DE3505287A1 - Verbesserte nucleinsaeure-reagenzien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Verbesserte nucleinsaeure-reagenzien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

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DE3505287A1 DE19853505287 DE3505287A DE3505287A1 DE 3505287 A1 DE3505287 A1 DE 3505287A1 DE 19853505287 DE19853505287 DE 19853505287 DE 3505287 A DE3505287 A DE 3505287A DE 3505287 A1 DE3505287 A1 DE 3505287A1
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Description

Die.Erfindung betrifft verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien, ffiinaesOens^ ° *
die/eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, und Zusammenstellungen solcher verbesserter Reagenzien. Außerdem betrifft die Erfindung gentechnologischejierstellungs-
mindestens verfahren der Nucleinsäure-Reagenzien, die/eine Reihe von Klonen enthalten, und :Dlsta-Rekonibinationsverfahren zur Herstellung von Korabinationen solcher Nucleinsäure-Reagenzien. Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung der Nucleinsäure-Reagenzien zur Identifizierung von Nucleinsäuren durch Hybridisierungs-Verfahren.
Verschiedene Hybridisierungs-Verfahren wurden bereits für die Identifizierung und die Untersuchung von Nucleinsäuren angewendet. Einige Beispiele sind die direkten Hybridisierungs-Verfahren, bei denen die die zu identifizierende Nucleinsäure enthaltende Probe entweder in einer Lösung (Bräutigam et al., J. Clin. Microbiol. 12, 226 - 254 (198o)und GB-OS 2 019 4o8) oder an einen festen Träger gebunden vorliegt (us-PSen 4 139 j46, 4 302 204, 4 358 535, 4 395 486, GB-OSen 2 034 323, 2 095 833, EP-A-62 286,
62 237 und 6l 740) und mit einem markierten Nucleinsäure-Reagenz nachgewiesen wird , das mit der zu identifizierenden
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Nucleinsäure hybridisiert.
Zu weiteren bekannten Hybridisierungs-Verfahren gehören das zweistufige "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren von Dunn und Hassell (Cell 12, 23 - 36 (1977)) und die einstufigen "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren der EP-A-79 139. Bei der Identifizierung von Nucleinsäuren durch die "Sandwich"-Verfahren werden zwei getrennte Nucleinsäure-Reagenzien zum Nachweis der Nucleinsäuren in der Probenlösung benötigt. Eines dieser Reagenzien ist an ein feste s Trägermaterial gebunden, das andere ist markiert. Sowohl die Nucleinsäure-Reagenzien, die an das feste Trägermaterial gebunden sind, als auch die, die markiert sind, sind dadurch gekennzeichnet, daß ihre Nucleotidsequenz komplementär oder nahezu komplementär zu der der zu identifizierenden Nucleinsäure ist, d.h. sie ist homolog. Die verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien sind entweder natürliche Nucleinsäuren oder Fragmente von diesen. Die Fragmente werden beispielsweise mit Restriktionsenzymen hergestellt.
Nucleinsäure-Reagenzien wurden auch bereits synthetisch oder 20
mit Hilfe von DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt.
Auch natürliche Plasmide (US-PS 4 358 535), Nucleinsäuren aus Bakteriophagen (US-PS'4 543 535), Ribosomale-RNA und Boten-RNA (US-PS 4 302 2θ4) oder Nucleinsäuren aus verschiedenen Viren (Sta*lhandske et al., curr. top. Microbiol. Virol.lo4 (1983)) wurden bereits als Nucleinsäure-Reagenzien verwendet. Das gesamte Virus-Genom wurde beispielsweise bereits zur Identifizierung der Anteile verschiedener Viren in der mRNA eines Hybrid-Virus verwendet (Dunn
_Λ und Hassell, Cell 12, 23 - 36 (1977))· Ebenso wurden Nucleinsäure-Reagenzien bereits mit DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt (US-PS 4 395 486 und 4 395 535, EP-A-79 I39 und GB-OS 2 034 323 sowie EP-A-62 286). Mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellte Nucleinsäure-Reagenzien wurden entweder als definierte, aus dem Vektor herausgeschnittene und von dessen DNA abgetrennte DNA-Frag-
r SyS(p
mente oder als rekombinante DNA-Moleküle, also verbunden mit verschjeäenen Vektoren, hergestellt. Die im Stand der Technik verwendeten, mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellten Nucleinsäure-Reagenzien bestehen aus einem kontinuierlichen, zur Identifizierung verwendeten Nucleinsäure-Pragment oder aus verschiedenen getrennten Klonen.
Erfindungsgemäß wurden neue, empfindlichere Nucleinsäure-Reagenzien entwickelt, die mindestens eine "Reihe" von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, die aus zu der zu identifizierenden Nucleinsäure homologen DNA-Segmenten gewonnen werden. Aus verschiedenen zu der zu identifizierenden Nucleinsäure homologen DNA-Sequenzen gewonnene Reihen von Fragmenten können zu einer "Serie" zusammengestellt werden, wobei die einzelnen Fragmente ganz oder zum Teil miteinander verbunden werden können. Vorzugsweise enthält das Nucleinsäure-Reagenz der Erfindung mindestens zwei derartige Serien, wobei die Fragmente der Serien nicht miteinander hybridisieren.
Nucleinsäure-Reagenzien, die solche Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, sind bei "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren mindestens doppelt so empfindlich wie die im Stand der Technik verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien.
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Reagenzien oder ihrer Kombinationen ist es möglich, geringere Nucleinsäure-Mengen als früher nachzuweisen und sie sind besonders gut für "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren geeignet.
Die höhere Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Reagenzien bei "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren
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beruht teilweise darauf, daß die Verwendung verschiedener Sondenmoleküle die Menge der markierten Hybride auf dem festen Trägermaterial erhöht. Jedes hybridisierende Sondenmolekül kann auch vom. Vektor abgeleitete markierte Nucleinsäure enthalten (Pig. 1 und 2). In Fig. 1 und 2 ist Vektor-DNA mit ν gekennzeichnet, die zu identifizierende Nucleinsäure mit x, die markierte Probe mit b, das an das feste Trägermaterial gebundene identifizierende Nucleinsäure-Reagens mit a und der Filter mit F. Wenn mehrere Sondenmoleküle verwendet werden, steigt die Menge markierter, vom Vektor abgeleiteter Nucleinsäure-Anteile und mehr Markierung wird an die sich bildenden Hybride gebunden. Deshalb sind die Hybride leichter nachzuweisen.
Wenn die Reihe der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Fragmente bei"Sandwich-Hybridisierungs-Verfahren verwendet wird, werden mindestens zwei oder, wie in Fig. 1 abgebildet, drei identifizierende Nucleinsäure-Fragmente an das feste Trägermaterial gebunden. Je nach Ausmaß der Reaktion können in diesem Fall verschiedene Bereiche des nachzuweisenden Nucleinsäure-Stranges χ an die an das feste Trägermaterial gebundenen Nucleinsäure-Fragmente, beispielsweise a,,, ap und a^, an einem oder mehreren Stellen hybridisieren. Wenn die Reaktion ihr Endstadium erreicht, kann eine Situation,wie sie in Fig. 1 beschrieben ist, vorliegen. Dabei bildet der nachzuweisende Strang eine oder mehrere Schleifen an die ein oder mehrere Sondenmoleküle hybridisieren, in Fig. 1 sind dies beispielsweise b^ und bp· Zu diesem Zeitpunkt nimmt die Entfernung von vom Vektor abgeleiteten Nucleinsäure-Bereichen vom Hybridisierungs-Verbindungs-Punkt (1) (Fig. 1) ab und das Hybrid ist stabiler als ein aus einem Reagenz-Paar gebildetes (Stand der Technik, Fig. 2). Das einzelne Reagenz-Paar-Hybrid hat dabei die gleiche Größe wie der Gesamtbereich der Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten. Die Vektorbereiche des aus einem Reagenz-Paar gebildeten Hybrids werden beispielsweise durch mechanische Beanspruchung (z.B. Schütteln) leicht
zerstört. Dabei wird die bereits an das Hybrid gebundene Markierung freigesetzt.
Da die verbesserten erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Reagenzien empfindlicher sind als die im Stand der Technik verwendeten Nucleinsäure-Reagenzien, sind sie zum Nachweis von Chromosomen-Umlagerungen und von Erbkrankheiten geeignet.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäure-Reagenzien aus ·einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, ihre Kombinationen, ihre Herstellung und ihre Verwendung zum Nachweis von Nucleinsäuren bei Hybridisierungs-Verfahren.
Die Beispiele und Zeichnungen erläutern die Erfindung. Fig. 1 zeigt eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden.
Fig. 2 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das aus dem Stand der Technik bekannt ist,
Fig. 3 zeigt die Bereiche von alternierenden Abschnitten einer Nucleinsäure, die für die Herstellung von zwei Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (für zwei verschiedene Serien) ausgewählt wurde.
Fig. 4· zeigt die entsprechenden Bereiche von Abschnitten
für die Herstellung von drei Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten (für drei verschiedene Serien). 30
Fig. 5 zeigt die in Fig. 3 beschriebenen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die getrennt (a), miteinander verbunden (b) und sowohl getrennt als auch miteinander verbunden (c) vorliegen. 35
51Ig. 6 zeigt verschiedene Ausführungen von "Sandwich"-Hybriden.
Fig. 6a zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei der Verwendung getrennter b-Fragmente entsteht,
Fig. 6b zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung verbundener b-Fragmente entsteht und
Fig. 6c zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung sowohl getrennter als auch verbundener b-Fragmente ent steht.
Fig. 7 zeigt eine aus drei Reihen bestehende Serie von
Nucleinsäure-Fragmenten zur Identifizierung verschiedener Nucleinsäuren.
15
Fig. 8 zeigt "Sandwich"-Hybride, die bei Verwendung der in Fig. 7 beschriebenen, verschiedene Nucleinsäuren identifizierenden Serie von Nucleinsäure-Fragmenten entstehen.
Fig. 9 zeigt Hybride, die bei direkter Hybridisierung entstehen.
Fig. 10 zeigt das rekombinante Plasmid pETH1220. 25
Fig. 11 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei Verwendung einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten aus dem rekombinanten Plasmid pKTH1220 entsteht.
Fig. 12 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH1271.
Fig. 13 zeigt ein "Sandwich"-Hybrid, das bei der Verwendung von Nucleinsäure-Fragmenten des rekombinanten Plasmids PKTHI271 entsteht.
mindestens
Die Erfindung betrifft Nucleinsäure-Reagenzien, welche feine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten. Vorzugsweise umfassen die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten. mindest ens zwei, vorzugsweise jedoch mehrere (bis zu zwanzig), alternierende Nucleinsäure-Fragmente, die sich von einer oder mehreren Nucleinsäuren ableiten, welche homolog genug zur zu identifizierenden Nucleinsäure sind. Dabei erhält man mindestens zwei Serien alternierender Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die nicht zueinander homolog sein dürfen.
Die Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien können synthetisch hergestellt werden. In diesem Fall dürfen die Fragmente der beiden alternierenden Serien von Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten nicht miteinander homolog sein. Sie müssen Jedoch
ausreichend homolog zu alternierenden Bereichen in den zu identifizierenden Nucleinsäuren sein. Diese Fragmente können leicht durch vollautomatische Maschinen nach der Charakterisierung der Nucleinsaure-Sequenz der zu identifizierenden Nucleinsäure hergestellt werden.
20
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Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Reagenzien setzen sich aus einzelnen oder miteinander verbundenen oder sowohl aus einzelnen und miteinander verbundenen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammen. Die einzelnen oder miteinander ver bundenen Nucleinsäure-Fragmente, die Reihen und/oder die Serien von Nucleinsäure-Fragmenten können in einen Vektor eingebaut sein, können Teile von Vektoren umfassen oder können ohne jegliche Vektor-Bereiche vorliegen.
Die verwendeten Nucleinsäure-Fragmente haben eine Mindestlänge von 15 Nucleotiden. !Für die Länge gibt es keine obere Grenze, vorzugsweise werden jedoch Fragmente mit einer Länge von 20 bis 5000 Nucleotiden verwendet. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Fragmente werden entweder vom zu identifizierenden Genom oder von einem Teil des Genoms abgeleitet, beispielsweise von einem verhältnismäßig großen Clon, der einen gewissen Teil des Genoms repräsentiert. Die erfindungsgemäßen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können somit aus verschiedenen unabhängigen genomischen Bereichen hergestellt werden,
20' die nicht direkt benachbart sind. Die so hergestellten Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten werden kombiniert und für dasselbe Reagenz verwendet. Die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können ebenso aus DNA isoliert werden, die nicht identisch/, jeäoch
ausreichend homolog mit der zu identifizierenden Nucleinsäure ist, so daß stabile Hybride zwischen dem Reagenz und der zu identifizierenden Nucleinsäure gebildet werden. Die Herstellung geeigneter Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten ist nicht auf die Isolierung geeigneter Nucleinsäure-Fragmente des Genoms beschränkt. Es gibt viele ebensogut geeignete Verfahren zur Herstellung solcher Reihen von Fragmenten. Der Durchschnittsfachmann kann Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten auch durch synthetische oder semisynthetische Verfahren gewinnen.
35
Die Reagenzien werden so isoliert, daß mindestens zwei Serien alternierender Nucleinsäure-Fragmente erhalten werden, d.h. a^, &2i Β.-? usw. und b^, b2, b^ usw. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie a^, ag, &.-, usw. bestehen aus Fragmenten, die sehr nahe beieinanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie b^,, b~, b^ usw. bestehen ebenfalls aus Nucleinsäure-Fragmenten, die nahe beieinanderliegen, jedoch nicht direkt benachbart sind. Die Nucleinsäure-Fragmente der Serie a^,, ap, a^ usw. und die der Serie b,,, bo, b, usw. dürfen nicht miteinander homolog sein. Vorzugsweise werden die Nucleinsäuren der Serie a,,, a^, a^ usw. und die der Serie b^, \>2-> ^* usw. so isoliert, daß jedes zweite Fragment zur a-Serie und jedes zweite Fragment zur b-Serie gehört (s.Fig. 3)· In Fig. 3 sind a^, &2ϊ a* usw.
und b^j, \>2, b^ usw. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten, die ausreichend homolog zur zu identifizierenaen Nucleinsäure sind. Wie in Fig. 4 dargestellt, ist es natürlich auch möglich, daß sogar eine dritte Nucleinsäure-Fragment-Serie, c,, Cp, C7, usv/. aus der gleichen Nucleinsäure isoliert wird.
Vorzugsweise folgen die alternierenden zwei Nucleinsäure-Reagenzien direkt aufeinander, jedoch ist dies erfindungsgemäß keine notwendige Voraussetzung.
Die vorstehend beschriebene Serie von Nucleinsäure-Fragmenten kann entweder als voneinander getrennte Fragmente a^,, ao, a, usw. und b^,, bp, b, usw. (Fig. 5a) oder als miteinander zu längeren Strängen verbundene Fragmente a^-a2~a:z, usw. und b.-bo-b^, usv/. (Fig. 5b) verwendet werden. Natürlich ist es auch möglich, alle Arten von Zwischenprodukten herzustellen, wie beispielsweise eine a-Serie, in welcher a^ ein getrenntes Fragment ist und a^-a^ miteinander verbunden sind sowie solche der b-Serie, bei der beispielsweise t>^-t>2 miteinander verbunden sind und b^, getrennt vorliegt (Fig. 5c).
In Fig. 6 sind "Sandwich"-Hybride dargestellt, bei'denen das Reagenz aus .zwei Serien mit je einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten besteht. Fig. 6a zeigt ein "Sandwich"-Hybrid,
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bei dem die Fragmente in den Reihen getrennt vorliegen.Fig. 6b zeigt ein Hybrid, bei dem die Fragmente der markiertaiReihe miteinander verbunden sind. In Fig. 6c ist ein Fall dargestellt, bei dem eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden sowohl aus miteinander verbundenen als auch aus voneinander getrennten markierten
Fragmenten gebildet wird. In Fig. 6 ist χ die zu identifizierende Nucleinsäure; b^,, bo und b^ sind das markierte Sondenmolekül und a*, Ep und a^ sind die an ein festes Trägermaterial gebundenen Fragmente.
Zur b-Serie gehörende Nucleinsäure-Fragmente können beispielsweise so markiert werden, daß ein Sondenmolekül B als markiertes Nucleinsäure-Reagenz erhalten wird. Die Nucleinsäurereihe der a-Serie kann so an ein festes Trägermaterial gebunden werden, daß ein Nucleinsäure-Reagenz A erhalten wird. Umgekehrt ist es natürlich auch möglich ein markiertes Nucleinsäure-Reagenz A herzustellen und das entsprechende Nucleinsäure-Reagenz B an ein festes Trägermaterial zu binden.
Solche Nucleinsäure-Paare A und B oder B und A, die markiert und entsprechend an ein festes Trägermaterial gebunden sind, können für einige verschiedene zu identifizierende Nucleinsäuren hergestellt werden. Sie können in geeigneten Nucleinsäure-Reagenz-Kombinationen miteinander kombiniert werden, die verschiedene Nucleinsäure-Reagenz-Paare A^ und B^, A2 und B0, Α-, und Β-,, usw. oder B„ und A„, B0 und A0, B-, und A-, usw.
c.1 ρ ρ I I7Ci cL1 z> j
enthalten. Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten-enthaltende Reagenzien zur Identifizierung verschiedener Nucleinsäuren können auch so kombiniert v/erden, daß ein Sondenmolekül A-A -A erhalten wird, welches beispielsweise eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten (a1-a2-a5)x-(a1-a2-a3) -(a,,-a2~ a^)z enthalten (s. Fig. 7), in welcher 0
Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten A sind, die die Nuclein-
säure χ identifizieren; a^ , a2_ und a, Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten A sind, die die Nucleinsäure A identifizieren; a.^? &2z ^121^ a3z Re^en von Nucleinsäure-Fragmenten A sind, die die Nucleinsäure ζ identifizieren und in der ν ein aus dem Vektor stammender Nucleinsäure-Bereich ist. Miteinaider verbundene Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können natürlich ebenso als getrennte Fragmente in geeigneten Gemischen verwendet werden.
Die ' . in Fig. 8 abgebildeten "Sandwich"-Hybride werden mit den in Fig. 7 abgebildeten Reagenzien erhalten. Wenn gleichzeitig die Identifizierung mehrerer verschiedener Nucleinsäuren beabsichtigt wird, ist es selbstverständlich erforderlich, wie in Fig. 8 abgebildet, verschiedene Filter zu verwenden. Fig. 8a zeigt ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure χ identifiziert, Fig. 8b ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure y identifiziert und Fig. 8c zeigt ein festes Trägermaterial, das die Nucleinsäure ζ identifi-In den Fig. 8a, 8b und 8c sind b^, b^ und "b-,^ eine Reihe
/Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden ist und die die Nucleinsäure χ identifiziert;^ ,bg undb^ ist eine.Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten, die an ein festes"Trägermaterial gebunden ist . und die die Nuclein-
..säure y identifiziert; b^ , b~ und bz_ ist eine Reihe von Nuclein; ι ζ ^z ^z
/saur"e-Fragmenten, die an ein festes Trägermaterial gebunden
ist und die die Nucleinsäure ζ identifiziert und x, y und ζ sind die zu identifizierenden Nucleinsäuren. Fx, F und Fz sind die entsprechenden festen Trägermaterialien oder Filter, A -A -A ist ein Sondenmolekül, das gleichzeitig alle χ y ζ
drei Nucleinsäuren identifiziert, wenn verschiedene feste Trägermaterialien verwendet werden.
Reihen und -
Die vorstehend beschriebenen Nucleinsaure-Fragment^Serien, Reagenzien und Reagenz-Kombinationen können durch an sich bekannte DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt werden.
Eine Reihe unterschiedlich langer Nucleinsäure-Fragmente
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kann mit Restriktionsenzymen aus der zu identifizierenden Nucleinsäure oder aus einem sie repräsentierenden Bereich ausgeschnitten werden. Wenn die Restriktionskarte des zu identifizierenden Genoms bekannt ist, ist es möglich, aus dem Genom geeignete benachbarte Fragmente auszuwählen. Diese werden mit Restriktionsenzymen ausgeschnitten, isoliert und mit DNA-Rekombinations-Verfahren vermehrt.
Wenn ein unbekanntes Genom untersucht wird, kann ein Zwischenprodukt für die Herstellung der Reagenzien verwendet v/erden. In diesem Fall wird ein verhältnismäßig großes Restriktions-Fragment cloniert, dieses Fragment wird kartiert und die Reihen von Nucleinsäure-Fragment-Serien a,,, ap a^ usw. und b^,, bo, b-, usw. werden auf Grundlage der so erhaltenen Information hergestellt.
Es ist natürlich möglich, Kombinationen der vorstehend genannten Methoden einzusetzen und mehrere große, voneinander getrennt clonierte Restriktions-Fragmente als Ausgangsmaterial zu verwenden sowie mehrere getrennte Serien herzustellen, die zu geeigneten Kombinationen zusammengestellt werden.
Erfindungsgemäß werden die Nucleinsäure-Fragment-Serien a^, ap, a, usw. und b^, b^, b^ usw. vorzugsweise mit DNA-Rekombinations-Verfahren hergestellt. Dabei wird die Serie a in einem Vektor cloniert, beispielsweise im Plasmid pBR322. Die Serie b dagegen wird in einem anderen geeigneten Vektor cloniert, der keine zum vorstehenden Vektor homologen Sequensen enthält. Der Bakteriophage M13 ist ein Beispiel eines solchen zweiten geeigneten Vektors. Die Fragmente, die zu dieser Serie gehören, können miteinander verbunden werden und die verbundene Serie kann in einem Vektor cloniert werden. Beispielsweise können a^,-ap miteinander verbunden werden und als kontinuierliche Insertion im gleichen Vektor, nämlich in pBR322 cloniert werden. Entsprechend ist
es möglich, eine Reagenz-Serie b^-bo herzustellen. Bei der Clonierung werden vorzugsweise Vektoren verwendet, in die man große Fremd-DNA-Insertionen einsetzen kann. Beispielsweise sind für diese Zwecke der λ-Phage und Oosmid-Vektoren geeignet.
Es werden also zwei Reagenz-Paare, die eine Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, bei dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt, nämlich ein Reagenz, das mit der zu identifizierenden Markersubstanz markiert ist, d.h. ein Sondenmolekül und ein sogenanntes Filter-Reagenz, das an ein festes Trägermaterial gebunden ist.
Meistens werden radioaktive Isotope zur Markierung der Sondenmoleküle verwendet. Beispielsweise werden in der GB-OS 2 054 323, den US-PSen 4 358 535 und 4 302 204 die folgen-
■zo 12S 1^1 -5 den Isotope verwendet: ^P, ^J, ^J und -Έ. In der EP-A-
12S
79 139 wird das Isotop ^J verwendet. Nucleinsäure-Sondenmoleküle wurden auch anderweitig modifiziert und beispielsweise mit Fluoreszenz-Markierungen versehen (FR-OS 2 5I8 755)· Auch enzymatische oder enzymatisch meßbare Markierungen werden verwendet (GB-OS 2 019 408, EP-A- 63 879 und FR-OS 2 519 005). Die EP- A— 70 685 und 70 687 beschreiben eine Licht-emittierende Markierung und ein entsprechendes Markierungsverfahren. Die FR-OS 2 5I8 755 beschreibt eine immunologisch meßbare Markierung. Auch Lanthanidchelate (US-PS 4 374 120), insbesondere Europium, können als Markersubstanzen verwendet werden. Ebenso ist die Biotin-Avidin-Markierung geeignet (Leary et al. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80, 4045-4049 (1983)). Neben den vorstehend genannten, erfindungsgemäß verwendbaren Substanzen zur Markierung von Nucleinsäure-Reagenzien können selbstverständlich auch neu entwickelte, verbesserte Markersubstanzen verwendet werden, die ebenso für die erfindungsgemäße Markierung von Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten geeignet sind. Als Trägermaterial
für Filter-Reagenzien sind beispielsweise verschiedene Nitrocellulose-Filter geeignet (US-PS 4 358 535 und GB-OS 2 Ü95 833). In der DD-OS 148 955 ist ein Verfahren zur chemischen Bindung von Nucleinsäuren an das Trägermaterial (Papier) beschrieben. In den US-PSen 4 359 535 und 4 302 204 sind chemisch modifizierte Papierarten beschrieben, die als festes Trägermaterial verwendet werden können. Auch Nylonmembranen und modifizierte Nitrocellulose-Filter können verwendet werden. Natürlich können auch in Zukunft entwickelte Materialien, die noch besser als festes Trägermaterial geeignet sind, erfindungsgemäß verwendet werden. Auch andere feste Trägermaterialien, wie verschiedene Chromatographie-Matrizen (beispielsweise Triazin- oder Epoxy-aktivierte Cellulose) oder Latex können erfindungsgemäß verwendet werden. Außer den nachstehend beschriebenen Beschränkungen gibt es grundsätzlich keine weiteren Beschränkungen für die Auswahl des festen Trägermaterials. Es muß möglich sein, die Nucleinsäure in einzelsträngiger Form so an das feste Trägermaterial zu binden, daß diese einzelsträngigen Nucleinsäuren mit der komplementären Nucleinsäure hybridisieren können. Das feste Trägermaterial muß außerdem leicht aus der Hybridisierungslösung entfernt werden können oder die Hybridisierungslösung muß leicht vom festen Trägermaterial entfernt werden können. Schließlich darf das Sondenmolekül nicht am Trägermaterial selbst anhaften, so daß es nicht mehr abgewaschen werden kann.
Aus den vorstehend beschriebenen Kombinationen von Reihen von Nucleinsäure-Reagenz-Paaren A und B oder B und A, entsprechend markiert und an ein festes Trägermaterial gebunden, und aus für die Identifizierung von verschiedenen Nucleinsäuren hergestellten Nucleinsäure-Paaren kann eine Kombination A und B , A und B , A und B zusammengestellt werden. Diese Kombinationen können für die gleichzeitige Identifizierung der Nucleinsäuren x, y und ζ durch "Sandwich" -Hybridisierungs-Verfahren verwendet werden.
L j
JQ
Die Probe wird so behandelt, daß die Nucleinsäuren in die Hybridisierungs-Lösung abgegeben v/erden und daß diese in einzelsträngiger Form vorliegen. Die Hybridisierung wird in einer Hybridisierungslösung durchgeführt, zu der sowohl die an ein festes Trägermaterial gebundenen Nucleinsäure-Reagenzien als auch die markierten Nucleinsäure-Reagenzien zugegeben werden. Palis Filter als festes Trägermaterial verwendet wurden, werden diese nach der Hybridisierung aus der Eybridisierungslösung entnommen. Wenn Chromatographie-Matrizen, Latex oder ein vergleichbares Material verwendet wurde, wird die Hybridisierungslösung entnommen. Die festen Trägermaterialien werden mit einer geeigneten Waschlösung abgespült. Die Reihen gebildeter "Sandwich"-Hybride (Fig. 8a, 8b, 8c) werden in an sich bekannter Weise nachgewiesen. Beispielsweise wird die radioaktive Markierung durch Autoradiographie, mit einem Szintillations-Zähler oder einem Gamma-Zähler bestimmt. Eine Enzym-Markierung kann beispielsweise nach einer Farbreaktion, photometrisch oder durch Bestimmung eines Niederschlags gemessen werden. Lanthanid-Chelate können mit dem sogenannten "time resolved fluorescence"-Verfahren nachgewiesen werden. Eine immunologische Markierung wird mit geeigneten immunologischen Methoden nachgewiesen.
Einige verschiedene Gemische können als Hybridisierungs-Lösung verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise die in der EP-A-79 139 und in der US-PS 4- 302 204- genannten. Selbstverständlich können auch andere Hybridisierungs-Gemische verwendet werden. Die Hybridisierung wird bei O°bis 800C durchgeführt, günstig ist eine Temperatur von 65°C. Eine ausreichende Hybridisierung kann schon nach einer sehr kurzen Zeitspanne vorliegen, günstig ist jedoch eine Hybridisierungs-Zeit von etwa 12 bis 20 Stunden.
Das zweistufige "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren wird an sich genauso durchgeführt, jedoch wird dabei das an das feste Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagenz zuerst
L J
t zur Hybridisierungs-Lösung zugegeben. Wenn die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird das feste Trägermaterial gewaschen und eine zweite Hybridisierung wird durchgeführt, bei der das markierte Nucleinsäure-Reagenz verwendet wird. 5
Die vorstehend beschriebenen markierten Nucleinsäure-Reagenzien oder Reagenz-Kombinationen A , A , A usw. und B , B , B usw. können natürlich auch für direkte Hybridisierungs-Verfahren verwendet werden. Dabei muß die in einer Lösung vorliegende Nucleinsäure-Probe für jede zu identifizierende Nucleinsäure x, y und ζ geteilt werden. Wenn die Probe an ein festes Trägermaterial gebunden ist, muß für jede Probe eine getrennte, an ein Trägermaterial gebundene Probe hergestellt werden. Die gebildete Reihe von Hybriden (fig. 9) wird mit an sich bekannten Verfahren nachgewiesen. In Fig. ist F das feste Trägermaterial, d.h. der Filter, χ die zu identifizierende Nucleinsäure und ν kennzeichnest die vom Vektor abgeleiteten Bereiche. Die verwendeten, markierten Sondenmoleküle a^,, a? und a^ (Fig. 9a) » t>^ und bg (Fig. 9t>) und a1? b^, a2, t>2; a^ (Fig. 9c).
Wie bereits vorstehend beschrieben wurde, können erfindungsgemäß verschiedene Kombinationen von Nucleinsäure-Reagenzien aus den Reihen von NucIeinsäure-Fragmenten zusammengestellt werden. Mit diesen Kombinationen ist es möglich, einige verschiedene Nucleinsäuren gleichzeitig zu identifizieren. Die zu den verschiedenen zu identifizierenden Nucleinsäuren homologen Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können in den Gemischen als getrennte Fragmente oder als miteinander verbundene Fragmente so verwendet werden, daß ein Sondenmolekül erhalten wird, mit dem einige verschiedene Nucleinsäuren identifiziert werden können. Natürlich müssen an ein festes Trägermaterial gebundene Nucleinsäure-Reagenzien für eine
erfolgreiche Identifizierung getrennt aufbewahrt werden. 35
Die Hybridisierung mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten kann für die Identifizierung verschiedener menschlicher, tierischer oder pflanzlicher pathogener Mikroorganismen verwendet werden. Durch das Verfahren ist es möglich, Nahrungsmittelvergiftungen-hervorrufende Mikroorganismen in Nahrungsmitteln nachzuweisen, beispielsweise Clostridien, Salmonellen oder Staphylococcen. Das Verfahren ist auch für die Identifizierung von Kontaminationen in Wasser, beispielsweise durch Enterobakterien oder Enteroviren, geeignet.
Da der "Sandwich"-Hybridisierungs-Test mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten ein quantitatives Verfahren ist, kann es beispielsweise auch für die Bestimmung und die Messung von Genamplifikationen verwendet werden. Dieses Merkmal ist beispielsweise für den Nachweis und die Behandlung von Krebs von Bedeutung. Zur Bildung einer stabilen Reihe von Hybriden sollten die homologen Sequenzen des Sondenmolekül-Reagenz und des Filter-Reagenz im Proben-Strang mäßig voneinander entfernt sein, vorzugsweise weniger als 5 &b (Kilobasen).
Zwischen diesen beiden Bereichen auftretende Entfernungsveränderungen sind mit diesem Verfahren deutlich zu beobachten. Deshalb ist das Verfahren ebenso für den Nachweis veränderter mRNA, von chromosomalen Umlagerungen, von bei Immunglobulin-Genen für die Expression ablaufenden Umlagerungen und von Erbkrankheiten geeignet. Es ist also möglich, verschiedene Reagenz-Kombinationen aus den Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zu konstruieren. Beispielsweise können für die Identifizierung von Geschlechtskrankheiten-verursachenden Stoffen Analysebestecke hergestellt werden, die ein Sondenmolekül mit Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten, mit denen Gonorrhö, Syphilis, Herpes und GhlaBydien nachgewiesen werden können. In diesem Fall ist die Identifizierung durch Verwendung getrennter Filter für Gonorrhö, Syphilis,
Herpes und Chlamydien möglich.
35
Die Erfindung betrifft insbesondere die Reihen von Nuclein-L J
5Jl
säure-Fragmenten, die in den rekombinanten Plasmiden pKTH122G und ρΚΤΞ1271 enthalten sind. Das rekombinante Plasmid pKTH1220 besteht aus dem Plasmid-Vektor pBR322 und aus DNA von Chlamydia trachomatis L2, die für die Chlamydien spezifisch ist. Dieses rekombinante Plasmid wird in Escherichia coli K12 HB1O1 cloniert. Das rekombinante Plasmid 1271 enthält im Plasmid-Vektor pBR 325 DNA aus dem Cytomegalovirus AD169· Dieses rekombinante Plasmid wird im Wirt Escherichia coli K12 HB1O1 cloniert. Die die rekombinanten Plasmide pKTH1220 und PKTHI27I enthaltenden Wirte wurden bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstraße 8, D-34-00 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt. Die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH1220 ist DSM2825 und die Hinterlegungs-Nummer des rekombinanten Plasmids pKTH1271 ist DSM2826.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Die Struktur der Nucleinsäuren von Eucaryoten und Procaryoten (DNA und RNA) ist ähnlich. Deshalb sind die nachstehenden Beispiele auch mit Nucleinsäuren von Tieren (dazu gehört in diesem Zusammenhang auch der Mensch), Pflanzen, Mikroorganismen oder Viren ausführbar. Die erfindungsgemäßen Reagenzien können also zum Nachweis von Nucleinsäuren des Menschen, von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Viren verwendet werden. Die Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten können auch synthetisch hergestellt werden. Die zu identifizierende Nucleinsäure-Sequenz kann bestimmt werden,und homologe Reihen von Fragmenten können mit geeigneten Maschinen automatisch hergestellt werden.
Beispiel 1
a) Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Chlamydia trachomatis und ihre Herstellung
Für die Diagnose der Chlamydia trachomatis-Gruppe wurden geeignete DNA-Fragmente aus der DNA von Chlamydia trachomatis Serotyp L2 hergestellt. Die DNA wurde isoliert, in an sich
bekannter Weise fragmentiert, die resultierenden DNA-Fragmente wurden im Plasmid pBR322 cloniert und in an sich bekannter Weise in den Wirtsorganismus Escherichia coli K12 HB1O1 eingebracht. Das Ergebnis dieses Clonierungsvorgangs war eine Genbank des Bakteriums Chlamydia trachomatis L2, d.h. eine große Anzahl rekombinanter Plasmide, die jeweils ein bestimmtes BamHI-Restriktions-Fragment der Chlamydia-DNA tragen. Zur Reagenz-Herstellung wurden aus der Chlamydia-Genbank rekombinante Plasmide mit größtmöglichen DNA-Insertionen ausgewählt. Eines dieser Plasmide wurde pKTH1220 genannt. Es wurde bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 2825 hinterlegt. Durch einen direkten Hybridisierungs-Test wurde gezeigt, daß dieses Plasmid als Reagenz geeignet ist. In diesem Test identifizierte pKTH1220 alle aus Chlamydia trachomatis-Serotypen gewonnenen Nucleinsäuren/jedoch keine anderen Nucleinsäuren.
Die verwendbaren Fragmente wurden aus dem Plasmid pKTH122O mit*verschiedenen Restriktions-Enzymen gewonnen. Einige dieser Fragmente wurden im Plasmid pAT153 subcloniert (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory, S. 6, 1982). Andere Fragmente wurden im Phagen M13 subcloniert. Fig. 10 zeigt das rekombinante Plasmid pKTH1220, das eine Länge von 14 kb hat. In Fig. 10 sind BamHI, Sail und CIaI die verwendeten Restriktions-Enzyme,und a„, ao, b„, bo und b-, kennzeichnen die Größe und die relative Lage
I 7 ei I 7 d. $
zueinander der mit den vorstehend genannten Restriktions-Enzymen gewonnenen Fragmente. Die Fragmente der Serie b sind markierte Sondenmoleküle. In Tabelle 1 sind die Größen der Fragmente und die für die Subclonierung verwendeten Vektoren die Namen der rekombinanten Plasmide und ihre Anwendung zusammengefaßt .
L J
- 2Ö-
Tabelle 1
Fragment
Größe Vektor
Rekombinantes I3Ia smid
Verwendung
Clal-Sall
SaII-CIaI
Sall-BamHI
BamHI-Sall
Clal-Clal
3.0kb pAT153
2.9kb pAT153
0.7kb M13mp8
1.4kb M13mp8
1.7kb M13mp8
bl-b2 BamHI-BamHI 2.1kb M13mp8
pKTH1252 pKTH1250 mKTH1242 mKTH1239 mKTH1248 Π1ΚΤΗ1245
Filter
Filter Markiertes .
Sondenmolekül
Die in Tabelle 1 aufgeführten Fragmente wurden durch Elektroelution aus einem Agarosegel isoliert und in an sich bekannter Weise in mit geeigneten RestriktJons-Enzymen gespaltenen und in Tabelle 1 aufgeführten Vektoren subcloniert,
Das 2,1 kb-BamHI-BamHI-Fragment wurde folgendermaßen hergestellt: Das 1,4- kb-BamHl-Sall-Fragment und das 0,7 kb-Sall-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pKTH122O wurden in einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt und anschließend aus dem Gel isoliert. Die gereinigten Fragmente wurden mit T4~ Ligase miteinander verbunden. Von den dabei gebildeten 2,1 kblangen DNA-Fragmenten wurden die mit freien BamHI-Enden in die BamHI-Restriktions-Spaltstelle doppelsträngiger DNA des Phagen M13mp8 eingebaut. Die auf diese Weise hergestellte rekombinante Phagen-DNA (mKTH1245) enthält also zwei verschiedene DNA-Fragmente von Chlamydia trachomatis, die in dessen Genom nicht benachbart sind. Sie liegen jedoch im Chlamydia trachomatis Genom benachbart zu den DNA-Reagenzien PKTHI25O und PETHI252, die an den Filter gebunden werden (Fig. 11). Fig. 11 zeigt eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden, die entstehen, wenn die in Tabelle 1 aufgeführten rekombinanten Plasmide und rekombinanten Phagen als Reihen von Nucleinsäure-Reagenzien verwendet werden.
b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien aus Chlamydia trachomatis unter Verwendung des "Sandwichn-Hybridisierungs-Verfahrens
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien, verglichen mit einem einzelnen kontinuierlichen Reagenz-Paar, wurde mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren untersucht. Der Test wurde mit Filtern durchgeführt, die jeweils ίο"1"1 Moleküle sowohl von pKTH125O (a2)- als auch von pKTH1252 (a^|)-Einzelstrang-DNA enthielten. Die zu untersuchende Probe war das Plasmid pKTH1220, welches für den Test durch 5minütiges Erhitzen in 0,17 M NaOH, anschließendes Abschrecken bei 0 C und durch Neutralisierung mit einer äquimolaren Menge Essigsäure in die Einzelstrangform überführt wurde. Die fol-
Ί2Β
genden mit ^J markierten und in Tabelle 1 aufgeführten Sondenmoleküle wurden bei den Tests verwendet: mKTH124-2(b^), mKTH1239(b2), mKTH1248(b5) und mKTH1245Cb1-I)2).
Die Hybridisierung wurde 17 Stunden bei +650C in einer Hybridisierungs-Lösung der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
4- χ SSC, 0,02$ Pie oll, 0,02$ Polyvinylpyrrolidon, 0,2# SDS und 200 μg/ml Hering-Spermien DNA. Die Filter wurden 2 Stunden bei 500C mit einer Waschlösung der folgenden Zusammensetzung gewaschen: 0,1 χ SSC,0,2$ SDS. Anschließend wurden sie in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt und sind jeweils der Mittelwert von fünf Parallelversuchen.
L J
- 2-g -
Tabelle 2
Hybridisierte Radioaktivität
mit (£>) als iSondenmolekül		 b ,b (b-,-b·,) (]
JL £* \* £m ■ 		bl-b2}'b3
Probe bl b2 b3 49 39 52
Moleküle/Test 37 37 33 93 68 140
0 48 44 48 396 416
2912 2637		 686
3580
ίο6 226 236 232
1475 1415 1456		 5 χ 10 cpm/pgDNA
4 χ 107 cpm/pgDNA
5 χ 107 cpm/pgDNA
7 χ 10 cpm/^gDNA
107
108		 380,000 cpm/T-est;
340,000 cpm/T-est;
350,000 cpm/T.est;
310,000 cpra/T.est;
700,000 cpm/f.est;
700,000 cpm/Test;
bi
b2
b3
bl"b2
bl'b2
Bei der statistischen Berechnung wurden 95$ der ohne Probe durchgeführten Tests (= negative Kontrollen) als untere Grenze für eine positive Reaktion gewertet. Diese Werte waren 52-54- cpm, wenn das Sondenmolekül b1, b oder b3 war, 58 cpm, wenn das Sondenmolekül b^ oder b2 war, 56 cpm, wenn das Sondenmolekül Ia1-Ix, war und 65-cpm, 'wenn das Sondenmolekül b„-b , b
ι 2
c) Diagnose von Chlamydia durch "Sandwich"-Hybridisierung mit Reihen von Nucleinsäure-Iragmenten
Von drei an Urethritis leidenden Männern sowie von drei an Cervicitis leidenden Frauen wurden Proben für den Test genommen. Aus Urethra der Männer und Cerbix der Frauen wurde
war.
Chlamydia trachomatis isoliert. Zusätzlich vnirde eine Reihe von ähnlichen Proben aus Patienten untersucht, aus denen Chlamydia nicht isoliert wurde. Die zu untersuchenden Proben wurden mit Wattestäbchen genommen, die in einen ChIamydia-Probenaufnahme-Puffer eingetaucht waren, der 0,2 M Saccharose, 20 mM Phosphatpuffer, 3$ fötales Kälberserum, 10 μg/ml Gentamicin, 100 |ug/ml Vancomycin und 25 IU/ml Nystatin enthielt.
Aus den Proben wurde Chlamydia gezüchtet. Die ursprünglichen Proben wurden außerdem durch "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten untersucht. Die Proben wurden mit 2-Butanol konzentriert. Dabei wurde soviel Flüssigkeit entfernt, daß das Endvolumen 80 μΐ betrug und die Proben damit drei- bis siebenfach konzentriert waren. Danach wurde den Proben 70 mM EDTA, 0,7$ SDS, 200 /ag/ml Proteinase K zugesetzt und sie wurden 15 Minuten bei 550C und 4-5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden dann 5 Minuten in 0,175 M NaOH gekocht. Die gekochten Proben wurden bei O0C abgeschreckt mit einer äquimolaren Menge Essigsäure neutralisiert und getestet. Die in Beispiel 1b)
beschriebenen !Filter und Hybridisierungs-Bedingungen wurden bei diesem Test verwendet. Das bei der Hybridisierungs -Reaktion verwendete Sondenmolekül war mKTH124-5 (b^-b2) mit einer Radioaktivität von 300.000 cpmAOO jal. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
L J
ft*
_ 24- -
Tabelle 3
Probe"
Hybridisierte Ergebnis der Radioaktivität Chlamydia-Kultur
10 15
Mannl. Probant 151
1 . 164
2. 154
_ 3. 61
4. 76
: 5. 55
6.
Weibl. Probant 343
1. 509
2. 362
: 3. 57
4. 58
5. 81
: 6· 30-:
Puffer, x"4
Chi. trachomatis
L2 Biakterium, 10
419
Die Grenze für die positive Beurteilung des Tests war 104 cpm.
Die Ergebnisse aus Tabelle 3 zeigen, daß die "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten für die Diagnose von Geschlechtskrankheiten geeignet ist. Proben mit negativem Ergebnis beim Kultur-Test zeigten auch bei der "Sandwich"-Hybridisierung ein negatives Ergebnis .
Beispiel2
a) Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien des Cytomegalovirus und ihre Herstellung
Für die Diagnose des Cytomegalovirus geeignete DNA-Fragmente wurden aus dem Cytomegalovirus (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV) hergestellt. Die DMA wurde isoliert und in an sich bekannter Weise fragmentiert. Das etwa 9 kb lange EcoRI-Fragment I (definiert von Spector et al., J. Virol. 4-2, 558-582 (1982)) wurde nach der Größentrennung der EcoRI-Restriktions-Fragmente auf einem Agarosegel durch Elektroelution isoliert.
Die eluierte DNA wurde mit Phenol extrahiert und anschließend mit Äthanol gefällt. Die so gereinigte DNA wurde mit T4—Ligase in mit dem Enzym EcoRI-gespaltene DNA des Plasmids pBR325 ligiert. Die erhaltene rekombinante DNA wurde in E.coli K12 HB101 überführt. Aus den Ampicillin- und Tetracyclin-resistenten, jedoch Chloramphenicol-sensitiven Clonen wurde ein Clon mit einer Cytomegalovirus-DNA-Insertion der richtigen Größe ausgewählt. Die Identität der Cytomegalovirus-DNA wurde durch einen Southern blot bestätigt. Der Test zeigte, daß das beschriebene 9 kb-EcoRI-Fragment aus dem HindIII-D-Fragment der Cytomegalovirus-DNA stammt (Oram et al., J.Gen.Virol. 59, 111-129 (1982)). Das genannte rekombinante Plasmid wurde als pKTH1271 bezeichnet und bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 2826 hinterlegt. Das rekombinante Plasmid wurde in an sich bekannter Weise vermehrt und gereinigt.
Weitere Clonierungsschritte wurden in an sich bekannter V/eise unter Verwendung des Plasmids pBR322 und der Phagen M13mp7 und M15mp8 durchgeführt. Fig. 12 zeigt das hybride Plasmid PKTHI27I mit einer Länge von etwa 9 kb. Die in Fig. 12 gezeigte Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, CIaI und Pstl hergestellt. Fig. 12 zeigt die mit Restriktions-Enzymen erhaltenen Fragmente und ihre relative Lage und Größe. In Tabelle 4- sind die Größen der in Frage kommenden Fragmente und die für ihre
L J
~ι
Subclonierung verwendeten Vektoren, die Bezeichnung der so erhaltenen Plasmide und ihre Verwendung entweder als Filter-Reagenzien oder als markierte Sondenmoleküle aufgeführt. Fig. 13 zeigt eine Reihe von "Sandwich"-Hybriden, die gebildet wird, wenn die in Tabelle 4 aufgeführte Reihe von Nucleinsäure-Fragmenten verwendet wird.
Tabelle 4·
Restriktions-Eragment Vektor Bezeichnung Verwendung
15 b.
EcoRI-PstI (3.3kb) pBR322 pKTH1273 Filter
Clal-BamHI (3.0kb) pBR322 pKTF1274 Filter
Pstl-Pstl (0.6kb) M13mp7 mKTH1277 Markiertes . .
Pstl-Clal (l.Okb) . M13mp8 mKTH1278 ' S ondenm ölekül
BamHI-EcoRI (l.Okb) M13mp8 mKTH1279 J
b) Nachweis der Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien des Cytomegalovirus mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren
Die Empfindlichkeit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien im Verhältnis zur Empfindlichkeit eines Paares kontinuierlicher Reagenzien wurde mit dem "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren untersucht. Die Proben bei den Tests waren CMV-DNA, die in 0,17 M NaOH 5 Minuten gekocht wurde und anschließend gemäß Beispiel 1 b) neutralisiert wurde. Die Filter enthielten alle 1011 Moleküle sowohl von pKTH1273(a1)-DNA als auch von pKTH1274(aP)-DNA, die in die einzelsträngige Form überführt worden war. Die folgenden mit ^J markierten, in Tabelle 4 aufgeführten Sondenmoleküle wurden verwendet:
mKTH1277(b/l), mKTH1278(bo) und mKTH1279(b,). Die Proben ent-
8
hielten jeweils 10 cpm/jug DNA. Die Hybridisierung wurde wie in Beispiel 1 b) beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.
30
Tabelle 5
Proben-. Moleküle/Test
Hybridi sierte Radioaktivität (b)
bl b2 b3 bl'b2 bl'b2'b3
10
10
4xlO6
1.6x10
33
44
38
46
85 135 142
203 254 265
205
415
53
125 292 645
15
bl 310.000 cpm/Test
b2 320.000 cpm/Test
b3 300.000 cpm/Test
bl,b2 300.000 cpm bei jedem Test
bl,b2,b3 300.000 cpm bei jedem-Test
20
Die untere Grenze für eine positive Beurteilung des Testergebnisses waren 51-55 cpm, wenn das Sondenmolekül b., b2 oder b^ war, 59 cmp, wenn das Sondenmolekül b,. oder b2 war und 63 cpm, wenn das Sondenmolekül b^, b2 oder b, war.
Die in Tabelle 5 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß bei einer "Sandwich"-Hybridisierung mit einem einzelnen Sondenmolekül-Reagenz (b^, b2 oder b,) jeweils 4 χ CMV-DNA-Moleküle nachgewiesen werden. Andererseits werden bei einer Hybridisierung mit einem Reagenz aus b.,,, b2 oder byj, b2, b^ nur 10 Moleloile CMV-DNA nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien viermal empfindlicher ist als ein einzelnes Nucleinsäure-Reagenz.
c) CMV~Diagnose durch "Sandwich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien
Klinische Proben wurden durch "Sand\tfich"-Hybridisierung mit einer Reihe von Reagenzien untersucht. Zu diesen Proben gehören auch zwei Urinproben von Kindern mit einem Alter von weniger als einem Jahr. Es wurde angenommen, daß diese Kinder an der congenitalen Cytomegalovirus-Erkrankung leiden. Eine Lungenbiopsie-Probe aus einem Patienten mit einer CDfV-PuImonar-Infektion wurde ebenso mit der "Sandwich"-Hybridisierung untersucht. Sowohl Cytomegalovirus-infizierte als auch nicht-infizierte fötale menschliche Zellen wurden als Proben beim Test verwendet.
Zu 10 ml einer Urin-Probe wurde eine Lösung mit 1$ Sarcosyl und 5 bM EDTA sowie 200 pg Kalbsthymus-DNA zugegeben. Dadurch wird die Virus-DNA freigesetzt. Durch Zugabe von 10 ml Isopropanol bei Raumtemperatur wird die DNA zusammen mit dem "carrier" (Kalbsthymus-DNA) ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wurde in 200 μΐ TE-Puffer gelöst. Die DNA wurde dann durch 5minütiges Kochen und Abschrecken bei O0C in die Einzelstrangform überführt und zur Hybridisierungs-Lösung zugegeben.
Die Lungenbiopsie-Probe (einige mnr) wurde mit einem Messer zerkleinert und 200 μΐ TE-Puffer mit 1$ SDS und 1 mg/ml Proteinase K wurden zugegeben. Bei +37°C wurde der Abbau 1 Stunde durchgeführt, und die Probe wurde anschließend zweimal in eine Injektions-Spritze mit einer dünnen Hypodermis-Nadel aufgezogen. Die so homogenisierte Probe wurde gekocht und anschließend zur Test-Lösung zugegeben.
Die mit Cytomegalovirus infizierten Zellen und die nichtinfizierten Zellen wurden wie vorstehend beschrieben durch SDS, Proteinase K-Behandlung, Homogenisierung und Kochen aufgeschlossen.
L J
38.
Als i'ilter-ßeagenzien wurden beim Hybridisierungs-Test pKTH1273 Ca1) ttnd pKTH127^(a2) und als Sondenmoleküle 1023351277Cb1), mK!TH1278(b2) und mKTH1279(b,) mit jeweils 200.000 cpm/Reaktion verwendet. Ansonsten wurde die Hybri disierung, das Waschen der Filter und das Auswerten der Ergebnisse wie vorstehend in Beispiel 1b) beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse der vorliegenden Hybridisierung sind in Tabelle 6 aufgeführt.
■ ' Tabelle 6
Probe .· (ίο5) Hybridisierte
Badioaktivität		 Virus-Isolat ;
Infizierte
Zellen		 ml) 3521 nicht ermittelt
15 Urin; 1(10 ml) 243 CMV
Urin- 2(10 3215 CMV
20
Urin= einer gesunden.Testperson (10 ml) 52 nicht ermittelt
Lungenbiopsie-rProbe 535 CMV
Kontrollzel-,(10 ) 68 nicht ermittelt len
Keine Probe 65 nicht ermittelt
Die in Tabelle 6 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, mit einer Reihe von Nucleinsäure-Reagenzien CMV in verschiedenen klinischen Proben, wie Urin, Lungenbiopsie-Proben und in Zellen nachzuweisen. 35
Der Test ist für Cytomegalovirus spezifisch. Er identifi-
L J
1 ziert keine menschliche DNA, d.h. der Test zeigt keine Interferenzen mit der in der Probe vorhandenen menschlichen DNA. Die Art der Probe spielt überhaupt keine Rolle für die Spezifität des Tests.
L J
- Leerseite -

Claims (13)

VOSSIUS - VOSSI US · TAU OKJSTER-: WfQNE-MAN N · RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4· · 8OOO MÜNCHEN 86 ■ PHONE: (O89) 47 4Ο75 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 45 3 VOPAT D u.Z.: T 532 (Ra/Jae/H) 3505287 Case: SI-84-0655 Orion-yhtymä Oy Espoo, Finnland 15. Februar, 1985 "Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung" Patentansprüche
1. Nucleinsäure-Reagenzien, dadurch gekenn- |
zeichnet , daß sie mindestens eine Reihe alternierender Nucleinsäure-Fragmente enthalten.
2. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwei oder mehr Serien von mindestens zwei, vorzugsweise jedoch mehreren Reihen alternierender Nucleinsäure-Fragmente enthalten, die genügend homolog zur zu identifizierenden Nucleinsäure sind, jedoch nicht homolog zueinander sind.
3. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie entweder getrennte oder miteinander verbundene Reihen alternierender Nucleinsäure-Fragmente enthalten.
4-. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß sie Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten mit von Vektoren abgeleiteten Bereichen enthalten. ■*
5· Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß sie markierte Reihen von Nucleinsäure Fragmenten enthalten.
6. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 bis 4·, dadurch gekennzeichnet, daß sie an ein festes Trägermaterial gebundene Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten enthalten.
7. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß sie das rekombinante Plasmid pK3?H1220 oder Derivate davon enthalten, welches DNA des Bakteriums Chlamydia trachomatis L2 enthält.
8. Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß sie das rekombinante Plasmid pKTH1271 oder Derivate davon enthalten, welches DNA des Cytomegalovirus AD169 enthält.
9. Verfahren zur Herstellung der Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man mit DNA-Rekombinations-Verfahren, oder auf synthetischem oder semisynthetischem Weg Reihen von Nucleinsäure-Pragmenten herstellt.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:
a) Isolierung einer ausgewählten Nucleinsäure mit geeigneter Länge,
b) Clonierung der ausgewählten Nucleinsäure in einem geeigneten Vektor,
c) Fragmentierung der Nucleinsäure mit Restriktions-Enzymen,
d) Zuordnung von nicht miteinander hybridisierenden Fragmenten zu verschiedenen Reihen von Fragmenten, wobei die Fragmente gegebenenfalls kovalent miteinander verbunden werden,
L J
e) gegebenenfalls Zuordnung geeigneter Reihen von Fragmenten zu Serien, wobei die Reihen gegebenenfalls kovalent miteinander verbunden werden,
f) Subclonierung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen, zu einer Reihe zugeordneten Fragmente, oder der miteinander verbundenen, zu einer Serie zugeordneten Reihen von Fragmenten in geeigneten Vektoren, wobei Fragmente oder Reihen von Fragmenten, die verschiedenen Serien angehören, vorzugsweise in verschiedenen, nicht miteinander hybridisierenden Vektoren subcloniert werden,
g) gegebenenfalls Bindung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer Reihe oder Serie an ein festes Trägermaterial, und
h) Markierung der getrennt vorliegenden oder miteinander verbundenen Fragmente einer anderen Reihe oder Serie.
11. Verwendung der Nucleinsäure-Reagenzien nach Anspruch 1 bis ,; zur Identifizierung von Nucleinsäuren in diagnostischen Hybridisierungs-Verfahren.
12. Ausführungsform nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Identifizierung mehrerer verschiedener Nucleinsäuren geeignete Kombinationen von Nucleinsäure-Reagenzien aus Reihen von Nucleinsäure-Fragmenten zusammengestellt werden, die ausreichend homolog zu diesen verschiedenen Nucleinsäuren sind.
13. Ausführungsform nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung als diagnostisches "Sandwich"-Hybridisierungs-Verfahren durchgeführt wird.
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