DE3834636A1 - Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen - Google Patents
Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichenInfo
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Längen
polymorphismen in DNA-Bereichen.
Alle bekannten Verfahren zur Bestimmung von DNA-
Längenpolymorphismen beruhen auf der Verwendung von
Restriktionsendonucleasen. Dabei werden spezifische DNA-
Fragmente hergestellt, die anschließend mit Hybridisierungs
verfahren nachgewiesen werden. Mit diesen Verfahren werden
entweder Längenvariationen nachgewiesen, die zwischen den
entsprechenden Erkennungsstellen für Restriktionsendonucle
asen entstanden sind, oder Längenvariationen, die aufgrund
des Fehlens bestimmter Restriktionsspaltstellen entstanden
sind. Das erstgenannte Verfahren macht sich die Längenvaria
tion in sogenannten Minisatellitenbereichen (3, 4) bzw. in
Bereichen mit spezifischen simplen DNA-Sequenzen (5) zu
nutze. Das zweite Verfahren, bei dem Restriktionslängenpoly
morphismen (RFLP) nachgewiesen werden, ist nur in speziel
len, empirisch gefundenen Fällen anwendbar und ist im we
sentlichen nur sinnvoll einsetzbar bei der Analyse von gene
tischen Krankheiten.
Der Nachteil der beiden bekannten Verfahren besteht darin,
daß eine Hybridisierungsreaktion durchgeführt werden muß, um
die längenpolymorphen Bereiche sichtbar zu machen. Dadurch
werden die Verfahren zeitaufwendig und teuer. Weiterhin er
laubt eine einzelne Analyse mit den bisherigen Verfahren in
der Regel keine ausreichend abgesicherte Aussage, so daß zu
sätzlich noch eine zweite, unabhängige Analyse erforderlich
wird. Deshalb eignen sich diese Verfahren nicht sehr gut für
Reihenuntersuchungen und Routinetests. Außerdem sind die be
schriebenen Verfahren nicht zur Automatisierung geeignet.
Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfah
ren zur Analyse von Längenpolymorphismen in DNA-Bereichen
bereitzustellen, das hochempfindlich ist, bei geringem Zeit
aufwand zuverlässige Ergebnisse liefert, auch für Reihenun
tersuchungen und Routinetests geeignet ist, und gegebenen
falls auch automatisch durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Analyse von Längenpolymorphismen in
DNA-Bereichen gelöst, bei dem man folgende Schritte durch
führt:
- (a) Anlagerung von mindestens einem Primer-Paar an die zu analysierende DNA, wobei jeweils eines der Moleküle des Primer-Paares im wesentlichen komplementär ist zu einem der komplementären Stränge der 5′- bzw. 3′-Flanke einer simplen oder kryptisch simplen DNA-Sequenz, und die An lagerung in solcher Orientierung erfolgt, daß die bei einer Primer-gesteuerten Polymerisationsreaktion mit je weils einem der beiden Primer gewonnenen Syn theseprodukte nach einer Denaturierung als Matrize zur Anlagerung des jeweils anderen Primers dienen können;
- (b) Primer-gesteuerte Polymerasekettenreaktion; und
- (c) Auftrennung und Analyse der Polymerasekettenreaktions produkte.
Die Primer gesteuerte Kettenreaktion ist als solche aus der
EP-A2 02 00 362 (1) und aus (2) bekannt. Dabei handelt es
sich um ein Verfahren zur Amplifikation spezifischer DNA-
Fragmente, bei dem eine PCR (Polymerase Chain Reaction)
durchgeführt wird. Die spezifische Amplifikation wird bei
diesem Verfahren durch die Verwendung von Oligonucleotid-
Primern erzielt, die das Zielmolekül antiparallel flankie
ren. Dadurch werden bei einer matrizenabhängigen Verlänge
rung der Primer durch eine Polymerase DNA-Fragmente
gebildet, die selbst wieder als Matrizen für einen erneuten
Zyklus zur Verfügung stehen. Die DNA-Synthese wird durch
Hitzedenaturierung des Ausgangsmoleküls, Anlagerung der
entsprechenden Primer und durch Kettenverlängerung mit einer
Polymerase eingeleitet. Durch eine erneute Hitzedenaturie
rung wird der nächste Zyklus begonnen. Der spezifisch
amplifizierte Bereich wächst dadurch in exponentieller Weise
und es wird schließlich ein durch normale Gelelektrophorese
nachweisbares Fragment gebildet. Die Länge dieses Fragments
wird durch die 5′-Enden der Primer und den dazwischenliegen
den Bereich bestimmt. Die Verwendung von thermostabilen
Synthesekomponenten erlaubt es, das Verfahren durch einfache
und leicht automatisierbare Erhitzungs- und Kühlungszyklen
zu steuern.
Unter der "antiparallelen Flankierung" des Zielmoleküls
durch Oligonucleotid-Primer versteht man die Anlagerung je
eines der beiden Primer eines Primer-Paares an einen der
komplementären Stränge des Zielmoleküls, so daß die 3′-Enden
des Primer-Paares zueinander zeigen.
Simple und kryptisch simple DNA-Sequenzen sind repetitive
Bestandteile von allen eukaryontischen Genomen, die teil
weise auch in prokaryontischen Genomen (6-9) vorkommen. Da
bei umfassen simple DNA-Sequenzen kurze DNA-Motive, die min
destens ein Nucleotid und höchstens etwa 6 bis 10 Nucleotide
enthalten und dutzend- bis etwa hundertmal tandemartig wie
derholt sind. Diese simplen DNA-Sequenzen sind durch Hybri
disierung mit synthetischen DNA-Sequenzen und durch direkte
Sequenzierung in allen bisher analysierten eukaryontischen
Genomen und auch im menschlichen Genom gefunden worden (8,
10). Vermutlich kommen darin alle möglichen Permutationen
von kurzen Motiven mit unterschiedlicher Häufigkeit vor (9).
Kryptisch simple DNA-Sequenzen zeichnen sich durch eine
über zufällig häufige, aber unregelmäßige direkte Wiederho
lung von kurzen DNA-Motiven aus (9). Kryptisch simple DNA-
Sequenzen werden in der Regel nur indirekt mit einem
entsprechenden Computerprogramm in bereits sequenzierten
DNA-Bereichen gefunden. Sie treten jedoch mindestens ebenso
häufig oder sogar noch häufiger auf, wie simple DNA-Sequen
zen.
Die simplen und kryptisch simplen DNA-Sequenzen dürften
durch genomische Mechanismen entstanden sein, die eine Ten
denz haben, bereits existierende kurze Verdopplungen von be
liebigen DNA-Sequenzmotiven nochmals zu verdoppeln oder in
beliebigen DNA-Sequenzmotiven längere Bereiche von bereits
bestehenden simplen oder kryptisch simplen DNA-Sequenzen
teilweise zu deletieren (8-10). Daher ist davon auszugehen,
daß diese Bereiche in der Regel längenpolymorph sind. Auf
diesem Längenpolymorphismus beruht das erfindungsgemäße Ver
fahren.
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete simple oder
kryptisch simple DNA-Sequenzen können mit oder ohne Hilfe
eines Computerprogramms in bereits bekannten DNA-Sequenzen
gefunden werden (9). Geeignet ist eine simple oder kryptisch
simple DNA-Sequenz dann, wenn sie eine Länge von ca. 20 bis
300 Nucleotiden besitzt, und von Zufallssequenzen, also von
DNA-Sequenzen ohne interne Wiederholungen flankiert wird.
Aus dem Bereich der flankierenden DNA-Sequenzen ohne interne
Sequenzwiederholungen werden dann Stücke ausgewählt, zu
denen geeignete komplementäre, synthetische Oligonucleotide
hergestellt werden. Geeignet ist ein Oligonucleotid für die
sen Zweck dann, wenn seine Nucleotidzusammensetzung und
seine Nucleotidabfolge mit hoher Wahrscheinlichkeit nur ein
mal im zu untersuchenden Genom vorkommt und somit spezifisch
für den individuell zu analysierenden DNA-Bereich ist.
Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren Primer-
Paare verwendet, deren einzelne Moleküle in einem Abstand
von 50 bis 500 Nucleotiden voneinander an den zu untersu
chenden DNA-Bereich angelagert werden, diesen also sozusagen
im angegebenen Abstand umspannen. Dabei wird der zu untersu
chende DNA-Bereich von den angelagerten Molekülen des Pri
mer-Paares umgeben.
Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zwei
Primer-Paare eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Aus
führungsform werden 2 bis 50 Primer-Paare eingesetzt.
Vorzugsweise haben die beim erfindungsgemäßen Verfahren ver
wendeten Primer eine Länge von 15 bis 25 Nucleotiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden bei der Verwendung mehrerer Primer-Paare
die einzelnen Primer-Paare so ausgewählt, daß die entspre
chenden spezifischen Polymerase-Kettenreaktionsprodukte der
einzelnen Primer-Paare auf einem geeigneten Gel in einzelne
Banden auftrennbar sind.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens erfolgt der Nachweis der spezifischen Po
lymerasekettenreaktionsprodukte durch radioaktive Markierung
oder durch nicht-radioaktive Markierung, z.B. mit Fluores
zenzfarbstoffen.
Die Markierung der Oligonucleotid-Paare kann radioaktiv oder
wie in (12) beschrieben, mit einem fluoreszierenden Farb
stoff durchgeführt werden.
Ferner sind Bestecke (Kits), mit denen sich das erfindungs
gemäße Verfahren durchführen läßt, Gegenstand der vorliegen
den Erfindung. Die darin enthaltenen Primer sind gegebenen
falls radioaktiv, z.B mit 35S oder 14C, oder fluoreszenz
markiert.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Synthesepro
dukte lassen sich mit hochauflösenden Gelsystemen, wie übli
chen Sequenzierungsgelen, auftrennen. Dabei kann auch die
Länge der Syntheseprodukte bestimmt werden. Polymorphismen,
die durch Insertionen oder Deletionen einzelner oder mehre
rer Motive der simplen oder kryptisch simplen DNA-Sequenz
gebildet werden, sind durch eine geänderte Position der Syn
theseprodukte im Gel erkennbar. Bei geeigneter Auswahl der
Primer-Paare lassen sich bei einem geeigneten Auf
lösungsvermögen des Gelsystems ca. 20 bis 50 unabhängige po
lymorphe Bereiche gleichzeitig untersuchen. Somit läßt sich
die Identität eines Individuums aufgrund der individuellen
Kombination von Längenverteilungen der erhaltenen Syn
theseprodukte zuverlässig feststellen.
Falls keine geeigneten simplen oder kryptisch simplen DNA-
Sequenzen in den zu untersuchenden DNA-Bereichen bekannt
sind, lassen sich diese wie folgt identifizieren.
Eine zu untersuchende genomische DNA wird einer partiellen
Restriktionsspaltung unterworfen. Dabei werden Restriktions
enzyme verwendet, die üblicherweise nicht in simplen oder
kryptisch simplen DNA-Sequenzen spalten. Die erhaltenen DNA-
Fragmente werden in einem geeigneten Vektor, z.B. in lambda-
Phagen-Derivaten oder in M13-Phagen cloniert und sodann in
üblicher Weise durch Hybridisierung auf simple oder kryp
tisch simple DNA-Sequenzen abgesucht; vgl. (11). Die verwen
deten Sondenmoleküle sind synthetische DNA-Moleküle, die
verschiedene Permutationen von simplen oder kryptisch simp
len DNA-Sequenzen enthalten. Auf diese Weise lassen sich
hybridisierende Plaques identifizieren. Sodann kann die
darin enthaltene rekombinante DNA isoliert und durch Sequen
zierung charakterisiert werden. Die so erhaltene DNA-Sequenz
läßt sich dann auf für das erfindungsgemäße Testverfahren
geeignete DNA-Sequenzen absuchen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit Drosophila-DNA als
Modellsystem ausgeführt. Da jedoch simple und kryptische
simple DNA-Sequenzen in allen eukaryontischen Genomen und
teilweise auch in prokaryontischen Genomen vorkommen, ist
davon auszugehen, daß die im Drosophila-Modellsystem erziel
ten Ergebnisse auch bei der Untersuchung anderer Genome,
insbesondere bei der Untersuchung des menschlichen Genoms
erzielt werden können.
Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Identitäts-
und Verwandtschaftsbestimmung von Organismen, beispielsweise
von Menschen geeignet.
Beim Menschen lassen sich Vaterschaftstests und forensische
Tests zur Identitätsbestimmung von Straftätern mit dem er
findungsgemäßen Verfahren durchführen.
Neben der Identitätsbestimmung für Individuen ist das Ver
fahren auch geeignet, den Vererbungsgang für genetische
Krankheiten zu bestimmen, für die der Locus bekannt und
sequenziert ist. Dazu werden eine oder mehrere simple oder
kryptisch simple Sequenzen ausgewählt, die im oder in der
Nähe des zu analysierenden Locus liegen. Das spezifische
Längenmuster dieser Bereiche wird mit dem mutierten Locus
korreliert, so wie dies mit herkömmlichen RFLP-Markern üb
lich ist; vgl. (14). Mit dieser Information kann dann bei
den betroffenen Familien eine genetische Beratung bzw. eine
pränatale Diagnose durchgeführt werden und zwar in analoger
Weise, wie es für RFLP-Marker üblich ist. Der Einsatz des
erfindungsgemäßen Verfahrens zu diesem Zweck ist vor allem
deswegen sinnvoll, weil es sich auf DNA-Bereiche stützt, die
mit einer vorhersagbaren Wahrscheinlichkeit polymorph sind,
während die RFLP-Analyse auf zufällig gefundene Variationen
angewiesen ist, die oft weit von dem Locus selbst entfernt
liegen, was die Diagnosesicherheit herabsetzt.
Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von
Polymorphismen in simplen oder kryptisch simplen DNA-Sequen
zen von Tieren und Pflanzen geeignet. Daher können in der
Tierzucht, z.B. bei Pferden, Hunden oder Rindern, die
Verwandtschaftsverhältnisse zu hochwertigen Zuchtindividuen
zuverlässig nachgewiesen werden.
Zusammenfassend liegt also der Vorteil des erfindungsgemäßen
Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Verfahren in sei
ner breiten Anwendbarkeit, schnellen Durchführbarkeit und in
seiner hohen Empfindlichkeit. Der im erfindungsgemäßen Ver
fahren durchgeführte Amplifikationsschritt für die längenpo
lymorphen simplen oder kryptisch simplen DNA-Sequenzen macht
einen unabhängigen Nachweisschritt, wie eine nachfolgende
Hybridisierungsreaktion, überflüssig. Dadurch eignet sich
das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut zur Automati
sierung und für Routinetests und Reihenuntersuchungen.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 Hybridisierung einer Genbank mit einer simplen DNA-
Sequenz als Sondenmolekül.
Auf einer 12×12 cm großen Platte wurden ca. 20 000 verein zelte Phagenclone ausplattiert und mit einem Sondenmolekül hybridisiert, das die simple Trinucleotidsequenz CAG/CTG enthält. Dabei werden etwa 300 bis 400 positive Signale er halten. Die positiven Signale sind als Schwärzung erkennbar.
Auf einer 12×12 cm großen Platte wurden ca. 20 000 verein zelte Phagenclone ausplattiert und mit einem Sondenmolekül hybridisiert, das die simple Trinucleotidsequenz CAG/CTG enthält. Dabei werden etwa 300 bis 400 positive Signale er halten. Die positiven Signale sind als Schwärzung erkennbar.
Fig. 2 Sequenz des in Beispiel 2 auf Polymorphismus gete
steten Bereichs.
Die Bereiche, zu denen komplementäre Oligonucleotide syn
thetisiert wurden, sind mit einer Wellenlinie unterstrichen.
Der Bereich der simplen DNA-Sequenz ist mit einer Doppelli
nie unterstrichen. Die direkte Wiederholung von 8 Nucleoti
den ist mit zwei Pfeilen gekennzeichnet. Die HaeIII-Spalt
stelle ist kursiv markiert.
Fig. 3 Analyse der Längenvariationen in 11 Wildtypstämmen
von Drosophila.
Die mittels PCR amplifizierten und mit HaeIII gespaltenen DNA-Sequenzen sind in den Bahnen 1 bis 11 aufgetragen. Rechts ist eine Sequenzierungsreaktion aufgetragen, die als Längenmarker dient. Die Position der erwarteten Fragmente ist links mit Pfeilen markiert. Die Positionen der zusätz lich beobachteten Fragmentklassen ist mit Strichen markiert.
Die mittels PCR amplifizierten und mit HaeIII gespaltenen DNA-Sequenzen sind in den Bahnen 1 bis 11 aufgetragen. Rechts ist eine Sequenzierungsreaktion aufgetragen, die als Längenmarker dient. Die Position der erwarteten Fragmente ist links mit Pfeilen markiert. Die Positionen der zusätz lich beobachteten Fragmentklassen ist mit Strichen markiert.
Fig. 4 Test auf Reproduzierbarkeit.
Zehn unabhängige PCR-Ansätze mit der DNA-Präparation "A" des Drosophila-Stammes Nummer 3 wurden links aufgetragen, zehn unabhängige PCR-Ansätze mit der DNA-Präparation "B" des Dro sophila-Stammes Nr. 3 wurden rechts aufgetragen. Ganz rechts sind Markerfragmente aus einer Sequenzierungsreaktion aufge tragen. Alle beobachteten Testbanden sind identisch.
Zehn unabhängige PCR-Ansätze mit der DNA-Präparation "A" des Drosophila-Stammes Nummer 3 wurden links aufgetragen, zehn unabhängige PCR-Ansätze mit der DNA-Präparation "B" des Dro sophila-Stammes Nr. 3 wurden rechts aufgetragen. Ganz rechts sind Markerfragmente aus einer Sequenzierungsreaktion aufge tragen. Alle beobachteten Testbanden sind identisch.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Drosophila-DNA wird mit der Restriktionsendonuclease EcoRI
vollständig gespalten und die resultierenden Fragmente wer
den in den lambda-Vektor 641 cloniert. Eine nähere Beschrei
bung der angewendeten Methoden findet sich in (11). Somit
wird eine Genbank erhalten, von der etwa 20 000 Phagen aus
plattiert werden. Die entsprechenden vereinzelten Plaques
werden auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen und mit
einem Sondenmolekül hybridisiert, das das simple DNA-Se
quenzmotiv CAG/CTG enthält.
Die Filter werden bei 65°C hybridisiert und gewaschen. Die
Hybridisierungslösung enthält 5x SSPE, 5x Denhardt′s Lösung,
0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und etwa 1×106 cpm/ml ra
dioaktiv (32P) markierte DNA als Sondenmolekül. Die Waschlö
sung enthält 2x SSPE und 0,1% SDS (die Zusammensetzung von
Denhardt′s Lösung und SSPE ist in (11) beschrieben).
Etwa 300 bis 400 der ausgebildeten Plaques zeigen ein posi
tives Signal; vgl. Fig. 1. Von diesen Plaques werden einige
gereinigt, es wird DNA isoliert und sequenziert. In den er
haltenen DNA-Sequenzen lassen sich Bereiche identifizieren,
die die simple DNA-Sequenz CAG/CTG enthalten; vgl. (7).
Für diesen Versuch wurde die in Fig. 2 wiedergegebene und
in (13) veröffentlichte DNA-Sequenz ausgewählt. Es wurden
zwei Oligonucleotide mit den folgenden Sequenzen syntheti
siert:
Oligonucleotid 1: 5′-TAAGCTTGGGAATCA-3′
Oligonucleotid 2: 5′-ATTGAACTTTGTATC-3′.
Oligonucleotid 2: 5′-ATTGAACTTTGTATC-3′.
Diese DNA-Sequenzen befinden sich unmittelbar am Beginn bzw.
am Ende der in Fig. 2 dargestellten Sequenz. Zur Verwendung
als Primer werden die synthetisierten Oligonucleotide an ih
rem 5′-Ende mit 32P markiert. Sodann wird eine PCR-Reaktion
mit den markierten Primern durchgeführt. Insgesamt werden 20
Zyklen durchgeführt, wobei jeweils 90 Sekunden bei 95°C de
naturiert wird, 90 Sekunden bei 45°C angelagert wird und 120
Sekunden bei 72°C synthetisiert wird. Als zu untersuchende
DNA′s werden die genomischen DNA′s von 11 Wildtypstämmen von
Drosophila melanogaster aus verschiedenen Gebieten der gan
zen Welt eingesetzt. Diese Drosophila-Wildtypstämme stammen
ursprünglich von einzelnen fertilisierten Weibchen ab und
wurden während der letzten 10 Jahre gesammelt. Nach der PCR-
Reaktion werden die amplifizierten Fragmente mit der Re
striktionsendonuklease HaeIII gespalten. Dabei sollten üb
licherweise zwei Fragmente entstehen, die eine Länge von 202
Nucleotiden bzw. 177 Nucleotiden aufweisen. Dieser Schritt
ist für Routineexperimente normalerweise nicht erforderlich.
Er dient hier lediglich der Verfeinerung der Analyse. Die
entstehenden Fragmente werden auf einem 5prozentigen Sequen
zierungsgel aufgetrennt, sodann wird das Gel getrocknet und
ein Röntgenfilm wird mit dem getrockneten Gel belichtet. Die
beiden erwarteten DNA-Fragmente zeigen einen ausgeprägten
Polymorphismus in den verschiedenen Drosophila-Wildtypstäm
men. Das die simple DNA-Sequenz enthaltende Fragment mit 202
Nucleotiden zeigt vier verschiedene Größenklassen; vgl.
Fig. 3. Diese Größenklassen sind jeweils um drei Nucleotide
verschoben. Dies ist ausgehend von Rasterverschiebungen in
nerhalb der Wiederholung der Trinucleotide zu erwarten. In
drei Fällen tauchen gleichzeitig zwei verschiedene Banden
auf; vgl. Fig. 3, Bahnen 5, 8 und 9. Dies ist dadurch er
klärbar, daß in diploiden Organismen jeder Locus zweimal
vorkommt und mit unterschiedlichen Allelen besetzt sein kann
(sogenannter balancierter Polymorphismus). Die Bande des
Fragments mit 177 Nucleotiden zeigt drei verschiedene
Größenklassen, die 5 bzw. 8 Nucleotide auseinanderliegen;
vgl. Fig. 3. Die um 8 Nucleotide kürzere Bande ist vermut
lich durch eine Deletion der in der DNA-Sequenz markierten
Wiederholung von 8 Nucleotiden entstanden. Die Herkunft der
längeren Bande ist unklar. Diese Deletionen bzw. Insertionen
entsprechen denen, die man im Bereich einer kryptisch simp
len DNA-Sequenz erwarten kann.
Die Mehrzahl der in diesem einfachen Experiment untersuchten
Stämme ist bereits voneinander unterscheidbar. Nicht unter
scheidbar sind lediglich die Stämme 2, 7 und 11 sowie 3 und
4. Für einen tatsächlichen Test würde man daher weitere Pri
mer-Paare einsetzen. Beispielsweise könnten 20 bis 50 unab
hängige DNA-Bereiche untersucht werden, um eine eindeutige
Identifizierung zu ermöglichen. Da die Größenklassen der
einzelnen Drosophila-Wildtypstämme in sich einheitlich sind,
ist davon auszugehen, daß die beobachteten Polymorphismen
nicht mit so hoher Häufigkeit auftauchen, daß Verwandt
schaftsbeziehungen nicht mehr feststellbar wären. Die Droso
phila-Wildtypstämme stammen ja alle von jeweils einem ein
zelnen Ausgangspaar ab und für den Test wurde die DNA von
mehreren 100 Individuen vereinigt. Wenn innerhalb dieser
"Familien" eine Änderung des Musters aufgetreten wäre, müßte
man mehr als maximal zwei Banden erwarten. Dies ist aber
hier nicht der Fall. Daraus folgt, daß die beobachteten Län
genklassen zumindest für einige Dutzend Generationen stabil
sind.
Die beobachteten Längenvariationen könnten auch durch wäh
rend des Versuchs auftretende Polymerasefehler verursacht
werden. Um diese Möglichkeit auszuschließen und um
gleichzeitig die allgemeine Reproduzierbarkeit nachzuweisen,
wird der in Beispiel 2 durchgeführte Versuch mit zwei ver
schiedenen DNA-Präparationen des Drosophila-Stammes Nr. 3 in
jeweils 10 unabhängigen Ansätzen wiederholt. Aus Fig. 4 ist
ersichtlich, daß alle Ansätze zu den gleichen Banden führen.
Ähnliche Versuche wurden auch für andere Loci durchgeführt.
Jedoch wurde in keinem Fall eine Veränderung der Bandenlänge
beobachtet. Dies zeigt, daß das Verfahren zuverlässig repro
duzierbar ist.
Literatur:
1. EP-A2 02 00 362
2. R. K. Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491
3. A. J. Jeffreys et al., Nature 314 (1985), 67-73
4. A. J. Jeffreys et al., Nature 316 (1985), 76-79
5. EP 87 11 6408.3
6. D. Tautz, Doktorarbeit Universität Tübingen (1983)
7. D. Tautz und M. Renz, J. Mol. Biol. 172 (1984), 229-235
8. D. Tautz und M. Renz, Nucleic Acids Research 12 (1984), 4127-4138
9. D. Tautz et al., Nature 322 (1986), 652-656
10. G. Levinson und G. A. Gutman, Mol. Biol. and Evolution 4 (1987), 203-221
11. T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982
12. L. M. Smith et al., Nature 321 (1986), 674-679
13. K. A. Wharton et al., Cell 40 (1985), 55-62
14. Y. W. Kan und A. M. Dozy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 5631-5635
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Claims (12)
1. Verfahren zur Analyse von Längenpolymorphismen in DNA-
Bereichen, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende
Schritte durchführt:
(a) Anlagerung von mindestens einem Primer-Paar an die
zu analysierende DNA, wobei jeweils eines der Mole
küle des Primer-Paares im wesentlichen komplementär
ist zu einem der komplementären Stränge der 5′- bzw.
3′-Flanke einer simplen oder kryptisch simplen DNA-
Sequenz, und die Anlagerung in solcher Orientierung
erfolgt, daß die bei einer Primer-gesteuerten Poly
merisationsreaktion mit jeweils einem der beiden
Primer gewonnenen Syntheseprodukte nach einer Dena
turierung als Matrize zur Anlagerung des jeweils an
deren Primers dienen können;
(b) Primer-gesteuerte Polymerasekettenreaktion; und
(c) Auftrennung und Analyse der Polymeraseketten
reaktionsprodukte.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Moleküle des Pri
mer-Paares in einem Abstand von 50 bis 500 Nucleotiden
voneinander an die zu untersuchende DNA angelagert wer
den.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem mindestens 2
Primer-Paare eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem 2 bis 50 Pri
mer-Paare eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die
Primer eine Länge von 15 bis 25 Nucleotiden aufweisen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die
Lage der Primer-Paare so ausgewählt wird, daß die spezi
fischen Polymerasekettenreaktionsprodukte der Primer-
Paare auf einem geeigneten Gel in einzelne Banden auf
trennbar sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der
Nachweis der spezifischen Polymerasekettenreaktionspro
dukte durch radioaktive Markierung oder durch nicht-ra
dioaktive Markierung, wie Fluoreszenzfarbstoffe, er
folgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die
zu untersuchenden simplen oder kryptisch simplen DNA-Se
quenzen in der Nähe oder innerhalb eines genetisch defi
nierten Locus sitzen, so daß der gefundene Polymorphis
mus als Marker für diesen Locus dienen kann.
9. Besteck (Kit) zur Durchführung des Verfahrens nach einem
der Ansprüche 1 bis 8, enthaltend:
- (a) ein oder mehrere Gefäße mit einer äquimolaren Mi schung von 1 bis 50 Oligonucleotidprimer-Paaren, die simple oder kryptisch simple DNA-Sequenzen flankie ren, wobei die Primer gegebenenfalls radioaktiv oder fluoreszenz-markiert sind;
- (b) ein Gefäß mit einem Enzym zur Polymerisation;
- (c) ein Gefäß mit den vier Desoxynucleosidtriphosphaten; und
- (d) ein Gefäß mit einer geeigneten Pufferstammlösung; und gegebenenfalls
- (e) ein Gefäß mit einer Kontroll-DNA, die zum Testen der Komponenten des Bestecks (Kit) geeignet sind.
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