DE3410602A1

DE3410602A1 - Verfahren zur herstellung von lipidblaeschen durch verdampfen von loesungsmitteln und vorrichtung zur durchfuehrung dieses verfahrens

Info

Publication number: DE3410602A1
Application number: DE19843410602
Authority: DE
Inventors: Rose-Marie Handjani; Manlio Vaujours Maurelli; Alain Paris Ribier
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1983-03-22
Filing date: 1984-03-22
Publication date: 1984-09-27
Also published as: GB2136762B; FR2543018B1; JPS6322178B2; US4608211A; JPS59179146A; GB2136762A; FR2543018A1; IT1178896B; IT8467264A1; GB8407325D0; DE3410602C2; IT8467264A0

Description

« β »te«

Μ/25 022 /T

2

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidbläschen mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 1OOO £ und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Mit den Lipidbläschen kann eine wäßrige Flüssigkeit, z. B. eine wäßrige Lösung einer biologisch aktiven Substanz, eingekapselt werden. Bekanntlich erhält man je nach dem Verfahren, das man zur Herstellung von Bläschen verwendet, entweder multilamellare Bläschen (vesicules multilamellairesj MLV), die jeweils aus mehreren sphärischen Lipidbläschen bestehen, oder unilamellare Bläschen, die nur ein einziges Lipidblättchen aufweisen. Im letzteren Fall erhält man je nach dem Herstellungsverfahren Bläschen mit einem Durchmesser kleiner als 1OOO £ (SUV) oder mit einem Durchmesser größer als 1000 % (LUV).

Unilamellare Bläschen besitzen gegenüber multilamellaren . Bläschen Vorteile, da letztere unterschiedlich groß ~ sind und eine ungleichmäßige Anzahl von Blättchen besitzen. Von den unilamellaren Bläschen besitzen außerdem diejenigen der zweiten Art (LUV) Vorteile gegenüber denjenigen der ersten Art (SUV), da sie größer sind und somit eine größere Fähigkeit zur Verkapselung besitzen. Außerdem können mit diesen Bläschen Makromoleküle mit erhöhtem Molekulargewicht eingekapselt werden. Forschungsarbeiten beschäftigen sich daher damit, unilamellare Bläschen des Typs (LUV) im industriellen Maßstab größtmöglicher Ausbeute herstellen zu können.

M/25 022 2:

Zur Herstellung dieser Art von unilamellaren Bläschen sind derzeit zwei Herstellungsverfahren bekannt: ein Dialyseverfahren zur Entfernung des Detergens und ein Verfahren zur Verdampfung von Lösungsmitteln.

In dem Artikel von David S.Cafiso (Biochemica et Biophysica Acta, 649 (1981), 129-132, mit dem Titel »Preparation of unilamellar lipid vesicles at 37°C by vaporization methods") ist ein Verfahren beschrieben, das Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt zur Herstellung von Bläschen des Typs LUV bei physiologischen Temperaturen einsetzt. Gemäß diesem bekannten Verfahren injiziert man in eine Kolonne mit einem Wasserpuffer von 37⁰C Ethylmethylether- oder Dichlorfluormethan-Lösungen von 4⁰C, welche solubilisierte Lipide enthalten. In dieser Druckschrift sind die prinzipiellen Vorteile dieses Verfahrens beschrieben. Diese Vorteile eind einerseits, daß die hitzeempfindlichen Substanzen im Inneren des Bläschens ohne thermische Denaturierung leichter eingeschlossen werden können und daß andererseits die Anzahl der Lipide, die in Dichlorfluormethan löslich sind, größer ist als die Zahl der Lipide, die in zahlreichen anderen Lösungsmitteln solubilisiert werden können. Obwohl dieses Verfahren, bei dem die Injizierungsstufe in einem Milieu von 37°C durchgeführt wird, eine Verbesserung, der zuvor bekannten Verfahren darstellt, bei denen das Injektionsmilieu im allgemeinen eine Temperatur von 60 bis 65⁰C besaß, ist dieses Verfahren jedoch nicht bei Substanzen anwendbar, die sich bei Temperaturen unterhalb 37°C zersetzen. So findet beispielsweise bei 37°C die Denaturierung von verschiedenen Proteinen oder die Inaktivierung bestimmter, aktiver Moleküle statt.

M/25 022 Jf

Man hat daher versucht, die obengenannten Nachteile zu vermeiden. Dies zeigt auch die europäische Patentanmeldung 55 576. In dieser Anmeldung ist ein industrielles Verfahren zur Herstellung von Bläschen unter milden Bedingungen vorgeschlagen (d.h. unterhalb der Übergangstemperatur von Lipidbläschen und ohne daß man stark auf das aufnehmende Milieu einwirken muß). Bei diesem Verfahren verwendet man ein« Lösungsmittelsystem für die Lipide. Dieses System umfaßt ein wasserlösliches Lösungsmittel S1, das aus Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol ausgewählt ist, und ein hydrophobes Lösungsmittel S2, das flüchtiger ist als die wäßrige Lösung und das ausgewählt ist aus Hexan, Cyclohexan, 2,2-Dimethylbutan, Pentan, Isopentan und 1,1,2-Trichlortrifluormethan. Da der Siedepunkt von S2 höher ist als Umgebungstemperatur (28 bis 81⁰C),muß man die Bläschendispersion auf eine verhältnismäßig hohe Temperatur bringen, um S2 zu entfernen. Da außerdem S2 wasserlöslich ist, muß man diese Dispersion dialysieren oder über eine Kolonne filtrieren, um das Lösungsmittel S2 zu entfernen. Folglich kann auch das in der europäischen Patentanmeldung 55 556 beschriebene Verfahren nicht dazu eingesetzt werden, thermisch empfindliche Substanzen einzukapseln.

Es wurde nun gefunden, daß man Bläschen bei niedriger Temperatur herstellen kann, wenn man den Druck vermindert, bei dem die einzukapselnde, wäßrige Phase konditioniert ist. Es wurde gefunden, daß man, wenn man mit vermindertem Ausstoß bei reduziertem Druck eine Lipidlösung, die in einem unter Druck stehenden Behälter konditioniert ist, in ein wäßriges, aufnehmendes Milieu injiziert, bei den zuvor genannten Temperaturen Bläschen

* A

• «

M/25 022 U

<*Λ

in einer sehr befriedigenden Ausbeute erhält. Das beobachtete Phänomen beruht auf der Kombination zweier Faktoren: Einerseits wird die Injektion mit einem verminderten Ausstoß durchgeführt; andererseits ist derjenige Druck, bei dem die einzukapselnde, wäßrige Phase konditioniert ist, geringer als der Druck, bei dem die Lipidlösung in flüssigem Zustand konditioniert ist, und niedriger als der Dampfdruck der oder des Lösungsmittels) in den Tröpfchen, die sich am Injektionspunkt bei der Temperatur des aufnehmenden Milieus bilden.

Zur Erklärung der wesentlich besseren Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu den bekannten Verfahren, bei denen Lösungsmittel verdampft werden und bei denen die Lipidmilieus und die empfangenden Milieus unter normalem Druck stehen, hat man die Hypothese entwickelt, ohne jedoch an diese Err klärung gebunden zu sein, daß sich bei den bekannten Verfahren im Injektionsmilieu ein verhältnismäßig langsamer, thermischer Austausch ausbildet, so daß sich die ' Lipidtröpfchen teilen und zu verhältnismäßig kleinen (mittlerer Durchmesser 150 nm) Bläschen führen. Im Gegensatz dazu wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die in das aufnehmende Milieu eingeführten Tröpfchen praktisch unverzüglich platzen, so daß unilamellare Bläschen mit großem Umfang gebildet werden. Folglich ist der erfindungsgemäß durch Druckverminderung im wäßrigen Milieu hervorgerufene "Blitz" ("flash") nicht vergleichbar mit dem bekannten Blitz, der auf einer Temperaturerhöhung durch Injektion in das aufnehmende Medium beruht. Erfindungsgemäß ist es außerdem möglich, bei einer beliebigen Temperatur des aufnehmenden Mediums zu arbeiten.

Vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur, die un-

» β «φ«

M/25 022 X

Al

terhalb 25⁰C liegt, damit man thermoempfindliche Substanzen einkapseln kann.
5

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidblaschen mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 1OOO A₉ wobei jedes dieser Bläschen aus einem sphärischen Lipidblättchen besteht, in dem sich eine einzukapselnde Substanz befindet, wobei man das (die) zur Bildung des Blättchens der Bläschen bestimmte(n) Lipid(e) in mindestens einem in Wasser unlöslichen Lösungsmittel solubilisiert, die Lipidlösung in flüssigem Zustand in einem Behälter bei einem Druck P₁ und einer Temperatur θ^ konditioniert, die einzukapselnde Substanz zur Herstellung einer wäßrigen Phase solubilisiert, diese wäßrige, einzukapselnde Phase bei einem Druck Pg und einer Temperatur Qp konditioniert und die Lipidlösung in die wäßrige · Phase derart injiziert, daß sich das oder die Lösungsmittel der Lipidlösung verflüchtigt oder verflüchtigen, wenn es (sie) mit dieser wäßrigen Phase in Kontakt kommt

oder kommen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Lipidlösung in die einzukapselnde, wäßrige Phase mit einem verringerten Ausstoß injiziert, damit man am Anfang Tröpfchen erhält, wobei der Druck P₂ niedriger ist als P₁ und der Dampfdruck des (oder der) Lösungsmittel^) in diesen Tröpfchen bei der Temperatur Θ₂·

Vorzugsweise wählt man die Temperaturen θ^ und Q₂ so, daß sie im wesentlichen gleich sind.

Bei einer bevorzugten, ©rfindungsgemäßen Ausführungsform konditioniert man die Lipidlösung in einem Behälter vom Typ "Aerosolbombe", der ein Treibmittel enthält. Man

Μ/25 022
1

wählt den Druck Ρ2 so, daß er unter Atmosphärendruck liegt. Aus nachstehend angegebenen Gründen verwendet man vorzugsweise ein oder mehrere Lipid(e), die in der in der Aerosolbombe enthaltenen Flüssigkeit völlig löslich sind. Der Druck P^ in der Aerosolbombe liegt bei spielsweise zwischen 1 und 8 bar (absolut). Vorzugsweise liegt der Druck P* zwischen 4 und 6 bar (absolut).

Zur Einkapselung von thermo empfindlichen Substanzen verwendet man als Lösungsmittel für das oder die Lipid(e) ein oder mehrere Lösungsmittel, dessen (deren) Siedepunkt unterhalb 25°C liegt. Ferner arbeitet man bei Temperatüren Θ,. und θρ, die im wesentlichen Umgebungstemperatur entsprechen. Weiterhin verwendet man als Lösungsmittel für das (die) Lipid(e) ein oder mehrere Lösungsmittel mit geringer Polarität. Als Lösungsmittel, die die obengenannten Bedingungen erfüllen, kann,man insbesondere halogenierte Kohlenstoffverbindungen nennen. Von diesen kann man Trichlorfluormethan, Dichlorfluormethan und Dichlordifluormethan nennen.

Das erfindungsgemäß verwendete Treibmittel kann ein komprimiertes Gas sein, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase löslich ist. Man kann Lachgas oder Kohlendioxid einsetzen. Das Treibmittel kann auch ein verflüssigtes Gas sein, das mit der in der Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist und im wesentliehen aus einem Kohlenwasserstoff besteht, der gegebenenfalls halogeniert ist. Als Kohlenwasserstoffe kann man Butan und Propan und als halogenierte Kohlenstoffe kann man Chlorfluoralkane, wie Dichlorfluormethan, Dichlordifluormethan und 1,2-Dichlor-1,1,2,2-tetrafluorethan,nennen. Das Treibmittel kann auch aus einem

Μ/25 022

/JIj.

komprimierten Gas bestehen, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase nicht löslich ist. Dieses komprimierte Gas kann Stickstoff sein. Is.t das Treibmittel ein mit der Lipidlösung der Aerosolbombe mischbares, verflüssigtes Gas, so kann sich die Löslichkeit der Lipide in dem Lösungsmittel vermindern. In diesem Fall kann man das Treibmittel und das Lösungsmittel in der Aerosolbombe mittels einem Beutel aus Plastik oder Metall trennen.

Erfindungsgemäß löst man das (oder die) Lipid(e) in dem ausgewählten Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 10 g/100 ml Lösungsmittel.

Falls man ein oder mehrere ionische Lipide verwendet, setzt man vorteilhafterweise ein zusätzliches Lösungsmittel ein, das polarer ist als das oder die. Grundlösungsmittel. Man verbessert so die Löslichkeit des (oder der) ionischen Lipid(e). Als Beispiel für ein derartiges zusätzliches Lösungsmittel kann man Ethylmethylether nennen.

Es ist ferner möglich, in die Lipidlösung einzukapselnde, lipophile Substanzen einzuführen, wobei diese Substanzen in den Wandungen der Bläschen bleiben, die sich zuvor gebildet haben.

Um einen verminderten Ausstoß der Lipidlösung in den die einzukapselnde, wäßrige Phase enthaltenden Behälter sicherzustellen, verwendet man vorteilhafterweise einen Mikroschleber, den man vorzugsweise derart regelt, daß er einen Ausstoß zwischen 5 ml/h und 10 ml/min liefert.

M/25 022 JS

In Abhängigkeit von den anderen erfindungs gemäß en Verfahrensbedingungen wählt man den Druck P₂ so, daß er zwischen 0,1 mbar und 15 mbar liegt. Die Lipidlösung leitet man mittels eines Kapillarröhrchens in die in dem Behälter vorhandene, wäßrige Phase der einzukapselnden Substanz. Die Temperatur Q₂ der einzukapselnden Phase hält man mit Hilfe eines Thermostaten konstant niedrig. Vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur Q₂, die niedriger ist als 25°C Die einzukapselnde Phase bewegt man leicht. Handelt es sich bei der einzukapselnden Substanz um eine nicht abbaubare Substanz, dann bewegt man die einzukapselnde, wäßrige Phase πιει 5 chanisch mit Hilfe eines Ultraschallbades. Handelt es sich bei der einzukapselnden Substanz um eine Proteinsubstanz, dann gibt man in die einzukapselnde, wäßrige Phase ein Antischaummittel.

Erfindungs gemäß kann man außerdem vorteilhafterweise die Bläschen fortlaufend herstellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform injiziert man die Lipidlösung in ein Kanalsystem, in dem man die einzukapselnde, wäßrige Phase zirkulieren läßt.

Bei der Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens regelt man zweckmäßigerweise die durch den Mikroschieber vorgegebenen Werte für den Ausstoß und den Druck P₂ in Abhängigkeit von der einzukapselnden Substanz. Bei den gelösten Stoffen, die keine Proteinsubstanzen sind, kann man einen maximalen Ausstoß verwenden und bei einem Druck P₂ von 15 mbar bis 0,1 mbar arbeiten. Zur Verkapselung von Proteinprodukten, bei denen die Gefahr besteht, daß sich ein stabilisierter Schaum bildet, arbeitet man jedoch bei einem geringen Ausstoß und bei einem geringfügig verminderten Druck.

0 9 M «β ·» * fr

M/25 022 Jf

Es wurde gefunden, daß die Heterogenität der Verteilung der Bläschen wenig vom Ausstoß, im mittleren Maß von der Lipidkonzentration der Aerosolbombe und den Mitteln zum Bewegen bzw. Rühren der wäßrigen Lösung und stark von der einzukapselnden Substanz, insbesondere dessen Viskosität,und der Ausflockung der in bestimmten Arten von gelösten Stoffen gebildeten Bläschen abhängt.

Die nach dem erfindungs gemäßen Verfahren erhaltene, endgültige Bläschenlösung besitzt eine Konzentration an Lipiden, die zwischen 0,1 und 10 Gew.% liegen kann. Das eingekapselte Volumen ist größer als bei den nach den bekannten Verfahren erhaltenen Bläschen.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie einen ersten Behälter vom Typ "Aerosolbombe¹¹, der ein Auslaßventil besitzt, und einen zweiten Behälter, in dem ein verminderter Druck aufrechterhalten werden kann, Mittel, die es ermöglichen, daß die Flüssigkeiten des ersten und des zweiten Behälters miteinander derart in Verbindung stehen, daß der Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters injiziert werden kann, und einen Mikroschieber aufweist, welcher mit den-zuvor genannten Mitteln so verbunden ist, daß der Ausstoß der Injektion reguliert werden kann.

Nach einer bevorzugten^ erfindungsgemäßen Ausführungsform bestehen die Mittel, die es ermöglichen, daß eine Flüssigkeit vom ersten zum zweiten Behälter gelangen kann, einerseits aus einem röhrchenförmigen übergangs-

qc teil, das an einem seiner Enden an den Auslaß-

Μ/25 022

stutzen des Auslaßventils des Aerosolbehälters und an seinem anderen Ende an den Eingang des Mikroschiebers angepaßt ist, und andererseits aus einem kapillaren Verteilungsröhrchen besteht, dessen eines Ende an den Ausgang des Mikroschiebers angepaßt ist. Vorzugsweise ist der Mikroschieber ein Injektornadel-Mikroschieber.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Kapillarröhrchen besitzt einen Durchmesser kleiner als ungefähr 0,3 mm. Eine Verteilvorrichtung ist am Ende des Kapillarröhrchens angebracht, um eine Verteilung zu gewährleisten. Der zweite Behälter weist einen Thermostaten auf. Der zweite Behälter ist ferner mit Mitteln ausgestattet, durch die sein Inhalt bewegt bzw. gerührt werden kann.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend mehrere Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Die Zeichnungen zeigen eine schematische Ansicht der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienenden Vorrichtung.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine schematische Gesamtansicht einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 eine Ansicht im vergrößerten Maßstab eines erfindungs gemäßen Aerosolbehälters, auf dessen Auslaß ein Mikroschieber angebracht ist, der dazu dient, den für das erfindungs gemäße Verfahren erforderlichen, verminderten Ausstoß zu gewährleisten; und

Fig. 3 eine schematische Schnittansicht eines Aerosolbehälters, der zur Aufnahme eines verflüssigten Treibmittels dient, welches die Löslichkeit der Lipide im Lösungsmittel vermindern kann.

M/25 022
1

Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung besitzt einen ersten Behälter, der aus einer Aerosolbombe 1 besteht, und einen zweiten Behälter, der aus einem Ballon 2 besteht, in dem ein verminderter Druck "P^ aufrechterhalten werden kann.

Der Aerosolbehälter 1 weist ein Schließventil 3 und ein Röhrchen 4 auf, das in die darin enthaltene Flüssigkeit 5 taucht. Der Ausgang der Aerosolbombe ist mit einem Mikroschieber 6 verbunden, an dessen Ausgang sich ein Kapillarröhrchen 7 befindet, das in die Flüssigkeit 8 des Ballons 2 taucht. Dieses Kapillarröhrchen besitzt einen Durchmesser von ungefähr 0,3 mm und eine Länge von ungefähr 20 cm.

Bei einer besonderen Ausführungsform der Fig. 2 ist ein röhrchenförmiges Übergangsteil 9 an einem seiner Enden an die Öffnung des Auslaßventils 3 und an seinem anderen Ende an den Eingang des MikroSchiebers 6 angepaßt. Dazu greift das Teil 9 mit seinem Auslaßende in die zentrale Ausbohrung 10 eines ersten Ringes 11 ein, wobei die Ausbohrung 10 auf der gegenüberliegenden Seite die Auslaßöffnung 12 des Mikro Schiebers 6 aufnimmt. Außerdem ist der Ring 11, der ein Schrumpfring ist, mit einem zweiten Ring 13 verbunden, welcher um den Hals des Aerosolbehälters 1 verläuft. Diese beiden Ringe werden durch Verschrauben der beiden konzentrischen Schürzen 11a und 13a verbunden, welche sich jeweils an den Ringen 11 und 13 befinden.

Der Mikroschieber 6 ist ein InJektornadel-Mikroschieber, der mittels der Schraube 14 eine· sehr feine Regulierung ermöglicht. Man kann beispielsweise einen "Nupro"-Schie-

M/25 022 J^r xf^

ber (Bezeichnung SS2SG) aus rostfreiem Stahl verwenden. Das Kapillarröhrchen 7 ist mit Hilfe eines Ubergangsgliedes 15 am Ausgang des Mikroschiebers 6 befestigt.

Enthält der Aerosolbehälter 1 ein Treibmittel, das aus einem verflüssigten Gas besteht, welches mit der in der Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist und welches die Löslichkeit der Lipide in den verwendeten Lösungsmitteln vermindern kann, trennt man das Treibmittel vom Lösungsmittel, in dem die Lipide solubilisiert sind, durch eine Tasche bzw. einen Beutel 17 aus einem Plastikmaterial oder aus Metall, wobei sich das Treibmittel außerhalb der Tasche bzw. des Beutels 17 befindet.

In den nachfolgenden Beispielen ist die erfindungsgemäße Herstellung von Lipidbläschen beschrieben. Es sind auch Vergleichsbeispiele A, B und C beschrieben, in denen die Herstellung von Bläschen identischer Lipidzusammensetzung nach bekannten Verfahren dargelegt ist. Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß das in den erfindungsgemäß erhältlichen Bläschen eingekapselte Volumen wesentlich größer ist als das Volumen, das in den nach den bekannten Verfahren erhaltenen Bläschen eingekapselt werden kann.

Die für alle Beispiele verwendete Lipidzusammensetzung (ausgedrückt in Gew.#) ist die folgende:

- nichtionische Lipidverbindung der allgemeinen Formel

R fO

CH₂OH

M/25 022 ^ Io

worin R einen Hexadecylrest bedeutet und

η für 3 steht (statistischer Mittelwert) 47,5%

- Cholesterin . 47,5%

- Dicetylphosphat 5 %

B eispiel 1

Herstellung von unilemallaren Lipidbläschen des Typs LUV nach dem erfindungsgemäßen Verfahren

In einen 150 ml Aerosolbehälter wiegt man 0,5 g einer Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein. Man gibt 100 g Trichlorfluormethan zu, verschließt den Aerosolbehälter hermetisch mit einer Einheit aus Ring-Ventil-Eintauchröhrchen, löst die Lipide in ihrem Lösungsmittel durch Bewegen des Behälters bei einer Temperatur von ungefähr 40°C und läßt dann auf Umgebungstemperatur abkühlen. Man gibt 4 g Lachgas in den Aerosolbehälter, um dort einen Druck von 6 bar zu erzeugen. Auf dem Aerosolbehälter befestigt man die Vorrichtung, die aus einem Übergangsröhrchen, einem Injektornadel-Mikroschieber mit Mikrometerschraube, einem Kapillarröhrchen mit einem inneren Durchmesser von 0,3 mm und einem Verteiler mit einem rostfreien Metallnetz mit Maschen von 2 Mikron besteht. Man taucht den Verteiler in 50 ml einer 0,3 molarenGlucoselösung, die in einem Erlenkolben enthalten ist, welcher einen flachen Boden besitzt und einem Anschlußstück zum Anlegen von Vakuum ausgestattet ist. Den Erlenkolben stellt man in ein Wasserbad, das auf 20⁰C thermostatisiert ist, und auf einen Magnetrührer. Man verbindet die Auslaßöffnung zum Anlegen von Vakuum des Erlenkolbens mit einer Wasserstrahlpumpe, die einen verminderten Druck von 15 mbar ermöglicht. Man regelt den Mikroschieber so, daß er einen Ausstoß von

Μ/25 022

3 ml/min liefert. An die wäßrige Dispersion der so gebildeten Bläschen legt man eine Stunde einen verminderten Druck von 0,1 mbar an, um die letzten Lösungsmittelspuren zu entfernen. Die Bläschendispersion erhält man in einer Lipidkonzentration von 1%. Die mit Hilfe eines Korngröße-Bestimmungsgeräts auf Basis einer quasi-elastischen Diffusion (Nanosizer) gemessene, mittlere Größe beträgt 300 nm. Die durch Analyse der eingekapselten Glucose bestimmte Ausdehnung beträgt 18/ul/mg Lipide.

Ver^leichsbeispiel A

Herstellung von multilamellaren Bläschen durch Ultradispersion

Dieses Verfahren ist in der FR-PS 2 315 991 beschrieben.

In einen 250 ml Becher aus rostfreiem Stahl wiegt man 8 g der Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein und schmilzt sie bei 100 bis 120⁰C. Bei 80⁰C gibt man 20 g einer wäßrigen, 0,3 molaren Glucose lösung zu und homogenisiert die so gebildete Lipidphase (lameHare Phase) mit Hilfe eines metallischen Spatels. Danach gibt man 72 g einer wäßrigen 0,3 M Glucoselösung zu, unterwirft das Ganze einem Ultradispergierer Virtis Modell 60 K, regelt die Turbinengeschwindigkeit auf 40000 Touren/min und bewegt 30 min. Das Erwärmen der bläschenartigen Dispersion begrenzt man dadurch, daß man sie in ein auf 20⁰C thermostatisiertes Wasserbad taucht. Man erhält eine Bläschendispersion mit einer Lipidkonzentration von 896. Die in einem Nanosizer bestimmte, mittlere Größe beträgt ^300 nm. Die Ausdehnung be-

trägt 7 /Ul/mg Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten Glucose.

»VW • · W W VV „ « « «

M/25 022 45" γι

Vergleichsbeispiel B

Herstellung von unilamellaren Bläschen des Typs SUV durch das Ultraschallverfahren

In einen 100 ml Rundkolben wiegt man 0,3 g der Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein, löst die Mischung in 5 ml einer Chloroform-Methanol-Mischung (Verhältnis 2:1) und verdampft das Lösungsmittel mit Hilfe eines Rotationsverdampfers. Letztere Lösungsmittelspuren entfernt man, indem man mit einer Radiaischieberpurape einen reduzierten Druck 1 h an die Mischung der Produkte anlegt. Den erhaltenen Lipidfilm bringt man in Kontakt mit 10 ml einer 0,3 molaren, wäßrigen Glucoselösung, stellt den Kolben auf eine Schüttelmaschine und schüttelt 2 h heftig bei einer Temperatur von 60⁰C. Dann kühlt man, zunehmend bis zu Umgebungstemperatur. Die Bläschendispersion behandelt man dann 20 min mit Ultraschall, indem man sie mit einer Mikrosonde in Kontakt bringt, die mit einem Branson-Generator des Typs Sonifier B 30 verbunden ist. Während der Behandlung mit Ultraschall'begrenzt man das Erwärmen der Bläschendispersion mittels eines auf 20⁰C thermostatisierten Wasserbades. Die erhaltene Bläschendispersion besitzt eine Lipidkonzentration von 3%· Die im Nanosizer bestimmte, mittlere Größe beträgt 90 nm. Die Ausdehnung beträgt 2/ul/mg Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten Glucose.
30

Vergleichsbeispiel C

Herstellung von unilamellaren Lipidbläschen des Typs

LUV durch Dialyse .

In einen 100 ml Rundkolben wiegt man 0,15 g der Lipid-

M/25 022 *6~ Th

mischung der obengenannten Zusammensetzung ein, löst diese in 3 ml einer Chloroform-Methanol-Mischung (Verhältnis 2:1) und verdampft das Lösungsmittel mit Hilfe eines Rotationsverdampfers. Dann entfernt man letzte Lösungsmittelspuren, indem man an die Mischung der Produkte eine Stunde einen verminderten Druck anlegt, der durch eine Radialschieberpumpe erzeugt wird. Den erhaltenen Lipidfilm bringt man in Kontakt mit 10 ml einer 0,3 molaren, wäßrigen Glucoselösung, stellt den Ballon auf eine Schüttelmaschine und schüttelt 2 h heftig bei einer Temperatur von 60⁰C. Dann gibt man 600 mg Octylglucosid zu, wobei man weiter 2 h bei 60⁰C schüttelt.

Die so erhaltene Mizellenlösung ist klar. Man gibt 5 ml dieser Lösung in eine Dialysezelle von Lipoprep Diachema "Bilayer Liposome Preparation Device". Es werden dabei folgende Bedingungen eingestellt:

- Temperatur des Dialyseabteils: 18 h 60°C, dann zunehmende Abkühlung während eines Zeitraums von 4 h von 60 auf 25°C;

- Dialyseausstoß: 2 ml/min für Jede der beiden Halbzellen;

- Dialyselösung: 0,3 molare Glucose;

- Rührgeschwindigkeit des Magnetstabs in der Zelle: 100 U/min.

Die erhaltene Bläschendispersion besitzt eine Lipidkonzentration von Λ ,5%. Die im Nanosizer bestimmte Größe beträgt 150 mn. Die Ausdehnung beträgt 4 /ul/mg

Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten Glucose.

M/25 022

1	Tabelle I	Bläschen- Verfahren art	Ultradispersion	Mittl. Größe	Eingekaps. Unverträglich Volumen mit	temperaturempf.
		Beispiel A	(nm)	( /Ul/mg 'Lipide)	Substanzen und
	MLV		300	7	mechanischer Be
5					wegung
		Ultraschall			dito
		Beispiel B
	SUV	Dialyse	90	2	thermoempfindli
		Beispiel C			chen Substanzen
	LUV	erfindungs gern.	150	4	nichts
η		Verfahren
υ	LUV	Beispiel 1	300	18

Bestimmt durch enzymatische Mikroanalyse einer eingekapselten, gelösten Glucosemenge. Die in einer 0,3 M Glucoselösung gebildeten Bläschen werden über eine GeI-Kolonne-Pharmacia des Typs Sephadex G5Q Coarse filtriert, die mit einer 0,15 molaren, wäßrigen Natrium-Chloridlösung eluiert wird. Die so von jeglichen, nichteingekapselten Glucosespuren freigewaschenen Bläschen werden dann mit einem oberflächenaktiven Mittel, z.B. Triton X 1OO (Octylphenoxypolyethoxyethanol) mizellisiert. Dies führt dazu, daß die zuvor eingekapselte

Glucose befreit wird und anschließend analysiert werden kann.

Claims

M/25 022 j( Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidbläschen mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 1OOO &, wobei jedes dieser Bläschen aus einem sphärischen Lipidblättchen besteht, in dem sich eine einzukapselnde Substanz befindet, wobei man das (die) zur Bildung des Blättchens der Bläschen bestimmte(n) Lipid(e) in mindestens einem in Wasser unlöslichen Lösungsmittel solubilisiert,

die Lipidlösung in flüssigem Zustand in einem Behälter bei einem Druck P^ und einer Temperatur Q^ konditioniert,

die einzukapselnde Substanz zur Herstellung einer wäßrigen Phase solubilisiert,

diese wäßrige, einzukapselnde Phase bei einem Druck Pp und einer Temperatur Qp konditioniert und die Lipidlösung in die wäßrige Phase derart injiziert, daß sich das oder die Lösungsmittel der Lipidlösung verflüchtigt oder verflüchtigen, wenn es (sie) mit dieser wäßrigen Phase in Kontakt kommt oder kommen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in die einzukapselnde, wäßrige Phase mit einem verringerten Ausstoß injiziert, damit man am Anfang Tröpfchen erhält, wobei der Druck P₂ niedriger ist als P₁ und der Dampfdruck des (oder der) Lösungsmittels in diesen Tröpfchen bei der Temperatur Q₂.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im wesentlichen gleiche Temperaturen Θ..

und θ₂ wählt.

6 WO

M/25 022 2

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in einem Behälter vom Typ "Aerosolbombe", der ein Treibmittel enthält, konditioniert und daß man den Druck P₂ so wählt, daß er unter dem Atmosphärendruck liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lipid oder Lipide verwendet, welches oder welche in dem flüssigen Inhalt der Aerosolbombe vollständig löslich ist (oder sind).

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P^ von 1 bis 8 bar (absolut) arbeitet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P₁ von 4 bis 6 bar (absolut) arbeitet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für das (die) Lipid(e) ein Lösungsmittel oder Lösungsmittel verwendet, dessen (deren)Siedepunkt unterhalb 25°C liegt, und daß man die Temperaturen Q* und θ~ so wählt, daß sie im wesentlichen der Raumtemperatur entsprechen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für das (oder die) Lipid(e) ein oder mehrere schwach polare Lösungsmittel wählt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 und 8 gemeinsam, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel halogenierte Kohlenstoffverbindungen wählt.

M/25 022 3

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein komprimiertes Gas verwendet, das in der flüssigen, in der Aerosolbombe enthaltenen Phase löslich ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein verflüssigtes Gas einsetzt, das mit der in der Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel einen Kohlenwasserstoff einsetzt, der gegebenenfalls halogeniert ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein komprimiertes Gas einsetzt, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase nicht löslich ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Treibmittel und das Lösungsmittel in der Aerosolbombe durch einen Beutel aus Plastik oder Metall trennt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lipid oder die Lipide in dem oder den Lösungsmitteln in einer Konzentration von 0,01 bis 10 g/100 ml Lösungsmittel löst.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei man ein oder mehrere ionische(s) Lipid(e) verwendet, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Verbesserung der Löslichkeit des ionischen Lipids oder der ionischen Li-

M/25 022 4

pide ein zusätzliches Lösungsmittel einsetzt, das polarer ist als das oder die Basislösungsmittel. 5

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als zusätzliches Lösungsmittel Ethylmethylether einsetzt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Lipidlösung einzukapselnde, lipophile Substanzen einführt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroschieber verwendet, um den verminderten Ausstoß der Lipidlösung in den die einzukapselnde, wäßrige Phase enthaltenden Behälter zu gewährleisten.

20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroschieber so reguliert, daß er einen Ausstoß zwischen etwa 5 ml/h und 10 ml/min ermöglicht.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P₂ zwischen 0,1 mbar und 15 mbar arbeitet.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in den die wäßrige Phase der einzukapselnden Substanz enthaltenden Behälter mit Hilfe eines Kapillarröhrchens zuführt.

Μ/25 022 5

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur Qp der

einzukapselnden, wäßrigen Phase mit Hilfe eines Thermostaten konstant und niedrig hält.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur Q₂

niedriger als 25°C arbeitet.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzukapselnde, wäßrige Phase leicht bewegt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die einzukapselnde Substanz eine nichtabbaubare
Substanz ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzukapselnde, wäßrige Phase mit Hilfe eines Ultraschall-

bades mechanisch bewegt.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die einzukapselnde Substanz eine proteinartige Substanz ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Anti-

schaummittel in die einzukapselnde, wäßrige Phase einführt.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bläschen fortlaufend

herstellt.

29« Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in ein .Kanalsystem injiziert, in der man die einzukapselnde, wäßrige Phase zirkulieren läßt.

β ο - · * tt W 9 · O V

U W _V W * W O « φ

M/25 022 6

30. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen ersten Behälter vom Typ "Aerosolbombe" (1), der ein Auslaßventil (3) besitzt, und einen zweiten Behälter (2), in dem ein verminderter Druck aufrechterhalten werden kann, Mittel, die es ermöglichen, daß die Flüssigkeiten des ersten und des zweiten Behälters miteinander derart in Verbindung stehen, daß der Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters injiziert werden kann, und einen Mikroschieber (6) aufweist, welcher mit den zuvor genannten Mitteln so verbunden ist, daß der Ausstoß der Injektion reguliert werden kann.

31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel, die es ermöglichen, daß die Flüssigkeiten des ersten und des zweiten Behälters miteinander in Verbindung stehen, einerseits aus einem röhrchenförmigen übergangsteil (9), das an einem seiner Enden an den Auslaßstutzen des Auslaßventils des Aerosolbehälters (1) und an seinem anderen Ende an den Eingang des Mikroschiebers (6) angepaßt ist, und anderer- ·seits aus einem kapillaren Verteilungsröhrchen (7) besteht, dessen eines Ende an den Ausgang des MikroSchiebers (6) angepaßt ist.

32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroschieber (6) ein Injektornadel-Mikroschieber ist.

33· Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Kapillarröhrchen (7) einen Durchmesser besitzt, der geringer ist als ungefähr 0,3 mm.

M/25 022

34. Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß sich am Ende des kapillaren Verteilungsröhrchens eine Diffusoreinrichtung befindet.

35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Behälter einen Thermostaten aufweist.

36. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Behälter Mittel aufweist, mit denen sein Inhalt bewegt werden kann.