DE3615384A1

DE3615384A1 - Method for determining rheumatoid factor and denatured, human gamma -globulin for the method

Info

Publication number: DE3615384A1
Application number: DE19863615384
Authority: DE
Inventors: Akiei Tochigi Hamano; Takashi Ohmiya Saitama Nakadate; Hideaki Kasukabe Saitama Shibata
Original assignee: Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Current assignee: Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Priority date: 1985-05-08
Filing date: 1986-05-07
Publication date: 1986-11-13

Abstract

A method for the quantitative determination of rheumatoid factor is described. In the method, an immune reaction between the rheumatoid factor in the serum sample and a denatured human gamma -globulin is initiated, specifically in the presence of an activator. The turbidity of the resulting reaction solution is measured using an automatic analyser. The invention furthermore relates to the denatured human gamma -globulin itself.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Rheumafaktors und denatu-Method for determining the rheumatoid factor and denatural

riertes, menschliches y-Globulin für das Verfahren Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung des Rheumafaktors sowie ein denaturiertes y-Globulin, das bei Durchführung des Verfahrens eingesetzt wird. rated human γ-globulin for the method The invention relates to a new method for determining rheumatoid factor and a denatured one y-globulin, which is used when carrying out the procedure.

Der Rheumafaktor (auch als 'BRheumatoidfaktor" bezeichnet; im folgenden einfach als "RFIß abgekürzt) wurde in den Seren von Patienten mit einer Erkrankung des Immumkomplexes festgestellt, z.B. bei Patienten mit rheumatoider chronischer Arthritis. Der RF umfaßt als Hauptkomponente ein:-Makroglobulin mit einem Molekulargewicht von etwa 1 000 000 und wurde als ein IgM mit einer Sedimentationsrate von 19 sec abgeschätzt. Der RF verhält sich wie ein Antikörper und zeigt eine spezifische und starke Wirkung gegen y-Globulin, und zwar eigenes, von der gleichen Familie oder einer unterschiedlichen Art. The rheumatoid factor (also referred to as "B rheumatoid factor"; in the following simply abbreviated as "RFIß") was found in the sera of patients with a disease of the immune complex, for example in patients with rheumatoid chronic arthritis. The RF comprises as a main component a: Macroglobulin with a molecular weight of about 1,000,000 and was estimated to be an IgM with a sedimentation rate of 19 seconds. The RF behaves like an antibody and shows a specific and strong effect against γ-globulin, whether of its own, of the same family or of a different species.

Man hat daher eine quantitative RF-Bestimmungsmethode unter Verwendung eines Serums als Probe in der Praxis angewendet, um Diagnosen von rheumatoiden Erkrankungen und insbesondere rheumatoider chronischer Arthritis durchzuführen.A quantitative RF determination method has therefore been used of a serum as a sample used in practice to diagnose rheumatoid diseases and particularly rheumatoid chronic arthritis.

Zur Bestimmung des RF sind bisher verßchiedene Verfahren vorgeschlagen worden, z.B. ein RA-Test unter Verwendung von Polystyrollatex oder Bentonitteilchen und unter Nutzung einer Aggregationsreaktion; eine Waalar-Rose-Reaktion unter Nutzung einer sensibilisierten Schaf-Rotzellen-Agglutination; Heller-Modifikation sowie ein RAHA-Test, bei dem einige manuelle Operationen bei der Waalar-Rose-Reaktion einfacher gestaltet werden.Various methods have hitherto been proposed for determining the RF for example, an RA test using polystyrene latex or bentonite particles and using an aggregation reaction; utilizing a Waalar-Rose reaction a sensitized sheep red cell agglutination; Heller modification as well a RAHA test that involves some manual operations on the Waalar-Rose reaction be made simpler.

Im allgemeinen verwendet man den RA- und den RAHA-Test.The RA and RAHA tests are generally used.

Der RA-Test zeigt eine hohe Empfindlichkeit und ist daher als erstes Screeningverfahren hervorragend geeignet.The RA test shows high sensitivity, so it is the first Screening method excellently suited.

Er hat jedoch Nachteile dahingehend, daß oft eine nichtspezifische Reaktion eintritt und zu einer fälschlich positiven Beurteilung führt und daß ferner die Beurteilung auf der Beobachtung durch das menschliche Auge basiert, wodurch eine quantitative Bestimmung schwierig wird. Demgegenüber ist beim RAHA-Test eine relativ hohe Spezifität der Reaktion gegeben. Diese Testmethode hat jedoch Nachteile wegen ihrer geringen Empfindlichkeit und wegen der erforderlichen langen Reaktionszeit. Bei dem RAHA-Test ist eine quantitative Bestimmung möglich, die erhaltenen Ergebnisse lassen jedoch eine Kontinuität vermissen, da der Test ein Serumsystem erfordert, das über die Untersuchungsserie auf das Doppelte verdunnt wird.However, it has disadvantages in that it is often non-specific Reaction occurs and leads to a false positive assessment and that furthermore the judgment is based on the observation by the human eye, whereby a quantitative determination becomes difficult. In contrast, the RAHA test has a given relatively high specificity of the reaction. However, this test method has disadvantages because of their low sensitivity and because of the long response time required. With the RAHA test, a quantitative determination is possible, the results obtained however lack continuity as the test requires a serum system which is doubled over the series of tests.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Bestimmung des RF zu schaffen, bei dem die Nachteile der herkömmlichen Methoden vermieden und die Vorteile der herkömmlichen Methoden erzielt werden. Die speziellen Probleme, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst werden sollen, sind wie folgt: (a) Unterdrückung von nicht-spezifischen Reaktionen, (b) Ermöglichung einer quantitativen Messung, (c) Steigerung der Meßgenauigkeit, (d) Verkürzung der erforderlichen Reaktionszeit, um eine Anwendung dieser Methode bei einem automatischen Analysator zu ermöglichen und auf diese Weise die manuelle Tätigkeit auf ein Minimum zu reduzieren, und (e) eine positiv- oder negativ-Beurteilung, basierend auf einem optischen Meßergebnis, um auf diese Weise das Einschleichen von Fehlern durch ein unbewaffnetes Auge zu vermeiden und das Beurteilungsverfahren zu beschleunigen.It is therefore the object of the present invention to provide a new method to create the determination of the RF which the disadvantages of conventional Avoid methods and take advantage of traditional methods. the special problems which are to be solved by the method according to the invention, are as follows: (a) suppression of non-specific responses, (b) enabling a quantitative measurement, (c) increasing the measurement accuracy, (d) shortening the reaction time required to apply this method to an automatic Analyzer and in this way manual activity to a minimum to reduce, and (e) a positive or negative assessment based on a optical measurement result in order to prevent errors from creeping in to avoid the naked eye and to speed up the assessment process.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung i-st die Schaffung eines denaturierten, menschlichen y-Globulins per se, welches geeignet ist zur Anwendung bei dem obigen RF-Bestimmungsverfahren der Erfindung.Another object of the present invention is to provide a denatured, human γ-globulin per se, which is suitable for use in the above RF determination method of the invention.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Nutzung einer Immunoskopometrie. Die Immunoskopometrie ist per se ein bekanntes Verfahren unter Nutzung einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Eine Anwendung der Immunoskopometrie zur Bestimmung von RF wurde bisher noch nicht berichtet. Genauer gesagt haben die erwähnten, herkömmlichen Verfahren des RA-Tests, der Waalar-Rose-Reaktion, der Heller-Modifikation und des RAHA-Tests mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemein die Nutzung der Immunreaktion. Es bestehen jedoch Unterschiede dadurch, daß jedes der ersteren herkömmlichen Verfahren eine Agglutination oder Aggregation nutzt, während das letztere, erfindungsgemäße Verfahren eine Präzipitation oder Sedimentation nutzt.The method according to the invention is based on the use of immunoscopy. Immunoscopy per se is a known method using an antigen-antibody reaction. An application of immunoscopy for the determination of RF has not yet been found reported. To be more precise, the above-mentioned conventional methods of the RA test, the Waalar-Rose reaction, the Heller modification and the RAHA test with the inventive Procedures in common use the immune response. However, there are differences as a result of that any of the former conventional methods involve agglutination or aggregation uses, while the latter method according to the invention uses precipitation or sedimentation.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt folgende Verfahrensstufen: Zu einer Serumprobe wird eine Pufferlösung gegeben, welche ein denaturiertes, menschliches y-Globulin enthält sowie eine wasserlösliche, hochmolekulare Substanz als Beschleuniger. In der resultierenden Lösung wird eine Antigen-Antikörper-Reaktion verursacht, die Trübung der Reaktionslösung wird unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen und die Trübheit wird mit einer Standard-Eichlinie verglichen, welche zuvor hergestellt wurde durch Trübheitsmessungen auf ähnliche Weise und unter Verwendung einer Standard-Serumprobe. Auf diese Weise wird der RF-Wert der Serumprobe quantitativ bestimmt.The process according to the invention comprises the following process steps: To a serum sample is given a buffer solution which is a denatured human Y-globulin contains a water-soluble, high-molecular substance as an accelerator. An antigen-antibody reaction is caused in the resulting solution, which Turbidity of the reaction solution is measured using a spectrophotometer and the turbidity is compared to a standard calibration line which was previously made was determined by turbidity measurements in a similar manner and using a standard serum sample. In this way the RF value of the serum sample is quantified.

Bei der Pufferlösung kann es sich um eine vom Typ HEPES handeln. Die wasserlösliche, hochmolekulare Substanz kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykolen, Polysacchariden und Proteinen. Als Polysaccharide und Proteine seien erwähnt: Dextran, Chondroitinschwefelsäure, Arginsäure, Gummiarabikum, Methylcellulose, Heparin, Gelatine, Albumin, Casein, Fibrinogen, Lecithin, Con A, PHA und dergl. Unter den wasserlöslichen, hochmolekularen Substanzen hat man das Polyethylenglykol in weitem Umfang als Beschleuniger bei allgemeinen Antigen-Antikörper-Reaktionen eingesetzt. Falls man diese Verbindung jedoch auswählt für die Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, so sollte ihre Konzentration auf einem niedrigen Niveau gehalten werden, z.B. 2% oder weniger im Falle eines Molekulargewichts von 6000 und 3% oder weniger im Falle eines Molekulargewichts von 4000. Falls man die Konzentration höher einstellt, um die Empfindlichkeit zu steigern, so beobachtet man Schwankungen bei einem Proben-Blindwert, wodurch sich die Meßgenauigkeit verringert.The buffer solution can be of the HEPES type. the water-soluble, high molecular substance can be selected from the group consisting of from polyethylene glycols, polysaccharides and proteins. As polysaccharides and proteins are mentioned: dextran, chondroitin sulfuric acid, arginic acid, gum arabic, methyl cellulose, Heparin, gelatin, albumin, casein, fibrinogen, lecithin, Con A, PHA and the like. Polyethylene glycol is one of the water-soluble, high-molecular substances Widely used as an accelerator in general antigen-antibody reactions used. However, if this connection is selected for use with the method according to the invention, their concentration should be at a low level for example, 2% or less in the case of a molecular weight from 6000 and 3% or less in the case of a molecular weight of 4000. In the case of the Adjusts concentration higher to increase sensitivity, so observed there are fluctuations in a sample blank value, as a result of which the measurement accuracy is reduced.

Die Erfindung betrifft ferner das denaturierte, menschliche Globulin per se, welches für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Erfindungsgemäß ist das denaturierte, menschliche y-Globulin dadurch gekennzeichnet, daß es ein Verhältnis von polymerem IgG zu monomerem IgG von 0,7 oder mehr aufweist.The invention also relates to denatured human globulin per se which is suitable for carrying out the method according to the invention. According to the invention, the denatured, human γ-globulin is characterized by that it has a ratio of polymeric IgG to monomeric IgG of 0.7 or more.

Zur Herstellung des denaturierten, menschlichen y-Globulins der vorliegenden Erfindung kommen verschiedene, ansich bekannte Verfahren in Betracht, z.B. die Anwendung von Hitze, Harnstoff oder anderer Denaturierungsverfahren. Die Einschränkung hinsichtlich des Verhältnisses hat seinen Grund darin, daß bei einem zu geringen Gehalt an polymerem IgG die gewünschte, bemerkenswerte Verbesserung der Reaktivität nicht erreicht wird. Mit anderen Worten, es besteht keine obere Grenze hinsichtlich des Gehalts an polymerem IgG,und es kann somit ein 100% polymeres IgG eingesetzt werden, das aus einem Reaktionsprodukt bei dem Denaturierungsverfahren isoliert wurde.To make the denatured human γ-globulin of the present Various methods known per se come into consideration in the invention, e.g. application from heat, urea, or other denaturation processes. The limitation on The reason for the ratio is that if the content of polymer is too low IgG the desired, remarkable improvement in reactivity is not achieved. In other words, there is no upper limit on the content of the polymer IgG, and thus a 100% polymeric IgG can be used, which consists of a reaction product was isolated in the denaturation process.

Ein solches denaturiertes, menschliches Globulin erzeugt eine hohe Spezifität bei der Reaktion, wenn die RF-Messung durchgeführt wird, und der Beschleuniger dient im Sinne einer weiteren Förderung der Reaktion. Im Ergebnis wird damit erfindungsgemäß die Präzipitation oder Segmentation genutzt, und zwar anstelle der Aggregation oder Agglutination, die bei den herkömmlichen Verfahren angewendet wurde. Dieser Ersatz ermöglicht die Anwendung eines biochemischen Analysators. Dadurch kann eine rasche Messung des RF und eine vorläufige Beurteilung für die Enddiagnose hinsichtlich rheumatoider, chronischer Arthritis erzielt werden. Es werden Fehler vermieden, die auf der Beobachtung mit dem unbewaffneten Auge beruhen.Such a denatured human globulin generates high specificity in the reaction when the RF measurement is carried out, and the accelerator serves to further promote the reaction. As a result, according to the invention, precipitation or segmentation is used instead of the aggregation or agglutination that was used in the conventional methods. This replacement enables the Use of a biochemical analyzer. Thereby, a quick measurement of the RF and a preliminary assessment for the final diagnosis of rheumatoid chronic arthritis can be achieved. Errors based on observation with the naked eye are avoided.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Zeichnungen erläutert; es zeigen: Fig. 1 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen der Denaturierungstemperatur und der Trübung, wenn ein denaturiertes, menschliches Globulin der vorliegenden Erfindung mit RF umgesetzt wird; Fig. 2 eine graphische Darstellung des Einflusses der Verdünnungsrate des unter verschiedenen Temperaturbedingungen denaturierten, mensddlichen y-Globulins auf die Reaktivität mit RF; Fig. 3 eine graphische Darstellung ähnlich der von Fig. 2, jedoch bei mit Harnstoff denaturiertem, menschlichem t-Globulin; Fig. 4 eine Illustration zur Erläuterung der Operationen des erfindungsgemäßen RF-Meßverfahrens; Fig. 5 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen der Absorptionsfähigkeit und der Verdünnungsrate als RF-Wert, um eine Standard-Eichkurve darzustellen; und Fig. 6 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen dem in Fig. 4 gezeigten, erfindungsgemEßen Verfahren und einem Latex-Fixierverfahren als herkömmliches Verfahren.In the following the invention is explained with reference to drawings; Fig. 1 is a graph showing the relationship between denaturation temperature and turbidity when a denatured human globulin of the present Invention is implemented with RF; 2 shows a graph of the influence the dilution rate of the denatured under different temperature conditions, human y-globulin for reactivity with RF; 3 is a graphical representation similar to that of FIG. 2, but with human t-globulin denatured with urea; Fig. 4 is an illustration for explaining the operations of the RF measurement method according to the invention; Fig. 5 is a graph showing the relationship between absorbency and the dilution rate as an RF value to represent a standard calibration curve; and FIG. 6 is a graph showing the relationship between that shown in FIG. the method of the present invention and a latex fixing method as the conventional method.

Im folgenden wird die Erfindung anhand bevorzugter Beispiele erläutert.The invention is illustrated below with the aid of preferred examples.

Beispiel 1 Hitze-Denaturation von menschlichem y-Globulin und Reaktivität mit RF, wenn man das denaturierte Globulin zur Messung des RF einsetzt In O,OZM-HEPES-Puffer (pH 7,2), enthaltend Natriumazid(NaN3) und NaCl in Konzentrationen von 0,1 bzw. 0,85', löst man menschliches Globulin (Cohn Fraction II der Sigma Co.) auf, so daß dessen Konzentration 1 beträgt. Die resultierende Lösung wird in sechs Gruppen eingeteilt und jede der Lösungsgruppen bei einer festgelegten Temperatur zwischen 53 und 630C erhitzt, um eine Hitze-Denaturierung des Globulins zu verursachen.Example 1 Heat Denaturation of Human γ-Globulin and Reactivity with RF, if the denatured globulin is used to measure the RF In O, OZM-HEPES buffer (pH 7.2), containing sodium azide (NaN3) and NaCl in concentrations of 0.1 and 0.85 ', one dissolves human globulin (Cohn Fraction II from Sigma Co.) so that whose concentration is 1. The resulting solution is divided into six groups and each of the solution groups at a specified temperature between 53 and 630C heated to cause heat denaturation of the globulin.

Jede der so behandelten Gruppenlösungen wird unter Verwendung von Sephadex G-200, das mit 0,1% Phosphorsäure-Puffer äquilibriert wurde, gel-filtriert, um eine Trennung in polymeres IgG und monomeres IgG zu erreichen.Each of the group solutions thus treated is made using Sephadex G-200 equilibrated with 0.1% phosphoric acid buffer, gel-filtered, to achieve a separation into polymeric IgG and monomeric IgG.

Die Protein-Konzentration jeder Probe wird bestimmt mittels einer Lowry-Folin-Methode. Auf diese Weise wird ein Verhältnis zwischen dem polymeren IgG und dem monomeren IgG festgestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.The protein concentration of each sample is determined using a Lowry-Folin Method. In this way, a relationship between the polymer IgG and the monomeric IgG were detected. The results obtained are as follows Table 1 compiled.

Tabelle 1 Behandlungstemperatur (OC) Polymeres IgG Monomeres IgG 53 0,18 1 55 0,31 1 57 0,33 1 59 0,36 1 61 0,71 1 63 0,86 1 Die Reaktivität jedes der erhaltenen, denaturierten, menschlichen y-Globuline mit RF wird untersucht, und zwar auf die im nachfolgenden Beispiel 3 beschriebene Weise und durch Messung der Trübung. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Aus der graphischen Darstellung dieser Figur geht hervor, daß im Hinblick auf den Einfluß auf die Reaktivität ein rascher Wendepunkt bei dem Globulin beobachtet wird, welches bei einer Temperatur zwischen 59 und 610c denaturiert wurde, und daß der Einfluß auf die Reaktivität verringert werden kann, wenn die Denaturierungstemperatur auf 61°C oder mehr festgelegt wird. Wenn man dieses Ergebnise und die in der obigen Tabelle 1 zusammengefaßten Ergebnisse betrachtet, so wird auch deutlich, daß das Verhältnis von polymerem IgG zu monomerem IgG vorzugsweise 0,7 oder mehr beträgt. Table 1 Treatment temperature (OC) Polymeric IgG Monomeric IgG 53 0.18 1 55 0.31 1 57 0.33 1 59 0.36 1 61 0.71 1 63 0.86 1 The reactivity of each the denatured human y-globulins obtained with RF are examined, and in the manner described in Example 3 below and by measuring the turbidity. The results are shown in FIG. From the graphing this figure shows that in terms of influence on reactivity a rapid inflection point is observed in globulin, which was denatured at a temperature between 59 and 610c, and that the influence on reactivity can be reduced when the denaturation temperature is up 61 ° C or more is set. Taking this result and those in the above Looking at the results summarized in Table 1, it is also clear that the The ratio of polymeric IgG to monomeric IgG is preferably 0.7 or more.

Es wurde ferner eine 100% monomeres IgG-Sektion und eine 100% polymeres IgG-Sektion aus den Fraktionen von menschlichem Globulin isoliert, die bei verschiedenen Behandlungstemperaturen (53 bis 63°C mit Intervallen von 20C) denaturiert wurden. Auf diese Weise wird eine Verdünnungsserie von sechs Stufen hergestellt, nämlich 0/10, 2/10, 4/10, 6/10, 8/10 und 10/10. Der Einfluß derartiger Proben auf die Reaktivität mit RF wurde durch Trübungsmessungen, wie oben beschrieben, untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Man erkennt aus dem Kurvenverlauf dieser Figur, daß 100% monomeres menschliches Globulin (Denaturierungsgrad = O) für die Messung von RF nicht eingesetzt werden kann. Andererseits tritt ein vorteilhafter Effekt auf mit zunehmendem Denaturierungsgrad,und im Falle von Hitze-Denaturierung erhält man die besten Ergebnisse bei Human-y-Globulin, das bei einer Temperatur von 610C denaturiert wurde.There was also a 100% monomeric IgG section and a 100% polymeric section IgG section isolated from the fractions of human globulin obtained from various Treatment temperatures (53 to 63 ° C with intervals of 20C) were denatured. In this way a series of six dilutions is made, viz 0/10, 2/10, 4/10, 6/10, 8/10 and 10/10. The influence of such samples on reactivity with RF was examined by turbidity measurements as described above. The received Results are shown in FIG. One can see from the curve of this figure, that 100% monomeric human globulin (degree of denaturation = O) for the measurement cannot be used by RF. On the other hand, there is an advantageous effect on with increasing degree of denaturation, and in the case of heat denaturation get the best results with human y-globulin, which is kept at a temperature of 610C has been denatured.

Beispiel 2 Harnstoff-Denaturierung von Human-y-Globulin und Reaktivität mit RF, wenn man das denaturierte Globulin zur Messung von RF einsetzt In einer Lösung, enthaltend 6M Harnstoff und 0,15M NaCl, wird ein Human-y-Globulin (Cohn Fraction II der Sigma Co.) aufgelöst, so daß dessen Konzentration 1% beträgt.Example 2 Urea Denaturation of Human γ-Globulin and Reactivity with RF, if the denatured globulin is used to measure RF Solution containing 6M urea and 0.15M NaCl, a human γ-globulin (Cohn Fraction II from Sigma Co.) so that its concentration is 1%.

Die resultierende Lösung wird 24 h bei Raumtemperatur gegen 6M Harnstofflösung dialysiert, 72 h bei 40C gegen 15M NaCl-Lösung dialysiert und ferner 24 h bei 40C gegen 0,02M HEPES-Puffer (pH 7,2) dialysiert. Die resultierende Lösung wird gemäß Beispiel 1 gel-filtriert und in polymeres IgG und monomeres IgG getrennt. Das Verhältnis der Protein-Konzentrationen wird untersucht und man findet ein Verhältnis polymeres IgG/monomeres IgG = 1,26/1.The resulting solution is for 24 h at room temperature against 6M urea solution dialyzed, dialyzed against 15M NaCl solution at 40C for 72 h and further at 40C for 24 h dialyzed against 0.02M HEPES buffer (pH 7.2). The resulting solution is according to Example 1 gel-filtered and separated into polymeric IgG and monomeric IgG. The relationship The protein concentrations are examined and a polymeric ratio is found IgG / monomeric IgG = 1.26 / 1.

Das resultierende, denaturierte Human-y-Globulin sowie ein 100% monomeres IgG (nicht-denaturierte Substanz) und ein 100 polymeres IgG (vollständig denaturierte Substanz), wobei die beiden letzteren aus der ersteren isoliert wurden, werden eingesetzt, um eine Verdünnungsserie von sechs Stufen zu schaffen, nämlich 0/10, 2/10, 4/10, 6/10, 8/10 und i0/i0. Der Einfluß jeder Probe auf die Reaktivität mit RF wird auf die im folgenden Beispiel 3 beschriebene Weise untersucht, und zwar durch Messung der Trübung. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Man erkennt aus den Kurven dieser Figur, daß die Verwendung von hoch-denaturiertem, menschlichem -Globulin stärker bevorzugt ist und daß im Falle der nicht-denaturierten Substanz die Messung des RF unmöglich wird.The resulting, denatured human γ-globulin and a 100% monomeric IgG (non-denatured substance) and a 100 polymeric IgG (completely denatured Substance), the latter two being isolated from the former, are used, to create a series of six dilutions, namely 0/10, 2/10, 4/10, 6/10, 8/10 and i0 / i0. The influence of each sample on the reactivity with RF is on examined the manner described in Example 3 below, namely by measurement the cloudiness. The results are shown in FIG. You can see this from the curves Figure that the use of highly denatured human -globulin is stronger is preferred and that in the case of the non-denatured substance, the measurement of the RF becomes impossible.

Beispiel 3 Messung des RF unter Verwendung eines automatischen Analysators (A) Verwendeter Analysator und Einstellung der Parameter Um manuelle Tätigkeit möglichst einzusparen, wird ein biochemischer, automatischer Analysator (Typ 705 der Hitachi Ltd., Japan) eingesetzt. Es ist erforderlich, verschiedene Parameter einzustellen, damit der Analysator in den Betriebszustand gelangt. Die Parameter wurden gemäß folgender Tabelle 2 eingestellt.Example 3 Measurement of RF using an automatic analyzer (A) Analyzer used and setting of parameters To make manual activity as possible A biochemical, automatic analyzer (type 705 from Hitachi Ltd., Japan). It is necessary to set various parameters so that the analyzer enters the operating state. The parameters were according to the following table 2 is set.

Tabelle 2 Parameter Eingestellter Wert Test A Assay-Code END Probenvolumen 20 R1 Vol. 350 R2 50-1-tS) R3 Wellenlänge 1 700 Wellenlänge 2 340 RGT-BLK-ABS O RGT-BLK-Konz. O STD-Konz. 0-0-0 Faktor 10 000 STD-ABS-Zulässigkeit 20% Normalbereich L O Normalbereich H 9999 ABS-Limit (Rate) O Kontrolle ID.Nr. 0-0-0 (B) Reagentien a) Erstes Reagens (R1) 0,02M HEPES-Puffer (pH 7,2), enthaltend 0,1M NaCl, 0,196 NaN3, 0,1% Chondroitinschwefelsäure, 0,1°,4 TX-100 (oberflächenaktives Mittel) und 0,25°% Polyethylenglykol (Molekulargewicht 4000). Table 2 Parameter Set Value Test A Assay Code END Sample Volume 20 R1 Vol. 350 R2 50-1-tS) R3 wavelength 1 700 wavelength 2 340 RGT-BLK-ABS O RGT-BLK conc. O STD conc. 0-0-0 Factor 10,000 STD ABS permissibility 20% normal range L O normal range H 9999 ABS limit (rate) O control ID no. 0-0-0 (B) reagents a) First reagent (R1) 0.02M HEPES buffer (pH 7.2) containing 0.1M NaCl, 0.196 NaN3, 0.1% chondroitin sulfuric acid, 0.1 °, 4 TX-100 (surfactant) and 0.25% Polyethylene glycol (molecular weight 4000).

b) Zweites Reagens (R2) O,02M HEPES-Puffer, enthaltend 0,1M (0,8%) NaCl, 0,1% NaN3 und 1,0% Human-y-Globulin (Cohn Fraction II der Sigma Co.), wobei das Globulin durch 30minütiges Erhitzen bei 610C denaturiert wurde (Verhältnis polymeres IgG/monomeres IgG in dem Globulin = 0,71). b) Second reagent (R2) 0.02M HEPES buffer containing 0.1M (0.8%) NaCl, 0.1% NaN3 and 1.0% human γ-globulin (Cohn Fraction II from Sigma Co.), where the globulin was denatured by heating at 610C for 30 minutes (ratio polymeres IgG / monomeric IgG in the globulin = 0.71).

(C) Betriebsweise Die Operationen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind allgemein in Fig. 4 dargestellt. Zunächst wird die Absorption der Wasser-Blindprobe gemessen. Dann wird eine Serumprobe (S) und das erste Reagens (R1) gleichzeitig oder aufeinanderfolgende zugesetzt und eine Absorption der resultierenden Lösung kontinuierlich 31 Mal während 10 min mit 20 sec-Intervallen gemessen.(C) Mode of Operation The operations for performing the present invention Procedures are shown generally in FIG. First of all, the absorption of the Water blank measured. Then a serum sample (S) and the first reagent (R1) added simultaneously or successively and an absorption of the resulting Solution measured continuously 31 times over 10 min at 20 sec intervals.

Innerhalb dieser Meßperiode, nämlich 5 min nach Zugabe des ersten Reagens (R1), wird das zweite Reagens (R2) zugesetzt. Mit anderen Worten wird die Absorptionsmessung an der Serumprobe (S) 5 min nach Zusatz des ersten Reagens (R1) und dann an einer Reaktionslösung der Serumprobe (S) und dem zweiten Reagens (R2) während der folgenden 5 min durchgeführt. Jeder gemessene Absorptionswert im Verlauf der 31 Messungen ab Zugabe des ersten Reagens wird automatisch kompensiert durch Abzug des Absorptionswertes der Wasser-Blindprobe, und zwar mit Hilfe eines arithmetischen Mechanismus, der dem Analysator einverleibt ist.Within this measuring period, namely 5 minutes after adding the first Reagent (R1), the second reagent (R2) is added. In other words, the Absorbance measurement on the serum sample (S) 5 min after adding the first reagent (R1) and then on a reaction solution of the serum sample (S) and the second reagent (R2) carried out during the following 5 minutes. Every measured absorption value in the course of the 31 measurements from the addition of the first reagent is automatically compensated by Deduction of the absorption value of the water blank sample with the help of an arithmetic Mechanism built into the analyzer.

In diesem Beispiel wird zunächst die Absorption der Wasser-Blindprobe gemessen. Anschließend wird gemäß dem eingestellten Parameter unter Punkt A 20/ul der Serumprobe (S) und 350/ul der Blindprobe als erstes Reagens (R1) zugesetzt. Dann beginnt die Messung der Absorption und 5 min später werden 50/ul Lösung denaturiertem Human-y-Globulin (R2) als zweites Reagens zugesetzt und die Absorptionsmessung wird weitere 5 min fortgesetzt.In this example, the absorption of the blank water sample is taken first measured. Then according to the set parameters under Point A 20 / ul of the serum sample (S) and 350 / ul of the blank as first reagent (R1) added. Then the measurement of the absorbance begins and 5 min later it becomes 50 / ul Solution denatured human γ-globulin (R2) added as a second reagent and the Absorption measurement is continued for a further 5 min.

Da der Einstellwert bei dem Assay-Code der in Punkt A angegebenen Parameter als END eingestellt wird, nimmt man einen Mittelwert der letzten beiden Messungen (der 14. und der 15.) für die Absorption der Blindprobe und in ähnlicher Weise einen Mittelwert der letzten beiden Messungen (der 30. und 31.) für die Absorption der ausreagierten Lösung (der Lösung, in der R2 mit s reagiert hat).Since the setting value for the assay code is the same as that specified in point A. Parameter is set as END, one takes an average of the last two Measurements (the 14th and the 15th) for the absorbance of the blank and in the like Way an average of the last two measurements (the 30th and 31st) for the absorbance the fully reacted solution (the solution in which R2 reacted with s).

(D) Eichlinie Es wird die folgende Verdünnungsserie hergestellt unter Verwendung zweier Standardseren, nämlich eines Serums, das gemäß RAHA-Test als "negativ" beurteilt wird, und eines Serums, das mittels dieses Tests als"1280fach" beurteilt wird.(D) Calibration line The following dilution series is produced under Use of two standard sera, namely a serum that according to the RAHA test as "negative" and a serum judged "1280-fold" by this test will.

O (nicht-verdünntes Negativ-Serum) 128 (1/9) 256 (2/8) 384 (5/7) 512 (4/6) 640 (5/5) 768 (6/4) 896 (7/3) 1024 (8/2) 1152 (9/1) 1280 (nicht-verdünntes Positiv-Serum). O (undiluted negative serum) 128 (1/9) 256 (2/8) 384 (5/7) 512 (4/6) 640 (5/5) 768 (6/4) 896 (7/3) 1024 (8/2) 1152 (9/1) 1280 (non-diluted Positive serum).

Es werden jeweils 20/ul dieser Serumlösungen als Proben-Serum (S) eingesetzt sowie 350/ul erstes Reagens (R1) und 50/ul zweites Reagens (R2). Dabei wird die Absorption bestimmt und eine Beziehung zwischen der Absorption (mABS) und dem RF-Wert (entsprechend der Verdünnungsrate) aufgezeichnet, wobei man den in Fig. 5 gezeigten Graphen erhält. Aus dem Graphen wird deutlich, daß die Absorption und der RF-Wert eine lineare Beziehung haben und somit kann dieser Graph als Standard-Eichlinie verwendet werden. Die Beziehung zwischen der Absorption und dem RF-Wert in dem Graphen wird in einem Speicher des automatischen Analysators gespeichert.In each case 20 / ul of these serum solutions are used as sample serum (S) used as well as 350 / ul first reagent (R1) and 50 / ul second reagent (R2). Included the absorption is determined and a relationship between the absorption (mABS) and the RF value (corresponding to the dilution rate) is recorded, using the values shown in Fig. 5 is obtained. It is clear from the graph that the absorption and the RF value have a linear relationship and thus this graph can be used as a standard calibration line be used. The relationship between the absorption and the RF value in the graph is stored in a memory of the automatic analyzer.

(E) Vergleich mit einem herkömmlichen Verfahren Es werden jeweils 70 Serumproben mit unbekanntem RF-Wert einer Messung der Absorption unterzogen, und zwar auf die unter Punkt D beschriebene Weise. Dabei wird der O.D.-Wert der Proben festgestellt. Andererseits wird jede der Serumproben einer herkömmlichen Latex-Fixiermethode unterzogen, um eine Grenzagglutinationskonzentration festzustellen. Die mittels beider Methoden erhaltenen Ergebnisse werden zum Vergleich in einem Schaubild eingetragen, welches in Fig. 6 dargestellt ist. Aus dieser graphischen Darstellung geht hervor, daß die nach beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse korrelierbar sind, was bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren für die Praxis brauchbar ist.(E) Comparison with a Conventional Method There will be each 70 serum samples with an unknown RF value subjected to an absorbance measurement, in the manner described under point D. The O.D. value is the Samples found. On the other hand, each of the serum samples becomes a conventional one Subjected to the latex fixing method to determine a limiting agglutination concentration. The results obtained by means of both methods are used for comparison in one Entered the diagram, which is shown in FIG. 6. From this graphic The illustration shows that the results obtained by both methods can be correlated are, which means that the method according to the invention is useful in practice is.

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Claims

Claims 1. A method for measuring the rheumatoid factor, thereby characterized in that a buffer solution is added to a serum sample which contains a denatured, human γ-globulin and a water-soluble, high-molecular substance as an accelerator contains, causes an antigen-antibody reaction in the resulting solution, measures the turbidity of the reaction solution using a spectrophotometer and compare the turbidity with a standard calibration line previously prepared by measuring turbidity in a similar manner and using standard serum samples, in this way to quantify the RF value in the serum sample.

2. The method according to claim 1, characterized in that the water-soluble, high molecular weight substance is selected from polyethylene glycols, polysaccharides and proteins.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the Buffer solution is HEPES buffer.

4. The method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the water-soluble, high-molecular substance is polyethylene glycol and its concentration in the buffer solution is not higher than 35 '.

5. Denatured human globulin for use in the Process according to claim 1, characterized in that the ratio is polymeric IgG / monomeric IgG in the denatured globulin is at least 0.7.