nicht spezifisch an das
immobilisierte zweite Reagenz binden, aus dem ersten Bereich (35)
durch das chromatographische Lösungsmittel
entfernt und in Richtung auf das zweite Ende hin (34) und
zum zweiten Bereich oder zu den zweiten Bereichen (36)
hin transportiert werden. Das markierte erste Reagenz, das ein von
der Maus abgeleiteter Antikörper
gegen das zweite Reagenz sein kann, wenn der nachzuweisende Analyt
ein humaner Antikörper
gegen das zweite Reagenz ist, reagiert dann mit dem dritten Reagenz
(das aus anti-Maus-IgG-Antikörpern bestehen
kann), welches in dem zweiten Bereich (36) immobilisiert
ist, und welches gegenüber
dem markierten ersten Reagenz, nicht aber gegenüber dem Analyten spezifisch
reaktiv ist. Das dritte Reagenz reagiert mit dem markierten ersten
Reagenz, wodurch es in dem zweiten Bereich (36) immobilisiert
wird und ein nachweisbares Signal erzeugt. Die Vorrichtung kann
wahlweise zusätzliche "zweite Bereiche" umfassen, so daß wenn ein Überschuß an markiertem
ersten Reagenz mit Probenmaterial vermischt wird und wenn markiertes
erstes Reagenz teilweise oder völlig
aus der Bindung an den ersten Bereich (35) verdrängt wird,
dann das Ausmaß der
Verdrängung
aus dem Ausmaß an
Bindung an die zweiten Bereiche (36) ermittelt werden kann.
Der chromatographische Lösungsmitteltransport
hält an
und die Probe/Indikatorlösung schreitet
entlang der Vorrichtung fort, bis die Menge an Proben/Indikatorlösung erschöpft ist,
oder bis die Lösungsfront
um die rechte (37) und die linke (38) Lösungsmittelbarriere
herum fortschreitet und das zweite Ende (34) der Vorrichtung
erreicht.
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Vorrichtungen, die mit
markierten spezifischen Bindungsmaterial vorimprägniert sind
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Ein alternativer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft Vorrichtungen für Assays, die auf spezifischer
Bindung beruhen, bei denen eine Lösung von mit kolloidalen Partikeln
markierten spezifischen Bindungsreagenzien, die zu chromatographischem
Lösungsmitteltransport
befähigt
sind und ein meta-lösliches Protein
auf die chromatographischen Substratmaterialien der Vorrichtungen
aufimprägniert
und aufgetrocknet werden. Es ist überraschend herausgefunden
worden, daß das
Trocknen der mit kolloidalen Partikeln markierten spezifischen Bindungsreagenzmaterialien
in Anwesenheit von meta-löslichen
Proteinen, wie etwa Casein, nicht nur für den schnellen chromatographischen
Lösungsmitteltransport
von markierten Materialien sorgt, sondern auch für die schnelle Wiederauflösung solcher
markierter Materialien, die auf die chromatographischen Substratmaterialien
aufimprägniert
und aufgetrocknet sind. Die markierten Reagenzien, die derart wiederaufgelöst werden,
sind zum wirksamen Transport mittels herkömmlicher chromatographischer
Lösungsmittelsysteme
und zur Reaktion in den spezifischen Bindungsassays befähigt.
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Die Fähigkeit zu Imprägnierung
chromatographischer Substratmaterialien mit den markierten spezifischen
Bindungsreagenzien, die dann wieder aufgelöst werden können, ermöglicht die Durchführung einer
Vielzahl von Assayverfahren, die die Verwendung von Schritten der
Zugabe von markiertem Reagenz vermeiden. Sowohl Assays vom Sandwichtyp
als auch solche vom Konkurrenztyp können unter Verwendung der Kits
und Streifen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
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Sandwichassay-Vorrichtung
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Unter Bezugnahme auf die Zeichnung
zeigen die 4a, 4b und 4c eine Testvorrichtung (50)
zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei ein mit kolloidalen
Partikeln markiertes erstes Reagenz und ein meta-lösliches
Protein auf die Vorrichtung (50) aufimprägniert und
aufgetrocknet sind. Die Vorrichtung (50) umfaßt eine
bestimmte Länge
eines chromatographischen Substratmaterials (51) mit einem
ersten Ende (54), an dem der chromatographische Lösungsmitteltransport
einsetzt und mit zweiten Enden (58), an denen der chromatographische
Transport endet. Die Länge
des Materials (51) umfaßt einen ersten Bereich (55)
und einen zweiten Bereich (56) und einen dritten Bereich
(57).
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Zwischen dem ersten Ende (54)
und dem ersten Bereich (55) befindet sich eine Verzögerungsbox,
die durch eine Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(60) rechts vorne, eine Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(61) links vorne und eine querverlaufende Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(62) definiert wird. Die Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(60) rechts vorne und die rechte Kante (63) des
Materials definieren einen rechtsseitigen chromatographischen Lösungsmitteltransportweg
und die Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(61) links vorne und der linke Rand (64) des Materials
definieren einen linksseitigen chromatographischen Lösungsmitteltransportweg.
Der rechtsseitige und der linksseitige chromatographische Lösungsmitteltransportweg
treffen einander stromabwärts
des ersten Bereiches (55) und der Verzögerungsbox unter Ausbildung
eines mittleren chromatographischen Transportweges, indem sich der
zweite (56) und der dritte (57) Bereich befinden,
die durch eine rechtsrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(65) und eine linksrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(66) definiert werden. Stromabwärts des dritten Bereiches (57),
definieren die rechtsrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(65) und die rechte Kante (63) und die linksrückwärtige Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(66) und die linke Kante (64) einen chromatographischen
Lösungsmitteltransportweg
der zu den zweiten Enden (58) führt, an denen der chromatographische
Lösungsmitteltransport
endet.
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Der erste Bereich (55) ist
mit einem meta-löslichen
Protein und einem mit kolloidalen Partikeln markierten ersten spezifischen
Bindungsreagenz imprägniert,
das in einem chromatographischen Lösungsmittel (68) mobil
ist, und das zur Reaktion mit und zur Immobilisierung gegen Lösungsmitteltransport,
durch den Analyten befähigt
ist, wenn der Analyt in immobilisierter Form vorliegt. Der zweite
Bereich (56) befindet sich stromabwärts des ersten Bereiches (55)
und liefert eine geeignete Stelle zur Aufnahme der Probe, die analysiert werden
soll. Der dritte Bereich (57) befindet sich stromabwärts des
zweiten Bereiches (56) und ist mit einem zweiten Reagenz
imprägniert,
das entgegen dem Lösungsmitteltransport
immobilisiert ist, und daß zur
selektiven Reaktion mit dem Analyten befähigt ist, um den Analyten in
eine immobilisierte Form, zu überführen. Die Vorrichtung
umfaßt
desweiteren einen inerten Trägerstreifen
(52), an den ein Längenabschnitt
von chromatographischem Substratmaterial (51) angebracht
ist. Die Vorrichtung umfaßt
zusätzlich
eine Deckplatte (53), die wahlweise durchsichtig sein kann,
und die oberhalb des Längenabschnittes
des chromatographischen Materials (51) angebracht werden
kann, wobei das erste Ende (54) des Materials freigelassen
wird. Die Deckplatte (53) definiert eine Öffnung,
die dem zweiten Bereich (56) entspricht und diesen frei
läßt. Ein
entfernbarer Deckel (59) deckt den zweiten Bereich (56)
ab.
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Gemäß einem Verfahren zur Verwendung
der Vorrichtung (50) der 4a, 4b und 4c, wird der erste Deckel (59)
von der Vorrichtung (50) entfernt, eine Probe des zu testenden
Materials wird auf den zweiten Bereich (56) aufgegeben,
und der entfernbare Deckel (59) wird wieder aufgesetzt.
Die Vorrichtung (50) wird dann an ihrem ersten Ende (54)
in einen Behälter
(67) von chromatographischem Lösungsmittel (68) eingetaucht. Das
chromatographische Lösungsmittel
(48) schreitet dann entlang dem Längenabschnitt des chromatographischen
Materials fort, wobei es entlang dem rechtsseitigen und dem linksseitigen
chromatographischen Lösungsmitteltransportweg
zum mittleren chromatographischen Transportweg hin schreitet. Ein
Teil des Lösungsmittels
wird aufwärts
in Richtung auf den zweiten Bereich (56) hin transportiert,
während
ein anderer Teil des Lösungsmittels
abwärts
zum ersten Bereich (55) hin transportiert wird, wo es das
erste markierte Reagenz auflöst.
Ein Teil des chromatographischen Lösungsmittels (68)
von dem ersten Ende (54) tritt zwischen der rechtsvorwärtigen Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(60) und der linksvorwärtigen
Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(61) hindurch in die Verzögerungsbox hinein. Das chromatographische
Lösungsmittel
fließt
um die querverlaufende Lösungsmittelbarrierenvorrichtung
(62) herum, die dessen Fluß verzögert, bevor es zum ersten Bereich
(55) hin transportiert wird. Das markierte erste Reagenz
im ersten Bereich ist bereits von dem Lösungsmittel aus dem rechts-
und linksseitigen Lösungsmitteltransportweg
aufgelöst
worden, und das Lösungsmittel,
das durch die Verzögerungsbox
fortschreitet, beginnt, das erste Reagenz zu dem zweiten Bereich
(56) hin zu transportieren, sobald es das aufgelöste erste
Reagenz erreicht. Das chromatographische Lösungsmittel (68),
das durch den rechtsseitigen und den linksseitigen Lösungsmitteltransportweg
hindurch transportiert worden ist gerät dann mit der Probe in Kontakt,
die auf den zweiten Bereich (56) aufgegeben worden ist
und transportiert die Probe zu dem dritten Bereich (57).
Dort reagiert das immobilisierte zweite Reagenzmaterial selektiv
mit dem Analyt, der in der Probe vorhanden ist, wobei dieser immobilisiert
wird. Nicht-Analytkomponenten
der Proben werden von dem dritten Bereich (57) wegtransportiert.
Das markierte erste Reagenz wird dann zu dem dritten Bereich (57)
hintransportiert, wo es entgegen dem chromatographischen Lösungsmitteltransport
durch den Analyten immobilisiert wird, sofern der Analyt in immobilisierter
Form vorliegt. Der chromatographische Lösungsmitteltransport der an
Analyt verarmten Probe und des ersten Reagenzes hält an, bis das
chromatographische Lösungsmittel
(68) das zweite Ende (58) des Materials erreicht
hat.
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Eine Vielzahl von Assayvorrichtungen
von Sandwichtyp, die mit kolloidalen Partikeln markierte getrocknete
Reagenzien umfassen, können
gemäß der Erfindung
hergestellt werden. Es ist oft wünschenswert, verfrühten Kontakt
des Analyten und der Probenmaterialien mit den Reagenzien und den
Kontakt der Reagenzien untereinander zu vermeiden. Daher können die
relative Mobilität
der Probenbestandteile und der verschiedenen Reagenzien oder das
topologische Verhältnis
zwischen den Bereichen derart ausgewählt werden, daß die Reagenzien
und die Probenbestandteile sich nur zu den gewünschten Zeitpunkten und an
den gewünschten
Stellen vermischen. Die Europäische
Patentanmeldung Nr. 262 328 offenbart verschiedene Verfahren und
Vorrichtungen zur Durchführung
chromatographischer Lösungsmitteltransportassays,
bei denen es erwünscht
ist, den Kontakt eines markierten ersten Reagenzmaterials (wie etwa
eines antihuman-Immunglobulin-Antikörpers) mit Probenmaterial (wie
etwa Serum) vor dem Zeitpunkt zu vermeiden, zu dem der Analyt-Antikörper entgegen
dem Lösungsmitteltransport
in einem Reaktionsbereich immobilisiert ist, und zu dem andere nicht-Analyt-Antikörper, die
in der Serumprobe enthalten sind, von dem dritten Bereich durch
chromatographischen Lösungsmitteltransport
entfernt worden sind. Die Verwendung von Beschleunigungs- und Verzögerungswegen,
kann ebenfalls insbesondere zur Verhinderung des Eintrocknens der
Probenmaterialien oder anderer Reagenzien verwendet werden.
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Konkurrenzassayvorrichtung
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Die Assayvorrichtungen der vorliegenden
Erfindung, die auflösbare
spezifische Bindungsreagenzien umfassen, sind ebenfalls für die Durchführung von
Assays vom Konkurrenzbindungstyp geeignet. Gemäß solchen Verfahren wird, wie
in einem Assay vom Sandwichtyp, das immobilisierte zweite Reagenz
ausgewählt, so
daß es
spezifisch an den interessierenden Analyten bindet. Das markierte
erste Reagenz ist jedoch so ausgewählt, daß es ein spezifisches Bindungsanalogon
des Analyten darstellt, das konkurrierend an das immobilisierte zweite
Reagenz bindet. Bei der Durchführung
von Assays vom Konkurrenztyp gemäß der Erfindung
ist es allgemein nicht nötig,
daß der
Analyt und das mit kolloidalen Partikeln markierte Reagenz an dem
Kontakt miteinander vor ihrem In-Kontakt-Bringen mit dem immobilisierten
zweiten Reagenz gehindert werden. Daher kann die Vorrichtung so
ausgelegt werden, daß die
den Analyt enthaltende Probe und das markierte erste Reagenz vermischt
werden. Natürlich
kann die Vorrichtung, wenn es denn erwünscht ist, so ausgelegt werden, daß der Kontakt
der Probe und der markierten ersten Reagenzien verhindert wird,
bis zu dem Zeitpunkt, zu dem sie mit dem immobilisierten zweiten
Reagenz in Kontakt geraten sind.
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Unter Bezugnahme auf die Zeichnung
zeigen die 5a, 5b und 5c eine Testvorrichtung (70)
zur Durchführung
konkurrierender Bindungsassays zum Nachweis eines Analyten in einer
Probe, bei denen ein mit kolloidalen Partikeln markiertes erstes
Reagenz in Anwesenheit eines meta-löslichen Proteins auf die Vorrichtung
(70) aufimprägniert
und aufgetrocknet wird. Die Vorrichtung (70) umfaßt einen
Längenabschnitt
eines chromatographischen Substratmaterials (71) mit einem
ersten Ende (74), an dem der chromatographische Transport
einsetzt und einem zweiten Ende (77), an dem der chromatographische
Lösungsmitteltransport
endet. Der Längenabschnitt
des Materials (71) umfaßt einen ersten Bereich (75)
und einen zweiten Bereich (76). Der erste Bereich ist mit
einem markierten ersten Reagenz in Anwesenheit eines anti-Aggregationspuffers
imprägniert,
der ein meta-lösliches
Protein enthält.
Der zweite Bereich (76) befindet sich stromabwärts des
ersten Bereiches (75) und ist mit einem zweiten Reagenz
imprägniert,
das zur selektiven Bindungsreaktion sowohl mit dem Analyten als
auch mit dem ersten markierten Reagenz fähig ist, so daß der Analyt
und das markierte erste Reagenz in eine immobilisierte Form überführt werden.
Die Vorrichtung umfaßt
desweiteren einen inerten Trägerstreifen
(72), an dem ein Längenabschnitt
von chromatographischem Substratmaterial (71) angebracht ist.
Die Vorrichtung umfaßt
zusätzlich
eine Deckplatte (73), die oberhalb des Längenabschnittes
des chromatographischen Substratmaterials (71) angebracht
wird, und die das erste Ende (74) des Materials offen läßt. Die
Deckplatte (73) definiert eine Öffnung, die dem ersten Bereich
(75) entspricht und diesen freiläßt, welcher mit einem entfernbaren
Deckel (78) bedeckt wird.
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Gemäß einer Vorgehensweise zur
Verwendung der Vorrichtung (70) nach den 5a, 5b und 5c wird der Deckel (78)
von der Vorrichtung (70) entfernt und eine zu testende
Materialprobe wird auf den ersten Bereich (75) aufgegeben,
und der Deckel (78) wird wieder aufgesetzt. Die Vorrichtung
(70) wird dann an ihrem ersten Ende (74) in einen
Behälter
(79) eingetaucht, der chromatographisches Lösungsmittel
(80) enthält.
Das chromatographische Lösungsmittel
(80) schreitet dann entlang dem Längenabschnitt des chromatographischen
Substratmaterials (71) fort, wobei es das markierte erste
Reagenz, daß auf
den ersten Bereich (75) aufimprägniert ist, und die Probe,
die dort aufgebracht wurde, zu dem zweiten Bereich (76)
hin tranportiert. Dort konkurrieren der Analyt und das markierte
erste Reagenz, um die Bindung an das immobilisierte zweite Reagenz
dem gegenüber
sie beide spezifisch reaktiv sind. Nicht Analytbestandteile, wie
auch ungebundener Analyt und erstes Reagenzmaterial werden von dem
zweiten Bereich (76) mittels des chromatographischen Lösungsmitteltransportes
wegtransportiert, wobei der chromatographische Lösungsmitteltransport anhält, bis das
chromatographische Lösungsmittel
erschöpft
ist, oder bis die Lösungsmittelfront
das zweite Ende (77) des Materials erreicht. Nach Beendigung
des chromatographischen Lösungsmitteltransportes
kann der zweite Bereich (76) direkt betrachtet werden,
um die Anwesenheit von mit kolloidalen Partikeln markiertem ersten
Reagenz, das an dieser Stelle immobilisiert wurde, zu bestimmen.
Die Anwesenheit von markiertem ersten Reagenz an dieser Stelle kann
zu der Anwesenheit von Analyt in der Probe in Beziehung gesetzt
werden.
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Beschreibung
der kolloidalen Partikel
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Die vorliegende Erfindung ist auf
Mittel gerichtet, um die chromatographischen Transporteigenschaften
von kolloidalen Partikeln, die in spezifischen Bindungsassays verwendet
werden, zu verbessern. Die kolloidalen Partikel, die im Zusammenhang
mit den Verfahren, Kits und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können,
sind solche, wie sie allgemein bei spezifischen Bindungsassays verwendet
werden können.
Insbesondere gut bekannt ist die Verwendung kolloidaler Metallpartikel
und besonders kolloidalen Goldes zur Durchführung von Immunoassays. Andere
kolloidale Partikel, wie polymerisierte Farbstoffpartikel, die ebenfalls
als Markierungen in spezifischen Assayverfahren, wie etwa denjenigen
von Hirschfeld, U.S. Patent Nr. 4 166 105 und Henry, U.S. Patent
Nr. 4 452 886 verwendet werden können,
können
nun ebenfalls in spezifischen Bindungsassays verwendet werden, die
den chromatographischen Transport anwenden. Insbesondere bevorzugte
Markierungen aus kolloidalen Partikeln zur Verwendung mit der vorliegenden
Erfindung umfassen nicht metallische Partikel wie Selen, Tellur
und Schwefel, wobei Selen besonders bevorzugt wird.
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Die kolloidalen Partikel, die als
Markierungen gemäß der Erfindung
geeignet sind, umfassen solche, die an spezifische Bindungsreagenzien
konjugiert werden können,
ohne daß die
Aktivität
solcher Reagenzien oder anderer Reagenzien oder Analyten beeinträchtigt wird.
Die Partikel müssen
nachweisbar sein und vorzugsweise ein visuell nachweisbares Signal
erzeugen, wenn sie in relativ niedrigen Konzentrationen vorhanden
sind. Partikel, deren Größe von ungefähr 1 nm
(Nanometer) bis ungefähr
200 nm im Durchmesser reicht, sind allgemein geeignet, obwohl sowohl
größere als
auch kleinere Partikel ebenfalls zur Verwendung gemäß der Erfindung
geeignet sind. Die Verfahren der Erfindung sind insbesondere bei
Partikeln nützlich,
die größer als
ungefähr
1 nm im Durchmesser sind, und die im Hinblick auf die Aggregation
besonders empfindlich sind. Partikel, die größer als ungefähr 200 nm
sind, neigen dazu, eine verminderte Mobilität aufzuzeigen, und sie können sogar
in Anwesenheit des den chromatographischen Transport erleichternden
Agens der vorliegenden Erfindung zum Ausfallen aus der Suspension
neigen. Partikel, die wesentlich größer sind, weisen auch eine durch
die Porengröße des chromatographischen
Transportmaterials eingeschränkte
Transportfähigkeit
auf. Partikel, die kleiner als ungefähr 1 nm sind, neigen dazu, überlegene
chromatographische Mobilität
gegenüber größeren Partikeln
aufzuweisen, und in einigen Fällen
benötigen
sie nicht die Verwendung der den chromatographischen Transport erleichternden
Agenzien der vorliegenden Erfindung. Nicht desto trotz neigen die
Partikel, die kleiner als ungefähr
1 nm sind zur Lieferung schwächerer
Signale und sind daher zur Verwendung in Assayverfahren weniger
geeignet.
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Kolloidale Metallpartikel sind als
Markierungen gemäß der vorliegenden
Erfindung besonders geeignet und umfassen solche Partikel, die Metalle
oder Metallverbindungen umfassen, einschließlich Metalloxiden, Metallhydroxyden
oder Metallsalzen. Solche Partikel schwanken allgemein im Durchmesser
von ungefähr
1 nm bis ungefähr
200 nm, wobei Partikel mit einem Durchmesserbereich zwischen ungefähr 40 nm
bis ungefähr 80
nm besonders bevorzugt werden. Die Partikel können reines Metall oder Metallverbindungen
umfassen, aber sie können
ebenfalls Polymerkerne umfassen, die mit Metall oder mit Metallverbindungen
beschichtet sind. Von solchen Partikeln ist offenbart, daß sie Eigenschaften
aufweisen, die denjenigen der Partikel ähnlich sind, die reines Metall
oder Metallverbindungen umfassen. Geeignete Metalle und Metallverbindungen
umfassen solche, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus den Metallen
Platin, Gold, Silber und Kupfer besteht und aus den Metallverbindungen
Silberjodid, Silberbromid, Kupferhydroxid, Eisenoxid, Eisenhydroxid
oder hydratisiertem Oxid, Alluminiumhydroxid oder hydratisiertem
Oxid, Chromhydroxid oder hydratisiertem Hydroxid, Bleisulfid, Quecksilbersulfid,
Bariumsulfat und Titandioxid. Bevorzugte Metallpartikel umfassen
solche, die aus Gold, Silber oder Eisenoxid bestehen.
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Die kolloidalen Metallpartikel können gemäß den in
der Technik allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden. Insbesondere
Frens, Nature, 241, 20 (1973), dessen Offenbarung hiermit durch
Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen wird, offenbart Verfahren
für die
Herstellung von Goldsolpartikel verschiedener Größen. Die Goldpartikel können nach
Verfahren hergestellt werden, bei denen eine Lösung von Goldchlorid zum Sieden
erhitzt wird und dann mit einer Lösung von Natriumcitrat vermischt
wird, um das Goldchlorid zu reduzieren. Kurz nach der Vermischung
der beiden Lösungen
wird die siedende Lösung
tiefblau, was das Einsetzen der Kernbildung anzeigt. Kurz darauf
wechselt die blaue Farbe zu rot hin, was die Ausbildung monodisperser
Partikel anzeigt. Die Reduktion des Goldchlorids ist nach nur wenigen
weiteren Minuten Siedens vollständig.
Die resultierenden Partikelgrößen können durch
Veränderung
der Konzentration der Natriumcitratlösung beeinflußt werden.
Partikel, die andere Metalle und Metallverbindungen wie auch solche
Partikel, die Polymerkerne umfassen, können nach ähnlichen Verfahrensweisen erhalten
werden. Die Farben der visuell nachweisbaren Signale der Markierungen
aus Metallpartikeln hängt
von der Art und der Partikelgröße der Metallpartikel
ab. Zum Beispiel erzeugen kolloidale Goldpartikel Farben, die von
orange bis rot bis hin zu violett reichen, in Abhängigkeit
von der Partikelgröße des Sols.
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Konjugation der Bindungsreagenzien
mit den kolloidalen Partikeln
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Die spezifischen Bindungsreagenzien
der Erfindung können
mit Markierungen aus kolloidalen Partikeln konjugiert werden, wobei
Verfahren angewendet werden, die in der Technik allgemein bekannt
sind. Gemäß einer
allgemeinen Vorgehensweise werden proteinhaltige spezifische Bindungsreagenzien
und kolloidale Partikel schnell miteinander vermischt und in einer
Lösung
inkubiert, zu der ein Agens, wie Rinderserumalbumin oder Polyethylenglykol
zugegeben wird. Die Suspension wird zuerst bei geringer Geschwindigkeit
zentrifugiert, um alle großen
Aggregate zu entfernen und dann bei hoher Geschwindigkeit, um ein
Pellet aus Reagenz/kolloidales Partikel-Konjugat zu erzeugen, bevor
der Überstand
abgesaugt und entfernt wird. Das Pellet wird dann in einer Lösung resuspendiert,
die ein den chromatographischen Transport erleichterndes Agens gemäß der Erfindung
enthält.
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Die Markierungen aus kolloidalen
Partikeln müssen
nicht direkt mit den spezifischen Bindungsreagenzien konjugiert
sein, sondern sie können
auch mit anderen Reagenzien beschichtet oder vorbehandelt sein. Leuvering,
offenbart im U.S. Patent Nr. 4 313 734 Verfahren, durch die metallische
Solpartikel mit inerten Polymeren- und Copolymerenbeschichtungen
beschichtet werden können.
Das metallische Sol kann mit dem Polymer in Kontakt gebracht werden,
oder das Sol kann in eine Umgebung eingetragen werde, die ein oder
mehrere Monomere enthält,
und die Polymerisationsreaktion kann initiiert werden. Nach dem
Beschichten mit dem inerten Polymer kann der immunologisch spezifisch
bindende Bestandteil an das Beschichtungsmaterial mittels Adsorption
oder kovalenter Bindung gekuppelt werden.
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Beschreibung
des meta-löslichen
Proteins
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Wie hierin verwendet, bezeichnet
der Ausdruck meta-löslichen
Protein solche Proteine, die in ihrer nativen Form hydrophob und
in Wasser wenig löslich
sind, die aber, wenn sie einer chemischen Behandlung wie etwa einer
alkalischen Reinigungsbehandlung unterzogen wurden, hydrophiler
gemacht werden können,
und die daher zur Ausbildung einheitlicher Lösungen oder Dispersionen in
Wasser befähigt
sind. Solche chemischen Behandlungen dienen der Abspaltung hydrophober
Fettsäuregruppen
aus den Proteinmolekülen
durch Spaltung der Esterbindungen oder anderer Bindungen. Diese
Spaltung hinterläßt Carboxy-
und Hydroxyreste auf dem Molekül,
wodurch das Protein an diesen Stellen hydrophiler gemacht wird.
Ohne daß dadurch
die Erfindung auf eine einzelne Theorie eingeschränkt werden
soll, wird angenommen, daß die
alkalische Behandlung das meta-lösliche
Protein zu einem gewissen Ausmaß detergenzartig
macht, d. h., daß es
sowohl hydrophobe als auch hydrophile Aspekte aufweist. Die chemische
Behandlung, obwohl sie zur Durchführung der Erfindung notwendig
ist, braucht keine alkalische Behandlung zu sein, aber sie kann
ebenfalls mit Säuren,
Detergenzien oder Lösungsmitteln
wie etwa Alkohol oder Harnstoff erfolgen.
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Die Proteine sind, wenn sie so behandelt
sind, zur Funktion als starke den chromatographischen Transport
erleichternde Agenzien fähig,
wobei sie die Aggregation und daher die Inaktivierung der mit kolloidalen
Partikeln markierten Reagenzien verhindern. Zusätzlich sorgen die behandelten
meta-löslichen
Proteine, wenn sie zusammen mit einem mit kolloidalen Partikeln
markierten labilen Proteinmaterial auf einem chromatographischen
Medium zur Erzeugung einer Testvorrichtung der vorliegenden Erfindung
aufgetrocknet sind, für
die stabile Lagerung, und sie verhindern die Aggregation und Inaktivierung,
wenn der trockene Zustand beibehalten wird, während sie den Proteinmaterialien
erlauben, schnell wieder aufgelöst
zu werden und daher in chromatographischen Transportassays der vorliegenden
Erfindung verwendet zu werden. Bevorzugte meta-lösliche
Proteine umfassen Materialien, wie etwa Casein, Zein und einen nicht-Albuminbestandteil
von Eiweißprotein,
wobei Casein in Konzentrationen von 1 bis 5% besonders zur Verwendung
mit der Erfindung bevorzugt ist. Bevorzugte Materialien umfassen:
vitaminfreies Casein (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Katalognr.
C-3400), Zein (Sigma, Katalognr. Z-3625) und Eiweißprotein
(Sigma, Katalognr. A-5253) welche sowohl das meta-lösliche Protein umfassen, daß für die Auflösung und
den Transport verantwortlich ist, als auch inaktive Albuminfraktionen.
Es ist bekannt, daß der
Eiweißbestandteil,
der für
die Auflösung
und den Transport verantwortlich ist, kein Eiweißalbumin ist, da das reine
Albuminmaterial die Wiederauflösung
und den Transport nicht fördert.
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Beschreibung des den chromatographischen
Transport erleichternden Agens
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Wie hierin verwendet, betrifft der
Ausdruck "den chromatographischen
Transport erleichterndes Agens" solche
Materialien,,die die Aggregation und die Inaktivierung spezifischer
Bindungsmaterialien und von Reagenzien in Lösung verhindern und die desweiteren
deren chromatographischen Transport fördern. Die Agenzien können Flüssigkeiten
oder sie können
Feststoffe sein, wobei sie im letzteren Fall vorzugsweise in einer
Lösung
wie etwa einer Puffersalzlösung
gelöst
sind. Geeignete den chromatographischen Transport erleichternde Agenzien
umfassen Materialien wie Polyethylenglykol, proteinartige Materialien,
wie etwa Gelatine und Rinderserumalbumin und Detergenzien, wie etwa
Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumdeoxycholat (DOC) und Triton® X
100. Gemäß der Erfindung
umfasst das den chromatographischen Transport erleichternde Agens
meta-lösliche
Proteinmaterialien wie z.B. Casein. Meta-lösliche Proteine können ebenfalls
zur Imprägnierung
und Auftrocknung von mit kolloidalen Partikeln markierten Reagenzien
auf die chromatographischen Substratmaterialien verwendet werden,
wobei Testvorrichtungen gemäß der Erfindung
auf eine solche Weise erzeugt werden, daß die markierten Reagenzien
schnell wieder aufgelöst
und mittels chromatographischen Lösungsmittelstransportes transportiert
werden können.
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Wenn das den chromatographischen
Transport erleichternde Agens mit dem mit kolloidalen Partikeln markierten
Material vermischt werden soll, und wenn es als Bestandteil einer
Indikatorlösung
bei "Mix-and-Run-Kits" verwendet werden
soll, umfaßt
es Casein oder ein anderes behandeltes meta-lösliches Protein, in Kombination
mit anderen den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien,
wie etwa PEG in Puffersalzlösung.
Ein besonders bevorzugter, den chromatographischen Transport erleichternder
Puffer umfaßt
2%ig Casein in Kombination mit 0,1% PEG in PBS. Die Konzentration
der Bestandteile des Puffers und der Indikatorlösung werden für die Durchführung des "Mix-and-Run-Kits" der Erfindung derart
ausgewählt, das
für eine
gegebene Probengröße ausreichende
Konzentrationen der Bestandteile bereitgestellt werden, um die Aggregation
und die Inaktivierung der markierten Reagenzien zu verhindern und
deren chromatographischen Lösungsmitteltransport
zu fördern.
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Mit kolloidalen Partikeln markierte
spezifische Bindungsreagenzien haben in der Anwesenheit von Casein
enthaltenden Lösungen
Rf-Werte in der Nähe
von 1,0, während
mit kolloidalen Partikeln markierte Materialien in Puffern, die
PEG enthalten, Rf-Werte in der Nähe
von 0,7 aufweisen. Die Caseinkonzentrationen in geeigneten den chromatographischen Transport
erleichternden Puffern können
von zwischen 0,1% (G/V) (Gewicht/Volumen) bis mehr als ungefähr 5 (G/V)
reichen, wobei Konzentrationen von ungefähr 2 (G/V) bevorzugt sind.
Es ist zu bemerken, daß Konzentrationen,
die größer als
ungefähr
5 (G/V) sind, offensichtlich bei der Verhinderung der Aggregation
nicht helfen oder auch dem Puffer keine den chromatographischen
Transport erleichternden Eigenschaften verleihen, während sie
jedoch dazu neigen, mit der Wiederauflösung der markierten Reagenzien,
die auf den Teststreifen der Erfindung aufgetrocknet sind, zu interferieren.
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PEG-haltige Puffer haben Rf-Werte,
die bei 0,7 liegen. Bevorzugte PEG-Konzentrationen in geeigneten
den chromatographischen Transport erleichternden Puffern reichen
von ungefähr
0,05 bis ungefähr
2%, wobei ungefähr
1% bevorzugt ist. Geeignete PEG-Polymere können eine Vielzahl von Molekulargewichten aufweisen,
wobei Molekulargewichte von ungefähr 20 000 besonders bevorzugt
werden.
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Gelatine ist allgemein zur alleinigen
Verwendung als den chromatographischen Transport erleichternden
Agens ungeeignet, da Lösungen,
die Gelatine enthalten, nur einen Rf-Wert von ungefähr 0,2 liefern.
Sie kann nicht desto trotz nützlich
sein, wenn sie mit anderen anti-Aggregationsmaterialien kombiniert
wird, die in der Erfindung verwendet werden. Gelatine ist jedoch
allgemein, wenn sie in Konzentrationen, die größer als ungefähr 2% sind
ungeeignet, da sie zur Aggregationstendenz beiträgt.
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Pufferlösungen, die zur Verwendung
mit den den chromatographischen Transport erleichternden Agenzien
der Erfindung geeignet sind, sollten einen pH zwischen ungefähr 5 und
9 aufweisen, und sie sollten nicht mit der Reaktivität des Analyten
oder der Reagenzien oder deren chromatographischen Transport interferieren.
Bevorzugte Pufferlösungen
haben pH-Werte von
ungefähr
7, und umfassen Puffer wie Tris und PBS.
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Beschreibung der chromatographischen
Medien
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Chromatographische Medien, die zur
Verwendung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche chromatographischen
Substratmaterialien, die eine Kapillarität und die Fähigkeit zum chromatographischen
Lösungsmitteltransport
von nicht immobilisierten Reagenzien und reaktiven Probenbestandteilen
mittels eines ausgewählten
chromatographischen Lösungsmittels
aufweisen. Die chromatographischen Substratmaterialien, die mit
der Erfindung verwendet werden, liegen vorzugsweise in der Form
von Streifen vor, aber. es ist in Betracht gezogen, daß sie andere
Formen aufweisen können,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf Partikel oder Gelmaterialien in einer chromatographischen Säule. Während eine
große
Vielzahl von chromatographischen Streifenmaterialien, wie etwa gewebten
und nicht gewebten faserigen Materialien für die Papierchromatographie
zur Verwendung mit der Erfindung geeignet sind, wird die Verwendung
mikroporöser
oder mikrogranulärer
Dünnschichtchromatographiesubstrate
besonders bevorzugt, da die Verwendung solcher Substrate die Geschwindigkeit
und Auflösung
der Assays gemäß der Erfindung
verbessert. Die Materialien sollten vorzugsweise inert sein, und
sollten allgemein nicht physikalisch oder chemisch mit irgendwelchen
Bestandteilen der Probe, Reagenzien, Markierungen aus kolloidalen
Partikeln, Puffern oder Reaktionsprodukten reagieren.
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Dünnschichtchromatographiesubstratmaterialien,
die für
die Verwendung mit der vorlegenden Erfindung besonders geeignet
sind, umfassen granuläre
Dünnschichtchromatographiematerialien,
wie Silica oder mikrogranuläre
Zellulose. Bevorzugte nichtgranuläre mikroporöse Materialien umfassen mikroporöse Zelluloseester,
zum Beispiel Ester von Zellulose mit einer aliphatischen Carbonsäure, wie
einer Alkancarbonsäure, die
1 bis 7 Kohlenstoffatome aufweist, zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure oder,
eine der Buttersäuren
oder Valeriansäuren.
Besonders bevorzugt sind mikroporöse Materialien, die aus Nitrozellulose
bestehen, wobei mit diesem Ausdruck alle Salpetersäureester
von Zellulose gemeint sind. Geeignete Materialien umfassen Nitrozellulose
in Kombination mit allen der genannten Carbonsäurezelluloseestern. Daher können reine
Nitrozelluloseester verwendet werden, da sie aus einem Ester von Zellulose
bestehen, der ungefähr
3 Nitrogruppen pro 6 Kohlenstoffatome aufweist. Am meisten bevorzugt
ist das Typ SMWP Material (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts),
das eine Porengröße von 5 μm aufweist.
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Die verschiedenen chromatographischen
Substratmaterialien können
als solche in geeigneten Formen, wie etwa als Filme, Streifen oder
Blätter
verwendet werden. Sie können
ebenfalls auf ein geeignetes inertes Trägermaterial aufgezogen oder
daran gebunden oder auflamminiert werden, wie etwa auf Papier, Glas, Plastik,
Metall oder Stoff (ein bevorzugtes inertes Trägermaterial ist Mylar®).
Ein solches Trägermaterial
hat nicht nur die Auswirkung, eine strukturelle Stütze für das chromatographische
Substratmaterial abzugeben, sondern es verhindert auch die Verdampfung
von Reagenz- und von Lösungsmittelmaterialien
während
des Assayverfahrens. Die Deckplatten können ebenfalls aus solchen
inerten Materialien entworfen werden. Obwohl die Deckplatten für die Durchführung der
Erfindung nicht notwendig sind, verleihen sie zusätzlichen
strukturellen Rückhalt
und darüberhinaus
verhindern sie die Verdampfung von Reagenz und Lösungsmittelmaterialien während des
Assayverfahrens. Solche Deckplatten können durchsichtig sein, um
das Fortschreiten des Assays zu beobachten, und sie können Eingänge für die Zugabe
von Probenmaterialien, chromatographischen Lösungsmitteln oder Reagenzien
umfassen.
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Das chromatographische Medium, auf
dem die Assays durchgeführt
werden, kann, jedwede Form oder Größe haben, es weist jedoch vorzugsweise
die Form von Streifen einer Dicke im Bereich von ungefähr 0,01
mm bis ungefähr
0,5 mm auf, und besonders bevorzugt werden ungefähr 0,1 mm. Die Streifen können in den
anderen Ausmaßen
breit streuen, aber sie werden vorzugsweise ziemlich klein gehalten,
um die Assayentwicklungszeit zu verkürzen und den Materialverbrauch
zu minimieren. Wenn die Streifen in ihrer Größe extrem klein sind, können sie
an einem geeigneten Griff oder Halter angebracht werden, was die
Handhabung und Beobachtung der Ergebnisse erleichtert. Streifen,
die ungefähr
3 mm breit und bis zu 75 mm lang sind, haben sich als besonders
geeignet bei der Herstellung der Einzeltransportwegvorrichtungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung erwiesen. Die Porengröße kann
innerhalb breiter Grenzen schwanken, aber sie liegt vorzugsweise
zwischen ungefähr
0,05 μm
und 20 μm
und besonders bevorzugt bei ungefähr 5 μm. Die Porengröße ist an
ihrer unteren Grenze durch die Größe der transportierten Analyten,
Reagenzien und Markierungen aus kolloidalen Partikeln eingeschränkt. Wenn
die Porengröße zu gering
ist, werden die Assaymaterialien langsam oder überhaupt nicht transportiert.
Auf der anderen Seite ist die Porengröße durch die Bindungskapazität beschränkt. Es
ist allgemein wünschenswert,
daß der
chromatographische Transport schnell ist, wobei der Transport und
das Assay innerhalb weniger als 5 Minuten vervollständigt sein
sollen vorzugsweise innerhalb weniger als ungefähr 2 Minuten. Der chromatographische
Transport sollte nicht so schnell sein, daß die spezifische Bindungskapazität verloren
geht, weil die Reagenzien nicht die Zeit haben, um spezifisch aneinander zu
binden. Die Kombination von Porengröße und Substratdicke kann infolgedessen
entsprechend den Eigenschaften der chromatographischen Lösungsmittel,
der spezifischen Reagenzien, der Probenmaterialien und der Markierungen
aus kolloidalen Partikeln, die verwendet werden, verändert werden,
um die gewünschten
Eigenschaften in Bezug auf Geschwindigkeit und Auflösung zu
erhalten.
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Es ist wünschenswert, daß bei der
Ausbildung der Streifenmaterialien gemäß der vorliegenden Erfindung
jegliche Unregelmäßigkeiten
in den Materialien oder an den Kanten der Materialien, die ungleichmäßigen Fluß durch
das Material hindurch hervorrufen könnten, vermieden werden. Eine
Vorrichtung zum Zuschneiden der Streifenmaterialien umfaßt die Verwendung
eines Papierschneiders, mit einer rotierenden Wolframkarbidklinge.
Ein bevorzugtes Mittel umfaßt
jedoch die Verwendung von Laserschneidwerkzeugen, welche besonders
zur Verwendung in Massenherstellungsverfahren geeignet sind.
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Da das chromatographische Medium
der Vorrichtung vorzugsweise chemisch inert ist, muß es in
jedem Bereich, an dem gewünscht
wird, ein spezifisches Bindungsreagenz entgegen dem Lösungsmitteltransport
zu immobilisieren, aktiviert werden. Es sind verschiedene Verfahren
notwendig, um das Reagenz gemäß der besonderen
chemischen Natur des Substratmaterials und des zweiten Reagenzes
in den immobilisierten Zustand zu überführen. Allgemein ist, wenn das
Medium Nitrozellulose oder ein gemischter Nitrozelluloseester ist,
keine besondere chemische Bindung für die Immobilisierung von Reagenzien
notwendig. Verschiedene Verfahren können für andere Materialien und Reagenzien,
angewandt werden, welche die Funktionalisierung mit Materialien,
wie etwa Carbonyldiimidazol, Glutaraldehyd oder Bernsteinsäure umfassen
oder etwa die Behandlung mit Materialien wie Cyanogenbromid. Andere
geeignete Reaktionen umfassen die Behandlung mit Schiffbasen und
Borhydrid zur Reduktion von Aldehydgruppen, Carbonylgruppen und
Aminogruppen. DNA, RNA und gewisse Antigene können entgegen dem Lösungsmitteltransport
mittels Anbacken an dem chromatographischen Material immobilisiert
werden. Das Anbacken kann bei Temperaturen durchgeführt werden,
die von ungefähr
60°C bis
ungefähr
120°C reichen
während
Zeiträumen,
die von ungefähr
5 Minuten bis hin zu ungefähr
12 Stunden schwanken, vorzugsweise aber ungefähr bei 80°C für ungefähr 2 Stunden.
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Lösungsmitteltransportbarrieren
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Verschiedene Mittel sind bekannt,
um den nacheinander abfolgenden Transport von Reagenzien und Probenmaterialien
zu erzielen, wie er in der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 262 328 offenbart ist.
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Lösungsmittelbarrieren,
die den chromatographischen Fluß gemäß der Erfindung
blockieren, können nach
verschiedenen physikalischen oder chemischen Ätzverfahren ausgebildet werden.
Spalte von weniger als 0,1 mm Breite behindern den Flüssigkeitsfluß, wie herausgefunden
wurde. Ein bevorzugtes Mittel zur Ausbildung solcher Barrieren umfaßt die Verwendung
von Laserätzverfahren.
Ein CO2-Laser kann gemäß dem einen Verfahren verwendet
werden, wobei auf Mylar® verstärkte Zellulose auf eine Trägerhalterung
aufgebracht wird, welche auf einen computergesteuerten x-y Tisch
aufgebracht wird, der zu sehr genauen Positionierungstoleranzen
befähigt
ist. Alternativ kann ein Strahlbewegungsmechanismus verwendet werden.
Unter Verwendung einer Kombination geeigneter optischer Linsen und
unter vorsichtiger Strahlfokussierung, kann ein Laserstrahlspot
mit einem Durchmesser von ungefähr
0,13 mm (0,005 inch) auf die Nitrozellulose fokussiert werden. Unter
vorsichtiger Steuerung der Lasernetzspannung kann ein schmaler Steg
von Nitrozellulose ungefähr von
0,13 mm (0,005 inch) Breite entweder entfernt oder an den Mylarträger® festgeschmolzen
werden. Die Verwendung eines CO2-Lasers
wird besonders wird besonders bevorzugt, aufgrund des günstigen
Kopplungseffektes des Laserlichtes mit der Nitrozellulose. Nicht
desto trotz sind auch andere Arten von Lasern geeignet, vorausgesetzt,
daß die
Laserstrahlwellenlänge
den gewünschten
Effekt auf dem Lösungsmitteltransportmaterial
hervorruft. Über
die Verwendung eines sich bewegenden Strahls oder eines X-Y Führungstisches
können präzise gearbeitete
eingebuchtete Kanäle
oder andere komplizierte Formen auf der Nitrozellulose erzeugt werden.
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Beschreibung
der spezifischen Bindungsreagenzien
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Die spezifischen Bindungsreagenzien,
die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche
Materialien, die Glieder eines spezifischen Bindungspaares sind,
das aus einem Liganden und einem Rezeptor besteht. Der Ligand und
der Rezeptor stehen zueinander derart in Beziehung, daß der Rezeptor
spezifisch an den Liganden bindet, wobei er dazu fähig ist,
den Liganden von anderen Materialien zu unterscheiden, die ähnliche
Eigenschaften aufweisen. Die Verfahren, Kits und Vorrichtungen gemäß der vorliegenden
Erfindung sind besonders bei der Durchführung immunologischen Assayverfahren
nützlich,
bei denen die spezifischen Bindungsreagenzien Antigene und Antikörper sind.
Spezifische Bindungsmaterialien, wie etwa Avidin, Biotin, Strepatavidin
und Antibiotin können
ebenfalls mit kolloidalen Partikeln markiert werden und bei chromatographischen
Lösungsmitteltransportassays
gemäß der Erfindung
verwendet werden. Die Verfahren, Kits und Vorrichtungen können sich
ebenfalls bei der Durchführung
von DNA- und RNA-Hybridisierungsassays und anderen spezifischen
Bindungsassays als nützlich
erweisen, wie etwa bei solchen, die Rezeptoren für Hormone oder andere biologisch
aktive Agenzien umfassen.
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Die Antikörper, die bei der Durchführung der
Immunoassays der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche,
die spezifisch mit verschiedenen Analyten reaktiv sind, deren Nachweis
in biologischen Flüssigkeiten
erwünscht
ist. Solche Antikörper
sind vorzugsweise IgG- oder IgM-Antikörper oder Mischungen dieser,
welche im wesentlichen frei von Assoziationen mit Antikörpern sind,
die zur Bindung mit nicht-Analytmolekülen befähigt sind. Die Antikörper können polyklonal
oder monoklonal sein, und sie sind im Handel erhältlich oder sie können aus
Mäuseascites,
Gewebekultur oder gemäß anderen
in der Technik bekannten Verfahren erhalten werden. Eine typische
Beschreibung des Hybridomaverfahrens für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann
bei Wands, J.R., und V.R. Zurawski, in Gastroenterology 80: 225
(1981); Marshak-Rothstein, A., et al.; J. Immunol. 122: 2491 (1979);
Oi, V.Y. und L.A. Herzenberg, "Immunoglobulin
Producing Hybrid",
Mishell, B.B. und S.M. Shiigi (eds.) Selected Methods in Cellular
Immunoloay, San Francisco: W.H. Freeman Publishing, 1979; und U.S.
Patent Nr. 4 515 893 von Kung, et al. gefunden werden. Die Verwendung
von Mischungen monoklonaler Antikörper mit verschiedenen antigenen
Spezifitäten
oder von monoklonalen Antikörpern und
polyklonalen Antikörpern
kann wünschenswert
sein. Es wird desweiteren in Betracht gezogen, daß Fragmente
von Antikörpermolekülen als
spezifische Bindungsreagenzien gemäß der Erfindung verwendet werden können, einschließlich halben
Antikörpermolekülen und
Fab, Fab' oder F
(ab')2 Fragmenten,
die in der Technik bekannt sind. Unbeachtet der besonderen Quelle
oder der besonderen Art von Antikörpern wird es jedoch bevorzugt,
daß sie
allgemein frei von Verunreinigungen sind. Die Antikörper können mittels
Säulenchromatographie
oder mittels anderer herkömmlicher
Mittel gereinigt werden, aber sie werden vorzugsweise gemäß bekannten
Affinitätsreinigungsverfahren
aufgereinigt.
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Die Antigene und Haptene, die bei
der Ausführung
der Immunoassays der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen solche
Materialien, welche sowohl natürlichen
als auch synthetischen Ursprungs sind, und antigene Determinanten
aufweisen, gegen die die Analytantikörper spezifisch reaktiv sind,
wenn sie ihnen auf den chromatographischen Streifenmaterialien der
Erfindung angeboten werden. Synthetisierte Antigene umfassen solche,
welche gemäß herkömmlichen
chemischen Synthesen aufgebaut wurden, wie auch solche, welche gemäß rekombinanter
DNA-Verfahren aufgebaut wurden. Die Antigenmaterialien können ebenfalls
mit kolloidalen Partikeln gemäß der Erfindung
markiert sein und sie können
in Assays vom Sandwichtyp für
den Nachweis von Antikörperanalyten
oder in Konkurrenzassays zum Nachweis von Antigenanalyten verwendet werden.
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Die Verfahren und Vorrichtungen gemäß der vorliegenden
Erfindung sind erwartungsgemäß bei der Durchführung einer
großen
Vielzahl von spezifischen Bindungsassays einschließlich Nukleinsäurehybridisierungsassays
nützlich.
DNA- und RNA-Hybridisierungsmaterialien,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung nützlich
sind, umfassen DNA- und RNA-Polynukleotidsonden, welche Basensequenzen
aufweisen, die allgemein gegenüber
denjenigen des Analytgenmaterials komplementär sind. Die Sonden der Erfindung
haben allgemein zwischen ungefähr
25 und ungefähr
10 000 Basen, und vorzugsweise haben sie zwischen ungefähr 30 und
ungefähr
5000 Basen. Die Sonden müssen
zu den Basensequenzen des Analytgenmaterials nicht perfekt komplementär sein,
und sie hybridisieren allgemein, vorausgesetzt daß ungefähr 70% oder
mehr Homologie zwischen den Basensequenzen besteht. Die Bedingungen
in Bezug auf die DNA- und RNA-Hybridisierung sind allgemein in Crosa,
et al., J. Bact. 115(3), 904–911
(1973) offenbart. Die Polynukleotidsondenmaterialien können gemäß in der
Technik gut bekannten Verfahren erhalten werden. Siehe zum Beispiel
Kornberg, "DNA Replication", W.H. Freeman and
Co., San Francisco, 670–679
(1978); Dallas, et al., J. Bacteriol. 139, 850–858 (1979) und So, et al.,
Nature; 277, 453–456
(1979).
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Beschreibung
der Blockierungsagenzien
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Blockierungsagenzien, die bei der
Herstellung von Vorrichtungen für
die spezifische Bindung der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
sind solche Agenzien, die zur Blockierung überschüssiger Bindungsstellen auf
dem chromatographischen Medium fähig
sind, welche den chromatographischen Lösungsmitteltransport von Probenmaterialien
oder Reagenzien der Erfindung behindern könnten. Es ist allgemein nicht
notwendig, das chromatographische Substratmaterial bei der Durchführung von "Mix and Run"-Assays zu blockieren,
bei denen die spezifisch bindenden Reagenzien mit dem Probenmaterial
und dem chromatographischen Lösungsmittel
vermischt werden. Die Blockierung überschüssiger Bindungsstellen auf
dem chromatographischen Lösungsmaterial
ist jedoch insbesondere nutzvoll, wenn die Probe oder irgendwelche
der Reagenzien auf dem Streifen in Abwesenheit eines chromatographischen
Lösungsmittels
aufimprägniert
sind. Bei der Herstellung von Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung
wird das chromatographische Medium mit dem Reagenz oder mit den
Reagenzien imprägniert,
die an der Stelle oder an den gewünschten Stellen immobilisiert
werden sollen. Sobald das Reagenz oder die Reagenzien in den gewünschten
Bereichen immobilisiert worden sind, wird der Streifen dann so weiterverarbeitet,
daß die überschüssigen Bindungsstellen
auf den chromatographischen Material, welche mit dem chromatographischen
Lösungsmitteltransport
anderer Reagenzien oder Probenmaterialien interferieren könnten, blockiert
werden. Insbesondere geeignet ist die Verwendung von Blockierungslösungen,
die Proteine von Quellen wie etwa Casein, Gelatine oder Vollserum
umfassen. Solche Protein sind derart ausgewählt, daß sie mit den Reagenzmaterialien
des Assays nicht interferieren oder kreuzreagieren. Die Blockierung
der Reaktionsstellen kann vorzugsweise durch Eintauchen des chromatographischen
Substratmaterials in eine Lösung
von 0,2% Casein in physiologischer Kochsalzlösung und Lufttrocknen des Streifenmaterials
durchgeführt
werden. Andere Verfahren umfassen das Eintauchen in Lösungen von
0,1% Gelatine oder 0,1% BSA; gefolgt von der Lufttrocknung des Substratmaterials.
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Beschreibung
des chromatographischen Lösungsmittelsystems
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Kits zur Durchführung von "Dip and Run"-Assays gemäß der Erfindung verwenden Mischungen
von Probenmaterialien und Indikatorlösungen als solche zum chromatographischen
Transport der mobilen Elemente des Assays. Wenn die Assayvorrichtungen
nicht vom "Dip and
Run"-Typ sind, und
die Probenmaterialien in geringeren Mengen auf Stellen aufgegeben
werden, die sich nicht am ersten Ende der Assayvorrichtungen befinden,
sind chromatographische Lösungsmittel
notwendig, um die verschiedenen Reagenzien und Probenbestandteile
auf den Assayvorrichtungen zu transportieren.
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Geeignete chromatographische Lösungsmittelsysteme
für spezifische
Bindungsassays gemäß der Erfindung
sind solche, die zur Auflösung
des Analyten, des den chromatographischen Transport erleichternden Agens,
der mit kolloidalen Partikeln markierten Reagenzien und jedweden
zusätzlichen
Reagenzes und zusätzlicher
Materialien befähigt
sind, und die diese auf dem chromatographischen Material transportieren.
Solche Lösungsmittel
sollten eine ausreichende Ionenstärke aufweisen, um die elektrostatische
Wechselwirkung der transportierten Materialien mit dem Streifenmaterial
zu unterbinden. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Verwendung
im Immunoassayverfahren gemäß der Erfindung
ist physiologische Kochsalzlösung
mit einem pH im Neutralbereich. Proteine wie auch Detergenzien wie
etwa Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton®X-100
und Natriumdeoxycholat (DOC) können
in das chromatographische Lösungsmittel
in solchen Mengen beigesetzt werden, die die nicht-spezifische Bindung
mit dem Streifenmaterial auf ein Minimum reduzieren, aber nicht
in einem solchen Übermaß, als daß die gewünschte Bindungs-
und Immobilisierungsreaktion unterbunden würde. Andere chromatographische
Lösungsmittel,
wie etwa Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(HPLC)-Lösungsmittel
und Hochleistungsdünnschichtchromatographie-(HPTLC)- Lösungsmittel, welche die Auflösung von
Proteinen fördern
und auch die andere Reaktanten, und welche die Bindung an die Streifenmaterialien,
wie etwa Nitrozellulose, minimieren, können ebenfalls verwendet werden.
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Beispiel 1
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Gemäß diesem Beispiel wurde Casein
einem alkalischen Reinigungsbehandlungsverfahren unterzogen. Zweihundert
Gramm von im wesentlichen vitaminfreiem Casein (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO, Katalognr. C-3400) wurde mit 800 ml destilliertem
Wasser vermischt. Ein Liter einer 2M Natriumhydroxidlösung wurde
dann zugesetzt, gefolgt von 4 ml 30%igem Wasserstoffperoxid, und
die Mischung wurde über
Nacht bei Raumtemperatur vermischt.
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Das Material wurde durch einen Whatman
Nr. 1 Filterpapier-Filter
auf einem Büchnertrichter
filtriert und ungefähr
94,6 ml 100%igen Eisessigs wurden zu dem Filtrat zugesetzt, um es
auf pH 7,5 zu bringen. Die Mischung wurde erneut wie zuvor filtriert
und ungefähr
220 ml Essigsäure
wurde zugesetzt, um den pH auf ungefähr 4,5 einzustellen. Die Mischung
wurde 30 Minuten lang inkubiert, wobei während dieses Zeitraumes ein
großes
Faserknäuel
aus der Lösung
ausfiel. Der Überstand
wurde bei 2800 Umdrehungen pro Minute in einem kleinen RC5C Zentrifugenglas
30 Minuten lang zentrifugiert, und das Pellet wurde zu dem Faserbausch zugesetzt,
der dann mit deionisiertem Wasser gewaschen wurde.
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Das faserartige Material wurde dann
gerührt
und in einem Liter 0,15M wässeriger
Ammoniaklösung aufgelöst. (Für den Fall,
daß das
Casein nicht in Lösung
geht, sollte eine konzentrierte (15M) Ammoniumhydroxidlösung zugegeben
werden, bis der pH den Wert 7,5 erreicht). Das Casein wurde dann über Nacht
gefriertgetrocknet und nach der vollständigen Trocknung hatte man
eine Ausbeute von 136 Gramm erzeugt.
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Beispiel 2
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Gemäß diesem Beispiel wurde ein
kolloidales Gold/Antikörper-Konjugat
zur Durchführung
der Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt, wobei siliconisierte
Glasgefäße (Sigma
Silicote) während
dem Verfahren verwendet wurden, in dem 200 ml von 0,01%igem Goldchlorid
(HAuCl4·3H2O)
(Fischer Scientific, G-54-1) zum Sieden erhitzt wurden, und wobei
2 ml einer 1%igen Natriumcitratlösung
zugesetzt wurden und wobei das Sieden 5 weitere Minuten lang aufrecht
erhalten wurde, bis die Farbe der Lösung von blaß-gelb nach
purpurrot wechselte. Eine Lösung
von Kaliumcarbonat (0,02M) wurde zu der Suspension zugesetzt, um den
pH auf 7,6 einzustellen, gefolgt von der Zugabe von Ziegen-anti-human-IgG
(1 mg/ml) (Kirkegaard-Perry, Gaithersburg, MD) derart, daß ungefähr 10 μg IgG pro
ml an Goldsuspension (0,01 Gold) zugegeben worden waren.
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Nach einer Minute Inkubierung bei
Raumtemperatur wurden 0,1 ml einer Lösung von 30%ig Rinderserumalbumin
in Wasser zu 10 ml der Goldsuspension zugesetzt. Aggregiertes Material
wurde durch Zentrifugation bei 3 000 Umdrehungen pro Minute im SS34
Rotor einer Sorval RCSC Zentrifuge 10 Minuten lang entfernt. Der Überstand
wurde einem zusätzlichen
Zentrifugierungsschritt bei 6 000 Umdrehungen pro Minute 1 Stunde
lang unterzogen. Das kolloidale Goldkonjugat in dem Pellet wurde
in 2%ig Rinderserumalbumin in PBS (0,05M Kaliumphosphatpuffer, pH
7,4 in 0,9% NaCl) resuspendiert, wobei die bevorzugten Bedingungen
für die
flüssige
Lagerung bei 4° C
liegen. Das meta-lösliche
Caseinpräparat,
daß nach
Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde zugegeben, wobei eine Konzentration
von 1% unmittelbar vor der Aufgabe auf die Membran eingestellt wurde.
Das Konjugat wurde dann für
verlängerte
Zeiträume
im trockenem Zustand gelagert, wobei kein Aktivitätsverlust
nach 6 Monaten Lagerung bei 37°C
im trockenem Zustand auftrat.
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Beispiel 3
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Gemäß diesem Beispiel wurden Immunoassayvorrichtungen
vom Sandwichtyp zum Nachweis von Rubella-Antikörpern hergestellt und verwendet.
Mikroporöse
Nitrozellulosematerialien mit einer Dicke von ungefähr 0,1 mm
und einer durchschnittlichen Porengröße von 5 μm wurden auf Mylar® und
Klebstoff aufgezogen (Monokote®, Top Flite Models, Inc.,
Chicago, IL). Die Streifen von 1 cm × 3,5 cm wurden mit einem Hochleistungslaser
geschnitten, und die Lösungsmitteltransportwege
und eine Verzögerungsbox
wurden mittels der Laserätzung
gemäß dem allgemeinen
Entwurf der Vorrichtung nach 4 gestaltet.
Rubella-Antigen (Abbott Laboratories, North Chicago, Il) (0,2 μl, 2 500HA
Titer) wurde auf die Streifen in einem dritten Bereich aufgegeben,
wo es immobilisiert und luftgetrocknet wurde. Nicht-spezifische
Bindungsstellen auf dem chromatographischen Streifenmaterial wurden
dann mittels 10 minütiger
Inkubierung bei Raumtemperatur mit einer 0,1%igen Lösung von
LB Gelatine in Wasser (Inotech, Wohlen, Schweiz) blockiert, und
die Streifen wurden unter einem Luftstrom trocknen gelassen. Ein μl von mit
Goldpartikeln markiertem Ziegen-anti-human-IgG in einem anti-Aggregationspuffer
der gemäß Beispiel
2 hergestellt worden war, wurde dann auf einen ersten Bereich eines
jeden Streifens (Angrenzend an die Verzögerungsbox) aufgegeben und
getrocknet.
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Positive und negative Serumproben
für den
Rubella-Antikörper wurden
dann auf die zweiten Bereiche zwischen dem ersten und dritten Bereich
aufgegeben, und das erste Ende der Streifen wurde in ein chromatographisches
Transportlösungsmittel
eingetaucht, das TBS und 1%ig Triton®X 100
umfaßte.
Die Flüssigkeitsfront
wurde bis zu den zweiten Enden der Vorrichtungen fortschreiten lassen,
wobei dies während
eines Zeitraums von ungefähr
2,5 Minuten geschah, und wobei das Probenmaterial und das mit Gold
markierte Ziegen-anti-human-IgG zu dem dritten Bereich hin transportiert
wurde. Das positive Serum und die Immobilisierung des markierten
ersten Reagenzes führten
zur Anwesenheit eines roten Punktes in dem dritten Bereich. Die
Streifen, die mit negativem Serum getestet wurden, erzeugten kein
Signal in dem dritten Bereich.
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Beispiel 4
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In diesem Beispiel wurde eine "Mix and Run"-Immunoassayvorrichtung
vom Sandwichtyp zum Nachweis von humanem chorionischem Gonadotropin
(HCG) gebaut und verwendet. Die Vorrichtung, die gemäß der gleichen
allgemeinen Ausgestaltung, wie die Vorrichtung nach 2 ausgelegt ist, erzeugt ein Signal,
das die Anwesenheit von markiertem erstem spezifischem Reagenz in
der Probe als negative Kontrollprobe bestätigt, und sie erzeugt ein zusätzliches
Signal, das die Anwesenheit des HCG-Analyten anzeigt. Mikroporöses Nitrozellulosematerial
mit einer Dicke von ungefähr
0,1 mm und einer mittleren Porengröße von 5 μm wurde auf Mylar® und
Klebstoff aufgezogen (Monokote®), gemäß den Verfahren nach Beispiel
3.
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In einem ersten Bereich wurden die
Streifen mit einem zweiten Reagenz imprägniert, das 0,35 μl an 2 mg/ml
polyklonalem anti-HCG-Antikörper
in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung umfaßte, welche 1%ig Sacharose
enthielt. An einem zweiten Bereich wurden die Streifen mit einem
dritten Reagenz imprägniert,
das 0,45 μl
eines 100 μg/ml
Ziegen-anti-Mäuse-IgG's in Tris-gepufferter
physiologischer Kochsalzlösung umfaßte, die
1%ig Sacharose enthielt. Die beiden Bereiche wurden ungefähr 10 mm
von dem ersten Ende des Streifens angebracht, und sie wurden derart
angeordnet, daß der
zweite Bereich die Form eines Minuszeichen (–) aufwies, und daß der erste
Bereich sich auf beiden Seiten in Bezug auf den zweiten Bereich
befand, so daß die
beiden Bereiche zusammen eine Pluszeichen (+) ausbilden.
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Anti-HCG-Antikörper (Abbott Laboratories,
North Chicago, IL) wurden mit 1 ml einer kolloidalen Goldsuspension
inkubiert, die mit Kaliumcarbonat gemäß dem Verfahren nach Beispiel
2 auf pH 6,6 eingestellt worden war, derart daß ungefähr 10 μg IgG pro ml an Goldsuspension
zugegeben wurden. Die Indikatorlösung wurde
dann hergestellt, die 10 ml mit kolloidalem Gold markierten anti-HCG-Antikörpern umfaßte. Die
mit Goldpartikeln markierten Antikörper wurden zu 10 ml von Tris-gepufferter
Kochsalzlösung
enthaltend 10%ig alkalisch behandeltes Casein nach Beispiel 1 und
enthaltend 1%ig PEG (M.G. 20 000) zugegeben. Die Indikatorlösung wurde
dann mit 100 μl
einer Urinprobe vermischt, zu der verschiedene Mengen von HCG hinzugegeben
worden waren.
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Der Teststreifen wurde dann an- seinem
ersten Ende in die Mischung aus Probe und Indikatorlösung getaucht,
und die Flüssigkeitsfront
wurde durch die Bereiche bis hin zum zweiten Ende des Streifens
hin aufsteigen lassen. Wenn die Probenlösung kein HCG-Antigen enthielt,
schritten die Mischung aus Probe und Indikatorlösung durch den Streifen hinweg
voran. Beim In-Kontakt-Gelangen
mit dem zweiten Bereich, wo die Ziegen anti-Mäuse-IgG
immobilisiert worden waren, wurden die markierten anti-HCG Antikörper mittels
der selektiven immunologischen Reaktion immobilisiert. Da in der
Probenlösung
kein HCG vorhanden war, kam es zu keiner spezifischen Bindung mit
dem zweiten Reagenz, das in dem ersten Bereich immobilisiert war.
Die mit kolloidalem Gold markierten Reagenzien erzeugten daher ein
visuell nachweisbares Signal in Form eines Minuszeichens (–), das
die Funktionstüchtigkeit
der Reagenzien, aber die Abwesenheit von HCG in der Probe anzeigte.
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Wenn die Probenlösung HCG enthielt, bildeten
die markierten anti-HCG Antikörper,
die selektiv an den Analyten gebunden waren, ein markiertes Konjugat.
Die Mischung aus der Probenlösung
und der Indikatorlösung
wurde mittels chromatographischem Transport durch die ersten und
zweiten Bereiche bis zum zweiten Ende hin transportiert. Beim In-Kontakt-Gelangen
des ersten Bereiches, an dem die polyklonalen anti-HCG-Antikörper immobilisiert
worden waren, mit der Lösung
wurde das mit Gold markierte Antikörper/HCG-Konjugat mittels einer
spezifischen Bindungsreaktion des HCG-Antigens mit den anti-HCG-Antikörpern immobilisiert.
Zum gleichen Zeitpunkt wurden das HCG/Antikörper-Konjugat und aller unkonjugierter
markierter anti-HCG-Antikörper,
die mit dem zweiten Bereich in Berührung kamen, in diesem Bereich
immobilisiert, indem sie mit den Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörpern in
Kontakt gerieten, die in diesem Bereich immobilisiert waren. Die
mit kolloidalem Gold markierten Reagenzien, die so sowohl im ersten
als auch im zweiten Bereich immobilisiert worden waren, erzeugten
ein visuell nachweisbares Signal in der Form eines Pluszeichens
(+), das die Anwesenheit von HCG in der Probe anzeigte. Die Empfindlichkeit
für HCG
bei diesem Konzept wurde als 25milli-IU/ml bestimmt.
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Beispiel 5
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Bei diesem Beispiel wurde ein "Mix and Run" Immunoassay vom
Sandwichtyp zum Nachweis von A-Polysaccharid (APS) hergestellt und
gemäß den Verfahren
des Beispiels 4 verwendet. Gemäß diesem
Beispiel wurden Nitrozellulosestreifen nach Beispiel 4 hergestellt,
und sie wurden mit polyklonalen anti-APS Antikörpern behandelt, welche in
dem ersten Bereich immobilisiert wurden.
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Polyklonale anti-APS-Antikörper von
Kaninchen (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) wurden mit 1
ml einer kolloidalen Goldsuspension inkubiert, die mit Kaliumcarbonat
gemäß dem Verfahren
von Beispiel 2 auf pH 7,2 eingestellt worden war, derart, daß ungefähr 10 μg anti-APS-Antikörper pro
ml Goldsuspension zugesetzt wurde. Eine Indikatorlösung wurde
dann hergestellt, die 10 μl
des mit kolloidalem Gold markierten anti-APS-Antikörpers umfaßte. Die mit kolloidalen Goldpartikeln
markierten anti-APS-Antikörper
wurden dann zu 10 μl
von Tris-gepufferter
Kochsalzlösung,
die 10%ig alkalischbehandeltes Casein gemäß Beispiel 1 und 1%ig PEG enthielt,
zugesetzt. Die Indikatorlösung
wurde dann mit 100 μl
eines Abstrichextraktionspuffers für Streptokokken vermischt,
zu dem wechselnde Anteile von APS (Abbott Laboratories, North Chicago,
IL) zugesetzt worden waren.
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Der Teststreifen wurde dann mit seinem
ersten Ende in die Mischung einer Probe und einer Indikatorlösung getaucht,
und die Flüssigkeitsfront
wurde durch den ersten Bereich hindurch bis zum zweiten Ende des Streifens
hin aufsteigen lassen. Das in den Proben vorhandene APS reagierte
mit und wurde an die anti-APS Antikörper in der Indikatorlösung gebunden,
wobei sich ein Konjugat ausbildete. Diese Konjugate wurden dann in
dem ersten Bereich mittels Reaktion zwischen dem APS und den polyklonalen
anti-APS-Antikörpern,
die in den Bereich immobilisiert worden waren immobilisiert. Die
Anwesenheit von APS in der extrahierten Abstrichprobe wurde durch
die Ausbildung einer Purpurfarbe als Folge der Anreicherung von
mit kolloidalem Gold markierten Partikeln in diesem Bereich angezeigt.
Die Empfindlichkeit für APS
von Vorrichtungen gemäß dieser Auslegung
wurde als 0,5 ng/ml APS bestimmt.
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Beispiel 6
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Bei diesem Beispiel wurden Immunoassayvorrichtungen
vom Sandwichtyp zum Nachweis von Schweine-anti-Trichinen Antikörpern gemäß dem, allgemeinen
Verfahren nach Beispiel 3 hergestellt. Nitrozelluloseassaystreifen
wurden hergestellt, und sie wurden mit teilweise gereinigtem Trichinen-Antigen
(United States Department of Agriculture) behandelt, das in einem
Nachweisbereich immobilisiert worden war.
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Kolloidale Selenpartikeln verschiedener
Größen wurden
hergestellt. Verschiedene Volumina (40, 80 und 150 μl-Anteile)
an konzentriertem Selensol wurden in einzelne Reagenzgläser pipettiert,
die jedes 4 ml Wasser enthielten, und der pH einer jeden Lösung wurde
durch die Zugabe von 0,01M Kaliumcarbonat auf 7,2 eingestellt. Zu
jedem der Reagenzgläser
wurden dann 150 μl
von Ziegen-anti-Schwein-Antikörper
(1 mg/ml Konzentration) (Kirkegaard-Perry) zugesetzt. Die Lösungen wurden
vermischt und 10 Minuten lang inkubieren lassen. Ein 0,5 ml-Anteil
einer 0,5%igen Lösung
von alkalisch behandeltem Casein wurde zu jeder Lösung zugesetzt,
und es wurde gut gemischt. Drei Anteile a 1 ml einer jeden Selenkonjugatlösung wurden
in 1 ml-Portionen auf einer TDx-Tischzentrifuge zentrifugiert, und
die Pellets wurden für
jedes Konjugat vereinigt, nachdem der Überstand abdekantiert worden
war. Die vereinigten Pellets eines jeden Konjugates wurden in einer Lösung von
4%ig Casein in 20 μl
TBS resuspendiert. 0,5 μl
Anteile der mit Selenpartikeln markierten Antikörperindikatorlösungen wurden
dann auf einen ersten Bereich des Streifens (angrenzend an, die
Verzögerungsbox)
aufgebracht und getrocknet.
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Positive und negative Serumproben,
die Trichinen-Antikörper
enthielten, wurden dann auf die zweiten Bereiche der Vorrichtungen
zwischen dem ersten und dritten Bereich aufgebracht, und das erste
Ende der Streifen wurde in ein chromatographisches Transportlösungsmittel
eingetaucht das TBS, und 1%ig Triton®X 100 umfaßte. Die
Flüssigkeitsfront
wurde zu den zweiten Enden der Vorrichtungen hinfortschreiten lassen,
wobei ein Zeitraum von ungefähr
2,5 Minuten benötigt
wurde, und wobei das Probenmaterial und die Selen-markierten anti-Schweine-Antikörper zu
dem dritten Bereich hin transportiert wurden. Alle Konjugate ergaben
ein sichtbares positives Signal, wobei das Konjugat, das Selenpartikel
von 80 nm verwendete, die besten Ergebnisse ergab. Alle Konjugatlösungen wurden
gegenüber
einer negativen Kontrollprobe getestet, welche keine spezifische
Bindung anzeigte.
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Beispiel 7
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Bei diesem Beispiel wurde eine "Mix and Run"-Immunoassayvorrichtung
vom Sandwichtyp hergestellt und gemäß den allgemeinen Verfahren
nach Beispiel 4 verwendet. Anstatt daß die anti-HCG-Antikörper mit Goldpartikeln
inkubiert wurden, wurden die Antikörper mit kolloidalen Selenpartikeln
inkubiert. Selenpartikel verschiedener Größen wurden gegenüber verschiedenen
Konzentrationen von HCG getestet. Das Konjugat, das die 80 nm Partikel
verwendete, ergab die besten Resultate bei einer Nachweisgrenze
von 20 mIU/ml. Die Antikörper,
die mit größeren oder
kleineren Partikeln markiert waren, ergaben weniger empfindliche
Resultate, wie dies in Tabelle 1 unten gezeigt ist. Alle Konjugatlösungen wurden
gegenüber
einer negativen Kontrollprobe getestet, die keinerlei spezifische
Bindung anzeigte.
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Die Verwendung von mit kolloidalen
Partikeln markierten Reagenzien bei chromatographischen Assayverfahren
erfreut sich einer großen
Anwendbarkeit und ist nicht auf die besonderen offenbarten Beispiele beschränkt. Es
liegt daher durchaus innerhalb üblichen
Fachkönnens
die vorliegende Erfindung gemäß einer Vielzahl
von Verfahren und Auslegungen auszuführen. Demgemäß soll die
Erfindung nur als durch die nachfolgenden Ansprüche eingeschränkt gelten.