DE3650788T2

DE3650788T2 - Produktion des pluripotenten Granulozyten-Koloniestimulierungsfaktors

Info

Publication number: DE3650788T2
Application number: DE3650788T
Authority: DE
Inventors: Lawrence M. Thousand Oaks Souza
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 1986-08-22
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2006-08-23
Also published as: NO982132D0; PT83242B; SG35892G; JPH0690751A; GR862185B; HK1029600A1; JPH11276168A; JP2527365B2; NO2003010I2; SA92130186B1; ATE332375T1; JP3115561B2; SG48964A1; NO2003010I1; CA1341537C; FI871700A0; NO303544B1; NL930127I1; EP0237545A1; NO314902B1

Description

Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen hämatopoetische Wachstumsfaktoren und Polynukleotide, die solche Faktoren kodieren. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere menschlichen pluripotente Granulozytenkolonien stimulierenden Faktor (hpG-CSF).
Das menschliche blutbildende (hämatopoetische) System ersetzt eine Vielzahl von weißen Blutzellen (neutrophile Leukozyten, Makrophagen und basophile Leukozyten/Mastzellen), roten Blutzellen (Erythrozyten) und gerinselbildenden Zellen (Megakaryozyten/Blutplättchen). Beim hämatopoetischen System des durchschnittlichen Mannes ist geschätzt worden, daß dieses jedes Jahr Granulozyten und Erythrozyten in der Größenordnung von 4,5 × 10¹¹ produziert, was einem jährlichen Ersatz des gesamten Körpergewichtes gleichkommt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154–158 (1985).
Man nimmt an, daß geringe Mengen von gewissen hämatopoetischen Wachstumsfaktoren für die Differenzierung einer kleinen Anzahl von Vorläufer-"Stammzellen" in die Vielzahl von Blutzelllinien, für die ungeheure Proliferation dieser Linien und für die letztendliche Differenzierung von reifen Blutzellen aus diesen Linien verantwortlich sind. Da die hämatopoetischen Wachstumsfaktoren in extrem kleinen Mengen vorhanden sind, hat sich der Nachweis und die Identifizierung dieser Faktoren auf eine Reihe von Tests gestützt, die bis jetzt nur zwischen den unterschiedlichen Faktoren auf der Grundlage von stimulativen Wirkungen auf kultivierte Zellen unter künstlichen Bedingungen unterscheiden. Als Ergebnis ist eine große Anzahl von Namen geprägt worden, um eine viel kleinere Anzahl von Faktoren zu bezeichnen. Als ein Beispiel für die daraus folgende Verwirrung sind die Ausdrücke IL-3, BPA, Multi-CSF, HCGF, MCGF und PSF alles Akronyme, von denen man nunmehr annimmt, daß sie einen einzigen hämatopoetischen Wachstumsfaktor bei Ratten betreffen. Metcalf, Science, 229, 16–22 (1985). Siehe auch, Burgess, et al. J. Biol. Chem., 252, 1988 (1977), Das, et al. Blood, 58, 600 (1980), Ihle, et al., J. Immunol., 129, 2431 (1982), Nicola, et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf, et al., Int. J. Cancer, 30, 773 (1982), und Burgess, et al. Int. J. Cancer, 26,647 (1980), die verschiedene wachstumsregulierende Glykoproteine bei Ratten betreffen.
Die Anwendung von rekombinanten genetischen Techniken hat etwas Ordnung in dieses Chaos gebracht. Zum Beispiel sind die Aminosäure- und DNA-Sequenzen für menschliches Erythropoietin, das die Produktion von Erythrozyten erregt, erhalten worden (siehe Lin, Veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. 85/02 610, veröffentlicht 20. Juni 1980). Rekombinante Verfahren sind auch auf die Isolierung von cDNA für einen menschlichen Granulozyten-Makrophagen-Kolonien erregenden Faktor angewendet worden. Siehe Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360–4364 (1985) und Wong, et al., Science, 228, 810–814 (1985). Siehe auch Yokota et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070 (1984), Fung, et al., Nature, 307, 233 (1984), und Gough, et al., Nature, 309, 763 (1984), welche die Klonierung von Rattengenen betreffen, sowie Kawasaki, et al., Science, 230, 291 (1985), die menschliches M-CSF betrifft.
Es ist gezeigt worden, daß ein menschlicher hämatopoetischer Wachstumsfaktor, menschlicher pluripotente Kolonien stimulierender Faktor (hpCSF) oder Pluripoietin genannt, im Kulturmedium einer menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie vorhanden ist, die mit 5637 bezeichnet und unter restriktiven Bedingungen bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland als A. T. C. C. Hinterlegungsnummer HTB-9 hinterlegt ist. Es ist berichtet worden, daß der hpCSF, der aus dieser Zellinie gereinigt erhalten worden ist, die Proliferation und Differenzierung von pluripotenten Vorläuferzellen erregt, was in Tests, die Vorläuferzellen für menschliches Knochenmark verwenden, zur Produktion aller hauptsächlichen Blutzellarten führt. Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526–1530 (1985). Die Reinigung von hpCSF verwendete: (NH₄)₂SO₂-Fällung; Anionen-Austauschchromatographie (DEAE-Cellulose, DE52); Gelfiltration (AcA54-Säule); und C18-Umkehrphasen-Hochauflösungsflüssigkeitschromatographie. Es wurde berichtet, daß ein als hpCSF identifiziertes Protein, das im zweiten der zwei Aktivitätspeaks in den C18-Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen eluiert wird, ein Molekulargewicht (MW) von 18.000 besitzt, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), unter Verwendung von Silberanfärbung. Von hpCSF wurde früher berichtet, das er einen isoelektrischen Punkt von 5,5 besitzt [Welte, et al., J. Cell. Biochem., Supp 9A, 116 ((985)) und eine hohe Differenzierungsaktivität für die myelomonozytische Leukämiezelllinie WEHI-3B D⁺ bei Mäusen [Welte, et al., UCLA Symposia on Molecular und Cellular Biology, Gale, et al., Hrg., New Series, 28 (1985)). Vorstudien zeigen, daß der als hpCSF identifizierte Faktor vorwiegend Granulozytkolonien erregende Aktivität während der ersten sieben Tage in einem menschlichen CFU-GM-Test besitzt.
Ein anderer Faktor, als menschliches CSF-β bezeichnet, ist ebenfalls aus der menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 isoliert und als ein Konkurrent des ¹²⁵I-markierten Granulozytkolonien erregenden Faktors bei Ratten (G-CSF) bei der Bindung an WEHI-3B D⁺-Zellen in einer dosisabhängigen Beziehung, die mit derjenigen von nicht-markiertem Ratten-G-CSF identisch ist, beschrieben worden [Nicola, et al., Nature, 314, 625–628 (1985)]. Es ist früher berichtet worden, daß diese dosisabhängige Beziehung einzigartig für nicht-markierten Ratten-G-CSF ist und Faktoren wie M-CSF, GM-CSF oder Multi-CSF ihn nicht besitzen [Nicola, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 3765–3769 (1984)]. CSF-β und G-CSF sind unter den CSFs auch in der Weise einzigartig, daß sie eine hochgradige Fähigkeit besitzen, die Differenzierung von WEHI-3B D⁺-Zellen zu induzieren. Nicola, et al., Immunology Today, 5, 76–80 (1984). Bei hohen Konzentrationen erregt G-CSF vermischte Granulozyt/Makrophagen-Kolonien bildende Zellen [Nicola, et al., (1984) oben], was mit Vorergebnissen konsistent ist, die das Auftreten von granulozytischen, monozytischen, vermischten granulozytischen/monozytischen und eosinophilen Kolonien (CFU-GEMM) nach 14tägiger Inkubation von menschlichen Knochenmarkskulturen mit hpCSF zeigten. CSF-β ist auch als die Bildung von neutrophilen granulozytischen Kolonien in Tests, die Mäuse-Knochenmarkszellen verwenden, erregend beschrieben worden, eine Eigenschaft, die ein Kriterium für die Identifizierung eines Faktors als ein G-CSF gewesen ist. Auf der Grundlage dieser Ähnlichkeiten ist menschliches CSF-β mit G-CSF (granulozytische Kolonien stimulierender Faktor) identifiziert worden. Nicola et al., Nature, 314, 625–628 (1985).
Basierend auf ihren gemeinsamen Eigenschaften, scheint es, daß menschliches CSF-β von Nicola et al., oben, und der hpCSF von Welte et al., oben, derselbe Faktor sind, den man richtigerweise als einen menschlichen pluripotente Granulozytkolonien erregenden Faktor (hpG-CSF) bezeichnen könnte. Die Charakterisierung und rekombinante Herstellung von hpG-CSF wäre besonders angesichts der berichteten Fähigkeit von Ratten-G-CSF, eine in-vitro-WEHI-3B D⁺-Leukämiezellpopulation bei "ganz normalen Konzentrationen" vollständig zu unterdrücken, und der berichteten Fähigkeit von rohen, injizierten Präparaten von Ratten-G-CSF, etablierte verpflanzte Myeloidleukämien in Mäusen zu unterdrücken, wünschenswert. Metcalf Science, 229, 16–22 (1985). Siehe auch, Sachs, Scientific American, 284(1), 40–47 (1986).
In dem Maße, in dem hpG-CSF sich als therapeutisch bedeutsam herausstellen sollte und daher in kommerziellen Mengen zugänglich sein müßte, ist es unwahrscheinlich, daß die Isolierung aus Zellkulturen eine angemessene Materialquelle zur Verfügung stellt. Es ist z.B. beachtenswert, daß Beschränkungen im Hinblick auf die kommerzielle Verwendung von Humantumorbank-Zellen, wie etwa der menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 (A. T. C. C. HTB9) zu bestehen scheinen, von denen bei Welte et al. (1985, oben) als Quellen für natürliche hpCSF-Isolate berichtet worden ist.
Die europäische Patentanmeldung EP-A-0169566 offenbart die Isolierung eines menschlichen CSF aus der Tumorzelllinie CHU-1 und dessen physikochemische Charakterisierung. Die spätere europäische Patentanmeldung EP-A-0215126, die auf sieben verschiedenen Prioritätsdokumenten beruht, von denen nur das erste dem ersten Prioritätsdatum im vorliegenden Fall vorangeht, offenbart die weitere Charakterisierung besagten CSFs und seine Herstellung durch rekombinante DNA-Technologie.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen pluripotenten Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (hpG-CSF)-Erzeugnisses, das die in vivo granulozytopoetischen biologischen Eigenschaften von natürlich auftretendem hpG-CSF aufweist, zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von:

(a) Kultivieren unter geeigneten Nährbedingungen von Säugerzellen, umfassend eine Promotor DNA, die anders ist als die hpG-CSF Promoter DNA, wirksam verbunden mit der DNA, die für ein hpG-CSF Polypeptid kodiert, das die ausgereifte Aminosäuresequenz von Tabelle 7 aufweist; und
(b) Isolieren von hpG-CSF, das von den Zellen exprimiert wurde.

Ebenfalls eingeschlossen sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen von Polypeptidprodukten hergestellt durch das Verfahren der Erfindung zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägermitteln umfassen und nützlich in der hpG-CSF-Therapie sind.
Die Polypeptidprodukte wie hergestellt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung können, allein oder in Kombination mit anderen hämatopoetischen Faktoren oder Medikamenten bei der Behandlung von hämatopoetischen Störungen, wie etwa aplastische Anämie, nützlich sein. Sie können auch bei der Handlung von hämatopoetischen Mangelerscheinungen nützlich sein, die von Chemotherapie oder von Strahlungstherapie herrühren. Der Erfolg von Knochenmarkstransplantationen z.B. kann durch Anwendung von hpG-CSF erhöht werden. Die Wundheilungsbehandlung bei Verbrennungen und die Behandlung von bakteriellen Entzündungen können ebenfalls aus der Anwendung von hpG-CSF Nutzen ziehen. Zusätzlich kann hpG-CSF auch bei der Behandlung von Leukämie nützlich sein, basierend auf einer berichteten Fähigkeit, Leukämiezellen zu differenzieren. Welte et al., proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526–1530 (1985) und Sachs, oben.
Zahlreiche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden den Fachleuten auf diesem Gebiet bei Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung deutlich werden, die die Praxis der Erfindung in ihren gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen veranschaulicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Figur ist eine teilweise Restriktionsendonukleasekarte des hpG-CSF-Gens mit Pfeilen, welche die Sequenzierungsstrategie darstellen, die verwendet worden ist, um die genomische Sequenz zu erhalten.
Detaillierte Beschreibung
DNA-Sequenzen, die einen Teil oder die Gesamtheit der Polypeptidsequenz von hpG-CSF kodieren, sind isoliert und charakterisiert worden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung vorgestellt und sind insbesondere auf Verfahren, die vor der Identifizierung von hpG-CSF-cDNA und genomischen Klonen durchgeführt werden, auf Verfahren, die zu einer solchen Identifizierung führen, und auf die Sequenzierung, die Entwicklung von Expressionssystemen, basierend auf cDNA, genomischen und künstlich hergestellten Genen, und die Verifizierung der Expression von hpG-CSF und Analogprodukten in solchen Systemen gerichtet.
Genauer gesagt, ist Beispiel 1 auf die Aminosäuresequenzierung von hpG-CSF gerichtet. Beispiel 2 ist auf die Darstellung einer cDNA-Bibliothek für Koloniehybridisierungs-Screening gerichtet. Beispiel 3 betrifft die Konstruktion von Hybridisierungssonden. Beispiel 4 betrifft das Hybridisierungs-Screening, die Identifizierung von positiven Klonen, die DNA-Sequenzierung eines positiven cDNA-Klons und die Erzeugung von Informationen über die Polypeptid-Primärstruktur (Aminosäuresequenz). Beispiel 5 ist auf die Identifizierung und Sequenzierung eines genomischen Klons gerichtet, der hpG-CSF kodiert. Beispiel 6 ist auf die Konstruktion eines künstlich hergestellten Gens gerichtet, das hpG-CSF kodiert, wobei E. coli-Präferenzcodons verwendet werden.
Beispiel 7 ist auf Verfahren zur Konstruktion eines E. coli-Transformationsvektors, der hpG-CSF kodierende DNA umfaßt, die Verwendung des Vektors bei der prokaryontischen Expression von hpG-CSF und die Analyse von Eigenschaften von rekombinanten Produkten der Erfindung gerichtet. Beispiel 8 ist auf Verfahren zur Erzeugung von Analoga von hpG-CSF gerichtet, wobei Cysteinreste mittels auf hpG-CSF kodierender DNA durchgeführter Mutagenese durch andere geeignete Aminosäurereste ersetzt werden. Beispiel 9 ist auf Verfahren zur Konstruktion eines Vektors, der hpG-CSF-Analoga kodierende DNA, abgeleitet aus einem positiven cDNA-Klon, umfaßt, die Verwendung des Vektors zur Transfektion von COS-1-Zellen und das kultivierte Wachstum der transfizierten Zellen gerichtet. Beispiel 10 betrifft physikalische und biologische Eigenschaften von rekombinanten Polypeptidprodukten der Erfindung.
Beispiel 1
(A) Sequenzierung von nach Literaturverfahren erhaltenem Material
Eine Probe (3–4 μg, 85–90% rein von SDS, Silberanfärbungs-PAGE) von hpG-CSF wurde vom Sloan Kettering Institute, New York, New York, erhalten, isoliert und gereinigt gemäß Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1526–1530 (1985).
Die N-terminale Aminosäuresequenz dieser Probe von hpG-CSF wurde in einem Durchlauf Nr. 1 durch Mikrosequenzanalyse unter Verwendung eines AB407A-Gasphasensequenzers (Applied Biosystems, Foster City, California) bestimmt, um die in Tabelle I unten dargestellte Sequenzinformation zu erhalten. In den Tabellen I bis IV werden Einzelbuchstabencodes verwendet, wobei "X" einen Rest bezeichnet, der nicht unzweideutig bestimmt wurde, und Reste in Klammern nur alternativ oder provisorisch zugeordnet wurden.
Tabelle I
In jedem Zyklus des Durchlaufs, für den Resultate in Tabelle I berichtet sind, war ein hoher Hintergrund vorhanden, was anzeigt, daß die Probe viele verunreinigende Bestandteile aufweist, vermutlich in Form chemischer Reste aus der Reinigung. Die Sequenz wurde nur zu Vergleichszwecken aufbewahrt.
In Durchlauf Nr. 2 wurde eine zweite Probe (5–6 μg, 95% rein) vom Sloan Kettering erhalten, wie für Durchlauf Nr. 1, und wie für Durchlauf Nr. 1 wurde ein Sequenzierungsverfahren durchgeführt. Diese Probe stammte aus derselben Materialpartie, die verwendet wurde, um 4 von Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82 1526–1530 (1985), zu erzeugen. Die Resultate sind in Tabelle II angegeben.
Tabelle II
Obgleich mehr Reste identifiziert wurden, lieferte Durchlauf Nr. 2 keine hinreichend lange, unzweideutige Sequenz, aus der eine vernünftige Anzahl von Sonden konstruiert werden könnte, um nach hpG-CFS-DNA zu suchen. Es wurde berechnet, daß wenigstens 1536 Sonden erforderlich gewesen wären, um, basierend auf der Sequenz von Tabelle II, die Isolierung von cDNA in Angriff zu nehmen. Man nahm an, daß wieder die Verunreinigung der Probe das Problem war.
Demgemäß wurde eine dritte Probe (3–5 μg, 40% rein) vom Sloan Kettering erhalten, wie oben. Dieses Präparat wurde nach Abtrennung durch SDS-PAGE in einem Versuch weiterer Reinigung elektrotransferiert. Die Sequenzanalyse dieser Probe lieferte keine Daten.
(B) Sequenzierung von nach verbesserten Verfahren erhaltenen Materialien
Um eine genügende Menge an reinem Material zu erhalten, um in geeigneter Weise eine definitive Aminosäuresequenzanalyse durchzuführen, wurden Zellen einer Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 (Subklon 1A6), wie im Sloan Kettering erzeugt, von Dr. E. Platzer erhalten. Die Zellen wurden anfangs in Kolben in Iscove-Medium (GIBCO, Grand Island, New York) kultiviert, um zu konfluieren. Nach Konfluenz wurden die Kulturen trypsinisiert und in Rollflaschen (1-1/2 Kolben/Flasche) eingeimpft, die jede 25 ml vorkonditioniertes Iscove-Medium unter 5% CO₂ enthielten. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C bei 0,3 UPM gezüchtet.
Cytodex-1^®-Perlen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) wurden gewaschen und unter Verwendung der folgenden Verfahren sterilisiert. 8 g Perlen wurden in eine Flasche gegeben und 400 ml PBS hinzugefügt. Die Perlen wurden durch sanftes Verwirbeln für 3 Stunden suspendiert. Nachdem man die Perlen absitzen ließ, wurde PBS abgezogen, die Perlen wurden in PBS gespült und frisches PBS wurde zugesetzt. Die Perlen wurden für 15 Minuten autoklaviert. Vor Verwendung wurden die Perlen in Iscove-Medium plus 10% Kalbsfötusserum (FCS) gewaschen, bevor frisches Medium plus 10% FCS hinzugefügt wurde, um behandelte Perlen zu erhalten.
Nachdem bis auf 30 ml das gesamte Medium aus jeder Rollflasche entfernt worden war, wurden 30 ml frisches Medium plus 10% FCS und 40 ml behandelte Perlen zu den Flaschen zugegeben. Die Flaschen wurden mit 5% CO₂ begast und alle Blasen wurden durch Absaugen entfernt. Die Flaschen wurden in Rollgestelle bei 3 UPM für 1/2 Stunden gelegt, bevor die Geschwindigkeit auf 0,3 UPM verringert wurde. Nach 3 Stunden wurde ein zusätzlicher Kolben trypsinisiert und jeder Rollflasche, die Perlen enthielt, zugesetzt.
Bei 40% bis 50% Konfluenz wurden die Rollflaschenkulturen mit 50 ml PBS gewaschen und für 10 Minuten gerollt, bevor das PBS entfernt wurde. Die Zellen wurden für 48 Stunden in Medium A (Iscove-Medium, das 0,2% FCS, 10^–8 M Hydrocortison, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält] kultiviert. Als nächstes wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugation bei 3000 UPM für 15 Minuten abgeerntet und bei –70°C gelagert. Die Kulturen wurden wieder mit Medium A, das 10% FCS enthielt, versorgt und für 48 Stunden kultiviert. Nach Verwerfen des Mediums wurden die Zellen mit PBS wie oben gewaschen und für 48 Stunden in Medium A kultiviert. Der Überstand wurde erneut abgeerntet und wie zuvor beschrieben behandelt.
Annähernd 30 Liter Medium, konditioniert mit 1A6-Zellen, wurden auf etwa 2 Liter auf einer Millipore-Pellicon-Einheit konzentriert, ausgerüstet mit zwei Kassetten, mit 10.000 MW-Schnitten bei einer Filtratrate von etwa 200 ml/min und einer Retentatrate von etwa 1000 ml/min. Das Konzentrat wurde mit etwa 10 Litern 50 mM Tris (pH 7,8) unter Verwendung derselben Vorrichtung und derselben Durchflußraten diafiltriert. Das diafiltrierte Konzentrat wurde mit 40 ml/min auf eine 1 Liter-DE-Zellulose-Säule geladen, äquilibriert in 50 mM Tris (pH 7,8). Nach Beladen wurde die Säule mit derselben Rate mit 1 Liter 50 mM Tris (pH 7,8) und dann mit 2 Litern 50 mM Tris (pH 7,8) mit 50 mM NaCl gewaschen. Die Säule wurde dann aufeinanderfolgend mit sechs 1 Liter-Lösungen von 50 mM Tris (pH 7,5) eluiert, die die folgenden Konzentrationen an NaCl enthielten: 75 mM; 100 mM; 125 mM; 150 mM; 200 mM; und 300 mM. Fraktionen (50 ml) wurden gesammelt und aktive Fraktionen wurden gepoolt und auf einer Amicon-Ultrafiltrationsrührzelleinheit, ausgerüstet mit einer YM5-Membran, auf 65 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wurde auf eine 2 Liter-AcA54-Gelfiltrationssäule, äquilibriert in PBS, geladen. Die Säule wurde bei 80 ml/h betrieben und 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Aktive Fraktionen wurden gepoolt und direkt auf eine C4-Hochauflösungsflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Säule geladen.
Proben, die im Volumen von 125 ml bis 850 ml variierten und 1–8 mg Protein enthielten, von dem etwa 10% hpG-CSF war, wurden bei einer Durchflußrate, die von 1 ml bis 4 ml pro Minute variierte, auf die Säule geladen. Nach Beladen und einer Anfangswaschung mit 0,1 M Ammoniumacetat (pH 6,0–7,0) in 80% 2-Propanol bei einer Durchflußrate von 1/ml/min, wurden 1 ml-Fraktionen gesammelt und bei 220 nm, 260 nm und 280 nm auf Proteine überprüft.
Als Ergebnis der Reinigung wurden von anderen proteinhaltigen Fraktionen klar Fraktionen getrennt, die hpG-CSF enthielten (als Fraktion 72 und 73 von 80). HpG-CSF wurde bei einer Reinheit von etwa 85 ± 5% und bei einer Ausbeute von etwa 50% isoliert (150–300 μg). Aus diesem gereinigten Material wurden 9 μg in Durchlauf Nr. 4 verwendet, einer Aminosäuresequenzanalyse, in der die Proteinprobe auf eine TFA-aktivierte Glasfaserscheibe ohne Polybrene aufgebracht wurde. Die Sequenzanalyse wurde mit einem AB 470A-Sequenzer gemäß den Verfahren von Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, 7990–7997 (1981) und Lai, Anal. Chim. Acta, 163, 243–248 (1984) durchgeführt. Die Ergebnisse von Durchlauf Nr. 4 erscheinen in Tabelle III.
Tabelle III
In Durchlauf Nr. 4 wurde über 31 Zyklen hinaus (entsprechend Rest 31 in Tabelle III) keine weitere signifikante Sequenzinformation erhalten. Um eine längere unzweideutige Sequenz zu erhalten, in einem Durchlauf Nr. 5, wurden 14 μg hpG-CSF, gereinigt aus konditioniertem Medium, mit 10 μl β-Mercaptoethanol für 1 Stunde bei 45°C reduziert, anschließend gründlich unter einem Vakuum getrocknet. Der Proteinrest wurde dann in 5%iger Ameisensäure wieder aufgenommen, bevor er auf eine polybrenisierte Glasfaserscheibe aufgebracht wurde. Die Sequenzanalyse wurde durchgeführt, wie für Durchlauf Nr. 4 oben. Die Ergebnisse von Durchlauf Nr. 5 sind in Tabelle IV angegeben.
Tabelle IV
Die in Tabelle IV angegebene Aminosäuresequenz war hinreichend lang (44 Reste) und unzweideutig, um Sonden für das Erhalten von hpG-CSF-cDNA zu konstruieren, wie unten beschrieben.
Beispiel 2
Unter den Standardverfahren zum Isolieren von interessierenden cDNA-Sequenzen ist die Herstellung von plasmidgetragenen cDNA-"Bibliotheken", abgeleitet aus reverser Transkription von mRNA, die in Donorzellen reichlich vorhanden ist, welche auf der Grundlage ihrer Expression eines Zielgens ausgewählt sind. Wo wesentliche Teile der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, können markierte einzelsträngige DNA-Sondensequenzen, die eine mutmaßlich in der "Ziel"-cDNA vorhandene Sequenz duplizieren, in DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, die auf klonierten Kopien der cDNA durchgeführt werden, die zur einzelsträngigen Form denaturiert worden sind. Weissmann, et al., US-Patent Nr. 4,394,443; Wallace, et al., Nucleic Acids Res., 6, 3543–3557 (1979), und Reyes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 3270–3274 (1982), und Jaye, et al., Nucleic Acids Res., 11, 2325–2335 (1983). Siehe auch US-Patent Nr. 4,358,535 für Falkow et al., das die DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren im Hinblick auf Diagnose betrifft; und Davis et al., "A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Labora tory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1980) auf Seiten 55–58 und 174–176, betreffend Kolonie- und Plaque-Hybridisierungstechniken.
Die Gesamt-RNA wurde aus annähernd 1 g Zellen aus einer Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 (1A6) unter Verwendung eines Guanidiniumthiocyanatverfahrens zur quantitativen Isolierung von intakter RNA extrahiert. [Chirgwin, et al., Biochemistry, 18, 5294–5299 (1979)].
Die sterile wäßrige RNA-Lösung enthielt die Gesamt-RNA aus den 1A6-Zellen. Um nur die Boten-RNA aus der Gesamt-RNA-Lösung zu erhalten, wurde die Lösung durch eine Säule gegeben, die Oligodesoxythymidylat [Oligo(dT)] (Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts) enthielt. Polyadenylierte (Poly-A⁺) Schwänze, die charakteristisch für BotenRNA sind, bleiben auf der Säule hängen, während ribosomale RNA eluiert wird. Als Ergebnis dieses Verfahrens wurden annähernd 90 μg Polyadenylierte Boten-RNA (Poly-A⁺-mRNA) isoliert. Die isolierte Poly-A⁺-Boten-RNA wurde mit Methylquecksilberhydroxid (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts) bei einer Endkonzentration von 4 mM für 5 Minuten bei Raumtemperatur vor Verwendung in einer cDNA-Reaktion vorbehandelt. Die Methylquecksilberhydroxidbehandlung denaturierte Wechselwirkungen von Boten-RNA sowohl mit sich selbst als auch mit verunreinigenden Molekülen, die die Translation hemmen. Payvar, et al., J. Biol. Chem., 258, 7636–7642 (1979).
Gemäß dem Okayama-Verfahren [Okayama, et al., Molecular & Cellular Biology, 2, 161–170 (1982)] wurde eine cDNA-Bank unter Verwendung der aus 1A6-Zellen erhaltenen mRNA hergestellt. Die cDNAs wurden dann durch Inkubation in einen Wirtsmikroorganismus E. coli K-12-Stamm HB101 zur Amplifikation transformiert.
Beispiel 3
Hybridisierungssonden, die auf der Basis der aminoterminalen Sequenz von hpG-CSF von Tabelle IV entworfen worden waren, bestanden aus einem Satz von 24 Oligonukleotiden, jedes 23 Basen lang und 3 Inosin-Reste enthaltend. Die Sondenoligonukleotide wurden gemäß dem Verfahren von Caruthers et al., Genetic Engineering, 4, 1–18 (1982) hergestellt und mit γ-³²P-ATP durch Kinasieren mit Polynukleotidkinase markiert. Die Sondenoligonukleotide, die der Boten-RNA für die Reste 23–30 der Sequenz von Tabelle IV entsprechen, sind in Tabelle V dargestellt.
Tabelle V hpG-CSF-Sonden
Die Zuweisung von Neutralität zu den Is beruhte auf der veröffentlichten Arbeit von Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1931–1935 (1985) und Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260, 2605–2608 (1985). Inosin kann jedoch einen destabilisierenden Effekt haben, wenn es mit G oder T basengepaart ist. In Takahashi et al. könnte es scheinen, daß Inosine eine neutrale Wirkung haben, weil sie sich im Durchschnitt als eine Gruppe nahe der Neutralität darstellen (z.B. drei hatten sich vorzugsweise mit C gepaart und zwei bevorzugten es nicht, sich mit T zu paaren).
Um die Wirkung zu testen, wenn Is mit Gs basengepaart sind, wurden Kontrollexperimente unter Verwendung einer N-myc Gensequenz und eines entsprechenden Klons entworfen. Die aus dem N-myc-Gen herausgepickten Sequenzen besaßen denselben Gesamt-G und -C-Gehalt an den ersten zwei Positionen jedes Codons wie dies durch die hpG-CSF-Sonden vorgeschrieben war. Die N-myc-Testsonden hatten somit dieselbe Länge, enthielten Is an denselben relativen Positionen und hatten potentiell denselben mittleren Tm (62–66°C, ohne Berücksichtigung der drei oder vier eingeschlossenen Inosin-Reste) wie die hpG-CSF-Sonden.
Zwei Sätze der N-myc-Testsonden wurden gemäß dem Verfahren von Caruthers et al., oben, konstruiert. Satz I, wie in Tabelle VI dargestellt, schloß ein: 1, ein 23 mer, perfekt passend; 2, bei dem drei Cs an der dritten Position durch Is ersetzt wurden, was den schlechtestmöglichen Fall des Hinzufügens von Is erzeugt; und 3, bei dem vier Cs an der dritten Position durch Is ersetzt wurden. Der zweite Satz von Testsonden wurde konstruiert, um eine mehr zufällige Verteilung von Inosin-Basenpaaren darzustellen, die eine insgesamt neutrale Basenpaarungswirkung ergeben könnte. Satz II, wie in Tabelle VI dargestellt, schloß ein: 4, enthaltend zwei Is, die sich mit Cs basenpaaren und eine mit einem G; und 5, identisch mit 4 mit der Addition von einem I:G-Basenpaar mehr.
Tabelle VI N-myc Testsonden
Fünf Replika-Filter, die N-myc-DNA-Sequenzen und Hühner-Wachstumshormon-DNA-Sequenzen (als eine Negativkontrolle) enthielten, wurden in einem Vakuumofen für zwei Stunden bei 80°C vor der Hybridisierung gebacken. Alle Filter wurden hybridisiert, wie in Beispiel 4 für die hpG-CSF-Sonden beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungszeit nur 6 Stunden betrug. Die Filter wurden dreimal bei Raumtemperatur dann einmal bei 45°C jeweils 10 Minuten gewaschen. Die Filter wurden mit einem Geigerzähler überprüft.
Der Filter, der die N-myc-Sonde 3 repräsentiert, ergab ein sehr schwaches Signal relativ zu den anderen vier mit Sonden beladenen Filtern und wurde nicht weiter gewaschen. Nach einer 10minütigen Waschung bei 50°C ergab der Geigerzähler das folgende Prozentsignal, wobei Probe 1 als 100% normalisiert wurde: Probe 2: 20%; Probe 3 (45°C): 2%; Probe 4: 92%; und Probe 5: 75%. Nach einer Waschung bei 55°C betrugen die Prozentanteile: Probe 2: 16%; Probe 4: 100%; und Probe 5: 80%. Eine letzte Waschung bei 60°C ergab die folgenden Prozentanteile: Probe 2: 1,6%; Probe 4: 90%; und Probe 5: 70%.
Somit wird in Gegenwart von drei Is, wie in den Sonden 2 und 4, ein bis zu 60facher Unterschied im Signal beobachtet, wenn man sich dem theoretischen Tm (Is nicht in die Berechnung eingeschlossen) annähert [basierend auf einem schlimmsten Fall von I-Basenpaarung (Sonde 2) und einem relativ neutralem I-Basenpaarungsfall (Sonde 4)].
Die durch die N-myc-Testhybridisierungen gewonnene Standardisierungsinformation wurde beim Waschen und Überwachen der hpG-CSF-Hybridisierung verwendet, wie unten angegeben, um den Grad an Vertrauen abzuschätzen, mit dem die Ergebnisse von weniger scharfen Waschungen akzeptiert werden können.
Beispiel 4
Gemäß dem Verfahren von Hanahan et al., J. Mol. Biol., 166, 557–580 (1983), wurden bakterienhaltige Rekombinanten mit cDNA-Inserts, wie in Beispiel 2 hergestellt, auf 24 Nitrocellulose-Filter (Millipore, Bedford, Massachusetts) verteilt, die auf Agarplatten lagen. Die Platten wurden dann inkubiert, um annähernd 150.000 Kolonien zu etablieren, die auf 24 andere Nitrocellulose-Filter replikaplattiert wurden. Die Replikas wurden inkubiert, bis eindeutige Kolonien auftraten. Die Bakterien auf den Filtern wurden für 10 Minuten auf Bögen von gerade mit Natriumhydroxid (0,5 M) gesättigtem Whatman 3 MM-Papier lysiert, dann mit Tris (1 M) für 2 Minuten übertragen, gefolgt von Übertragung mit Tris (0,5 M), das NaCl (1,5 M) enthält, für 10 Minuten. Wenn die Filter nahezu trocken sind, werden sie für zwei Stunden bei 80°C in einem Vakuumofen vor der Nukleinsäurehybridisierung gebacken. [Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 3683–3687 (1979)] und Maniatis et al., Cell, 81, 163–182 (1976).
Die Filter wurden für 2 Stunden bei 65°C in 750 ml 10 × Denhardts-Lösung, 0,2% SDS und 6 × SSC vorhybridisiert. Die Filter wurden in 6 × SSC gespült, dann zu viert in einen Beutel gegeben und für 14 Stunden in 6 × SSX und 10 × Denhardts-Lösung hybridisiert. Es gab annähernd 15 ml Lösung pro Beutel, die 50 × 10⁶ cpm ³²P-markierte Sonde (Oligonukleotide) enthielt.
Nach der Hybridisierung wurden die Filter dreimal in 6 × SSC (1 Liter/Waschung) bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten gewaschen. Die Filter wurden dann zweimal bei 45°C für jeweils 15 Minuten, einmal bei 50°C für 15 Minuten und einmal bei 55°C für 15 Minuten, unter Verwendung von 1 Liter Volumenteilen 6 × SSC gewaschen. Die Filter wurden für 2 Stunden bei –70°C unter Verwendung eines Verstärkungsschirms und eines Kodak XAR-2-Films autoradiographiert. Auf diesem Autoradiogramm gab es 40–50 nachgewiesene positive Signale, einschließlich fünf sehr starker Signale.
Die Bereiche, die die stärksten fünf Signale und zusätzliche fünf positive enthielten, wurden von den Masterplatten abgeschabt und für ein Sekundärscreening unter Verwendung derselben Sondenmischung unter denselben Bedingungen replattiert. Das Waschverfahren unterschied sich, in dem die Hochtemperaturwaschungen aus zwei bei 55°C für jeweils 15 Minuten und dann einer bei 60°C für 15 Minuten bestanden. Basierend auf der N-myc-Sondenstudie von Beispiel 3, wurde die letzte Waschtemperatur beim zweiten Screening erhöht, weil die Schmelztemperatur des Aggregats für die 24 23 mere 60–68°C betrug, ähnlich derjenigen der N-myc-Sonden. Direkt nach der zweiten Waschung bei 55°C wurden die Filter feucht belassen und ein Autoradiogramm wurde gemacht. Der Vergleich dieses Autoradiogramms mit einem zweiten Autoradiogramm, das für einen ähnlichen Zeitraum nach einer letzten Waschung bei 60°C gemacht wurde, zeigte, daß nur zwei der 10 getesteten Klone keinen wesentlichen Verlust im Signal beim Ansteigen von 55 bis 60°C erlitten. Es wurde später gezeigt, daß diese zwei Klone nahezu identische Länge und Restriktionsendonukleasenmuster aufwiesen. Ein als Ppo2 bezeichneter Klon wurde für die Sequenzierung ausgewählt.
Die Sequenzierung des rekombinanten hpG-CSF-cDNA-Klons Ppo2, erhalten mit dem obigen Verfahren, wurde mit dem Didesoxy-Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74, 5463–5467 (1977), durchgeführt. Der einzelsträngige DNA-Phage M-13 wurde als ein Klonierungsvektor verwendet, um einzelsträngige DNA-Matrizen aus den doppelsträngigen cDNA-Klonen zu liefern. Das Verfahren nach Sanger et al. erbrachte die in Tabelle VII dargestellte Sequenz, begleitet von ihrer Aminosäuretranslation und einem komplementären Strang in der Polypeptid-Kodierungsregion.
Folgende Merkmale der Sequenz von Tabelle VII sind bemerkenswert. Am 5'-Ende der Sequenz sind Basen gezeigt, die denjenigen des PolyG-cDNA-Linkers entsprechen. Dort treten dann etwa fünf Basen (bezeichnet mit "N") auf, die wegen der vorangehenden Mehrfach-Gs mit dem Verfahren von Sanger et al. nicht ohne weiteres unzweideutig bestimmt werden konnten. Die Sequenz danach zeigt eine Reihe von 12 Codons, die einen Teil einer mutmaßlichen Leader-Sequenz für das Polypeptid kodieren. Basierend auf der Übereinstimmung mit der aminoterminalen Sequenz von natürlichen Isolaten von hpCSF, beschrieben in Beispiel 1, wird der Anfangs-Threonin-Rest der mutmaßlichen "reifen" Form von hpG-CSF mit +1 bezeichnet. Reifer hpG-CSF ergibt sich danach als 174 Reste einschließend, wie angegeben. Auf die "Stop"-Codons (den OP-Codon, TGA) folgen annähernd 856 Basen einer untranslatierten 3'-Sequenz und Mehrfach-As des PolyA-"Schwanzes". Einmalig auftretende HgiAi- und ApaI-Restriktionsendonukleasenerkennungsstellen, sowie zwei StuI-Stellen (unten im Hinblick auf die Konstruktion von prokaryontischen und eukaryontischen Expressionssystemen diskutiert) sind ebenfalls in Tabelle VII bezeichnet. Wegen des Fehlens von Asparagin-Resten im Polypeptid gibt es keine sichtbaren Stellen für N-Glycosylierung. Die unterstrichenen sechs Basen nahe dem Ende der 3'-untranslatierten Sequenz stellen eine potentielle Polyadenylierungsstelle dar.
Es ist bemerkenswert, daß jeder der zwei zusätzlichen cDNA-Klone, die mit den oben beschriebenen Hybridisierungsverfahren aus einer Gesamtheit von 450.000 Klonen heraus identifiziert worden waren, keine DNA enthielten, welche die gesamte Leader-Sequenz von der Transkriptionsinitiationsstelle aufwärts kodiert. In der Tat endeten alle drei hpG-CFS-Klone in der 5'-Region an exakt derselben Stelle, was anzeigt, daß die Sekundärstruktur der transkribierten mRNA die cDNA-Bildung über diese Stelle hinaus stark behindert. In praktischer Hinsicht könnte daher ein cDNA-Expressionsscreening, wie etwa bei Okayama et al., Mol. and Cell. Biol., 3, 280–289 (1983) und tatsächlich bei Wong et al., Science, 228, 810–814 (1985), verwendet, um GM-CSF zu isolieren, nicht ohne weiteres auf die Isolierung von hpCSF-DNA angewendet werden, da solche Isolierungssysteme normalerweise auf dem Vorhandensein eines cDNA-Transkripts in voller Länge in den getesteten Klonen beruhen.
Die obige Sequenz ist nicht ohne weiteres für das Sicherstellen direkter Expression von hpG-CSF in einem mikrobiellen Wirt zugänglich. Um solch eine Expression sicherzustellen, sollte die hpG-CSF-Kodierungsregion mit einem Anfangs-ATG-Codon versehen werden und die Sequenz sollte in einen Transformationsvektor an einer Stelle inseriert werden, die unter Kontrolle einer geeigneten Promotor/Regulator-DNA-Sequenz steht.
Beispiel 5
In diesem Beispiel wurde cDNA, die hpG-CFS, wie im vorangehenden Beispiel isoliert, kodierte, verwendet, um einen genomischen Klon zu screenen. Eine Lambdaphagen-Genombibliothek aus fötaler menschlicher Leber [hergestellt gemäß dem Verfahren von Lawn et al., Cell, 15, 1157–1174 (1978) und von T. Maniatis erhalten] wurde unter Verwendung einer einzelstranggebrochenen translatierten Sonde gescreent, die aus zwei hpG-CSF-cDNA-Fragmenten besteht, die durch Verdauung mit HgiAI und StuI isoliert worden waren HgiAI bis StuI, 649 bp; StuI bis StuI, 639 bp). Eine Gesamtheit von annähernd 500.000 Phagen wurde auf 12 (15 cm) Petrischalen plattiert und die Plaques abgehoben und unter Verwendung des Benton/Davison-Verfahrens [Benton et al., Science, 196, 180 (1977)] zur Sonde hybridisiert. Eine Gesamtheit von 12 positiven Klonen wurde beobachtet. Drei Klone (1–3), welche die stärksten Signale bei Autoradiographie in einem Sekundärscreening lieferten, wurden in 1 Liter-Kulturen gezüchtet und durch Restriktionsenzymverdauung und Southern-Transfer unter Verwendung eines radioaktiv markierten 24meren Oligonukleotids (kinasiert mit γ-³²P-ATP) 5'CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3' kartiert. Die Kartierungsergebnisse zeigten, daß die Isolate 1 und 3 identisch waren und 2 enthielt 2.000 zusätzliche Basen 5' zum hpG-CSF-Gen. Daher wurde Klon 2 für die weitere Charakterisierung verwendet. DNA aus Klon 2 wurde mit R1 verdaut um ein 8.500 bp langes, hpG-CSF enthaltenes Fragment freizusetzen, das anschließend in pBR322 subkloniert und weiter durch Restriktionsendonukleaseverdauungen, Southern-Transfer, M13-Subklonierung und Sequenzierung kartiert wurde. Die erhaltene Sequenz ist, wie in Tabelle VIII dargestellt.
Eine Restriktionsendonukleasenkarte (annähernd 3,4 Kb) von genomischer DNA, die das hpGCSF-Gen enthält, ist detailliert in 1 dargestellt. Die in 1 gezeigten Restriktionsendonukleasen sind: NcoI, N; PstI, P; BamHI,B; ApaI, A; XhoI, X; und Kpn, K. Die Pfeile unter der Karte stellen die Sequenzierungsstrategie dar, die verwendet wurde, um die genomische Sequenz zu erhalten. Die eingerahmten Regionen sind diejenigen, die im cDNA-Klon gefunden wurden, wobei die Rahmen mit gestrichelten offenen Enden Sequenzen darstellen, die nicht im cDNA-Klon vorhanden sind, aber durch Sondierung von mRNA-Transfer identifiziert wurden. Identifizierung von Kodierungssequenzen, die für Exon'1 vorgeschlagen werden, wurden mit Northern-Transfer-Analyse durchgeführt. Eine 24mere Oligonukleotid-Sonde ^5'CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT^3', die die vorhergesagten Spleißverbindungen für die Exons 1 und 2 überspannt, wurde in einem Northern-Transfer-Format zu hpG-CSF-mRNA hybridisiert. Der resultierende Transfer zeigt eine mRNA mit derselben Größe (1650 bp) wie diejenige, die man mit einer Exon 2-Oligonukleotidsonde sieht. Diese Daten, kombiniert mit der Fähigkeit zu direkter Expression von hpG-CFS aus dem pSVGM-Ppo1-Vektor (Beispiel 9) unter Verwendung des in Tabelle VIII dargestellten Met-Initiationskodons, definieren die in Exon 1 enthaltenen Kodierungssequenzen. Die Exons 2–5 werden von den im cDNA-Klon (Ppo2) des hpG-Csf-Gens (Tabelle VII) erhaltenen Kodierungssequenzen definiert.
Beispiel 6
Das Beispiel betrifft die Herstellung eines künstlich hergestellten Gens, das hpG-CSF kodiert und E. coli-Präferenzcodons einschließt.
Kurz gesagt, war die verwendete Vorschrift im allgemeinen so, wie sie in der Offenbarung der PCT-Veröffentlichung Nr. WO83/04053 (Alton et al.) derselben Anmelderin dargestellt ist, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Die Gene wurden für den anfänglichen Zusammenbau von Teiloligonukleotiden zu mehrfachen Duplizes konstruiert, die selbst zu drei diskreten Abschnitten zusammengebaut wurden. Diese Abschnitte waren auf schnelle Amplifikation hin konstruiert und konnten nach Entfernung des Amplifikationssystems sequentiell oder durch eine mehrfache Fragmentligation in einem geeigneten Expressionsvektor zusammengebaut werden.
Die Konstruktion der Abschnitte I, II und III ist in Tabelle IX bis XIV dargestellt. Bei der Konstruktion von Abschnitt I, wie dargestellt in den Tabellen IX und X, wurden Oligonukleotide 1–14 zu 7 Duplizes (1 und 8; 2 und 9; 3 und 10; 4 und 11; 5 und 12; 6 und 13; und 7 und 14) zusammengebaut. Die 7 Duplizes wurden dann ligiert, um Abschnitt I, wie in Tabelle X gezeigt, zu bilden. Man kann in Tabelle X auch noch bemerken, daß Abschnitt I stromaufwärts ein kohäsives XbaI-Ende und stromabwärts ein kohäsives BamHI-Ende einschließt, die für die Ligation mit Amplifikations- und Expressionsvektoren und für die Ligation mit Abschnitt II nützlich sind.
Tabelle IX EChpG-CSFDNA ABSCHNITT I
Tabelle X EChpG-CSFDNA ABSCHNITT 1
Wie in Tabellen XI und XII dargestellt, werden bei der Konstruktion von Abschnitt II die Oligonukleotide 15–30 zu 8 Duplizes (15 und 23; 16 und 24; 17 und 25; 18 und 26; 19 und 27; 20 und 28; 21 und 29; und 22 und 30) zusammengebaut. Diese 8 Duplizes werden dann ligiert, um Abschnitt II, wie in Tabelle XII gezeigt, zu bilden. Wie weiter in Tabelle XII gezeigt, besitzt Abschnitt II stromaufwärts ein kohäsives BamHI-Ende und stromabwärts ein kohäsives EcoRI-Ende, die für die Ligation mit einem Amplifikationsvektor und für die Ligation mit Abschnitt I nützlich sind. Nahe seinem stromabwärtsliegende Ende schließt Abschnitt II auch noch eine stromabwärtige SstI-Stelle ein, die bei der eventuellen Ligation der Abschnitte II und III nützlich ist.
Tabelle XI EChpG-CSFDNA ABSCHNITT II
Schließlich wird Abschnitt III so konstruiert, wie in den Tabellen XIII und XIV dargestellt. Für diese Konstruktion werden die Oligonukleotide 31–42 zu 6 Duplizes (31 und 37; 32 und 38; 33 und 39; 34 und 409; 35 und 41; und 36 und 42) zusammengebaut. Die 6 Duplizes werden dann ligiert, um Abschnitt III, wie in Tabelle XIV dargestellt, zu bilden. Wie ebenfalls in Tabelle XIV gezeigt, schließt Abschnitt III stromaufwärts ein kohäsives BamHI-Ende und stromabwärts ein kohäsives EcoRI-Ende ein, die für die Ligation in einen Amplifikationsvektor und zumindest im Fall des EcoRI-Endes in einen Expressionsvektor nützlich sind. Zusätzlich besitzt Abschnitt III stromaufwärts eine SstI-Stelle, die bei der eventuellen Ligation der Abschnitte II und III nützlich ist.
Tabelle XIII EChpG-CSFDNA ABSCHNITT III
Das durch Abschnitt I gebildete XbaI-bis-BamHI-Fragment wird in einen M13mp11-Phagenvektor ligiert, geöffnet mit XbaI und BamHI. Der Vektor wird dann erneut durch Verdauung mit BamHI und EcoRI geöffnet, gefolgt von Ligation mit dem BamHI-bis-EcoRI-Fragment, das durch Abschnitt II gebildet ist. In dieser Stufe haben sich die Abschnitte I und II in richtiger Orientierung miteinander verbunden. Als nächstes wird ein anderer M13mp11-Vektor durch BamHI- und EcoRI-Verdauung geöffnet und dann mit dem BamHI-bis-EcoRI-Fragment ligiert, das durch Abschnitt III gebildet ist.
Der Vektor, der die Abschnitte I und II enthält, wird mit XbaI und SstI verdaut. In ähnlicher Weise wird der Vektor, der Abschnitt III enthält, mit SstI und EcoRI verdaut. Die beiden kleineren der zwei Fragmente, die aus jeder Verdauung hervorgehen, werden in ein Plasmid pCFM1156 ligiert, das zuvor mit XbaI und EcoRI geöffnet wird. Das Produkt dieser Reaktion ist ein Expressionsplasmid, das eine kontinuierliche DNA-Sequenz enthält, wie sie in Tabelle XV dargestellt ist, die das gesamte hpG-CSF-Polypeptid mit einem aminoterminalen Methionin-Codon (ATG) für E. coli-Translationsinitiation kodiert.
Obwohl jeder geeignete Vektor verwendet werden kann, um diese DNA zu exprimieren, kann das Expressionsplasmid pCFM1156 leicht aus einem Plasmid pCFM 836 konstruiert werden, dessen Konstruktion in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 136 490 beschrieben ist. pCFM836 wird zunächst mit NdeI geschnitten und dann mit PolI mit glatten Enden versehen, so daß beide existierenden NdeI-Stellen zerstört werden. Als nächstes wird der Vektor mit ClaI und SacII verdaut, um einen existierenden Polylinker vor Ligation mit einem Ersatz-Polylinker zu entfernen, wie in Tabelle XVI dargestellt. Dieser Ersatz-Polylinker kann gemäß dem Verfahren von Alton et al., oben, konstruiert werden. Die Steuerung der Expression im Expressionsplasmid pCFM1156 erfolgt mit Hilfe eines Lambda-P_L-Promotors, der selbst unter Kontrolle eines C₁₈₅₇-Repressor-Gens stehen kann (wie im E. coli-Stamm K12ΔHtrp zur Verfügung gestellt).
Beispiel 7
Dieses Beispiel betrifft die E. coli-Expression eines hpG-CSF-Polypeptids mittels einer DNA-Sequenz, die [Met^–1]hpCSF kodiert. Die verwendete Sequenz war teilweise synthetisch und teilweise von cDNA abgeleitet. Die synthetische Sequenz verwendete E. coli-Präferenzcodons.
Plasmid Ppo2, welches das hpG-CSF-Gen, das in Tabelle VII dargestellt ist, enthält, wurde mit HgiAI und StuI verdaut, was ein annähernd 645 Basenpaare langes Fragment zur Verfügung stellte, welches das Gen für reifen hpCSF (wie in Tabelle VII dargestellt) zur Verfügung stellt mit sieben der Leadersequenz-Restcodons am 5'-Ende und etwa 100 Basenpaaren der nicht-kodierenden 3'-Region. HgiAI-Verdauung ließ ein vier Basenpaare langes kohäsives 5'-Ende übrig, das identisch mit demjenigen von PstI ist, und StuI ließ ein glattes Ende übrig. Dies ermöglichte leichte Insertion des Fragments in M13 mp8 (Rf), geschnitten mit PstI und mit dem glatte Enden bildenden Restriktionsenzym HincII. Bei Amplifikation in M13 wurde die hpG-CSF-DNA durch Verdauung mit ApaI und BamHI herausgeschnitten, die an der ApaI-Stelle, die Codons für die Reste +3 bis +5 von hpCSF überspannend, bzw. an einer BamHI-Stelle, "stromabwärts" der HincII-Stelle im M13 mp8-Restriktionspolylinker, schneiden. Um E. coli-Expression des hpG-CSF-Polypeptids zu ermöglichen, wurde ein synthetisches Fragment hergestellt, wie in Tabelle XVII unten dargestellt.
Tabelle XVII
Wie man aus der Analyse von Tabelle XVII feststellen kann, schließt der Linker ein kohäsives ApaI-Ende, Codons, die die anfänglichen drei Reste des Aminoendes von hpG-CSF spezifizieren (und die Thr¹, Pro², Leu³ spezifizierenden Codons "wiederherstellen", die bei der ApaI-Verdauung der oben beschriebenen M13-DNA abgebaut wurden, und Codons verwenden, die vorzugsweise in E. coli exprimiert werden), ein translationinitiierendes ATG, eine Sequenz aus 24 Basenpaaren, die eine Ribosom-Bindungsstelle zur Verfügung stellt, und ein kohäsives XbaI-Ende ein.
Der für E. coli-Expression verwendete Expressionsvektor war derjenige, der als pCFM536 in der europäischen Patentanmeldung Nr. 136 490, veröffentlicht am 10. April 1985, von Morris beschrieben worden ist. (Siehe auch A. T. C. C. 39934, E. coli JM103, der pCFM536 enthält). Kurz gesagt, wurde Plasmid pCFM536 mit XbaI und BamHI verdaut. Das hpG-CSF-Fragment (ApaI/BamHI) und der oben beschriebene Linker XbaI/ApaI wurden dann dort hinein ligiert, um ein als Plasmid p536Ppo2 bezeichnetes Plasmid zu bilden.
Plasmid p536Ppo2 wurde in eine phagenresistente Variante des E. coli AM7-Stammes transformiert, der zuvor mit Plasmid pMW1 (A. T. C. C. Nr. 39933), das ein CI⁸⁵⁷-Gen enthält, transformiert worden war. Die Transformation wurde auf der Basis des antibiotischen (amp) Resistenz-Markergens verifiziert, das auf dem pCFM536-Vorläuferplasmid vorlag. Zellkulturen in LB-Brühe (Ampicillin 50 μg 1 ml) wurden bei 28°C gehalten und bei Zellwachstum in Kultur auf A600 = 0,5 wurde hpCSF-Expression durch Anheben der Kulturtemperatur auf 42°C für 3 Stunden induziert. Der endgültige O. D. der Kultur betrug A600 = 1,2.
Das Expressionsniveau von hpG-CSF durch transformierte Zellen wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel, angefärbt mit blauem Coomassie-Farbstoff, auf 3–5% des gesamten Zellproteins geschätzt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3500 g für 10 Minuten in einem JS-4.2-Rotor abgeerntet. Zellen bei 25% (w/v) in Wasser wurden durch dreimaliges Hindurchgeben durch eine French-Press-Zelle bei 10.000 psi zerbrochen. Die gebrochene Zellsuspension wurde bei 10.000 g für 15 Minuten in einem JA-20-Rotor zentrifugiert. Das Pellet wurde in Wasser wieder in Suspension gebracht und bei etwa 5 mg/ml Gesamtprotein in 1% Laurinsäure, 50 mM Tris, pH 8,7 löslich gemacht. Das löslich gemachte Pelletmaterial wurde bei 15.000 g für 10 Minuten zentrifugiert und zum Überstand wurde CuSO₄ bis 20 mM zugegeben. Nach einer Stunde wurde diese Probe zur Reinigung gemäß den Verfahren von Beispiel 1(B) auf eine C4-HPLC-Säule geladen, wobei Anpassungen für das Volumen und die Konzentration vorgenommen wurden.
Ein zweites Reinigungsverfahren wurde entwickelt, um größere Mengen hpG-CSF, formuliert in einem nicht-organische Verbindungen enthaltenden Puffer, zu liefern. Dieses Material ist für in-vivo-Studien geeignet. 150 g Zellpaste wurden in etwa 600 ml 1 mM DTT wieder in Suspension gebracht und 4mal durch einen Manton Gualin Homogenizer bei etwa 7000 PSI hindurchgegeben. Die gebrochene Zellsuspension wurde bei 10.000 g für 30 Minuten zentrifugiert und das Pellet wurde in 400 ml 1% Desoxycholat (DOC), 5 mM EDTA, 5 mM DTT und 50 mM Tris, pH 9 wieder in Suspension gebracht. Diese Suspension wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten vermischt und bei 10.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in etwa 400 ml Wasser wieder in Suspension gebracht und bei 10.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 100 ml 2% Sarkosyl und 50 mM bei pH8 löslich gemacht. CuSO₄ wurde auf 20 μM zugegeben und die Mischung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann bei 20.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Zum Überstand wurden 300 ml Aceton zugegeben. Diese Mischung wurde für 20 Minuten auf Eis gegeben und dann bei 5000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 250 ml 6 M Guanidin und 40 mM Natriumacetat bei pH 4 aufgelöst und über eine 1200 ml G-25-Säule gegeben, äquilibriert und betrieben in 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4. Der hpG-CSF-Peak (etwa 400 ml) wurde gepoolt und auf eine 15 ml CM-Cellulose-Säule gegeben, äquilibriert in 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4. Nach Beladen wurde die Säule mit 60 ml 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4 und mit 25 mM Natriumchlorid gewaschen und dann wurde die Säule mit 200 ml 20 mM Natriumacetat bei pH 5,4 und mit 37 mM Natriumchlorid eluiert. 150 ml dieses Eluats wurden auf 10 ml konzentriert und auf eine 300 ml G-75-Säule aufgebracht, äquilibriert und betrieben in 20 mM Natriumacetat und 100 mM Natriumchlorid pH 5,4. Die Peakfraktionen, die 35 ml umfassen, wurden gepoolt und filtersterilisiert. Die endgültige Konzentration von hpG-CSF betrug 1,5 mg/ml, ist mehr als 95% rein, wie durch Analyse auf einem Gel bestimmt, und enthielt weniger als 0,5 ng Pyrogen pro 0,5 mg hpG-CSF. Das Pyrogen-Niveau wurde unter Verwendung eines Limulus-Amebocyte-Lysat(LAL)-Testsatzes (M. A. Bioproducts, Walkersville, Maryland) bestimmt.
Beispiel 8
Dieses Beispiel betrifft die Verwendung rekombinanter Verfahren zur Erzeugung von Analoga von hpG-CSF, in denen Cysteinreste, die an den Positionen 17, 36, 42, 64 und 74 vorhanden sind, individuell durch einen geeigneten Aminosäurerest ersetzt sind.
Ortsgerichtete Mutageneseverfahren nach Souza et al., Veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO85/00817, veröffentlicht am 28. Februar 1985, wurden auf [Met^–1]-Kodierungs-DNA von Plasmid p536Ppo2 durchgeführt, wie unten beschrieben, unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, die in ihre Größe zwischen 20 und 23 Basen variierten, wie in Tabelle XVIII unten dargestellt. Oligonukleotid Nr. 1 ermöglichte die Bildung eines Gens, das [Ser¹⁷]hpG-CSF kodiert; Oligonukleotid Nr. 2 ermöglicht die Bildung von [Ser³⁶]hpG-CSF usw.
Tabelle XVIII
Die auf Cys zu Ser ortsgerichteten Mutageneserestriktionen wurden unter Verwendung von M13 mp10 durchgeführt, das ein XbaI-BamHI-hpG-CSF-Fragment enthielt, isoliert aus p536Ppo2, als Matrize. DNA aus jedem M13 mp10-Klon, der eine Cys-Ser-Substitution enthielt, wurden mit XbaI und BamHI behandelt. Das resultierende Fragment wurde in den Expressionsvektor pCFM746 kloniert und die Expressionsprodukte wurden wie in Beispiel 7 isoliert.
Das Plasmid pCFM746 kann durch Schneiden eines Plasmid pCFM736 (dessen Konstruktion aus hinterlegten und öffentlich zugänglichen Materialien bei Morris, Veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO85/00829, veröffentlicht am 28. Februar 1985, beschrieben ist) mit ClaI und BamHI, um einen existierenden Polylinker zu entfernen und den folgenden Polylinker einzusetzen, konstruiert werden.
Tabelle XIX
In einem Reinigungsverfahren für Cys-zu-Ser-Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung wurden etwa 10–15 g Zellpaste in 40 ml 1 mM DTT wieder suspendiert und dreimal durch eine Französische Druckzelle bei 10.000 psi hindurchgegeben. Die gebrochene Zellsuspension wurde bei 1000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in 1% DOC, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 9, suspendiert und man ließ es 30 Minuten bei Raumtemperatur durchmischen. Die Mischung wurde bei 10.000 g für 30 Minuten zentrifugiert, erneut in 40 ml H₂O suspendiert und noch einmal bei 10.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml 2% Sarkosyl, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8, gelöst. Nach Vermischen für eine Stunde wurde die Mischung durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 Minuten geklärt und dann auf eine 300 ml G-75-Säule, äquilibriert und betrieben in 1% Sarkosyl, 50 mM Tris, pH 8, aufgebracht. Fraktionen, die das Analogon enthalten, wurden gepoolt und man ließ sie durch Stehenlassen an der Luft für wenigstens einen Tag an der Luft oxidieren. Die endgültigen Konzentrationen variierten von 0,5–5 mg/ml.
Beispiel 9
In diesem Beispiel wurde ein Säugetierzell-Expressionssystem konstruiert, um in Erfahrung zu bringen, ob ein aktives Polypeptidprodukt von hpG-CSF-DNA in Säugetierzellen (COS-1, A. T. C. C. CRL-1650) exprimiert und durch diese zugeschnitten werden kann. Dieses System wurde konstruiert, um Ausscheidung eines Polypeptidanalogons von hpG-CSF über Expressi on und sekretorische Verarbeitung einer teilweise synthetischen, teilweise von cDNA abgeleiteten Konstruktion zu liefern, die [Ala¹]hpG-CSF kodiert, dem ein Leader-Polypeptid vorangeht, das die Sequenz von Resten hat, die bei Wong et al., Science, 228, 810–815 (1985) und Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4360–4364 (1985), menschlichem GM-CSF zugeschrieben wird.
Der Expressionsvektor, der für Vorstudien zur Expression von Polypeptidprodukten der Erfindung verwendet wurde, war ein "Shuttle"-Vektor, der sowohl pBR322 als auch SV40-DNA einschloß, und konstruiert worden war, um autonome Replikation sowohl in E. coli- als auch Säugetierzellen zu ermöglichen, wobei die Säugetierzellexpression inserierter exogener DNA unter der Kontrolle einer viralen Promotor/Regulator-DNA-Sequenz stand. Dieser Vektor, als pSVDM-19 bezeichnet, enthalten in E. coli HB101, wurde am 23. August 1985 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer A. T. C. C. 53241.
Die spezifischen Manipulationen, die mit der Konstruktion des Expressionsvektors verbunden waren, waren wie folgt. Eine leaderkodierende DNA-Sequenz wurde synthetisiert, wie in Tabelle XX unten dargestellt.
Tabelle XX
Wie in Tabelle XX gezeigt, schloß die Sequenz kohäsive HindIII- und ApaI-Enden und Codons für 17 Aminosäurereste ein, die dem "Leader" von menschlichem GM-CSF zugeschrieben werden. Es folgen Codons, die einen Alaninrest, einen Prolinrest und einen Leucinrest spezifizieren. Die Prolin- und Leucinreste duplizieren die an den Positionen +2 und +3 von hpG-CSF vorhandenen Aminosäuren, während der Alaninrest für den anfänglichen aminoterminalen (+1) Rest von GM-CSF statt von hpG-CSF duplikativ ist. Der Ersatz von Threonin durch Alanin wurde so konstruiert, um die richtige Wirtszell-"Abarbeitung" des GM-CSF-Leaders durch zelluläre Mechanismen zu erleichtern, die normalerweise bei der sekretorischen GM-CSF-Verarbeitung betroffen sind.
Plasmid pSVDM-19 wurde mit KpnI verdaut und die Stelle wurde mit Klenow-Enzym zu einem glatten Ende gemacht. Danach wurde die DNA mit HindIII geschnitten. Das resultierende große Fragment wurde mit dem HindIII/PvuII-Fragment, das in Tabelle VII dargestellt ist (isoliert aus Plasmid Ppo2 als das zweitgrößte Fragment, das aus der HindIII-Verdauung und der Teilverdauung mit PvuII stammt), kombiniert und ligiert, um Plasmid pSV-Ppo1 zu bilden. Das künstlich hergestellte GM-CSF-Leader-Sequenzfragment von Tabelle VIII wurde dann in pSV-Ppo1 ligiert (im Anschluß an dessen Schneiden mit HindIII und ApaI), um Plasmid pSVGM-Ppo1 zu liefern.
Calciumphosphat-Präzipitate (1–5 μg) von Plasmid-pSVGM-Ppo1-DNA wurde in 60 mm-Doppelplatten von COS-1-Zellen transformiert, wie sie im wesentlichen bei Wigler et al., Cell, 14, 725–731 (1978), beschrieben sind. Als Kontrolle wurde Plasmid pSVDM-19 ebenfalls in COS-1-Zellen transformiert. Gewebekulturüberstände wurden 5 Tage nach Transfektion abgeerntet und auf hpG-CSF-Aktivität getestet. Die Ausbeuten an [Ala¹]hpG-CSF aus dem Kulturüberstand lagen in der Größenordnung von 1 bis 2,5 μg/ml.
Im Anschluß an die erfolgreiche Expression des mit der Kodierung für [Ala¹]hpG-CSF-Produkt versehene Plasmid pSVGM-Ppo1 in COS-1-Zellen, wurde ein anderer Vektor konstruiert, der die menschliche GM-CSF-Leader-Sequenz einschließt, aber ein Codon für einen Threonin-Rest aufweist (das natürlicherweise an Position 1 von hpG-CSF auftritt), das das Codon für Alanin an dieser Position ersetzt. Kurz gesagt, wurde ein Oligonukleotid synthetisiert (^5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG) für ortsgerichtete Mutagenese (SDM). Das HindIII- bis BamHI-hpG-CSF-Fragment in pSVGM-Ppo1 wurde für die SDM in M13 mp10 ligiert. Das neu synthetisierte hpG-CSF-Gen, das ein Thr-Codon in Position 1 enthielt, wurde durch Schneiden mit HindIII und EcoRI isoliert. Das Fragment wurde dann in pSVDM-19 kloniert, hergestellt durch Schneiden mit denselben zwei Restriktionsendonukleasen. Der resultierende Vektor pSVGM-Ppo(Thr) wurde in COS-Zellen transformiert und die Ausbeuten an hpG-CSF, gemessen in den Kulturüberständen, variierten von 1 bis 5 μg/ml.
Schließlich wurde die genomische Sequenz, deren Isolierung in Beispiel 5 beschrieben ist, verwendet, um einen Expressionsvektor für Säugetierzellexpression von hpG-CSF zu bilden. Genauer gesagt, wurde pSVDM-19 mit KpnI und HindIII verdaut und das große Fragment in einer Vier-Wege-Ligation mit einem synthetischen Linker mit kohäsiven HindIII- und NcoI-Enden verwendet, wie in Tabelle XXI gezeigt. Ein NcoI-BamHI-Fragment, das das aus pBR322 isolierte Exon 1 enthielt (8500 hpG-CSF), ein genomischer Subklon und ein BamHI-KpnI-Fragment, das die aus pBR322 isolierten Exons 2–5 enthielt (8500 hpG-CSF genomischer Subklon). Der resultierende Säugetier-Expressionsvektor pSV/ghG-CSF produzierte 1 bis 2,5 μg/ml hpG-CSF aus transformierten COS-Zellen.
Tabelle XXI
Beispiel 10
Dieses Beispiel betrifft physikalische und biologische Eigenschaften von rekombinanten Polypeptiden.
1. Molekulargewicht
Rekombinante hpG-CSF-Produkte aus E. coli-Expression wie in Beispiel 7 besaßen ein scheinbares Molekulargewicht von 18,8 kD, wenn dieses in reduzierender SDS-PAGE bestimmt wurde (wie man auch aus der abgeleiteten Aminosäureanalyse von Tabelle VII vorhergesagt hätte), wohingegen natürliche Isolate, die wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt worden waren, ein scheinbares Molekulargewicht von 19,6 kD besaßen. Das Vorhandensein von N-Glykanen, die mit den natürlichen Isolaten verknüpft waren, konnte effektiv auf der Grundlage des Fehlens von Asparaginresten in der Primärsequenz von hpG-CSF in Tabelle VII ausgeschlossen werden und daher wurde ein Verfahren erdacht, um zu bestimmen, ob O-Glykane für die Molekulargewichtsunterschiede zwischen natürlichen Isolaten und den nicht-glykolisierten rekombinanten Produkten verantwortlich waren. Annähernd 5 μg des natürlichen Isolatmaterials wurden mit Neuraminidase (Calbiochem, LaJolla, California) behandelt, eine 0,5 μg Probe wurde entnommen und das restliche Material wurde mit 4 mU O-Glykanase (endo-x-n-Acetylgalaktoseaminidase, Genzyme, Boston, Massachusetts) bei 37°C inkubiert. Aliquote Teile wurden nach 1/2, 2 und 4 Stunden Inkubation entnommen. Diese Proben wurden Seite an Seite mit den von E. coli abgeleiteten rekombinanten Material SDS-PAGE unterworfen. Nach Neuraminidase-Behandlung verschob sich das scheinbare Molekulargewicht des Isolats von 19,6 kD zu 19,2 kD, was die Entfernung eines Sailinsäurerestes nahelegt. Nach 2 Stunden Behandlung mit O-Glykanase, verschob sich das Molekulargewicht zu 18,8 kD – identisch dem scheinbaren Molekulargewicht des von E. coli abgeleiteten Materials. Die Empfindlichkeit der Kohlehydratstruktur gegenüber Neuraminidase und O-Glykanase legt die folgende Struktur für die Kohlehydratkomponente nahe: N-Acetylneuraminsäure-α(2–6)(Galactose β)(1–3)-N-acetylgalactoseamin-R, wobei R Serin oder Threonin ist.
2. ³H-Thymidin-Aufnahme
Proliferationsinduktion von menschlichen Knochenmarkszellen wurde auf der Grundlage erhöhten Einbaus von ³H-Thymidin untersucht. Menschliches Knochenmark von gesunden Spendern wurde einem Dichteschnitt mit Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia) unterworfen und Zellen mit niedriger Dichte wurde in Iscove-Medium (GIBCO) suspendiert, das 10% fötales Rinderserum und Glutamin-Pen-Strep enthielt. Anschließend wurden für 2 × 10⁴ menschliche Knochenmarkszellen entweder mit Kontrollmedium oder mit dem rekombinanten E. coli-Material von Beispiel 7 in Platten mit 96 Näpfen mit flachem Boden bei 37°C in 5% CO₂ in Luft für zwei Tage inkubiert. Die Proben wurden doppelt getestet und die Konzentration schwankte über einen 10.000fachen Bereich. Die Kulturen wurden dann für 4 Stunden mit 0,5 μ Ci/Napf ³H-Thymidin pulsiert (New England Nuclear, Boston, Massachusetts). Die ³H-Thymidin-Aufnahme wurde gemessen, wie bei Ventua et al., Blood, 61, 781 (1983), beschrieben. In diesem Test können menschliche hpG-CSF-Isolate den Einbau von ³H-Thymidin in menschliche Knochenmarkszellen induzieren, bei Niveaus, die annähernd 4–10 mal höher liegen als Kontrollüberstände. Das von E. coli abgeleitete hpG-CSF-Material von Beispiel 6 hatte ähnliche Eigenschaften.
Eine zweite Studie zur Proliferation von menschlichem Knochenmarkszellen wurde unter Verwendung von Kulturmedium von transfizierten COS-1-Zellen, wie in Beispiel 9 hergestellt, durchgeführt und lieferte ähnliche Resultate, was anzeigt, daß kodierte Polypeptidprodukte in der Tat im Kulturmedium als aktive Materialien ausgeschieden wurden.
3. WEHI-3B D⁺ Differentiationsinduktion
Die Fähigkeit von rekombinanten, von E. coli abgeleiteten Materialien, Differentiation der myelomonozytischen Ratten-Leukämiezelllinie WEHI-3B D⁺ zu induzieren, wurde in halbfestem Agarmedium getestet, wie bei Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980), beschrieben. Das rekombinante hpG-CSF-Produkt und Medienkontrollansätze wurden mit 60 WEHI-3B D⁺ Zellen/Loch bei 37°C in 5% CO₂ in Luft für 7 Tage inkubiert. Die Proben wurden in Platten mit 24 Näpfen mit flachem Boden inkubiert und die Konzentration schwankte über einen 2000fachen Bereich. Die Kolonien wurden als undifferenziert, teilweise differenziert und vollständig differenziert klassifiziert und Koloniezellzählungen wurden mikroskopisch durchgeführt. Es stellte sich heraus, daß das rekombinante E. coli-Material Differentiation induzierte.
4. CFU-GM-, BFU-E- und CFU-GEMM-Tests
Es wurde festgestellt, daß die natürlichen Isolate von pluripotentem menschlichen G-CSF (hpG-CSF) und der rekombinante pluripotente G-CSF (rhpG-CSF) menschliche Knochenmarkszellen dazu veranlassen, zu wuchern und sich zu differenzieren. Diese Aktivitäten wurden in CFU-GM-[Broxmeyer, et al., Exp. Hematol., 5, 87, (1971)], BFU-E- und CFU-GEMM-Tests [Lu et al., Blood, 61, 250 (1983)] unter Verwendung nicht-haftender Knochenmarkszellen niedriger Dichte aus gesunden menschlichen Freiwilligen gemessen. Ein Vergleich der biologischen CFU-GM-, BFU-E- und CFU-GEMM-Aktivitäten unter Verwendung von entweder 500 Einheiten hpG-CSF oder rhpg-CSF sind in Tabelle XXII unten dargestellt.
Alle Kolonietests wurden mit nicht-haftenden Knochenmarkszellen niedriger Dichte durchgeführt. Menschliche Knochenmarkszellen wurden einem Dichteschnitt mit Ficoll-Hypaque (Dichte, 1,077 g/cm³; Pharmacia) unterworfen. Die Zellen mit niedriger Dichte wurden dann in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium erneut suspendiert, das fötales Kalbsserum enthielt, und zum Anhaften auf Falcon-Gewebekulturscheiben (Nr. 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, Md.) für 1-1/2 Stunden bei 37°C gegeben.
Tabelle XXII
Die Mediumkontrolle bestand aus Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium plus 10% FCS, 0,2 mM Hämin und 1 Einheit rekombinantes Erythropoietin.
Für den CFU-GM-Test wurden Zielzellen bei 1 × 10⁵ in 1 ml 0,3% Agar-Kulturmedium plattiert, das ergänztes McCoy-5A-Medium und 10% wärmeinaktiviertes fötales Kalbsserum einschloß. Die Kulturen wurden auf Kolonien (größer als 40 Zellen pro Aggregat) und Morphologie bewertet, durchgeführt am Tage 7 der Kultur. Die Anzahl der Kolonien ist als der mittlere ±SEM dargestellt, wie er aus Vierfachplatten bestimmt ist.
Für die BFU-E- und CFU-GEMM-Tests wurden Zellen (1 × 10⁵) zugesetzt zu einer 1 ml-Mischung von Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (Gibco), 0,8% Methylcellulose, 30% fötales Kalbsserum, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2 mM Hämin und 1 Einheit rekombinantes Erythropoietin. Die Scheiben wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 5% O₂ inkubiert. Niedrige Sauerstoffspannung wurde durch Verwendung eines Oxyreducers von Reming Bioinstruments (Syracuse, N. Y.) erreicht. Die Kolonien wurden nach 14 Tagen Inkubation bewertet. Die Anzahl der Kolonien ist als mittlerer ±SEM dargestellt, bestimmt von Doppelplatten.
Es stellte sich heraus, daß alle im CFU-GM-Test gebildeten Kolonien positiv auf Chloracetatesterase und negativ auf nicht-spezifische Esterase (α-Naphthylacetatesterase) waren, was mit den Kolonien konsistent ist, die von der Art granulozytisch sind. Es wurde festgestellt, daß sowohl natürlicher hpG-CSF als auch rhpG-CSF eine spezifische Aktivität eines annähernd 1 × 10⁸ U/mg reinen Proteins besitzen, wenn sie durch Reihenverdünnung in einen CFU-GEMM-Test untersucht werden. Die BFU-E- und CFU-GEMM-Daten in Tabelle XXII sind repräsentativ für drei separate Experimente und ähnlich denjenigen Daten, die früher für natürlichen hpG-CSF berichtet worden sind. Es ist wichtig anzumerken, daß der rhpG-CSF extrem rein und wegen seiner Produktion in E. coli frei von anderen potentiellen Säugetier-Wachstumsfaktoren ist. Somit ist rhpG-CSF in der Lage, gemischte Koloniebildung (CFU-GEMM) und BFU-E zu unterstützen, wenn er in Gegenwart rekombinanten Erythropoietins zugesetzt wird.
5. Zellbindungstests
Es ist früher berichtet worden, daß WEHI-3B(D⁺)-Zellen und menschliche Leukämiezellen aus frisch diagnostizierten Leukämien ¹²⁵I-markierten Ratten-G-CSF binden werden und daß diese Bindung bei Zugabe von unmarkiertem G-CSF oder menschlichem CSF-β konkurrieren kann. Die Fähigkeit von natürlichem hpG-CSF und rhpG-CSF, um die Bindung von ¹²⁵I-hpG-CSF an menschliche oder Ratten-Leukämiezellen zu konkurrieren, wurde untersucht. Hochgereinigtes natürliches hpG-CSF (> 95% rein; 1 μg) wurde iodiert [Tejedor, et al., Anal. Biochem., 127, 143 (1982)] und von den Reaktanten durch Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie abgetrennt. Die spezifische Aktivität des natürlichen ¹²⁵I-hpG-CSF betrug annähernd μCi/μg Protein. Ratten-WEHI-3B(D⁺) und zwei menschliche Myeloidleukämiezellpräparate aus peripherem Blut (ANLL, eines klassifiziert als M4, das andere als M5B) wurden auf ihre Fähigkeit getestet, ¹²⁵I-hpG-CSF zu binden.
Die Myeloidleukämiezellen aus peripherem Blut von Ratten und Menschen (frisch erhalten) wurden dreimal mit PBS/1% BSA gewaschen. WEHI-3B(D⁺)-Zellen (5 × 10⁶) oder frische Leukämiezellen (3 × 10⁶) wurden doppelt in PBS/1% BSA (100 μl) in Gegenwart und Abwesenheit verschiedener Konzentrationen (Volumenteil: 10 μl) von unmarkiertem hpG-CSF, rhpG-CSF oder GM-CSF und in Gegenwart von ¹²⁵I-hpG-CSF (annähernd 100.000 cpm oder 1 ng) bei 0°C für 90 Minuten (Gesamtvolumen: 120 μl) inkubiert. Die Zellen wurden dann erneut suspendiert und über 200 μl eiskaltes FCS in ein 350 μl-Kunststoffzentrifugenröhrchen geschichtet und zentrifugiert (1000 g; 1 Minute). Das Pellet wurde durch Abschneiden des Röhrchenendes gesammelt und das Pellet und der Überstand separat in einem Gammazähler (Packard) gezählt.
Die spezifische Bindung (cpm) wurde als Gesamtbindung in Abwesenheit eines Konkurrenten (Mittelwert von Doppelmessungen) minus Bindung (cpm) in Gegenwart eines 100fachen Überschußes von unmarkiertem hpG-CSF (nicht-spezifische Bindung) bestimmt. Die nichtspezifische Bindung betrug maximal 2503 cpm für WEHI-3B(D⁺)-Zellen, 1072 cpm für ANLL (M4)-Zellen und 1125 cpm für ANLL (M5B)-Zellen. Die Experimente 1 und 2 wurden an unterschiedlichen Tagen unter Verwendung desselben Präparates von ¹²⁵I-hpG-CSF durchgeführt und zeigen interne Konsistenz in der prozentuellen Hemmung, notiert für 2000 Einheiten hpG-CSF. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle XXIII unten berichtet.
Wie in Tabelle XXIII gezeigt, zeigte eine ¹²⁵I-hpG-CSF Bindung an die WEHI-3B(D⁺)-Leukämiezellen. Die Bindung wurde in dosisabhängiger Weise durch unmarkierten und natürlichen hpg-CSF oder rhpG-CSF, aber nicht durch GM-CSF gehemmt. Zusätzlich wurde Bindung von natürlichem hpG-CSF an menschliche myelomonozytische Leukämiezellen (ANLL, M4) beobachtet. Die Bindung dieser Zellen ist vergleichbar mit der Reaktion gegenüber natürlichem hpG-CSF in flüssigen Kulturen durch Differentiation in reife Makrophagen, beurteilt durch Morphologie. Die Abwesenheit einer Bindung von natürlichem ¹²⁵I-hpG-CSF an monozytische Leukämiezellen von einem anderen Patienten (ANLL, M5B) legt nahe, daß gewisse Leukämien Rezeptoren für hpG-CSF unterschiedlich exprimieren oder diese ganz fehlen. Die Fähigkeit von rhpG-CSF, um die Bindung von natürlichem ¹²⁵I-hpG-CSF zu konkurrieren, ähnlich zu natürlichem hpG-CSF, legt nahe, daß die Rezeptoren beide Formen gleich gut erkennen.
Diese Studien, die die Bindung von natürlichem ¹²⁵I-markiertem hpG-CSF an Leukämiezellen bestätigen, sind in Kultur vergleichbar mit der Fähigkeit von natürlichem hpG-CSF, granulozytische und monozytische Differentiation von Knochenmarkszellen von geringer Dichte zu induzieren, die von einem Patienten mit einer akuten promyetozytischen Leukämie (M3) und einem zweiten Patienten mit einer akuten myeloblastischen Leukämie (M2) erhalten wurden. Zellen von jedem Patienten wurden für 4 Tage im Medium allein oder in Gegenwart von 1 × 10⁵ Einheiten rhpG-CSF kultiviert. Zellen aus den M3-Kontrollkulturen, die im Medium allein inkubiert worden waren, waren von der Art her immer noch promyelozytisch; während Zellen, die in Gegenwart von rhpG-CSF kultiviert worden waren, reife Zellen des Myeloidtyps zeigten, einschließlich einem Metamyelozyten, Riesenbandform und segmentierte Neutrophile und Monozyten. Die tatsächlichen Unterschiede für diesen Patienten, auf 100 für die Kontrolle bewerteten Zellen, 100% Promyelozyten, und für die rhpG-CSF behandelten Zellen, 22% Blasten plus Promyelozyten, 7% Myelozyten, 35% Metamyelozyten, 20% Bandformen plus segmentierte Neutrophilen, 14% Monozyten und 2% Makrophagen. Bemerkenswert ist die Tatsache, daß einer der polymorphonuklearen Granulozyten immer noch ein hervorstechendes Auer-Stäbchen enthielt, was nahelegte, daß zumindest diese Zelle eine differenzierte Zelle repräsentierte, die zum Leukämieklon gehörte. Zellen aus dem zweiten Patienten mit einer myeloblastischen Leukämie (M2) wurden ebenfalls für 4 Tage in Gegenwart oder Abwesenheit von rhpG-CFS kultiviert. Visuelle Analyse von M2-Zellen, kultiviert in Medium allein, erbrachte große "blastenähnliche" Zellen, von denen einige Nukleoli besaßen. Einige der M2-Zellen differenzierten sich nach Behandlung mit rhpG-CSF zu reifen segmen tierten Neutrophilen, die die restlichen Auer-Stäbchen im Zentrum neutrophil zeigten, was nahelegte, daß die Differentiation in einer Zelle, die zum Leukämieklon gehörte, aufgetreten war. Die tatsächliche Differenzierung von 100 morphologisch bewerteten Zellen ergab, daß die Kontrollzellen aus 100% Blasten bestanden. Die rhpG-CSF behandelten Zellen bestanden aus 43% Blasten, 1% Myelozyten, 15% Metamyelozyten, 28% Bandformen plus segmentierte Neutrophile, 2% Promonozyten und 11% Monozyten. Die Leukämiezellen wurden auch bei anderen Konzentrationen von rhpG-CSF (5 × 10³, 1 × 10⁴, 2,5 × 10⁴ und 5 × 10⁴ U/ml, Daten nicht gezeigt) auf Differentiation untersucht. Selbst bei der niedrigsten getesteten Konzentration von rhpG-CSF (5 × 10³ U/ml) gab es signifikante Differentiation (über Myelozyten hinaus differenzierte Zellen) der M3-(50%) und M2-Leukämiezellen (37%).
6. Immunologischer Test
Um polyklonale Antikörper für die Zwecke eines immunologischen Tests herzustellen, war das verwendete Antigen pluripotenter G-CSF, gereinigt aus der menschlichen Harnblasenkarzinomzelllinie 5637 (1A6), hergestellt wie in Beispiel 1(B). Dieses Material wurde auf der Grundlage von Silbernitrotanfärbung von Polyacrylamidgelen als 85% rein beurteilt. Sechs Wochen alte Balb/C-Mäuse wurden mit subkutanen Injektionen von Antigenen an verschiedenen Stellen immunisiert. Das Antigen wurde in PBS erneut suspendiert und mit gleichen Volumenteilen von Freunds-Komplettadjuvans emulgiert. Die Dosis war 5–7 μg Antigen pro Maus pro Injektion. Eine Booster-Immunisierung wurde 18 Tage später verabreicht mit derselben Menge Antigen, das mit einem gleichen Volumen Freundschem unvollständigem Adjuvant emulgiert war. Vier Tage später wurde Mäuseserum entnommen, um auf den für menschlichen pluripotenten G-CSF spezifischen Antikörper zu testen.
Dynatech Immulon II Removawell-Streifen in Haltern (Dynatech Lab., Inc., Alexandria, Virginia) wurden mit hpG-CSF 5 μg/ml in 50 mM Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,2 beschichtet. Näpfe wurden mit 0,25 μg in einem Volumen von 50 μl beschichtet. Antigen-beschichtete Platten wurden zwei Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert und über Nacht bei 4°C. Die Lösung wurde dekantiert, und die Platten wurden 30 Minuten mit PBS inkubiert, das 5% BSA enthielt, um die reaktive Oberfläche zu blockieren. Diese Lösung wurde dekantiert, und die verdünnten Prä-Immun- oder Test-Seren wurden den Näpfen zugegeben und für zwei Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Seren wurden mit PBS, pH 7,0 verdünnt, das 1% BSA enthielt. Die Serum-Lösung wurde dekantiert, und die Platten wurden dreimal gewa schen mit Wash Solution (KPL, Gaithersburg, Maryland). Annähernd 200,000 cpm jodiertem Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG (NEN, Boston, Massachusetts) in 50 μl PBS, pH 7,0, die 1 BSA enthielt, wurden jedem Napf zugegeben. Nach Inkubation für 1-½ Stunden bei Zimmertemperatur wurde die Lösung dekantiert, und die Platten wurden fünfmal mit Wash Solution gewaschen. Die Näpfe wurden aus dem Halter entfernt und in einem Beckman-5500-Gamma-Zähler gezählt. Hochgetiterte Mäuseseren zeigten mehr als zwölfmal höhere Reaktivität als die entsprechenden Prä-Immunseren bei einer Verdünnung von 1:100.
Die immunologischen Eigenschaften von aus E. coli abgeleitetem hpG-CSF wurden durch Reaktivität gegenüber hochgetitertem Mäuseserum bestimmt, das gegenüber aus Säugetierzellen abgeleitetem hpG-CSF spezifisch war. 0,25 μg 90% reines, aus E. coli abgeleitetes Protein wurde auf Immulon II Removawells in einem Volumen von 50 μl beschichtet, und Mäuseserum wurde wie oben beschrieben getestet.
Hochgetiterte Mäuseseren zeigten 24mal höhere Reaktivität gegenüber dem von E. coli abgeleiteten Material als dies die entsprechenden Prä-Immunseren bei einer Verdünnung von 1:100 taten.
7. Serinanaloga-Biotests
[Ser¹⁷]hpG-CSF-, [Ser³⁶]hpG-CSF-, [Ser⁴²]hpG-CSF-, [Ser⁶⁴]hpG-CSF- und [Ser⁷⁴]hpG-CSF-Produkte, hergestellt gemäß Beispiel 9, wurden auf hpG-CSF-Aktivität in den ³H-Thymidin-Aufnahme-, CFU-GM- und WEHI 3B D⁺-Tests getestet. In jedem Test besaß das [Ser¹⁷]-Analogon eine Aktivität, die vergleichbar mit derjenigen war, die rekombinanten Moleküle mit der ursprünglichen Struktur besitzen. Die restlichen Analoga besaßen größenordnungsmäßig 100mal niedrigere Aktivität im ³H-Thymidin-Aufnahme-Test, 250mal niedrigere Aktivität im CFU-GM-Test und 500mal niedrigere Aktivität im WEHI-3B D⁺-Test. Diese Daten unterstützen die Vermutung, daß Cysteine an den Positionen 36, 42, 64 und 74 wahrscheinlich für vollständige biologische Aktivität erforderlich sind.
8. In-vivo-Biotest
Alzet^®-Osmosepumpen (Alzet Corp., Palo Alto, CA; Model 2001) wurden mit Verweilkathetern in der rechten Drosselvene verbunden und subkutan in sieben männliche syrische Gold hamster implantiert. Vier der Pumpen enthielten einen Puffer [20 mM Natriumacetat (pH 5,4) und 37 mM Natriumchlorid] und 1,5 mg/ml von E. coli abgeleiteten hpG-CSF, während drei Puffer allein enthielten. Die geforderte Pumprate für die Osmosepumpen betrug 1 Mikroliter/h für bis zu 7 Tage. Am dritten Tag nach Implantation der Pumpen war die mittlere Granulozytenzählung der vier behandelten Hamster 6mal höher als diejenige der drei (Puffer-)Kontrollen und die erhöhte Granulozytenzählung wurde wiedergespiegelt in einem vierfachen Anstieg bei den Gesamt-Lymphozyten. Die Erythrozytenzählung war durch Behandlung unverändert. Diese Ergebnisse zeigten, daß das rekombinante Material eine spezifische Produktionserhöhung und/oder Granulozytenfreisetzung in einem Säugetier erzeugt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt hpG-CSF-Produkte, wie etwa Polypeptidanaloga von hpG-CSF und Fragmente von hpG-CSF. Unter Befolgung der Verfahren der oben angegebenen veröffentlichten Anmeldung von Alton et al. (WO/83/04053) kann man ohne weiteres Gene konstruieren und künstlich herstellen, die für mikrobielle Expression von Polypeptiden kodieren, die Primärkonformationen besitzen, die sich von den hier spezifizierten hinsichtlich der Identität oder des Ortes eines oder mehrerer Reste unterscheiden (z.B. Substitutionen, terminale und intermediäre Additionen und Deletionen). Alternativ können Modifikationen von cDNA und genomischen Genen ohne weiteres durch wohlbekannte ortsgerichtete Mutagenesetechniken fertiggestellt und dazu verwendet werden, Analoga und Derivate zu erzeugen. Solche Produkte würden zumindest eine der biologischen Eigenschaften von hpG-CSF teilen, aber sich in anderen unterscheiden können. Als Beispiele schließen geplante Produkte der Erfindung solche ein, die durch z.B. Deletionen verkürzt sind; oder solche, die stabiler gegenüber Hydrolyse sind (und daher ausgeprägtere oder länger andauernde Effekte besitzen als natürlich auftretende); oder die so geändert worden sind, daß eine oder mehrere potentielle Stellen für O-Glykolisierung entfernt worden sind (was zu höheren Aktivitäten für in Hefe produzierten Produkten führen kann); oder die einen oder mehrere Cysteinreste weggelassen oder durch z.B. Alanin- oder Serinreste ersetzt aufweisen und potentiell leichter aus mikrobiellen Systemen in aktiver Form isoliert werden; oder die einen oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalanin ersetzt aufweisen und sich mehr oder weniger leicht an hpG-CSF-Rezeptoren auf Zielzellen binden können. Ebenfalls umfaßt sind Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der kontinuierlichen Aminosäuresequenz duplizieren, oder Sekundärkonformationen innerhalb von hpG-CSF, wobei diese Fragmente eine Aktivität (z.B. Rezeptorbindung) besitzen können und andere nicht (z.B. koloniewachstumserregende Aktivität). Es ist bemerkenswert, daß Aktivität für irgendeines oder mehrere der Produkte der Erfindung nicht not wendig ist, um therapeutische Nützlichkeit [siehe Weiland et al., Blut, 44, 173–175 (1982)] oder Nützlichkeit in anderen Zusammenhängen zu besitzen, wie etwa in Tests des hpG-CSF-Antagonismus. Konkurrierende Antagonisten können sehr wohl nützlich in z.B. Fällen von Überproduktion von hpG-CSF sein.
Die hier beschriebene DNA-Sequenz, die hpG-CSF-Polypeptide kodiert, ist für die Information wertvoll, die sie im Hinblick auf die Aminosäuresequenz des Säugetierproteins zur Verfügung stellt, die bisher trotz analytischer Verarbeitung von Isolaten von natürlich auftretenden Produkten unzugänglich gewesen ist. Die DNA-Sequenzen sind auch auffallend wertvoll als Produkte, die bei der Durchführung der mikrobiellen Synthese von hpG-CSF durch eine Vielzahl rekombinanter Techniken nützlich sind. Anders gesagt, sind durch die Erfindung zur Verfügung gestellte DNA-Sequenzen dabei nützlich, neue und nützliche virale und zirkuläre Plasmid-DNA-Vektoren, neue und nützliche transformierte und transfizierte mikrobielle prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen (einschließlich bakterieller und Hefezellen und in Kultur gezüchteter Säugetierzellen) und neue und nützliche Verfahren für das kultivierte Wachstum solcher mikrobiellen Wirtszellen, die zur Expression von hpG-CSF und seiner verwandten Produkte in der Lage sind, zu erzeugen. DNA-Sequenzen der Erfindung sind auch auffallend geeignete Materialien zur Verwendung als markierte Sonden bei der Isolierung von hpG-CSF und verwandtes Protein kodierender menschlicher genomischer DNA, sowie von cDNA und genomischen DNA-Sequenzen anderer Säugetierspezies. Die DNA-Sequenzen können auch bei verschiedenen alternativen Verfahren der Proteinsynthese (z.B. in Insektenzellen) oder bei der genetischen Therapie von Menschen und anderen Säugetieren nützlich sein. Man erwartet, daß die DNA-Sequenzen der Erfindung nützlich bei der Entwicklung transgener Säugetierspezies sind, die als eukaryontische "Wirte" für die Herstellung von hpG-CSF und hpg-CSF-Produkte in Mengen dienen können. Siehe im allgemeinen, Palmiter, et al., Science, 222(4625), 809–814 (1983).
Anwendbar auf hpg-CSF-Fragmente und Polypeptidanaloga sind Berichte über die immunologische Aktivität von synthetischen Peptiden, die im wesentlichen die in natürlich auftretenden Proteinen, Glykoproteinen und Nukleoproteinen auftretende Aminosäuresequenz duplizieren. Genauer gesagt, hat es sich gezeigt, daß Polypeptide mit relativ niedrigem Molekulargewicht an Immunreaktionen teilnehmen, die in Dauer und Ausmaß den Immunreaktionen physiologisch signifikanter Proteine wie etwa viraler Antigene, Polypeptidhormone und dergleichen, ähnlich sind. Eingeschlossen in die Immunreaktion solcher Peptide ist die Provoka tion der Bildung spezifischer Antikörper in immunologisch aktiven Tieren. Siehe z.B. Lerner et al., Cell, 23, 309–310 (1981); Ross et al., Nature, 294, 654–656 (1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77, 5197–5200 (1980); Lerner et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 3403–3407 (1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 4882–4886 (1981); Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78, 7412–7416 (1981); Green et al., Cell, 28, 477–487 (1982); Nigg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 79, 5322–5326 (1982); Baron et al., Cell, 28, 395–404 (1982); Dreesman et al., Nature, 295, 185–160 (1982); und Lerner Scientific American, 248, No. 2, 66–74 (1983). Siehe auch Kaiser et al., Science, 223, 249–255 (1984), betreffend biologische und immunologische Aktivitäten synthetischer Peptide, die annähernd die Sekundärstrukturen von Peptidhormonen teilen, aber nicht deren Primärstrukturkonformation teilen müssen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines menschlichen pluripotenten Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (hpG-CSF)-Erzeugnisses, das die in vivo granulozytopoetischen biologischen Eigenschaften von natürlich auftretendem hpG-CSF aufweist, umfassend die Schritte von: (a) Kultivieren unter geeigneten Nährbedingungen von Säugerzellen, umfassend eine Promotor DNA, die anders ist als die hpG-CSF Promoter DNA, wirksam verbunden mit der DNA, die für ein hpG-CSF Polypeptid kodiert, das die ausgereifte Aminosäuresequenz von Tabelle 7 aufweist; und (b) Isolieren von hpG-CSF, das von den Zellen exprimiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Promoter DNA eine virale Promotor DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen Primatenzellen sind,
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Primatenzellen COS Zellen sind.