DE3617896A1

DE3617896A1 - Knochenpfropfmaterial und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3617896A1
Application number: DE19863617896
Authority: DE
Inventors: Todd Corona Calif. Campbell; Aws Salim Costa Mesa Calif. Nashef
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1985-05-29
Filing date: 1986-05-28
Publication date: 1986-12-04
Also published as: GB2175507A; GB8613085D0; US4678470A; JPS6238169A; CA1276551C; GB2175507B; FR2582518B1; FR2582518A1

Description

Knochenpfropfmaterial und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung 20 eines biokompatiblen, stabilen und nicht-antigenen Knochen-Pfropfmaterials aus einem allogenen oder xenogenen Knochenausgangsmaterial und das dabei erhaltene Knochenpfropfmaterial.

Die überbrückung von großen Knochendefekten, beispielsweise solchen, wie sie als Ergebnis einer traumatischen Extrusion, einer radialen Tumorresektion und einer massiven Sequestration als Folge einer Infektion auftreten, ist eines der herausforderndsten orthopädischen Probleme. Frischer autogener Knochen wird als bestes Pfropfmaterial angesehen. Es gibt jedoch Fälle, in denen ausreichende Mengen an autogenem Knochen nicht zur Verfügung stehen oder die Sekundäroperation zur Gewinnung des Knochens zu schwerwiegend und traumatisch ist.

Durch Verwendung eines exogenen Materials kann die Notwendigkeit einer sekundären Operation zur Gewinnung

eines geeigneten Pfropfmaterials verringert werden.

Außerdem liegt die Fehlerquote bei Knochenübertragungen zwischen 13 und 30% und ist sogar noch höher, wenn ein allogener, gefrorener oder gefriergetrockneter Knochen verwendet wird. Dann besteht natürlich ein Bedarf für ein geeignetes Pfropfmaterial, das zum Reparieren von Knochendefekten, einschließlich solchen, die als Folge eines Tumors, einer Verletzung und der Osteomyelitis auftreten, verwendet werden kann. 10

Es wurden bereits verschiedene Versuche unternommen, exogenes Knochenpfropfmaterial zu verwenden, jedoch mit wechselndem Erfolg. Im Prinzip wurden zwei Methoden angewendet: die Osteoinduktion und die Osteoinvasion.

Der Hauptunterschied zwischen diesen Methoden besteht in der Art des Einwachsens des Wirtsknochens. Die osteoinduktive Knochenaufpfropfung beruht darauf, daß der Knochenpfropfkörper bewirkt, daß osteogene Vorlauferzellen im Mark (Kern) entstehen und zu den Pfropfkörper umgebenden Bindegeweben dedifferenziert werden und neue Knochenbildungen entstehen. Die osteoinvasive Knochenaufpfropfung beruht darauf, daß Wirtszellen in den Pfropfkörper wandern und neue Knochenbildungen hervorrufen.

Unter den beiden Verfahren hat sich die osteoinduktive Aufpfropfung als erfolgreicher als die osteoinvasive Aufpfropfung erwiesen. In der Regel werden die osteoinduktiven Pfropfkörper innerhalb eines Zeitraums von 2 bis 6 Wochen in den Wirtsknochen inkorporiert, während die osteoinvasiven Pfropfkörper, wie gefunden wurde, bis zu 1 Jahr lang ab der Implantation nicht inkorporiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen (biologisch verträglichen) , nicht-antigenen und inkorporierbaren Knochen-Pfropf ma-

terials aus einem allogenen oder xenogenen Knochen. Der Knochen kann pulverisiert werden, er kann als großer Block verwendet werden oder er kann (maschinell) bearbeitet werden, bis er die genau vorher festgelegte Form hat, je nach Knochendefekt, der repariert werden soll.

Das Verfahren zur Herstellung des Materials umfaßt das Beizen des Knochens mit Glutaraldehyd. Dieses Beizverfahren ergibt, wie gefunden wurde, ein stabilisiertes, IQ nicht-antigenes und hoch-biokompatibles Material, das osteoinvasiv ist. Es wurde gefunden, daß der zu dem Pfropfmaterial benachbarte Wirtsknochen innerhalb von nur 3 Monaten einwächst.

,c Die Erfindung betrifft ein biologisch gewonnenes, biokompatibles, nicht-antigenes und inkorporierbares Material für die Verwendung als generellen Knochenersatz sowie das Verfahren zur Herstellung dieses Materials. Das Knochenersatzmaterial wird gewonnen aus einem mit Glutaraldehyd gebeiztem Knochen, der sich als hoch-biokompatibel erwiesen hat. Der Wirtsknochen wächst leicht in den mit Glutaraldehyd gebeizten Knochen ein, wenn das zuletzt genannte Material benachbart zu dem Wirtsknochen implantiert wird.

Durch Behandlung mit Glutaraldehyd wird das Material stabilisiert und durch Vernetzung der Proteine wird es auch nicht-antigen gemacht. Aufgrund seiner Nicht-Antigenizität kann das Knochenausgangsmaterial, aus dem das Pfropfmaterial hergestellt wird, aus autogenen oder exogenen Quellen gewonnen werden. In großer Menge verfügbare und geeignete Knochen-Ausgangsmaterialien, auf die die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist, sind beispielsweise Rinder-, Schaf-, Pferde- und Schweineknochen .

Das aus dem Knochenausgangsmaterial hergestellte Knochenpfropf material kann in verschiedenen Formen vorliegen,

^ je nach dem spezifischen Knochendefekt, zu dessen Reparatur das Pfropfmaterial verwendet werden soll. Beispiele für diese Formen, auf welche die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist, sind folgende: (a) ein Block, der

c später durch den Chirurgen so geformt wird, daß er der aktuellen Kontur des Defekts entspricht; (b) eine pulverisierte Form (Teilchengröße innerhalb des Bereiches von weniger als 100 bis mehr als 300 pm), suspendiert in einem gelatineartigen Träger (biologischer oder nichtbiologischer Natur), die auf den Defekt aufgebracht und später verfestigt wird; (c) ein halb-verfestigter, formbarer Träger, der mit pulverisiertem Knochen imprägniert ist; und (d) vorgegebene Formen bzw. Gestalten (beispielsweise Zylinder), die zum Ausfüllen eines großen

Defekts verwendet werden. Bei den obenangegebenen For-15

men (b) und (c) hängt die verwendete Teilchengröße von

Grad der gewünschten Knochendichte ab (das heißt_/eine geringere Teilchengröße ergibt eine höhere Dichte des neuen Knochens, was bei Belastungssituationen Anwendung finden kann).
20

Es können konventionelle(maschinelle)Bearbeitungsmethoden angewendet werden, um dem Knochen eine genau vorgegebene Form und Größe zu verleihen. Die Fähigkeit, den Knochen genau zu bearbeiten, bis die für die Reparatur eines spezifischen Defekts erforderliche exakte Gestalt erzielt ist, ist einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der resultierende Knochenersatz behält seine Form und ein Chirurg braucht das Material während der Implantation nicht zu formen.

Zur Herstellung eines pulverisierten Knochens mit der gewünschten Teilchengröße einschließlich eines feinen Pulvers können bekannte Verfahren zur Zerkleinerung von Knochen, wie z.B. das Mahlen, Schleifen und Pulverisieren, angewendet werden, die Erfindung ist darauf jedoch nicht beschränkt. Dem pulverisierten/pulverförmigen

Knochen kann eine physiologische Salzlösung in einer Menge zugesetzt werden, die ausreicht, um eine pastenartige Suspension zu bilden. Alternativ wird das Knochenmaterial mit Trägern, wie oben angegeben, kombiniert. Beispiele für solche Träger, auf welche die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist, sind Gelatine und Polysaccharide. Die resultierenden Suspensionen können durch Formen oder Gießen in die gewünschte Form (Gestalt) gebracht werden, sie können in einen Knochendefekt injiziert werden (unter Verwendung einer Hypodermal-Spritze), oder sie können während der Implantation geformt werden, so daß sie in einen Defekt passen. Der Träger kann verfestigt werden oder er kann nach der Implantation resorbiert werden oder er kann seine ursprüngliche Konsistenz being behalten. Solche Suspensionen können zum Ausfüllen verschiedener Knochendefekte verwendet werden, die Hohlräume oder Tunnels, Knochenbruchstücke oder irgendwelche kleine Knochendefekte umfassen.

2Q Für einige Zwecke ist ein pulverisierter oder pulverförmiger Knochen als Pfropfmaterial nicht bevorzugt. Ein Beispiel dafür ist die Implantation eines Knochenpfropfmaterials in einer Gewichtsbelastungsposition.

Das erfindungsgemäße Pfropfmaterial ist geeignet für die Verwendung zum Raparieren eines breiten Bereiches von Knochendefekten, die das Ergebnis einer Verletzung, einer Erkrankung oder von Geburtsfehlern sind. Das Material kann auch in der kosmetischen Chirurgie verwendet werden. Das Material kann sowohl in Gewichtsbelastungssituationen als auch in Situationen ohne Gewichtsbelastung implantiert werden und nachstehend wird eine kleine Auswahl der vielen potentiellen Anwendungsmöglichkeiten beschrieben.

Das erfindungsgemäße Knochenersatzmaterial kann zum Reparieren von Defekten, wie z.B. großen Nicht-Verbindun-

gen (einschließlich solcher, die zu groß sind, um durch elektrische Stimulierung allein überbrückt zu werden), wie z.B. solchen, die aus Mehrfachbrüchen oder aus der operativen Entfernung von erkrankten Knochenteilen resultieren, verwendet werden. Bei Einzelpersonen, bei denen ein Arm oder ein Bein länger ist als der (das) andere, kann ein geformter Block aus dem Pfropfmaterial in den geeigneten Knochen inkorporiert werden, um ihn zu verlängern. Das erfindungsgemäße Knochenersatzmaterial ist im allgemeinen stark genug, um als Teil solcher großer gewichtsbelasteter Knochen, wie z.B, des Schienbeins oder des Oberschenkelknochens, verwendet zu werden.

Die Behandlung bestimmter Frakturen, beispielsweise solcher der Hüfte, umfaßt manchmal das Bohren eines Tunnels und das Einsetzen eines Stiftes, bis der Bruch geheilt ist. Wenn der Stift entfernt wird, wird der leere Tunnel durch den natürlichen Knochenbildungsmechanismus des Patienten langsam aufgefüllt. Eine schnellere Heilung kann dadurch erzielt werden, daß man den Tunnel mit dem erfindungsgemäßen Pfropfmaterial auffüllt. Zu anderen Anwendungszwecken gehören die Kiefer-Gesichtsknochen-Rekonstruktion und das Ausfüllen von Defekten aus Knochensplittern.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des Knochenpfropfmaterials handelt es sich um ein Mehrstufenverfahren, bei dem die Reihenfolge der Stufen variieren kann. Das Verfahren beginnt mit der Auswahl eines Knochenausgangsmaterial. Es kann jedes geeignete, leicht zugängliche allogene oder xenogene Knochenausgangsmaterial verwendet werden, wie z.B. Rinder-, Schweine-, Schaf- und Pferdeknochen, wie vorstehend erörtert. Wenn die gewünschte Endform des Knochenpfropfmaterials ein Block aus dem Knochen oder eine maschinell liergestellte Form ist, muß das Knochenausgangsmaterial groß genug sein,

um einen Block der erforderlichen Größe zu ergeben.

Das Knochenausgangsmaterial wird frisch gewonnen und der gewünschte Abschnitt des Knochens wird mittels einer geeigneten Einrichtung, beispielsweise durch Schneiden mit einer Säge, grob entfernt, wobei ein häufiges Spülen in einer Flüssigkeit, wie z.B. destilliertem Wasser oder einer Salzlösung, angewendet wird, um den Knochen feucht und kühl zu halten (bei oder unterhalb der physiologischen Temperatur, um eine Denaturierung der Knochenmaterialien (wie z.B. Collagen) zu verhindern). Das damit verbundene Bindegewebe (Sehnen, Bänder und Fascien) wird entfernt. Ein kleineres Knochenstück, das sich den gewünschten Dimensionen der fertigen Prothese mehr nähert, 5 kann erhalten werden, indem man das Knochenstück beispielsweise mittels einer Hohlsäge ausbohrt. Das Knochenstück wird während des Sägens und danach erneut gespült und gekühlt, um Bruchstücke zu entfernen.

Wenn der Knochen eher pulverisiert als zu einer spezifischen Gestalt bearbeitet werden soll, kann die Pulverisierung mittels einer geeigneten Einrichtung zu jedem beliebigen Zeitpunkt in diesem Mehrstufenverfahren durchgeführt werden. Zur Herstellung der gewünschten Endform aus dem Knochenstück können beliebige konventionelle Einrichtungen zur maschinellen Bearbeitung von harten Materialien, wie z.B. Bohrer, Drehbänke, Sägen und andere Werkzeuge, verwendet werden. Das Knochenstück kann dann gereinigt werden, um Maschinenöle und Bruchstücke zu entfernen (wenn das Stück maschinell bearbeitet wurde) und auch um die Oberfläche des Materials zu entfetten. Zu diesem Zweck kann jedes geeignete Lösungsmittel verwendet werden. Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß der Knochen in 100 %-iges Ethanol eingetaucht wird, woran sich Spülungen mit einer Salzlösung anschließen.

Zweckmäßig wird das Knochenstück anschließend behandelt, um die Porosität der Matrix zu erhöhen, und um dadurch das Einwachsen des Wirtsknochens in das Pfropfmaterial weiter zu fördern. Diese Behandlung kann dadurch erzielt werden, daß man den Knochen mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. mit Chloroform, 100 %-igem Ethanol, Chloroform : Methanol (1 : 1), Aceton oder ähnlichen Lösungsmitteln extrahiert, und anschließend in einer physiologischen Salzlösung spült, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Diese Stufe zur Erhöhung der Porosität kann ggf. umfassen die Behandlung des Knochenstückes mit einer Protease, wie z.B. Pronasel·-⁷ , Collagenase oder Hyaluronidase. Bei einem besonders bevorzugten Verfahren werden die Knochenstücke 24 Stunden lang in eine gepufferte Pronase=^ -Lösung bei 37 C eingetaucht, danach in einer gepufferten normalen Salzlösung gespült und mit Chloroform : Methanol (1 : 1) durch einstündiges Eintauchen unter konstantem Rühren bei 25 C extrahiert, woran sich das Spülen in einer gepufferten normalen Salzlösung anschließt. Durch diese Behandlung werden nicht Matrix-gebundene (nicht-collagenartige) Proteine entfernt. Zweckmäßig werden alle diese Proteine entfernt. Wenn alle diese Proteine entfernt sind, kann die Porosität der Matrix um bis zu 10 % erhöht werden.

Durch die Behandlung wird auch die Antigenizität des Materials weiter herabgesetzt. Der Grad der Porosität kann durch visuelle Inspektion bestimmt und durch Lichtoder Elektronenmikroskopie bestätigt werden.

Das Knochenmaterial kann gewünschtenfalls demineralisiert werden. Es kann jedes bekannte Demineralisierungsmitte1 verwendet werden, wie z.B. Lösungen, die organische oder Mineralsäuren (wie Ameisensäure, Chlorwasserstoffsäure, Salpetersäure, Zitronensäure oder Oxalsäure) und/oder Ca⁺⁺-Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA), enthalten, die Erfindung ist darauf jedoch nicht beschränkt, Vorzugsweise enthält oder besteht die Demineralisierungs-

lösung aus O_f1 bis 1,ON HCl, insbesondere O,3N HCl.

Zweckmäßig enthält die Lösung auch bis zu 1 %, vorzugsweise 0,1 % EDTA. Die Deminer aus ierung kann dazu dienen, die Porosität des Pfropfmaterial zu erhöhen. Der demineralisierte Knochen hat eine weichere, "schwammartigere" Struktur als der nicht-demineralisierte Knochen und kann daher nur brauchbar sein in nicht-gewichtsbelasteten Situationen, wie z.B. zur Reparatur von kleinen Defekten, zum Auffüllen von Tunnels oder anderen hohlen Bereichen, in der kosmetischen Chirurgie und für ähnliche Anwendungszwecke. Pulverisierter Knochen, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bearbeitet worden ist, ist besonders gut geeignet für die Demineralisierung. Wenn der demineralisierte Knochen benachbart zum Wirtsknochen implantiert wird, kann der Wirtsknochen in diesen hineinwachsen (Osteoinvasionsverfahren)

Das Knochenstück wird unter beizenden Bedingungen mit Glutaraldehyd behandelt. Diese Beizstufe kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt während des Mehrstufenverfahrens zur Herstellung des Pfropfmaterials durchgeführt werden. Das Knochenausgangsmaterial kann vor oder nach der (maschinellen) Bearbeitung oder Pulverisierung und beispielsweise vor oder nach der Stufe zur Erhöhung der Porosität gebeizt werden. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Beizstufe den maschinellen Bearbeitungs/ Pulverisierungs-, Oberflächenreinigungs- und Entfettungsund Porösitätserhöhungs-Stufen folgt.

Der Knochen wird mit einer Lösung behandelt, die Glutaraldehyd in einer zur Vernetzung der verfügbaren Proteine ausreichenden Konzentration enthält. Die Glutaraldehyd-Konzentration liegt zweckmäßig zwischen etwa 0,2 und etwa O^Vi^besonders bevorzugt bei etwa 0,6 % (Gew./Vol.).

Die Lösung wird vorzugsweise mit einem üblicherweise verwendeten Puffermittel gepuffert. Insbesondere wird die Lösung mit HEPES gepuffert. Das Knochenstück wird unter

physiologischen pH-Wertbedingungen gebeizt. Zweckmäßig liegt der pH-Wert zwischen 6,8 und 7,5.

Das Beizverfahren wird fortgesetzt, bis die Proteine in einem ausreichenden Umfang vernetzt worden sind, um den Knochen nicht-antigen zu machen, wenn er in einen Wirt einer anderen Spezies als der Spezies, von der er stammt, implantiert wird. Der Grad der Vernetzung muß auch ausreichend sein, um das Knochenmaterial zu stabilisieren. Die Stabilität sollte so sein, daß das Knochen-Pfropf material sich anschließend an die Implantation nicht zersetzt, sondern eher mindestens für eine Zeitspanne intakt bleibt, die ausreicht, um das Hineinwachsen des Wirtsknochens in die Matrix des Pfropfmaterials zu erlauben. Vorzugsweise ist das Pfropfmaterial stabilisiert und wird permanent in den Wirtsknochen inkorporiert. Der Knochen wird für eine solche Zeitspanne mit Glutaraldehyd in Kontakt gebracht, die ausreicht, um die Proteine bis zu dem gewünschten Grad zu vernetzen. Zweckmäßig wird der Knochen etwa 1 Monat lang oder länger mit Glutaraldehyd behandelt.

Durch die Glutaraldehyd-Behandlung werden dem Material viele erwünschte Eigenschaften verliehen. So macht bei-

«c spielsweise die Vernetzung der Proteine durch Glutaraldehyd das Material nicht-antigen, so daß es in einen anderen Wirt als den, aus dem das Knochenausgangsmaterial zur Herstellung des Pfropfmaterials entnommen wurde, implantiert werden kann. Es wurde gefunden, daß der mit Glutaraldehyd behandelte Knochen eine ausgezeichnete Biokompatibilität (biologische Verträglichkeit) aufweist. Wenn ein mit Glutaraldehyd behandelter Knochen in einen Säugetier-Wirtsknochen implantiert wird, tritt im allgemeinen keine faserförmige Einkapselung, Ein-

_oc schaltung eines Fasergewebes zwischen Wirtsknochen und ob

implantiertem Knochen oder irgend-ein anderes Anzeichen einer Abstoßung auf. Stattdessen wächst im Falle eines

nicht-demineralisierten Knochens der Wirtsknochen in den implantierten Knochen hinein, wodurch dieser inkorporiert wird. Im Gegensatz dazu treten dann, wenn Implantate aus weniger biokompatiblen Materialien in Säugetiere eingesetzt werden, die bekannten Probleme einer Zwischenschaltung eines Fasergewebes und einer Einkapselung auf.

Ein anderes bekanntes Problem ist die Resorption des implantierten Knochenmaterials. Das resorbierte Material kann durch den Wirt ersetzt werden oder es kann nicht ersetzt werden. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, eine Prothese zu implantieren, die resorbiert wird, da der Wirtsknochen sie ersetzt. In einem solchen Falle kann die Glutaraldehyd-Beizstufe ersetzt werden durch das 5 Beizen mit einem anderen Mittel (wie z.B. Formaldehyd oder Alkohol), wodurch das Knochenmaterial resorbierbar gemacht wird. In den meisten Fällen ist es jedoch erwünscht, daß das implantierte Material seine Gestalt und Position beibehält und nicht resorbiert wird. Die während

2Q der Glutaraldehyd-Beizung auftretende Vernetzung ergibt ein stabilisiertes Pfropfmaterial, das im allgemeinen nicht resorbiert wird.

Nach der Glutaraldehyd-Beizung kann das Knochenstück auf irgendeine geeignete Weise weiter sterilisiert werden, beispielsweise durch Bestrahlung oder Eintauchen in Ethanol oder in eine bakterizide Lösung. Vorzugsweise wird ein gepuffertes Tensid/Formaldehyd/Ethanol-Sterilisierungsmittel verwendet, wie in der US-Patentanmeldung Nr. 669 735 (eingereicht am 8. November 1984) beschrieben. Das Pfropfmaterial kann in einer geeigneten sterilen Lösung, beispielsweise in 0,05 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd in einem HEPES-Puffer, in sterilen Behältern aufbewahrt werden, bis es benötigt wird.

Um das Knochenpfropfmaterial in die geeignete Position zu bringen, können konventionelle Operationsmethoden an-

gewendet werden. Im allgemeinen werden die geschädigten Abschnitte des Wirtsknochens entfernt und das Pfropfmaterial, das so geformt ist, daß es den fehlenden Knochenabschnitt ersetzt, wird an dem Wirtsknochen befestigt. Zur Positionierung des Pfropfmaterials während des Heilens können übliche Befestigungseinrichtungen, wie z.B. Drähte und Schrauben, IntrameduHa — Stäbe, Gußkörper oder externe Fixiereinrichtungen verwendet werden. Das Einwachsen des Wirtsknochens in das Pfropfmaterial dient dazu, letzteres zu verankern, und die Drähte und Schrauben können gewünschtenfalls zu diesem Zeitpunkt entfernt werden.

Alternativ kann in bestimmten Fällen, wie z.B, beim Füllen eines durch Entfernung eines chirurgischen Stifts entstehenden Tunnels, das maschinell bearbeitete Pfropfmaterial in den Wirtsknochen eingeführt und durch einen Reibungssitz festgehalten werden. Zum Füllen solcher Tunnel oder kleiner Knochendefekte kann auch eine Suspension verwendet werden, die pulverisiertes Knochenpfropfmaterial, suspendiert in einem Träger, enthält.

Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Knochenpfropfmaterials wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. Es ist für den Fachmann klar, daß die Erfindung keineswegs darauf beschränkt ist, sondern daß diese abgeändert werden können in bezug auf die Reihenfolge der Stufen, die Gestalt der Prothese und in bezug auf andere Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens und der damit hergestellten Prothesen, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

-yfi Αψ" ^361789δ

BEISPIEL 1 (Maschinell) bearbeitete Knochenimplantate

Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde angewendet zur Herstellung von (maschinell) bearbeiteten Knochenimplantaten aus dem erfindungsgemäßen Knochenpfropfmaterial.

Aus frisch enthäuteten und von den Hufen befreiten Rinder-Hinterlaufen aus einem Schlachthof wurden Knochenplatten herausgeschnitten. Die Knochenplatte wurde vor dem Knöchel-Schienbein-Gelenk _x im Bereich der Epiphysenplatte, die sich vorher etwa 3,81 bis 5,08 cm (1,5 bis 2 inch) erstreckt, ausgeschnitten. Im allgemeinen ist etwas weicher Markbereich darin enthalten. Das damit verbundene Bindegewebe (Sehnen, Bänder und Fascien) wurde vor der Überführung in eine Maschinenwerkstatt entfernt, in welcher die Knochenplatten bis zur Bearbeitung bei 0 C eingefroren wurden.

Es wurde eine solche Knochenplatte ausgewählt, die mindestens ein 1,91 cm (3/4 inch)-Knochenstück ergab, das frei von der Epiphysenplatte war. Es wurden Knochenstücke entnommen sowohl aus dem Bereich vor der Epiphysenplatte (das heißt, dem Bereich ab der Epiphysenplatte bis zum Knochenmark des langen Schaftes) als auch aus dem Bereich nach der Epiphysenplatte (das heißt;dem Bereich zwischen der Epiphysenplatte und dem Gelenkknorpel).

Die Knochenplatte wurde in einen Bohrständer eingespannt und ausgebohrt unter Verwendung eines Schädelbohrers, wie er für die klinische Biopsie von Knochen verwendet wird. Zum Kühlen und Spülen des Knochens, während ein Kern ausgebohrt wurde, wurde destilliertes Wasser verwendet. Die resultierenden Knochenstücke hatten eine zylindrische Gestalt mit einem Durchmesser von etwa 0,28 cm (0,11 inch) und einer Länge von etwa 1,27 cm (1/2 inch). Die

restliche Knochenplatte wurde verworfen.

Die Knochenstücke ("Knochenkerne") wurden dann in 100 %-igem Ethanol oberflächengereinigt, um Maschinenöle und Bruchstücke zu entfernen. Die Kerne wurden 1/2 Stunde lang in den Alkohol eingetaucht und nach der ersten 1/2 Stunde wurde der Alkohol durch frisches 100 %-iges Ethanol für eine weitere 1/2 Stunde ersetzt. Der Alkohol wurde bei Raumtemperatur, etwa 25°C, gehalten. Die zweite Alkoholspülung wurde abgegossen und die Knochenkerne wurden in einer 0,9 %-igen normalen Salzlösung gespült. Zuerst wurde eine schnelle Spülung angewendet, um das Äußere der Kerne und den Behälter zu reinigen. Daran schlossen sich zwei 30 Minuten-Spülungen in einer 0,9 %-igen Salzlösung an.

Die Kerne wurden visuell inspiziert in bezug auf die MatrixIntegrität und die Matrixporosität und die gewünschten Dimensionen. Dann wurden akzeptable Kerne durch Eintauchen in 0,625 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd in einem HEPES-Puffer für mindestens einen Monat gebeizt. '

Die Knochenkerne wurden durch Eintauchen in eine Lösung mit 4 % Formaldehyd/22,5 % Ethanol/1,2 % Tween, die mit HEPES gepuffert war, pH 7,4, für mindestens 8 Stunden und für höchstens 24 Stunden bei 37°C sterilisiert. Dann wurden die Kerne gespült (vier 10 Minuten-Spülungen und eine 6 Stunden-Spülung) und in 0,05 % (Gew./VoI) HEPES-gepuffertem Glutaraldehyd aufbewahrt, bis sie benötigt wurden. Vor der Implantation wurden die Kerne in einer normalen Salzlösung gespült, bis die Gehalte an restlichem Glutaraldehyd (gemessen durch HPLC) auf nichttoxische Werte gesunken waren.

Die oben hergestellten Kerne wurden in komplementäre Löcher eingesetzt, die unter Anwendung üblicher Opera-

tionsmethoden in den Oberschenkelknochen von Kaninchen erzeugt worden waren. Der Quadrizepsmuskel wurde abgetrennt und über das Kondylum des Oberschenkelknochens beiseite gezogen und in dem Oberschenkelknochen wurde ein Loch mit einem Durchmesser von 0,28 bis 0,30 cm (0,11 bis 0,12 inch) erzeugt, das sich durch den vorderen Kortex bis in den Markbereich erstreckte, das jedoch nicht in den hinteren Kortex eindrang. Der Bereich wurde mit einer Salzlösung gespült, um alle Bruchstücke zu entfernen. Die Tiefe des Loches in dem Oberschenkelknochen stimmte überein mit derjenigen des einzuführenden Knochenkerns, so daß die Oberfläche des eingesetzten Kerns mit der Kondylumoberfläche fluchten würde. Ein Vorstehen des Kerns, das eine Muskelschädigung oder eine übermäßige Kallusbildung während des Reparaturverfahrens hervorrufen würde, wurde somit vermieden .

Die eingesetzten Knochenkerne wurden durch einen Reibungssitz und durch den damit verbundenen Quadrizepsmuskel-Druck auf die Oberseite an Ort und Stelle festgehalten. Die Fläche wurde durch eine Naht verschlossen und die implantierten Kerne wurden 1 bis 6 Monate lang an Ort und Stelle belassen, bevor sie aus den einzelnen Kaninchen entfernt wurden. Die entnommenen Kerne wurden in einem Veterinär-Vergleichslabor histologisch untersucht und es wurde ein Bericht auf monatlicher Basis angefertigt. Die bei allen Untersuchungen gefundenen Ergebnisse zeigen, daß keine faserige Ummantelung des Implantats auftrat und daß eine Wirtsknochen-Invasion in die endostelen, intramedulären (Markbereich) und die peristelen Oberflächen auftrat. Damit wurde die Gesamtinvasion aller Knochenoberflächen demonstriert. Um zwischen neuem und altem Knochen zu unterscheiden, wurden eine Phloxin-Tartrazin-Färbung sowie eine Schilderung, ob der abgeschiedene neue Knochen für eine Zeitspanne vorhanden gewesen war oder nicht, angewendet. Neu abge-

schiedener Knochen weist in der Regel eine Knochenstruktur vom Gewebe-Typ auf, während ein älterer Knochen eine Knochenstruktur vom Lamellen-Typ besitzt. Eine Invasion des Implantats durch den Wirtsknochen (Osteokonduktion) war bereits innerhalb von nur drei Monaten zu erkennen.

Es wurde gefunden, daß bei den Kernen, die aus Knochen

stammten, der aus dem Bereich nach der Epiphysenplatte

(siehe oben) entnommen war_r eine etwas stärkere Invasion des Wirtsknochens auftrat.

BEISPIEL 2

Knochenpfropfmaterial aus pulverisiertem ¹^ Knochen

Aus Rinderhinterlaufen wurden Knochenplatten herausgeschnitten, wie in Beispiel 1 beschrieben. Eine Knochenplatte wurde zerkleinert und mit destilliertem Wasser gewaschen, um irgendwelche wasserlösliche Substanzen zu entfernen. Dann wurde der Knochen getrocknet und in einer Flüssigstickstoffmühle pulverisiert. Das Material wurde dann gesiebt und es wurden Teilchen in dem gewünschten Größenbereich (etwa 75 um) isoliert. Der pulverisierte Knochen wurde dann in eine Lösung eingetaucht, die enthielt oder bestand aus O,3N HCl und 0,1 % EDTA, bis der Knochen vollständig demineralisiert war. Es folgten mehrere Waschvorgänge in destilliertem Wasser und das Knochenmaterial wurde dann 3 χ in 100 %-iges Ethanol eingetaucht und danach getrocknet. Das Material wurde mit Chloroform : Methanol (1 : 1) extrahiert, mit Pronase*⁵' behandelt und mit Glutaraldehyd gebeizt nach Verfahren, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind.

Das Knochenpfropfmaterial wurde mit einer Salzlösung gespült, um Glutaraldehyd zu entfernen (wie in Beispiel 1)

und mit Gelatine kombiniert in einen Tunnel implantiert, der bei der Entfernung eines chirurgischen Stiftes in einem Wirtsknochen entstand. Die Gelatine wurde nach der Implantation fest.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf spezifische bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen,
stabilen und nicht-antigenen Knochenpfropfmaterials aus einem allogenen oder xenogenen Knochenausgangsmaterial, dadurch gekennzeichnet , daß es die
folgenden Stufen umfaßt:
a) (maschinelle) Bearbeitung eines Knochensegments, bis die gewünschten Dimensionen erreicht sind^und
b) Beizen des Knochensegments durch Behandeln desselben mit Glutaraldehyd unter beizenden Bedingungen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Knochensegment mit einer Beizlösung behandelt

wird, die Glutaraldehyd in einer Konzentration enthält, die ausreicht, um die Proteine in dem Knochensegment im wesentlichen zu vernetzen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Knochensegment mit einer Beizlösung behandelt

wird, die etwa 0,2 bis etwa 0,8 % (Gew./VoI) Glutaraldehyd enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Beizlösung etwa 0,6 % (Gew./VoI) Glutaraldehyd

enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Beizlösung außerdem einen Puffer enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Puffer um HEPES handelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Beizbedingungen einen physiologischen pH-Wert umfassen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wertbereich bei etwa 6,8 bis etwa 7,4 liegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Knochensegment mit Glutaraldehyd behandelt wird für eine Zeitspanne, die ausreicht, um die Proteine in dem Knochensegment im wesentlichen zu vernetzen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Knochensegment mindestens etwa 1 Monat lang mit Glutaraldehyd behandelt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Grad der Vernetzung ausreicht, um den Knochen biokompatibel, stabil und nichtantigen zu machen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Behandlung des Knochensegments mit einer Protease, um die Porosität der Matrix zu erhöhen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt das Extrahieren des Knochensegments mit einem organischen Lösungsmittel, um die Porosität der Matrix zu erhöhen.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, da-OQ durch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Sterilisierung des Knochenpfropfmaterials.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Oberflächenentfettung und Entfernung von Maschinenölen von dem Knochensegment mit Ethanol.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Deminer alisierung des Knochensegments.

17. Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen und nicht-antigenen Knochenpfropfmaterials aus einem allogenen oder xenogenen Knochenausgangsmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

a) Pulverisieren eines Knochensegments zur Herstellung eines pulverisierten Knochens;

b) Beizen des pulverisierten Knochens mit Glutaraldehyd unter beizenden Bedingungen; und

c) Kombinieren des pulverisierten Knochens mit einem gelatineartigen oder halb-festen Träger.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Behandlung des Knochens mit einer Protease, um die Porosität der Matrix zu erhöhen.

19· Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Extraktion des Knochens mit einem organischen Lösungsmittel, um die Porosität der Matrix zu erhöhen.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Sterilisierung des Knochenpfropfmaterials.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Entfernung von Fetten und Maschinenölen von dem Knochen mit Ethanol.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich umfaßt die Deminer al is ierung des Knochens.

23. Biokompatibles, nicht-antigenes und stabiles Knochenpfropfmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem allogenen oder xenogenen Knochenausgangsmaterial durch(maschinelle) Bearbeitung in die gewünschte Form (Gestalt) gebracht worden ist und mit Glutaralde- hyd unter Beizbedingungen gebeizt worden ist.

24. Biokompatibles, nicht-antigenes und stabiles Knochenpfropfmaterial, gekennzeichnet durch sein allogenes oder xenogenes Knochenausgangsmaterial, das pulverisiert oder gepulvert und unter beizenden Bedingungen mit Glutaraldehyd gebeizt worden ist.

25. Knochenpfropfmaterial nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Implantieren benachbart zu dem Wirtsknochen eine Osteokonduktion aufweist.

26. Verfahren zur Reparatur von Knochendefekten, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

a) Entfernen der geschädigten oder erkrankten Wirtskno- - chen-Teile, die vorhanden sein können; und

b) Implantieren des Knochenpfropfmaterials der Ansprüche 23 oder 24, um den Defekt zu reparieren.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Knochensegment mit einer gepufferten Beizlösung, die etwa 0,2 bis etwa 0,8 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd enthält, für einen Zeitraum

g₀ von mindestens 1 Monat in Kontakt gebracht wird.