DE3213786C2

DE3213786C2 -

Info

Publication number: DE3213786C2
Application number: DE3213786A
Authority: DE
Inventors: Harumi Asaka Saitama Jp Katsuyama; Tadao Minami-Ashigara Kanagawa Jp Shishido
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1981-04-17
Filing date: 1982-04-15
Publication date: 1990-09-27
Also published as: US4418037A; JPS57174099A; DE3213786A1; JPH0431675B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Hydrogenperoxid- Nachweis nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Verschiedene Filme für die quantitative Analyse, insbesondere aus mehreren Schichten bestehende Analysenfilme, die eine kolorimetrische Analyse von Hydrogenperoxid mittel trocken arbeitender Verfahren ermöglichen - wobei eine Peroxidase beteiligt ist oder der Prozeß durch eine Peroxidase katalysiert wird -, wurden vorgeschlagen, und einige von ihnen sind auch zum praktischen Einsatz gelangt. Unter ihnen gibt es Filme für die quantitative Analyse von Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Cholinesterase, Kreatin etc. im lebenden Organismus mittels eines trocken arbeitenden Verfahrens, das, in dieser Reihenfolge, die Schritte der Umsetzung des betreffenden Stoffes mit dem geeigneten oxydierenden Enzym oder der Umsetzung eines in einer Enzymreaktion gebildeten Reaktionsprodukts mit dem geeigneten oxydierenden Enzym, der Reaktion des dabei freigesetzten Hydrogenperoxids mit einem Farbindikator zur Bildung einer Färbung und schließlich der Messung der gebildeten Färbung umfaßt. Wegen der Ziele der Erhöhung der Untersuchungsgeschwindigkeit, der Vermeidung komplizierter Arbeitsgänge und der Kostensenkung hat eine verstärkte Nachfrage nach Filmen des trocken arbeitenden Typs für die quantitative Analyse eingesetzt, insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Analyse. Infolgedessen wurden nach der Art von Test-Papierblättern aus einer oder mehreren Schichten bestehende Filme für die quantitative Analyse mit einer hohen Analysengenauigkeit entwickelt.

Aus mehreren Schichten zusammengesetzte Filme des integrierten Typs für die quantitative Analyse, die im Vergleich zu den herkömmlichen Filmen nach der Art von Test-Papierblättern mit einer einzigen oder zwei Schichten für die quantitative Analyse eine deutlich verbesserte Analysengenauigkeit aufweisen, sind insbesondere in der JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158) offenbart. Zur Erzielung einer weiteren Verbesserung der Analysengenauigkeit und unter Berücksichtigung des zu untersuchenden Analyten wurden auch Hydrogenperoxid- Indikatoren mit hoher Nachweisempfindlichkeit in Form solcher aus mehreren Schichten aufgebauter Filme des integrierten Typs für die quantitative Analyse verfügbar gemacht; Beispiele für solche Indikatoren zum Hydrogenperoxid-Nachweis und für Schichtstrukturen für derartige mehrschichtige Analysenfilme sind in den JP-OS 40 191/76 (entsprechend US-PS 40 42 335), 1 31 089/78, 29 700/79 (entsprechend der US-PS 41 66 093), 1 24 499/80 etc. offenbart.

Die Indikatoren zum Hydrogenperoxid-Nachweis, die für diese trocken arbeitenden Filme eingesetzt werden, basieren auf denen, die zum Hydrogenperoxid-Nachweis bei der herkömmlichen quantitativen Analyse mittels trocken arbeitender Verfahren verwendet werden, und die Prinzipien sind die gleichen.

Insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Untersuchungen wird eine Mannigfaltigkeit von Bestandteilen des lebenden Organismus durch chemische Reaktionen mit hoher Spezifität in gemeinsame Zwischenprodukte überführt, wobei im allgemeinen eine Enzymreaktion mit besonders hoher Spezifität zur Anwendung gelangt, um dadurch eine quantitative Bestimmung durchzuführen. Als ein derartiges gemeinsames Zwischenprodukt wird Hydrogenperoxid in vielen Bestimmungsmethoden herangezogen. Weiterhin wurden viele kolorimetrische Verfahren, die wenig aufwendig sind und hohe Genauigkeit erwarten lassen, in Verbindung mit Hydroperoxidasen - deren Substrat Hydrogenperoxid ist - und verwandten Reagenzien entwickelt.

Als Hydroperoxidase wird häufig Katalase oder Peroxidase (POD) verwendet, und es sind insbesondere viele Kombinationen mit Indikatoren zum Hydrogenperoxid-Nachweis bekannt, die sich der Peroxidation mittels Peroxidase bedienen. Indikatoren zum Nachweis von Hydrogenperoxid werden in zwei Gruppen eingeteilt:

(a) reduzierbare Chromogene und
(b) Kombinationen aus einem Wasserstoff-Donator (Entwickler) und einem Kuppler.

Erstere wurden von A. S. Keston et al (A. S. Keston, Specific Colorimetric Enzymatic Analytical Reagents for Glucose, Abstracts of Papers, 129th Meeting Amer. Chem. Soc., page 31C, April 1956) und letztere von P. Trinder (Ann. Clin. Biochem. 6, 24 (1969) und J. Clin. Pathol. 22, 246 (1969)) vorgeschlagen. Verbesserungen solcher reduzierbaren Chromogene, Wasserstoff-Donatoren und Kuppler werden u. a. in den JP-PS 33 798/72, 16 235/79, 37 555/76, 44 834/78, 12 360/79, 24 879/80 und 3 394/79 so wie den JP-OS 86 392/77, 26 188/78, 50 991/74, 11 892/75, 40 585/78, 1 10 897/80, 25 892/79, 20 471/80 und 1 01 861/80, der JP-PS 2 960/80 etc. offenbart.

Analytische Zusammensetzungen, Testpapiere und mehrschichtige Analysenfilme, die sich solcher enzymologischer Methoden bedienen, bringen Vorteile und Nachteile mit sich, die durch die als Reagenzien dienenden Enzyme bedingt werden.

Ein Hauptgrund dafür, daß eine Mannigfaltigkeit von Enzymen komplizierte Lebensvorgänge vollkommen und fehlerfrei steuert, liegt in der Substratspezifität eines Enzyms. Vermittels seiner Substratspezifität kann ein Enzym eine bestimmte ausgewählte chemische Substanz (eine zu untersuchende Verbindung) aus einer komplizierten Zusammensetzung selektiv ihrem Reaktionssystem zuführen. Eine solche hohe Selektivität ist einer der außerordentlichen Vorteile, die gewöhnliche chemische Reagenzien nicht haben können.

Auf der anderen Seite bedingen Enzyme jedoch auch Nachteile, die darauf beruhen, daß Enzyme Proteine sind und nicht den Katalysatoren ähneln, die in der chemischen Industrie, Fertigungsindustrie etc. eingesetzt werden, wenngleich Enzyme viele Reaktionen in vivo unter milden Bedingungen katalysieren. Ein besonders schwerwiegender Nachteil besteht in der Gefahr, daß eine Inaktivierung der Enzymwirkung aufgrund einer Denaturierung von Proteinen, in Form thermischer Denaturierung oder infolge einer irreversiblen Reaktion einer aktiven chemischen Species, eintreten kann. Die Enzymaktivität wird nämlich durch die Anwesenheit eines empfindlichen aktiven Zentrums an einer primären, sekundären oder hoch-dimensionierten Struktur eines komplizierten Proteins erzeugt; ein Enzym wird dadurch inaktiviert, daß eine Deformation der Struktur des Proteins stattfindet, die durch eine chemische Reaktion mit einer reaktionsfähigen chemischen Species aus einer äußeren Quelle, eine physikalische Adsorption oder dergleichen herbeigeführt wird. Wenn ein in einer Zusammensetzung für die quantitative Analyse enthaltenes Enzym inaktiviert wird, wird die erwartete Reaktion langsam, und die ursprünglich geplante Wirkung wird nicht erzielt. Als Folge davon wird ein falsches Analysenergebnis erhalten.

Bei analytischen Zusammensetzungen, Testpapieren, mehrschichtigen Analysenfilmen und dergleichen, in denen ein oder mehrere Enzyme als Reagenzien verwendet werden, ist die thermische Beständigkeit gering; weiterhin bestimmen diejenigen Eigenschaften, die ein Enzym prinzipiell besitzt, die jedoch der Gefahr einer Inaktivierung durch eine chemische aktive Species unterliegen, die Leistungsfähigkeit dieser analytischen Zusammensetzungen, so daß es im allgemeinen schwierig ist, sie während längerer Zeiträume aufzubewahren. Die Lagerbeständigkeit für einen Einsatz als Analysenelemente wird im allgemeinen allenfalls aufgrund einer Aufbewahrung unter Kühlung, Einfrieren, Feuchtigkeitsausschluß etc. aufrechterhalten.

Die US-A-42 60 679 betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung von Hydrogenperoxid. Bei dem dort offenbarten Verfahren wird eine Hydrogenperoxid enthaltende Probe mit einem Färbungsmittel behandelt, das Peroxidase, einen Wasserstoff-Donator und einen Elektronen- oder Radikalakzeptor enthält. Die Reagenzien reagieren stöchiometrisch mit dem Hydrogenperoxid zu einem Farbstoff, der kolorimetrisch ausgemessen wird. Als Wasserstoff- Donatoren sollen sich insbesondere bestimmte substituierte Aniline eignen.

In der US-A-42 51 629 wird ein kolorimetrisches Verfahren zur Hydrogenperoxid-Bestimmung unter anderem bei klinischen Untersuchungen offenbart, bei dem zur Farbbildung Reagenzien, wie 4-Aminoantipyrin, N-substituiertes-3- Alkylanilin und ein wasserstoffperoxidaktivierendes Reagenz, wie Peroxidase, verwendet werden.

In der US-A-42 47 631 wird offenbart, daß 3-Aminobenzolsulfonsäure in einem wäßrigen Medium in Gegenwart von Wasserstoffperoxid mit 4-Aminoantipyrin zu einem Farbstoff reagiert. Sowohl der Farbstoff als auch seine Bildungsreaktion sollen sich in analytischen Verfahren zur Hydrogenperoxid-Bestimmung, insbesondere bei enzymatischen Analysen eignen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Mittels zum Hydrogenperoxid-Nachweis unter Verwendung einer Peroxidase, das eine verbesserte Lagerfähigkeit besitzt, insbesondere in Form eines Filmes.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verhinderung einer Wirksamkeitsabnahme der Peroxidase bei entsprechenden Mitteln, wobei sowohl die Enzymreaktion als auch die Farbbildreaktion zum Hydrogenperoxid- Nachweis nicht nennenswert gestört oder gehemmt werden sollen.

Diese Aufgaben werden bei einem gattungsgemäßen Mittel durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft:

(1) Ein Mittel zum Nachweis von Hydrogenperoxid, enthaltend eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität und eine Substanz, die zur Verursachung einer nachweisbaren Farbänderung in Gegenwart von Hydrogenperoxid und der Substanz mit Peroxidase- Aktivität befähigt ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Pyrogallol-Derivat der nachstehenden Formel (1) enthält, in der
Q¹ eine Nitro-Gruppe, Cyano-Gruppe, Alkyl-Gruppe, substituierte Alkyl-Gruppe, Aryl-Gruppe, substituierte Aryl-Gruppe, Aralkyl-Gruppe, Carboxyl- Gruppe oder eine Gruppe -COOQ² bezeichnet, worin
Q² für eine Alkyl-Gruppe, substituierte Alkyl-Gruppe, Aryl-Gruppe, substituierte Aryl- Gruppe oder eine Aralkyl-Gruppe steht.
(2) Ein Mittel zum Nachweis von Hydrogenperoxid wie in (1) beschrieben, in der die zur Verursachung einer nachweisbaren Farbänderung befähigte Substanz eine Kombination aus einem Wasserstoff-Donator und einem Kuppler ist.
(3) Ein Mittel, wie in (1) oder (2) beschrieben, bei dem sich für die quantitative Analyse die einzelnen Reagenzien des Mittels in einer einem Träger zugeordneten Reagensschicht befinden.
(4) Ein Mittel für die quantitative Analyse wie in (3) beschrieben, in dem die Reagensschicht weiterhin aus einer Farbbildungsreaktionsschicht und einer Farbstoff-Fixierschicht zusammengesetzt ist.
(5) Ein Mittel für die quantitative Analyse wie in (3) oder (4) beschrieben, in dem die Reagensschicht eine einzelne Schicht ist. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind:
(6) Die in (2) beschriebene Zusammensetzung, in der der Wasserstoff-Donator mindestens eine Verbindung ausgewählt aus einem 4-Aminoantipyrin, einem 2-Hydrazinobenzothiazolin, einem p-Halogenophenol und einem N,N-disubstituierten p-Phenylendiamin der Formel (2) ist, in der
R⁵ und R⁶ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Alkyl-Gruppe, Alkoxyalkyl-Gruppe, Hydroxyalkyl-Gruppe, Cyanoalkyl-Gruppe, Halogenoalkyl- Gruppe oder Acylaminoalkyl-Gruppe bezeichnen und
R⁷ für ein Wasserstoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe, Alkoxy- Gruppe oder ein Halogen-Atom steht.
(7) Die in (2) beschriebene Zusammensetzung, in der der Kuppler mindestens eine Verbindung ausgewählt aus einem Naphthol, einem Phenol, einem Pyrazolon und einem N,N-disubstituierten Anilin der Formel (3) ist, in der
R¹ und R² gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe oder eine Alkoxy-Gruppe bezeichnen und
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Alkyl-Gruppe, Alkoxyalkyl-Gruppe, Hydroxyalkyl-Gruppe, Aminoalkyl-Gruppe, Cyanoalkyl- Gruppe, Halogenoalkyl-Gruppe oder eine Acylaminoalkyl-Gruppe bezeichnen.
(8) Die in (6) beschriebene Zusammensetzung, in der der Wasserstoff-Donator 4-Aminoantipyrin ist.
(9) Das in (3), (4) oder (5) beschriebene Mittel für die quantitative Analyse, in dem die Reagensschicht zwischen einem Träger und einer porösen Schicht angebracht ist und die poröse Schicht sich in fließfähiger Berührung mit der Reagensschicht befindet, so daß die beiden Schichten in integrierter Form vorliegen.
(10) Das in (3), (4) oder (5) beschriebene Mittel für die quantitative Analyse, in dem die Zusammensetzung in einem polymeren Bindemittel enthalten ist.
(11) Das in (3), (4) oder (5) beschriebene Mittel für die quantitative Analyse, in dem die Reagensschicht weiterhin ein ein anionisches Polymerisat oder ein kationisches Polymerisat enthaltendes Beizmittel enthält.
(12) Der in (4) beschriebene Film für die quantitative Analyse, in dem die Farbstoff-Fixierschicht weiterhin ein ein anionisches Polymerisat oder ein kationisches Polymerisat enthaltendes polymeres Beizmittel enthält.
(13) Das in (3) beschriebene Mittel für die quantitative Analyse, in dem ein poröser Träger mit der Zusammensetzung imprägniert ist.

Die Abbildungen Fig. 1 bis Fig. 8 zeigen Querschnitte repräsentativer Ausführungsformen des Mittels für die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung. In den Fig. 1 bis Fig. 8 bedeuten die Bezugszahlen:

10: Träger
20: Reagensschicht
21: Farbstoff-Fixierschicht
22: Farbbildungsreaktions-Schicht
23: Mit Reagenzien imprägnierter Träger
31: Poröse Spreitungsschicht
32: Poröse Schicht mit definierter Flächengröße
40: Lichtreflektierende Schicht.

In der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff "Reagensschicht" zur Bezeichnung einer solchen Schicht verwendet, in der ein Analyt in eine mit Hilfe von sichtbarem, nahem UV- oder nahem IR-Licht chemisch nachweisbare Species umgewandelt wird und die grundsätzlich eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität und eine Substanz, die zur Verursachung einer nachweisbaren Veränderung in Gegenwart von Hydrogenperoxid und der Substanz mit Peroxidase-Aktivität befähigt ist, enthält.

Der Begriff "Farbbildungsreaktions-Schicht" bezeichnet eine Schicht, in der ein Analyt in eine chemisch nachweisbare Species umgewandelt wird.

Der Begriff "Farbstoff-Fixierschicht" bezeichnet eine Schicht, die zur Verbesserung der Nachweisbarkeit der chemisch nachweisbaren Species beiträgt.

Die Reagensschicht kann eine Farbbildungsreaktions- und Farbstoff-Fixierschicht sein, wenn diese Reagensschicht aus einer einzigen Schicht besteht; die Reagensschicht kann jedoch auch in mindestens zwei Schichten unterteilt sein, von denen eine eine Farbbildungsreaktions- Schicht und eine andere eine Farbstoff-Fixierschicht ist. Mit anderen Worten können eine Farbbildungsreaktions- Schicht und eine Farbstoff-Fixierschicht auch gemeinsam als "Reagensschicht" bezeichnet werden.

Die chemisch nachweisbare Species ist direkt oder indirekt eine Nachweisgröße für die Anwesenheit und/oder Konzentration eines interessierenden Analyten oder eines Reaktions- oder Zersetzungsproduktes des Analyten.

Der Begriff "Substanz mit Peroxidase-Aktivität" ist so zu verstehen, daß er eine Substanz bezeichnet, die die Oxidation eines Wasserstoff-Donators mit Hydrogenperoxid (als Substrat) katalysiert, und in der Fachwelt wohlbekannt (I. Yamazaki et al, Molecular & Cellular Biochemistry, Band 2(1), Seiten 39-52 (1973)). Die Substanz mit Peroxidase-Aktivität nimmt an der Oxidation eines Wasserstoff-Donators mit Hydrogenperoxid nach dem folgenden Reaktionsschema teil:

Der Begriff "Wasserstoff-Donator" bezeichnet eine Verbindung, die ein Sauerstoff-Akzeptor ist, der im oxydierten Zustand mit einem Kuppler wie einem Naphthol, einem Phenol, einem Pyrazolon oder den N,N-disubstituierten Anilinen der Formel (3) kuppelt. Von diesen Wasserstoff- Donatoren werden die Pyrazolone und die N,N- disubstituierten Aniline der Formel (3) besonders bevorzugt.

Die Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis des Hydrogenperoxids (im folgenden gelegentlich einfach als "Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis" bezeichnet), ist eine Zusammensetzung, die zur Erzeugung einer mit Hilfe von sichtbarem, nahem UV- oder nahem IR-Licht nachweisbaren Verbindung befähigt ist, die als Ergebnis einer chemischen Wechselwirkung in Gegenwart von Hydrogenperoxid gebildet wird (im folgenden als "Farbstoff" bezeichnet). Der Indikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis gemäß der vorliegenden Erfindung kann nicht nur eine von Hydrogenperoxid erzeugte Färbung nachweisen oder dieses quantitativ bestimmen, sondern auch dessen Vorstufen, indem eine Reagens-Zusammensetzung verwendet wird, die zur Erzeugung von Hydrogenperoxid infolge einer chemischen Wechselwirkung mit einer solchen Verbindung befähigt ist, die ihrerseits Hydrogenperoxid bilden kann, erforderlichenfalls in Kombination (im folgenden als "Vorstufe" bezeichnet).

Beispiele für Substanzen mit Peroxidase-Aktivität sind unter anderem Peroxidase, die aus verschiedenartigen Organismen extrahiert wurde, synthetisierte Peroxidase sowie andere, aus Organismen extrahierte chemische Substanzen, die eine Aktivität zeigen, die derjenigen der Peroxidase ähnlich ist, wie sie in der JP-OS 1 37 192/75 offenbart ist. Von diesen wird Peroxidase bevorzugt.

Als Indikator-Zusammensetzungen vom Hydrogenperoxid- Nachweis, die eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität und eine Substanz enthalten, die zur Verursachung einer nachweisbaren Veränderung in Gegenwart von Hydrogenperoxid und der Substanz mit Peroxidase-Aktivität befähigt ist, können in der vorliegenden Erfindung Chromogene, die durch Oxidation ihrer selbst nachweisbare gefärbte Verbindungen liefern, wie Benzidin oder Phenylendiamin, die seit langem bekannt sind, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin, wie in der JP-OS 89 491/76 (entsprechend der US- PS 40 19 747) offenbart ist, Triarylimidazole, wie in der JP-OS 26 188/78 (entsprechend der US-PS 40 19 747) offenbart ist, und ähnliche, eine Kombination aus einem Wasserstoff-Donator und einem Kuppler, die aufgrund einer oxidativen Kupplungsreaktion zwischen beiden eine nachweisbare gefärbte Verbindung liefert, und dergleichen eingesetzt werden.

Als Wasserstoff-Donatoren, die in den Farbindikatoren enthalten sind, können 4-substituierte Antipyrine (4- substituierte 2,3-Dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-one), wie sie in der JP-OS 50 991/74 (entsprechend der US-PS 39 83 005) offenbart wurden, sowie andere bekannte 4- substituierte Antipyrine, N,N-disubstituierte o- oder p-Phenylendiamine, wie sie in der JP-OS 1 37 192/75 (entsprechend der US-PS 38 86 045) offenbart wurden, sowie andere bekannte N,N-disubstituierte o- oder p-Phenylendiamine, 2-Hydrazonobenzothiazoline, wie sie in der JP-OS 20 471/80 offenbart wurden, und andere bekannte 2-Hydrazonobenzothiazoline, p-Halogenophenole, wie sie in der JP-OS 1 48 100/80 offenbart wurden, sowie andere p-Halogenophenole und N,N-disubstituierte Phenylendiamine der vorstehenden Formel (2) eingesetzt werden.

Spezielle Beispiele für einsetzbare 4-substituierte Antipyrine sind (in Klammern ist die CAS-Registriernummer angegeben):

4-Aminoantipyrin (83-07-8),
4-(Dimethylamino)antipyrin (Pyramidon) (58-15-1),
4-Ethylaminoantipyrin (15 166-10-6),
4-Methylaminoantipyrin (Noramidopyrin) (519-98-2),
4-(Natriumsulfonatomethylamino)antipyrin (Sulphamipyrine) (129-89-5),
4-(Natriumsulfonatomethyl)(isobutyl)aminoantipyrin (Dibupyrone) (1046-17-9),
4-(Natriumsulfonatomethyl)(methyl)aminoantipyrin (Methampyrone) (5907-38-0)
und 4-Isopropylantipyrin (Propiphenazon) (479-92-5).

Als andere Verbindungen mit ähnlicher Struktur kommen

4-Amino-2,3-dimethyl-1-p-tolyl-3-pyrazolin-5-on (56 430-10-5)
und 4-Amino-1,3-diphenyl-2-methyl-3-pyrazolin-5-on (52 744-73-7)

in Betracht. Auch

2-Dimethylamino-5-phenyl-2-oxazolin-4-on (Tozalinone) (1046-17-9)

kann verwendet werden.

In den Fällen, in denen ein oder beide Substituenten R⁵ und R⁶ in den durch die Formel (2) dargestellten N,N- disubstituierten p-Phenylendiaminen Alkyl-Gruppen sind, können diese Alkyl-Gruppen geradkettige oder kettenverzweigte niedere Alkyl-Gruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoff- Atomen sein; spezielle Beispiele hierfür sind eine Methyl- Gruppe, Ethyl-Gruppe, Propyl-Gruppe, Butyl-Gruppe, Pentyl-Gruppe, Isopropyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, Isoamyl- Gruppe, t-Butyl-Gruppe und Neopentyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch Alkoxyalkyl-Gruppen besteht die betreffende Alkoxyalkyl-Gruppe aus einer niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine niedere Alkoxy-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff- Atomen substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Methoxymethyl-Gruppe, 2-Methoxyethyl- Gruppe, 1-Methoxyethyl-Gruppe, 3-Methoxypropyl-Gruppe, 2-Methoxypropyl-Gruppe, Ethoxypropyl-Gruppe und 2-Ethoxyethyl- Gruppe. Im Falle einer Substitution durch Hydroxyalkyl- Gruppen besteht die betreffende Hydroxyalkyl- Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Hydroxy-Gruppe substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Hydroxymethyl- Gruppe, 2-Hydroxyethyl-Gruppe, 1-Hydroxyethyl-Gruppe, 3-Hydroxypropyl-Gruppe, 2-Hydroxypropyl-Gruppe, 4-Hydroxybutyl- Gruppe und 5-Hydroxypentyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch eine Cyanoalkyl-Gruppe besteht die betreffende Cyanoalkyl-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Cyano-Gruppe substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Cyanomethyl-Gruppe, 2-Cyanoethyl-Gruppe, 1-Cyanoethyl- Gruppe, 3-Cyanopropyl-Gruppe, 2-Cyanopropyl-Gruppe und 5-Cyanopentyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch eine Halogenoalkyl-Gruppe besteht die betreffende Halogenoalkyl- Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff- Atomen, die durch ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atom als Halogen-Atom substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Fluoromethyl-Gruppe, Chloromethyl- Gruppe, Bromomethyl-Gruppe, 2-Fluoroethyl- Gruppe, 1-Chloroethyl-Gruppe, 2-Chloroethyl-Gruppe, 2-Bromoethyl-Gruppe und 3-Chloropropyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch eine Acylamino-Gruppe besteht die betreffende Acylamino-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Acetamido- Gruppe, Propionamido-Gruppe, Benzamido-Gruppe, Toluamido- Gruppe, Methansulfonamido-Gruppe, Benzolsulfonamido- Gruppe oder Toluolsulfonamido-Gruppe als Acylamino- Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoff-Atomen substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Acetamidomethyl- Gruppe, Propionamidomethyl-Gruppe, Benzamidomethyl- Gruppe, p-Toluamidomethyl-Gruppe, Methansulfonamidomethyl- Gruppe, Ethansulfonamidomethyl-Gruppe, Benzolsulfonamidomethyl- Gruppe, p-Toluolsulfonamidomethyl- Gruppe, 2-Acetamidoethyl-Gruppe, 2-Propionamidoethyl- Gruppe, 2-Benzamidoethyl-Gruppe, 2-p-Toluamidoethyl- Gruppe, 2-Methansulfonamidoethyl-Gruppe, 2-(Ethansulfonamido)ethyl- Gruppe, 2-(Benzolsulfonamido)ethyl-Gruppe, 2-(p-Toluolsulfonamido)ethyl-Gruppe, 3-Acetamidopropyl- Gruppe und 3-Benzamidopropyl-Gruppe.

In dem Fall, in dem die Substituenten R¹ und R² in dem durch die Formel (1) dargestellten N,N-disubstituierten Anilin eine Alkyl-Gruppe oder Alkoxy-Gruppe bezeichnen, sind spezielle Beispiele dafür die gleichen Gruppen, die als spezielle Beispiele für Alkyl- bzw. Alkoxy- Gruppen bei den Substituenten R⁵ und R⁶ des durch die vorerwähnte Formel (2) dargestellten N,N-disubstituierten p-Phenylendiamins angeführt wurden.

In dem Fall, in dem die Substituenten R³ und R⁴ eine Alkyl-Gruppe, Alkoxyalkyl-Gruppe, Hydroxyalkyl-Gruppe, Cyanoalkyl-Gruppe, Halogenoalkyl-Gruppe oder Acylaminoalkyl- Gruppe bezeichnen, sind spezielle Beispiele dafür die gleichen Gruppen die als spezielle Beispiele für Alkyl-, Alkoxyalkyl-, Hydroxyalkyl-, Cyanoalkyl-, Halogenoalkyl- bzw. Acylaminoalkyl-Gruppen bei den vorgenannten Substituenten R⁵ und R⁶ angeführt wurden. In dem Fall, in dem R³ und R⁴ eine Aminoalkyl-Gruppe bezeichnen, besteht die Aminoalkyl-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Amino- Gruppe substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine Aminomethyl-Gruppe, 2-Aminoethyl-Gruppe, 1-Aminoethyl-Gruppe, 3-Aminopropyl-Gruppe und 2-Aminopropyl- Gruppe.

Als Substituenten R¹ und R² bevorzugt werden ein Wasserstoff- Atom, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff- Atomen, eine Alkoxy-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff- Atomen; spezielle Beispiele für die Alkyl-Gruppen sind Methyl, Ethyl und Propyl, und spezielle Beispiele für Alkoxy-Gruppen sind Methoxy und Ethoxy.

Als Substituenten R³ und R⁴ bevorzugt werden eine Alkyl- Gruppe, eine Alkoxyalkyl-Gruppe, eine Hydroxyalkyl- Gruppe, eine Cyanoalkyl-Gruppe und eine Halogenoalkyl- Gruppe; zu den speziellen Beispielen hierfür zählen Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 3-Methoxypropyl, Ethoxymethyl, 2-Ethoxyethyl, Hydroxymethyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, Cyanomethyl, 2-Cyanoethyl, Chloromethyl, 1-Chloroethyl, 2-Chloroethyl, 2-Chloropropyl, 3-Chloropropyl, Bromomethyl, 2-Bromoethyl, Fluoromethyl und 2-Fluoroethyl.

Spezielle Beispiele für die durch die Formel (2) dargestellten N,N-disubstituierten Aniline sind die folgenden Verbindungen:

N,N-Dimethylanilin,
N,N-Diethylanilin,
N-Methyl-N-hydroxymethylanilin,
N-Methyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin,
N-Methyl-N-(2-methoxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-ethoxyethyl)anilin,
N,N-Dimethyl-m-toluidin,
N,N-Diethyl-m-toluidin,
N,N-Bis(hydroxymethyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(2-hydroxypropyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(3-hydroxypropyl)-m-toluidin,
N-Methyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Methyl-N-methoxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-methoxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)-m-toluidin,
N-Cyanomethyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Methyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin,
N-(2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Dimethyl-m-anisidin,
N,N-Diethyl-m-anisidin.

Von diesen Verbindungen sind bevorzugte N,N-disubstituierte Aniline die folgenden:

N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-(2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Dimethyl-m-anisidin,
N,N-Diethyl-m-anisidin.

Kuppler der Phenol-, Naphthyl- und 5-Pyrazolon-Typs, die als Kuppler in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind in der photographischen Technik wohlbekannt und werden beispielsweise in T. H. James, "The Theory of the Photographic Process", 4. Aufl., Kapitel 12, Seiten 335-372, überschrieben "Principles and Chemistry of Color Photography", erschienen bei Macmillan Publishing Co., Inc., New York (1977) beschrieben.

Spezielle Beispiele für solche Kuppler sind nachstehend aufgeführt:

Kuppler des Phenol- und Naphthol-Typs:
  Phenol,
  2,4-Dichlorophenol,
  2,6-Dichlorophenol,
  p-Hydroxybenzoesäure,
  m-Hydroxybenzoesäure,
  o-Bromophenol,
  4,6-Dichloro-o-kresol,
  2,4-Dibromophenol,
  N-Octyl-4-methoxysalicylamid,
  4-Acetamino-N-hydroxyethylsalicylamid,
  α-Naphthol,
  β-Naphthol,
  1,7-Dihydroxynaphthalin,
  N,N-Dimethyl-1-hydroxynaphthamid,
  N-Propyl-1-hydroxynaphthamid,
  1-Naphthol-2-sulfonsäure,
  1,8-Dihydroxynaphthalin-3,6-disulfonsäure,
  1-Naphthol-3-sulfonsäure,
  1-Naphthol-8-sulfonsäure,
  2,3-Dihydroxynaphthalin-6-sulfonsäure,
  p-Hydroxydiphenyl-1,5-dihydroxynaphthalin,
  3,5-Dihydroxynaphthoesäure etc.

Kuppler des 5-Pyrazolon-Typs:
  3-Methyl-1-phenyl-5-pyrazolon,
  3-Methyl-1-(p-sulfophenyl)-5-pyrazolon,
  1,3-Diphenyl-5-pyrazolon,
  3-Acetamino-1-(2′,4′,6′-trichlorophenyl)-5-pyrazolon,   3-Anilino-1-(p-sulfophenyl)-5-pyrazolon.

Der Mechanismus der vorliegenden Erfindung wird zwar noch nicht eindeutig verstanden, jedoch folgendermaßen angenommen:

Es ist bekannt, daß die Oxidationsprodukte bestimmter Verbindungen, insbesondere die Produkte einer Einelektronen- Oxidation stickstoffhaltiger Verbindungen oder dergleichen, Peroxidase inaktivieren; insbesondere besitzt ein Oxidationsprodukt eines Wasserstoff-Donators eine ausgeprägte Inaktivierungswirkung auf Peroxidase. So wurden die verschiedenartigsten Antioxidationsmittel Wasserstoff-Donatoren zugesetzt, um zu versuchen, die Oxidation des betreffenden Wasserstoff-Donators zu verhindern, und es wurde gefunden, daß 1,2-Dihydroxynaphthalin- und Naphthol-Derivaten die Tendenz eigen ist, Peroxidase nicht zu inaktivieren und gleichzeitig auch die Oxidation des Wasserstoff-Donators zu verhindern, und daß unter ihnen Pyrogallol-Derivate eine ausgeprägte Wirkung zeigen.

Unter den Pyrogallol-Derivaten zeigen diejenigen Pyrogallol- Verbindungen, die mit Wasserstoff-Donatoren nicht oxidativ kuppeln, d. h. Pyrogallol-Verbindungen, die einen nicht freisetzbaren Substituenten in ihrer 5-Stellung tragen, eine außerordentlich ausgeprägte Peroxidase-stabilisierende Wirkung.

Es wird angenommen, daß die Wirkung der Peroxidase-Stabilisierung, die durch in der Peroxidase-haltigen Farbindikator- Zusammensetzung zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltene Pyrogallol-Derivate erzielt wird, auf der Verhinderung der Bildung des Oxidationsproduktes - das die Peroxidase inaktiviert - beruht, das infolge der Wechselwirkung zwischen Sauerstoff und Luftfeuchtigkeit, Peroxidase, einem Wasserstoff-Donator und der in der Zusammensetzung enthaltenen Restfeuchtigkeit und dergleichen während der Aufbewahrung der Zusammensetzung gebildet wird. Einzelheiten des Mechanismus, aufgrund dessen Pyrogallol-Derivate eine derart spezifische Wirkung der Verhinderung einer Oxidation zeigen, sind nicht bekannt, jedoch wird vermutet, daß eine dahingehende Spezifität gegeben ist, daß das Oxidationsprodukt des Pyrogallol-Derivats die Peroxidase nicht inaktiviert.

Die Pyrogallol-Derivate, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, stören die kolorimetrische Bestimmung nicht und werden durch die im vorstehenden angegebene Formel (1) bezeichnet. In den Fällen, in denen der Substituent Q¹ eine Alkyl-Gruppe ist, ist die Alkyl-Gruppe geradkettig oder kettenverzweigt und enthält 1 bis 20 Kohlenstoff-Atome; spezielle Beispiele hierfür sind eine Methyl-Gruppe, Ethyl-Gruppe, Propyl-Gruppe, Butyl-Gruppe, Pentyl-Gruppe, Hexyl-Gruppe, Octyl-Gruppe, Nonyl-Gruppe, Decyl-Gruppe, Dodecyl- Gruppe, Octadecyl-Gruppe, Eicosyl-Gruppe, Isopropyl- Gruppe, Isobutyl-Gruppe, Isoamyl-Gruppe, 4-Methylpentyl- Gruppe, 6-Methylheptyl-Gruppe etc.

In den Fällen, in denen der Substituent Q¹ eine substituierte Alkyl-Gruppe darstellt, enthält die Alkyl-Gruppe eine gerade oder verzweigte Kette mit 1 bis 5 Kohlenstoff- Atomen, die mindestens einen Substituenten, bestehend aus Hydroxyl-Gruppen, Cyano-Gruppen und/oder Halogen-Atomen (Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atom) trägt. Spezielle Beispiele für die substituierten Alkyl- Gruppen sind die Gruppen Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 4-Hydroxybutyl, 5-Hydroxypentyl, Cyanomethyl, 2-Cyanoethyl, 1-Cyanoethyl, 3-Cyanopropyl, 5-Cyanopentyl, Fluoromethyl, Chloromethyl, Bromomethyl, 2-Fluoroethyl, 1-Chloroethyl, 2-Chloroethyl, 2-Bromoethyl, 3-Chloropropyl etc.

Die durch den Substituenten Q¹ dargestellte Aryl-Gruppe enthält vorzugsweise 6 bis 14 Kohlenstoff-Atome. Bevorzugte Beispiele für solche Aryl-Gruppen sind die Gruppen Phenyl, 1-Naphthyl, 2-Naphthyl, 2-Indenyl, 4-Biphenyl etc.

Die durch den Substituenten Q¹ dargestellte substituierte Aryl-Gruppe enthält vorzugsweise 6 bis 14 Kohlenstoff- Atome als Aryl-Struktureinheit. Bevorzugte Beispiele für solche substituierten Aryl-Gruppen sind die vorgenannten Aryl-Gruppen, die einen Substituenten wie etwa ein Halogen-Atom (Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atom), eine Cyano-Gruppe, Nitro-Gruppe oder eine geradkettige oder kettenverzweigte Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen tragen. Spezielle Beispiele für solche substituierten Aryl-Gruppen sind die Gruppen p-Fluorophenyl, p-Chlorophenyl, m-Bromophenyl, p-Cyanophenyl, m-Nitrophenyl, p-Tolyl, m-Tolyl, p-Ethylphenyl, m-Cumenyl, Mesityl, 4-Chloro-1-naphthyl, 5-Methylnaphthyl etc.

Die durch den Substituenten Q¹ dargestellte Aralkyl- Gruppe enthält vorzugsweise 7 bis 20 Kohlenstoff-Atome. Spezielle Beispiele für solche Aralkyl-Gruppen sind die Gruppen Benzyl, Phenethyl, 1-Naphthylmethyl, 2-Naphthylmethyl etc.

In den Fällen, in denen der Substituent Q¹ die Gruppe -COOQ² darstellt, worin Q² eine Alkyl-Gruppe, substituierte Alkyl-Gruppe, Aryl-Gruppe, substituierte Aryl- Gruppe oder eine Aralkyl-Gruppe bezeichnet, sind bevorzugte Beispiele für solche Gruppen -COOQ² die gleichen wie auch in den Fällen, in denen der Substituent Q¹ eine Alkyl-Gruppe, substituierte Alkyl-Gruppe, Aryl- Gruppe, substituierte Aryl-Gruppe bzw. eine Aralkyl- Gruppe ist.

Bevorzugte Beispiele für einen Substituenten -COOQ² sind die Gruppen Carboxyl, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Butoxycarbonyl, Pentyloxycarbonyl, Octyloxycarbonyl, Decycloxycarbonyl, Octadecyloxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, Isobutoxycarbonyl, Isoamyloxycarbonyl, 2-Chloroethoxycarbonyl, 3-Chloropropoxycarbonyl, Phenoxycarbonyl, p-Tolyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Phenethyloxycarbonyl, Cyano, Nitro, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Isopropyl, Isobutyl und Isoamyl.

Bevorzugte Beispiele für die Pyrogallol-Derivate sind Gallussäure, Methylgallat, Ethylgallat, Propylgallat, Isopropylgallat, Pentylgallat, Isoamylgallat, Octylgallat, Stearylgallat, b-Chloroethylgallat, Phenylgallat, p-Tolylgallat, Benzylgallat, Phenethylgallat, 5-Cyanopyrogallol, 5-Nitropyrogallol, 5-Methylpyrogallol, 5- Ethylpyrogallol, 5-Propylpyrogallol, 5-Butylpyrogallol, 5-Pentylpyrogallol, 5-Isopropylpyrogallol, 5-Isobutylpyrogallol, 5-Isoamylpyrogallol etc.

Die Farbindikator-Zusammensetzung zum Hydrogenperoxid- Nachweis oder der Film für die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiterhin ein Beizmittel enthalten. Als solche Beizmittel können kationische Polymerisate, wie sie in den JP-OS 40 191/76 (entsprechend der US-PS 40 42 335), 89 796/78 (entsprechend der US-PS 40 69 017) und 1 31 089/78 (entsprechend der US-PS 41 44 306) sowie in "The Theory of the Photographic Process", vgl. vorstehend, Seiten 366-372, beschrieben sind, sowie auch anionische Polymerisate, wie sie im folgenden beschrieben werden, eingesetzt werden. Wenn der in der vorliegenden Erfindung verwendete Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis aufgrund der chemischen Wechselwirkung in Gegenwart von Hydrogenperoxid einen zur Bildung eines Anions befähigten Farbstoff erzeugt, werden kationische Verbindungen wie etwa kationische Polymerisate verwendet; es erübrigt sich festzustellen, daß bei Bildung kationischer Farbstoffe anionische Verbindungen wie etwa anionische Polymerisate verwendet werden. Es erübrigt sich weiter die Feststellung, daß Beizmittel eingesetzt werden, die nicht absorbieren, d. h. die kolorimetrische Analyse nicht stören. Im folgenden wird vorliegende Erfindung hinsichtlich weiterer Einzelheiten in bezug auf solche Fälle beschrieben, in denen ein Beizmittel aus einem anionischen Polymerisat oder ein Beizmittel aus einem kationischen Polymerisat als Beizmittel eingesetzt werden, wobei der Ausdruck "Beizpolymerisat" hier als Sammelbezeichnung für kationische und anionische Polymerisate verwendet wird.

Das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte anionische Polymerisat ist ein Polymerisat, das die im Vorstehenden definierte anionische Gruppierung in dem Polymerengerüst selbst oder in der organischen Gruppe (Org in der folgenden Formel AP)), die an das Polymerengerüst gebunden ist, enthält. Neben den üblichen anionischen Polymerisaten können auch Kationenaustauschharze des Säure-Typs als anionische Polymerisate eingesetzt werden; vorzugsweise sind die üblichen anionischen Polymerisate oder Kationenaustauschharze wasserlösliche Polymere oder solche Polymere, die mit Wasser quellbar sind. Die anionischen Polymerisate können einzeln oder in Form einer Kombination aus zweien oder mehreren verwendet werden. Es können sowohl anionische Polymerisate mit der Fähigkeit zur Filmbildung als auch solche ohne diese Fähigkeit eingesetzt werden, jedoch wird bevorzugt, Polymerisate ohne die Fähigkeit zur Filmbildung in Kombination mit als Bindemitteln wirkenden Polymerisaten einzusetzen, die die Fähigkeit zur Filmbildung besitzen.

Zu speziellen Beispielen für derartige anionische Polymerisate zählen Polymerisate oder Copolymerisate mit einer Struktur, an der eine Carboxylat-Gruppe (-COO^-), eine Sulfonat-Gruppe (-SO₃^-) oder eine Phosphonat-Gruppe (-PO₃^2-) als anionische Atomgruppierung gebunden ist, oder aber die genannte anionische Atomgruppierung ist zusammen mit einem Gegen-Kation an sämtliche der sich wiederholenden Struktureinheiten (im folgenden als "CRU" bezeichnet) der hochmolekularen Kette oder einen Teil der CRU gebunden (wobei die Anordnung eine geordnete oder zufällige sein kann). Gegen-Kationen sind Alkalimetall- Ionen (z. B. Li⁺, Na⁺, K⁺, Cs⁺), Erdalkalimetall- Ionen (z. B. Mg²⁺, Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺) und Ammonium- Ionen (NH₄⁺).

Diese anionischen Polymerisate werden durch die Formel (AP) dargestellt

Org-CB-Z^-A⁺ (AP),

in der Org eine organische Gruppe bezeichnet, die einen Teil des Polymerengerüsts bildet, CB für eine (oder mehrere) chemische Bindung(en) oder eine chemische Gruppe steht, die Z^- mit Org verbindet, Z^- eine Carboxylat- Gruppe (-COO^-), eine Sulfonat-Gruppe (-SO₃^-) oder eine Phosphonat-Gruppe (-PO₃^2-) bezeichnet und A⁺ ein Gegen- Kation wie oben erwähnt ist.

Zu speziellen Beispielen für die anionischen Polymerisate, die die vorgenannten CRU enthalten, zählen die folgenden:

Alkali-Hydrolysate eines Methylvinylether-Maleinsäureanhydrid- Copolymerisats (wobei das Copolymerisat Dilithium-, Dinatrium oder Dikalium-ethylen-1,2-dicarboxylat als CRU enthält);
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer Polyacrylsäure;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines Poly- N-(β-sulfo-α,α-dimethylethyl)acrylamids;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer Polystyrol- p-sulfonsäure;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines Copolymerisats aus Styrol-p-sulfonsäure und einem hydrophilen Vinyl-Monomeren; Beispiele für solche hydrophilen Vinyl-Monomeren sind:

Acrylsäure, Acrylsäure-alkylester (z. B. Methacrylat), Acrylsäure-hydroxyalkylester (z. B. β-Hydroxyethylacrylat), Acrylamide (z. B. Acrylamid, N-Methylacrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-(β-Sulfonato-α,α-dimethylethyl)acrylamid, N-Ethyl-N-isopropyl-acrylamid,

N-Acryloylpiperidin, N-Acryloylpiperadin, N-Acryloylpiperazin), Methacrylsäure-hydroxyalkylester (z. B. β-Hydroxyethyl- methacrylat), Methacrylamide (z. B. Methacrylamid, Methacrylmorpholid);
Alkalimetallsalze einer Polyvinylphosphonsäure der Formel

in der M Lithium, Natrium oder Kalium ist;
Carboxymethylcellulose;
Carboxyethylcellulose;
Alginsäure und ihre Alkalisalze.

Typische Beispiele für bevorzugte anionische Polymerisate sind die folgenden:

Kalium-Polystyrol-p-sulfonat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylmorpholid-Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylamid-Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-Isopropylacrylamid- Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-N-Ethyl-N-isopropylacrylamid- Copolymerisat;
Kalium-Poly-N-(β-sulfonato-α,α-dimethylethyl)acrylamid;
Kalium-N-(β-Sulfonato-α,α-dimethylethyl)acrylamid- β-Hydroxyethylacrylat-Copolymerisat;
Kalium-N-(β-Sulfonato-α,α-dimethylethyl)acrylamid-N- Ethylacrylamid-Copolymerisat.

Von diesen anionischen Polymerisaten werden anionische Polymere des Polystyrol-Typs (bei denen in der Formel (AP) CB eine Phenylen-Gruppe darstellt) besonders bevorzugt.

Das anionische Polymerisat kann in eine Schicht, die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthält, eingearbeitet werden, oder eine Farbstoff- Fixierschicht, die das anionische Polymerisat - jedoch keinen anderen Reagens-Bestandteil - enthält, kann auch in Form einer getrennten Schicht von derjenigen Schicht, die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthält, eingesetzt werden. Weiterhin kann das anionische Polymerisat auch sowohl in eine den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende Schicht als auch in die Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet werden. Das anionische Polymerisat kann auch, falls erwünscht oder erforderlich, als eine Kombination zweier oder mehrerer Schichten eingesetzt werden, obwohl nur eine solche im allgemeinen ausreichend ist.

In dem Falle, in dem das anionische Polymerisat sowohl in die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende Schicht als auch in die Farbstoff- Fixierschicht eingearbeitet ist, können die betreffenden anionischen Polymerisate gleich oder voneinander verschieden sein. Weiterhin kann das anionische Polymerisat, falls dies erwünscht oder nötig ist, auch in eine andere Schicht als eine den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende Schicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet werden.

Manche oder sämtliche der den Farbindikator zum Hydrogenperoxid- Nachweis und das Beizpolymerisat enthaltenden Reagensschichten, eine den Farbindikator zum Hydrogenperoxid- Nachweis enthaltende Farbreaktions-Schicht und die das Beizpolymerisat enthaltende Farbstoff- Fixierschicht des Films für die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung können ein Bindemittel- Polymerisat enthalten. Als Bindemittel-Polymerisate können bekannte hydrophile Polymerisate wie Gelatine, Casein, Agarose, Stärke, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyethylenglycol etc. eingesetzt werden, und übliche Härter (Härtungsmittel oder Vernetzungsmittel) können ebenfalls zusammen mit diesen hydrophilen Polymeren verwendet werden.

Die Reagensschicht, die Farbbildungsreaktions-Schicht oder die Farbstoff-Fixierschicht werden entweder durch Dispergieren oder Auflösen einer Mischung des Farbindikators zum Hydrogenperoxid-Nachweis und des Beizpolymerisats bzw. des Farbindikators zum Hydrogenperoxid- Nachweis und des anionischen Polymerisats jeweils für sich in einem Bindemittel-Polymerisat und anschließendes Beschichten eines Trägers mit der Dispersion oder Lösung mittels eines üblichen Beschichtungsverfahrens und nachfolgende Trocknung hergestellt, oder aber durch Imprägnieren der Oberfläche oder des Inneren eines porösen Trägers mit mit der betreffenden Dispersion oder Lösung. Wenn die Reagensschicht, Farbbildungsreaktions- Schicht oder Farbstoff-Fixierschicht durch Beschichten auf einen Träger aufgetragen wird, liegt die Schichtdicke jeder Schicht im Bereich von 1 µm bis 100 µm, vorzugsweise von 2 µm bis 50 µm. Wenn die Farbstoff- Fixierschicht nur aus dem Beizpolymerisat, frei von einem Bindemittel-Polymerisat, besteht, liegt die Schichtdicke im Bereich von 1 µm bis 50 µm, vorzugsweise von 3 µm bis 30 µm.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert, die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.

Fig. 1 zeigt einen Film für die quantitative Analyse, der aus einem mit dem Reagens imprägnierten Träger 23 besteht, der durch Imprägnieren der Oberfläche und des Inneren eines selbsttragenden porösen Trägers mit einer den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltenden Reagens-Zusammensetzung erhalten wurde.

Als selbsttragende poröse Träger können bekannte Film-, folien- oder blattartige Träger wie Filterpapier, gewöhnliches Papier, Vliestuch, Membranfilter, poröse Kunststoffolie etc. eingesetzt werden. Wenn der Film für die quantitative Analyse mit einem Diapositiv-Rahmen eingefaßt werden soll, wie dies in den JP-OS 1 56 079/79 und 1 60 296/79, der JP-GBM-Anmeldung 41 787/80 und der JP-Patentanmeldung 1 31 800/80 etc. offenbart wurde, können neben den obengenannten Materialien auch biegsame Materialien wie Textilstoffe als poröse Träger verwendet werden. Ein derartiger Film für die quantitative Analyse kann in der Weise verwendet werden, daß er an einem film-, folien- oder blattartigen Träger unter Verwendung eines Heißschmelzklebers oder eines Klebebandes haftend befestigt wird, und die Schichtstruktur ist in diesem Falle ähnlich derjenigen eines in Fig. 2 dargestellten Films für die quantitative Analyse, wie er im Folgenden beschrieben wird.

Fig. 2 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer solchen Struktur, bei der die Reagensschicht 20, die den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und das Beizpolymerisat enthält, auf einem film-, folien- oder blattartigen Träger 10 vorliegt. Der Träger 10 kann entweder durchsichtig oder lichtundurchlässig sein.

Fig. 3 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer solchen Struktur, bei der die Farbstoff- Fixierschicht 21, die das Beizpolymerisat enthält, und die Farbbildungsreaktions-Schicht 22, die den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthält, in dieser Reihenfolge auf einen film-, folien- oder blattartigen Träger aufgebracht vorliegen. Der Träger kann entweder durchsichtig oder lichtundurchlässig sein, ist jedoch vorzugsweise ein durchsichtiger Träger.

Bei den Filmen für die quantitative Analyse, wie sie in den Fig. 4 bis 8 dargestellt sind, werden eine Reagensschicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht zwischen einem Träger und einer porösen Schicht aufgebracht, und die poröse Schicht wird in fließfähige Berührung (die Definition dieses Begriffs wird in der im Vorstehenden erwähnten JP-OS 40 191/76, der EPC-Anmeldung 00 13 156 etc. gegeben, d. h. eine Berührungsform, bei der die Substanzen die Eigenschaft, nach Art von Fluiden, ob flüssig oder gasförmig, besitzen, von jeweils einer Schicht in die andere überzutreten) mit der Reagensschicht, der Farbbildungs- Schicht, der Farbstoff-Fixierschicht gebracht; vorzugsweise besitzt der Analysenfilm eine solche Struktur, daß diese Schichten in Form einer Einheit oder integriert aneinander haften.

Die poröse Schicht wird in Form einer porösen Spreitungsschicht (porous spreading layer) oder einer porösen Schicht definierter Fläche (definite area porous layer) eingesetzt, die die nachstehende Funktion besitzen: Wenn eine flüssige Probe aufgetüpfelt wird, wird diese Flüssigkeitsprobe einer darunterliegenden Schicht zugeführt, und die Funktion besteht vorzugsweise darin, daß die Menge der Flüssigkeitsprobe pro Flächeneinheit annähernd konstant gehalten wird (im Falle der porösen Spreitungsschicht), oder daß sie bis auf die gleiche Fläche ihrer Form ausgebreitet wird und dadurch die Menge der Flüssigkeitsprobe pro Flächeneinheit annähernd konstant gehalten wird (im Falle der porösen Schicht mit definierter Fläche), wobei in beiden Fällen die Flüssigkeitsprobe einer darunterliegenden Schicht zugeführt wird. Im einzelnen wird die Fläche der porösen Schicht so festgelegt, daß die Menge einer in der porösen Schicht gehaltenen Flüssigkeitsprobe durch die definierte Fläche festgelegt wird, und die auf diese Weise festgelegte Menge der Flüssigkeitsprobe wird, in der gleichen Menge und auf der gleichen Fläche wie in der porösen Schicht, auf die darunter befindliche Schicht (gewöhnlich einer Reagensschicht) übertragen, da eine mögliche Ausdehnung der porösen Schicht infolge des Gehalts der Flüssigkeitsprobe in Richtung ihrer Breite, im Vergleich zu ihrer Dicke, vernachlässigbar ist.

Es genügt, wenn die poröse Schicht Leerräume besitzt, um den Transport der Flüssigkeitsprobe zu ermöglichen, jedoch wird im allgemeinen bevorzugt, daß das Leerraum- Volumen der porösen Schicht in einem Bereich von etwa 30% bis etwa 85% liegt. Das Leerraum-Volumen kann mittels einer von Chalkley, Journal of the National Cancer Institute 4, S. 47 (1943), beschriebenen Arbeitsweise berechnet werden und durch direkte Wägung und Bestimmung des Verhältnisses des tatsächlichen Gewichts der betreffenden Struktur und des Gewichts eines gleichen Volumens des kompakten festen Stoffes.

Fig. 4 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer Struktur, die aus einem film-, folien- oder blattartigen Träger 10 besteht, auf den, in dieser Reihenfolge, die den Farbindikator zum Hydrogenperoxid- Nachweis und das Beizpolymerisat enthaltende Reagensschicht 20 und die poröse Spreitungsschicht 31 aufgebracht sind.

Fig. 5 zeigt einen Film für die quantitative Analyse, der aus einem film-, folien- oder blattartigen Träger 10 besteht, auf den, in dieser Reihenfolge, die das Beizpolymerisat enthaltende Farbstoff-Fixierschicht 21, die den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Farbbildungsreaktions-Schicht 22, eine lichtreflektierende Schicht 40 und die poröse Spreitungsschicht 31 aufgebracht sind.

Als poröse Spreitungsschicht des in Fig. 4 oder Fig. 5 dargestellten Films für die quantitative Analyse können verschiedenartig aufgebaute poröse Schichten Verwendung finden, so eine poröse Schicht, in der in einem als Bindemittel wirkenden Polymerisat feinteilige poröse Pulver wie allgemein sogenannte "Trübpolymerisate" (blush polymers, Membranfilter), wie sie in der JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158) offenbart sind, Diatomeenerde, mikrokristalline Stoffe (z. B. mikrokristalline Cellulose wie "Avicel", Handelsbezeichnung der FMC Corporation) dispergiert sind, poröse Aggregate, die dadurch gebildet werden, daß man kleine kugelförmige Perlen aus Glas oder Polymeren dazu bringt, in Punkt-zu-Punkt-Berührung aneinander zu haften, eine nicht-faserförmige isotrope poröse Schicht wie eine aggregierte dreidimensionale Teilchen-Gitterstruktur, die dadurch gebildet wird, daß man kleine kugelförmige Teilchen aus in Wasser nicht-quellbaren organischen Polymerisaten unter Verwendung eines wasserunlöslichen Klebstoffs dazu bringt, in Punkt-zu- Punkt-Berührung aneinander zu haften etc., wie sie in der JP-OS 90 589/80 (US-PS 42 58 001) offenbart wurde, eine faserförmige anisotrope Schicht aus hydrophil gemachten Textilstoffen, wie sie in der JP-OS 1 64 356/80 (US-PS 42 92 272) offenbart wurde, Textilstoffe, die auf physikalischem Wege hydrophil gemacht wurden (z. B. durch Glimmentladung, Plasma-Behandlung, Corona-Entladung, Ultraviolett-Bestrahlung, Flammenbehandlung etc., wie sie in der JP-OS 1 40 532/80 offenbart wurden, Filterpapier etc.

Das Aufbringen einer nicht-faserförmigen isotropen porösen Schicht als poröse Spreitungsschicht auf die Reagensschicht 20 oder die lichtreflektierende Schicht 40 kann mittels einer Arbeitsweise erfolgen, wie sie in den obenerwähnten JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158) und 90 589/80 (entsprechend der US-PS 42 58 001) etc. beschrieben wurde, oder das Aufbringen der faserförmigen anisotropen porösen Spreitungsschicht auf die Reagensschicht 20 oder die lichtreflektierende Schicht 40 kann mittels einer Arbeitsweise erfolgen, wie sie in der obenerwähnten JP-OS 1 64 356/80 und der genannten JP-Patentanmeldung 1 40 532/80 beschrieben wurde.

Die poröse Schicht mit definierter Fläche kann unter Verwendung von Materialien (z. B. Textilstoffen, Papier, Membranfilter) und mittels der Arbeitsweise hergestellt werden, die für die poröse Schicht in der JP- GBM-Anmeldung 1 20 299/80 offenbart wurden. Als Materialien für die poröse Schicht mit definierter Fläche können die gleichen Materialien wie für die poröse Spreitungsschicht verwendet werden, und darüber hinaus kann jedes Material verwendet werden, dessen Inneres porös ist und eine Flüssigkeit wie etwa Wasser zurückhalten kann und dessen Poren sich durchgehend von der einen Hauptoberfläche zu der anderen Hauptoberfläche hin erstrecken. Das Aufbringen der porösen Schicht mit definierter Fläche auf eine Reagensschicht, eine lichtreflektierende Schicht oder dergleichen kann mittels des Verfahrens erfolgen, das in der JP-GBM-Anmeldung 1 20 299/80 offenbart wurde, oder mittels des oben beschriebenen Verfahrens zum Aufbringen der porösen Spreitungsschicht.

Als lichtreflektierende Schicht 40 (Dicke 2 bis 15 µm) können verschiedene Schichten eingesetzt werden, so etwa eine Schicht, in der in einem hydrophilen Bindemittel- Polymerisat ein oder mehrere weiße Pigmente wie feinteiliges Titandioxid-Pulver, feinteiliges Bariumsulfat- Pulver oder dergleichen dispergiert sind, wie sie in den JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158), 40 191/76, 1 64 356/80 (entsprechend der US-PS 42 92 272) etc. offenbart wurde, eine Trübpolymerisat-Schicht (Membranfilter), in der ein oder mehrere weiße Pigmente wie feinteiliges Titandioxid, feinteiliges Bariumsulfat oder dergleichen dispergiert sind, wie sie in der JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158) etc. offenbart wurde, eine Trübpolymerisat-Schicht, wie sie in der JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158) etc. offenbart wurde, eine wasserdurchlässige, aus einer porösen Metallschicht bestehende Schicht, wie sie in der JP-OS 26 428/80 offenbart wurde, oder eine wasserdurchlässige, ein oder mehrere Metallpulver enthaltende Schicht, wie sie in der JP-OS 26 429/80 etc. offenbart wurde; die Arbeitsweisen zur Herstellung dieser Schichten können den Verfahren entsprechen, die in den vorgenannten Veröffentlichungen beschrieben wurden.

Fig. 6 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer Struktur, die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge, die den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Farbbildungsreaktions-Schicht 22, die das Beizpolymerisat enthaltende Farbstoff-Fixierschicht 21, die lichtreflektierende Schicht 40 und die poröse Spreitungsschicht 31 umfaßt, wobei in dieser Struktur die relative Lage der Farbbildungsreaktions-Schicht zu einer Farbstoff-Fixierschicht umgekehrt ist wie dies in dem Fig. 5 dargestellten Film für die quantitative Analyse. Die relative Lage dieser beiden Schichten zueinander ist frei wählbar, wobei jedoch nicht eine solche kationische Verbindung verwendet werden sollte, die in dem Wellenlängenbereich, im allgemeinen von etwa 400 bis etwa 700 nm, absorbiert, in dem der von dem Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis gebildete kationische Farbstoff absorbiert, und die die kolorimetrische Analyse stört. Dementsprechend ist die relative Lage der Schichten in dem Falle von Bedeutung, in dem es erwünscht ist, daß die Farbbildungsreaktions-Schicht als untere Schicht vorliegt, so daß sie nicht mit der Luft in Berührung gelangt, z. B. wenn ein Bestandteil des Farbindikators zum Hydrogenperoxid-Nachweis durch Luft etc. oxydiert werden könnte.

Fig. 7 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer Struktur, die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge, die das Beizpolymerisat enthaltende Farbstoff-Fixierschicht 21, die den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Farbbildungsreaktions-Schicht 22, sowie weiterhin darauf, eine poröse Schicht 32, die porös ist und eine definierte Flächengröße besitzt, umfaßt; diese definierte Fläche ist so bemessen, daß ihr eine Flüssigkeitsprobe in einer Menge zugeführt werden kann, die größer ist als die Wassermenge, die in der porösen Schicht gehalten und in die Farbbildungsreaktions-Schicht 22, die sich in enger Berührung mit der porösen Schicht 32 definierter Fläche befindet, auf der gleichen Breite, wie sie die Schicht 32 besitzt, überführt werden kann. Ein Film für die quantitative Analyse mit einer porösen Schicht definierter Fläche ist für die Analyse des Hydrogenperoxid-Gehalts einer flüssigen wäßrigen Probe besonders geeignet, wenn diese nur eine kleine Menge Hydrogenperoxid enthält. Zwischen der Farbbildungsreaktions-Schicht und der porösen Schicht mit definierter Fläche kann eine lichtreflektierende Schicht angebracht sein. Weiterhin kann die relative Lage der Farbbildungsreaktions-Schicht und der Farbstoff-Fixierschicht zueinander umgekehrt werden (wie im Falle des in Fig. 6 dargestellten Films für die quantitative Analyse).

Fig. 8 zeigt einen Film für die quantitative Analyse mit einer Struktur, die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge, die den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und das Beizpolymerisat enthaltende Reagens-Schicht 20, die lichtreflektierende Schicht 40 und die poröse Schicht 32 definierter Flächengröße umfaßt. In den Fig. 7 und 8 ist die poröse Schicht definierter Flächengröße so dargestellt, daß sie kleiner ist als die übrigen Schichten. Es ist jedoch ausreichend, wenn die Schicht definierter Flächengröße nach Form und Größe so beschaffen ist, daß sie nicht größer als die Farbbildungsreaktions-Schicht oder die Reagensschicht ist; dementsprechend kann die poröse Schicht definierter Flächengröße die gleiche Form und Größe wie die Farbbildungsreaktions-Schicht und die Reagensschicht besitzen, wie in Fig. 8 dargestellt ist.

Als Träger können für die Filme für die quantitative Analyse, wie sie in den Fig. 2 bis 8 dargestellt sind, Filme oder Folien aus einer Vielzahl von Polymerisaten verwendet werden, wie etwa Polyethylenterephthalat, Celluloseester (Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetat-propionat etc.), Polycarbonate (Polycarbonate des Bisphenols A etc.), Polymethylmethacrylat, Polystyrol etc.; die Dicke dieser Folien beträgt etwa 25 µm bis 0,3 mm, vorzugsweise etwa 50 µm bis etwa 0,2 mm.

Träger, die farblos und durchsichtig sind oder für Licht der betreffenden Wellenlängen durchlässig sind, bei denen der aus dem Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis gebildete kationische Farbstoff absorbiert, können verwendet werden. Außerdem können auch Träger verwendet werden, die durch Einarbeiten von Pigmenten (z. B. feinteiliges Titandioxid-Pulver, feinteiliges Bariumsulfat-Pulver, feinteiliges Zinkoxid-Pulver, Ruß etc.) licht-blockierend gemacht worden sind. Wenn licht-blockierende Träger verwendet werden, kann die kolorimetrische Messung durchgeführt werden, nachdem der Träger im Anschluß an die kolorimetrische Bestimmung des von der trägerfreien Seite reflektierten Lichts abgestreift und entfernt wurde. Die Verwendung eines licht-blockierenden Trägers ist von Vorteil in denjenigen Fällen, in denen Reagensbestandteile, die der Gefahr unterliegen, durch Licht zersetzt zu werden, in eine Reagensschicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet sind.

Die Reagensschicht, die Farbbildungsreaktions-Schicht oder die Farbstoff-Fixierschicht des Films für die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung können eine Analyt-Komponente, die von Hydrogenperoxid verschieden ist (im folgenden als "Analyt-Vorstufenkomponente" bezeichnet), und ein System einer Reagens-Zusammensetzung enthalten, das zur Bildung von Hydrogenperoxid durch eine chemische Reaktion befähigt ist (im folgenden als "Hydrogenperoxid-bildendes Reagenssystem" bezeichnet). Alternativ hierzu kann getrennt von der Reagensschicht, der Farbbildungsreaktions-Schicht oder der Farbstoff-Fixierschicht eine das Hydrogenperoxid-bildende Reagenssystem enthaltende Reagensschicht (im folgenden als "Hydrogenperoxid-bildende Reagensschicht" bezeichnet) vorgesehen werden. Die Hydrogenperoxid-bildende Reagensschicht kann aus einem beliebigen System einer Reagens-Zusammensetzung bestehen, in dem Hydrogenperoxid aus der Analyt-Vorstufenkomponente in einer einstufigen chemischen Reaktion gebildet wird, oder aus einem solchen System, in dem Hydrogenperoxid aus der Analyt-Vorstufenkomponente durch eine mehrstufige, kontinuierliche Enzymreaktionen umfassende chemische Reaktionsfolge gebildet wird, z. B.

Je nach Art des Hydrogenperoxid-bildenden Reagenssytems kann dieses in die Reagensschicht, in die Farbbildungsreaktions-Schicht oder in die Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet sein, oder aber es kann in Form einer oder mehrerer, von den vorerwähnten Schichten verschiedenen Hydrogenperoxid-bildenden Reagensschicht(en) eingesetzt werden. Solche Verfahrensweisen sind Fachleuten wohlbekannt.

Zu Beispielen für Analyt-Vorstufenkomponenten und Hydrogenperoxid-bildenden Reagenssystemen zählt ein System, das Cholesterinester und Cholesterin (als Analyt-Vorstufen) und Cholesterinsterase und Cholesterinoxidase (als Hydrogenperoxid-bildendes Reagenssystem) enthält, wie es in den JP-OS 137 192/75 (entsprechend der US-PS 39 83 005), 131 588/75 (entsprechend der US-PS 38 69 349) und 124 499/80 (entsprechend der US-PS 42 69 938) offenbart wurde; weitere Beispiele (Analyt-Vorstufe - Hydrogenperoxid-bildendes Reagenssystem) sind ein Glucose-Glucoseoxidase enthaltendes System, wie es in den JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158), 40 191/76 (entsprechend der US-PS 40 42 335), 124 499/80 (entsprechend der US-PS 42 69 938) und 164 356/80 offenbart wurde, ein Glycerin, Triglyceride - Lipase, Glycerin-Kinase, α-Glycerophosphat-Oxidase etc. enthaltendes System, wie es in den JP-OS 24 892/78 (entsprechend der US-PS 42 41 178), 24 893/78 und 26 382/78 (entsprechend der US-PS 41 79 334) offenbart wurde, ein Milchsäure-Salze und Milchsäure - Lactat-Dehydrogenase und Lactat-Oxidase enthaltendes System, wie es in den JP-OS 105 292/78, 73 096/79 (entsprechend der US-PS 41 84 923) etc. offenbart wurde, ein Urikase und ein Hydrogenperoxid-bildendes Reagens, das eine der vorgenannnten Substanzen enthält oder zur Reaktion mit ihr befähigt ist, enthaltendes System, wie es in der US-PS 40 62 731 und den JP-OS 50 393/79 (entsprechend der US-PS 42 83 491), 124 499/80 (entsprechend der US-PS 42 69 938) etc. offenbart wurde. Es erübrigt sich festzustellen, daß die Analyt-Vorstufenkomponenten und Hydrogenperoxid-bildenden Reagenssysteme nicht auf die vorgenannten beschränkt sind und daß andere Hydrogenperoxid-bildende Reagenssysteme für entsprechende Analyt-Vorstufenkomponenten ebenfalls eingesetzt werden können.

In den Fällen, in denen der Film für die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich der in den Fig. 2 bis 8 dargestellten Ausführungsformen, aus einer mehrschichtigen Verbundstoff-Struktur besteht, können zur Herstellung derselben die Verfahren eingesetzt werden, die in den vorerwähnten JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158), 40 191/76 (entsprechend der US-PS 40 42 335), 90 859/80 (entsprechend der US-PS 42 58 001) und 164 356/80, der JP-Patentanmeldung 140 352/80, den JP-OS 26 428/80 und 26 429/80, der JP-GBM-Anmeldung 120 299/80 etc. beschrieben wurden. Andernfalls kann der Film für die quantitative Analyse auch mit Hilfe der verschiedenen Beschichtungsverfahren hergestellt werden, die zur Herstellung gebräuchlicher lichtempfindlicher Materialien für die Farbphotographie oder lichtempfindlicher Materialien für die Schwarzweiß- oder Color-Sofortbildphotographie eingeführt sind, wobei diese Verfahren als solche oder mit geringfügigen Abänderungen eingesetzt werden.

Ein Verfahren zur quantitativen analytischen Bestimmung von Hydrogenperoxid unter Verwendung des Films für die quantitative Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachstehend erläutert. Die Arbeitsgänge der quantitativen Analyse mit dem hierfür vorgesehenen Film gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen das Auftropfen einer zu untersuchenden flüssigen Probe auf den Film für die quantitative Analyse, die Messung der optischen Dichte einer auf der Farbstoff-Fixierschicht gebildeten Färbung sowie, je nach Bedarf, eine Inkubation nach dem Auftropfen. Das Auftropfen und die Inkubation einer zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe können unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden (im allgemeinen bei Temperaturen von etwa 15°C bis etwa 40°C während Zeitspannen von 2 bis 20 min), wobei Geräte zum Auftropfen und Meßgeräte wie bei den Verfahren verwendet werden, die in den vorgenannten PS oder den JP-OS 81 292/78 (entsprechend der US-PS 42 24 032), 76 044/78 (entsprechend der US-PS 41 19 381) und 76 095/78 (entsprechend der US-PS 41 52 390), der JP-Patentanmeldung 154 313/79, den JP-GBM-Anmeldungen 45 527/80 und 103 204/80 etc. offenbart wurden. Bei Einsatz von Filmen für die quantitative Analyse mit solchen Strukturen, wie sie in Fig. 4 bis 8 dargestellt sind, kann die quantitative Analyse mit außerordentlich hoher Genauigkeit in der Weise durchgeführt werden, daß eine Spurenmenge einer Flüssigkeitsprobe im Bereich von 5 µl bis 50 µl aufgetropft wird. Wenn andererseits die in den Fig. 1 bis 3 dargestellten Filme für die quantitative Analyse verwendet werden, kann die quantitative Analyse in der Weise durchgeführt werden, daß die Filme für die quantitative Analyse in eine zu untersuchende Probe eingetaucht, wieder aus ihr entfernt, erforderlichenfalls inkubiert und anschließend der kolorimetrischen Messung unterzogen werden. In diesem Fall können Geräte für die kolorimetrische Analyse verwendet werden, wie sie in den JP-OS 82 685/76 und 144 293/76, der JP-GBM-Anmeldung 134 381/77 etc. offenbart sind.

Im Anschluß an die vorstehende allgemeine Beschreibung wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Eine Lösung nachstehender Zusammensetzung für eine Farbstoff-Fixierschicht wurde auf einen als photographischer Film dienenden farblosen transparenten PET-Film mit einer Dicke von 180 µm aufgetragen, so daß die Dicke der trockenen Schicht 5 µm betrug, und danach getrocknet, wodurch die Farbstoff-Fixierschicht erhalten wurde.

Danach wurde eine Beschichtungslösung der nachstehenden Zusammensetzung für eine Reagensschicht auf die Farbstoff-Fixierschicht aufgetragen, so daß die Dicke der trockenen Schicht 10 µm betrug, und getrocknet, wodurch die Reagensschicht erhalten wurde.

Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die Reagensschicht:
N,N-Bis-(β-hydroxyethyl)-m-toluidin\|100 mg
4-Aminoantipyrin-hydrochlorid	120 mg
Propylgallat	50 g
Gelatine	3,2 g
Oberflächenaktives Mittel 10 G^R	100 mg
Peroxidase	1100 Einheiten
Wasser	15 ml

Auf den so hergestellten mehrschichtigen Film wurde ein Membranfilter (Fuji Microfilter-500^R, hergestellt von der Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan) aus Cellulosetriacetat, das feinteiliges Titandioxid enthielt, mittels Naßpressens (nachdem die Reagensschicht mit einer kleineren Menge des Wassers gleichmäßig feucht gemacht worden ist, wurde der Membranfilter unter leichterem Druck abgepreßt) auflaminiert, wodurch ein aus mehreren Schichten zusammengesetzter Analysenfilm (E 1) zum Hydrogenperoxid-Nachweis gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.

Dieser Film wurde in Stücke mit einer Flächengröße von 0,5 cm² zerschnitten. Auf das auf der Oberseite befindliche Membranfilter wurden jeweils 8 µl wäßriger Hydrogenperoxid-Lösungen verschiedener Konzentrationen, die nach einem Standardverfahren hergestellt worden waren, aufgetropft, und danach wurde 5 min bei 30°C inkubiert. Die optischen Dichten der dabei gebildeten Färbungen wurden als optische Reflexionsdichten gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.

Tabelle 1
Hydrogenperoxid-Konzentration einer wäßrigen Lösung der Substanz (mol/l)
Optische Reflexionsdichte (gemessen durch ein Grünfilter)
0 (Blindprobe)
0,17
10⁻³	1,50
5 × 10⁻³	2,20
10⁻²	2,80

Vergleichsbeispiel 1

Ein mehrschichtiger Film für die quantitative Analyse (C 1) zum Hydrogenperoxid-Nachweis wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß hierbei in der Beschichtungslösung für die Reagensschicht, bei sonst gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1, das Propylgallat fortgelassen wurde.

Unter Verwendung wäßriger Hydrogenperoxid-Lösungen wurden auf den Filmen für die quantitative Analyse (E 1) und (C 1) in ähnlicher Weise Färbungen gebildet. Die optischen Dichten dieser Färbungen waren fast gleich. Im einzelnen betrugen die optischen Dichten bei Verwendung von 8 µl einer wäßrigen Lösung mit 10⁻² mol/l Hydrogenperoxid bei Messung durch ein Grünfilter für den Analysenfilm (E 1) 2,80 bzw. für den Analysenfilm (C 1) 2,83.

Die Filme für die quantitative Analyse (E 1) und (C 1) wurden anschließend Prüfungen einer forcierten Wertminderung mit der Zeit unterworfen, und zwar unter folgenden Bedingungen:

(a) Trockenlagerung bei 45°C:
Hierzu wurden die Analysenfilme in einem dicht verschlossenen Behälter gelagert, in dem eine ausreichende Menge Trockenmittel (Silicagel-Pulver) vorhanden war.
(b) Lagerung bei 25°C und 50% relativer Feuchtigkeit.

Nach Verstreichen gewisser Zeitabstände wurden auf den Analysenfilmen durch Auftropfen einer wäßrigen Lösung mit 10⁻² mol/l Hydrogenperoxid wie oben beschrieben Färbungen erzeugt. Die (durch ein Grünfilter) beobachteten optischen Reflexionsdichten nach Einwirkung des Tests der forcierten Wertminderung werden angegeben als prozentuale Anteile der Werte der optischen Reflexionsdichten dre frischen Filme vor Testbeginn und sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.

Tabelle 2

Optische Reflexionsdichte (frisch) und Anteile der Reflexionsdichte nach forcierter Trockenlagerung bei 45°C:

Tabelle 3

Optische Reflexionsdichte (frisch) und Anteile der Reflexionsdichte nach forcierter Lagerung bei 25°C und 50% relativer Feuchtigkeit:

Wie aus den in den Tabellen angegebenen Ergebnissen zu ersehen ist, zeigten die Analysenfilme gemäß der vorliegenden Erfindung auch nach dem Wertminderungstest noch eine ausgezeichnete Farbbildung.

Beispiel 2

Ein Film für die quantitative Analyse zum Hydrogenperoxid-Nachweis wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit der Abänderung, daß die verschiedenen, in Tabelle 4 aufgeführten Antioxidationsmittel an Stelle des Propylgallats eingearbeitet wurden. Mit den auf diese Weise hergestellten Analysenfilmen wurde der Test der forcierten thermischen Trockenlagerung bei 45°C durchgeführt. Die Auswertung erfolgte wie in Beispiel 1. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt, wobei die Bewertungssymbole folgende Bedeutungen haben:

○: außerordentlich geringe Verminderung der optischen Reflexionsdichte (vorliegende Erfindung);
s: geringe Verminderung der optischen Reflexionsdichte (vorliegende Erfindung);
×: schwerwiegende Verminderung der optischen Reflexionsdichte, d. h. praktischer Einsatz unmöglich (Vergleichsverbindungen).

Tabelle 4

Wirkung verschiedener Antioxidationsmittel auf die Verhinderung einer Abnahme der POD-Aktivität

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu entnehmen, daß Pyrogallol-Derivate in wirksamer Weise eine Abnahme der POD-Aktivität verhindern.

Beispiel 3

Ein mehrere Schichten umfassender Film für die Analyse von Glucose wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, jedoch mit der Abänderung, daß Isobutylgallat an Stelle des Propylgallats in der Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die Reagensschicht des Beispiels 1 verwendet und außerdem noch 1500 Einheiten Glucoseoxidase in diese eingearbeitet wurden.

Dieser Analysenfilm wurde in Quadrate von 1,5 cm × 1,5 cm zerschnitten. Auf die Membranfilter-Schicht (poröse Spreitungsschicht) dieses Analysenfilms wurden je 10 µl eines im Handel erhältlichen Kontrollserums, das durch Zusatz von Glucose zu diesem Serum auf Glucose-Gehalte von 100, 200, 300 bzw. 500 mg/dl eingestellt worden war aufgetropft, und anschließend wurde zur Bildung der Färbung 5 min bei 37°C inkubiert.

Bei Verwendung von 50 mg Isobutylgallat wurden die in der nachstehenden Tabelle 5 aufgeführten Ergebnisse erhalten.

Tabelle 5
Wäßrige Glucose-Lösung einer Konzentration
Optische Reflexionsdichte (gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm)
100
0,73
200	1,14
300	1,48
500	1,97

Dieser Analysenfilm wurde anschließend der Prüfung einer forcierten Wertminderung mit der Zeit unter den Bedingungen der Trockenlagerung bei 45°C unterworfen. Der gleiche Farbbildungstest wurde 20 Tage später durchgeführt. Die Abnahme der optischen Reflexionsdichten im Bereich der Glucose-Gehalte von 100 mg/dl bis 500 mg/dl in wäßriger Lösung betrug 0%. Das heißt, daß die optischen Dichten auch 20 Tage später überhaupt nicht vermindert waren.

In ähnlicher Weise wurde der Test der forcierten Wertminderung mit der Zeit unter den Bedingungen der Trockenlagerung bei 45°C auch unter Verwendung anderer Gallussäureester durchgeführt. Derselbe Farbbildungstest wurde ebenfalls 20 Tage später durchgeführt. Die Abnahmen der optischen Reflexionsdichten im Bereich der Glucose-Gehalte von 100 mg/dl bis 500 mg/dl in Form der prozentualen Mittelwerte sind in der nachstehenden Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6
Gallussäureester
Abnahme der optischen Reflexionsdichte (%)
Isobutylgallat
0
Propylgallat	0
Butylgallat	1
Isoamylgallat	1
Methylgallat	3
Octylgallat	5

Beispiel 4

Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die Farbstoff-Fixierschicht:
Wäßrige Latex-Lösung (30%) von Poly(N,N,N-trimethyl-N-(vinylbenzyl)-ammoniumchlorid\|15 g
Gelatine	10 g
Oberflächenaktives Mittel 10 G^R	1 g
Wasser	80 g

Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die Reagensschicht:
1,7-Dihydroxynaphthalin\|80 mg
4-Aminoantipyrin-hydrochlorid	120 mg
Ethylgallat	20 mg
Gelatine	3,2 g
Oberflächenaktives Mittel 10 G^R	100 mg
Peroxidase	1100 Einheiten
Wasser	15 ml

Auf einen farblosen transparenten PET-Film mit einer Dicke im trockenen Zustand von 180 µm wurden, in dieser Reihenfolge, die Beschichtungslösung für die Farbstoff-Fixierschicht und die Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die Reagensschicht wie in Beispiel 1 aufgetragen (Dicken der Farbstoff-Fixierschicht 5 µm, der Reagensschicht 10 µm, jeweils im trockenen Zustand).

Danach wurde eine Beschichtungslösung der folgenden Zusammensetzung für eine lichtblockierende Schicht (lichtabschirmende oder -reflektierende Schicht) auf die Reagensschicht aufgetragen, so daß die Dicke der trockenen Schicht 7 µm betrug, und anschließend wurde getrocknet.

Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die lichtblockierende Schicht:
feinteiliges TiO₂-Pulver\|19,5 g
Gelatine	6,8 g
Natrium-dioctylsulfosuccinat	1,0 g
Wasser	87 g

Baumwollpopeline mit einer Garnnummer 100 und einer Dicke von 180 µm wurde anschließend auf das so hergestellte Laminat aus mehreren Schichten aufgepreßt, wodurch ein mehrschichtiger Analysenfilm (E 1) zum Hydrogenperoxid-Nachweis erhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 2

Ein mehrschichtiger Analysenfilm (C 2) zum Hydrogenperoxid-Nachweis wurde wie in Beispiel 4 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß hierbei in der Beschichtungslösung für die Reagensschicht, bei sonst gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 4, das Ethylgallat fortgelassen wurde.

Nachdem die Analysenfilme (E 4) und (C 2) 2 Wochen lang einem forcierten Test der Trockenlagerung bei 45°C unterworfen worden waren, wurden wäßrige Hydrogenperoxid-Lösungen auf die betreffenden Analysenfilme aufgetropft, und anschließend wurde 5 min bei 30°C inkubiert. Danach wurden die optischen Reflexionsdichten der jeweils gebildeten Färbungen gemessen. Die Abnahmen der optischen Reflexionsdichten zeigten die folgenden Mittelwerte:

Analysenfilm (E 4) 2%
Analysenfilm (C 2) 50%

Claims

1. Mittel zum Nachweis von Hydrogenperoxid, enthaltend eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität und eine Substanz, die zur Verursachung einer nachweisbaren Farbänderung in Gegenwart von Hydrogenperoxid und der Substanz mit Peroxidase-Aktivität befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Pyrogallol-Derivat der nachstehenden Formel (1) enthält, in der
Q¹ eine Nitro-Gruppe, Cyano-Gruppe, Alkyl-Gruppe, substituierte Alkyl-Gruppe, Aryl-Gruppe, substituierte Aryl-Gruppe, Aralkyl-Gruppe, Carboxyl-Gruppe oder eine Gruppe -COOQ² bezeichnet, worin Q² für eine Alkyl-Gruppe, substituierte Alkyl-Gruppe, Aryl-Gruppe, substituierte Aryl-Gruppe oder eine Aralkyl-Gruppe steht.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Verursachung einer nachweisbaren Farbänderung befähigte Substanz eine Kombination aus einem Wasserstoff-Donator und einem Kuppler ist.

3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff-Donator mindestens eine Verbindung ausgewählt aus einem 4-substituierten Antipyrin, einem 2-Hydrazinobenzothiazolin, einem p-Halogenophenol und einem N,N-disubstituierten p-Phenylendiamin der Formel (2) ist, in der
R⁵ und R⁶ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Alkyl-Gruppe, Alkoxyalkyl-Gruppe, Hydroxyalkyl-Gruppe, Cyanoalkyl-Gruppe, Halogenoalkyl-Gruppe oder Acylaminoalkyl-Gruppe bezeichnen und
R⁷ für ein Wasserstoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe, Alkoxy-Gruppe oder ein Halogen-Atom steht.

4. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kuppler mindestens eine Verbindung ausgewählt aus einem Naphthol, einem Phenol, einem Pyrazolon und einem N,N-disubstituierten Anilin der Formel (3) ist, in der
R¹ und R² gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe oder eine Alkoxy-Gruppe bezeichnen und
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Alkyl-Gruppe, Alkoxyalkyl-Gruppe, Hydroxyalkyl-Gruppe, Aminoalkyl-Gruppe, Cyanoalkyl-Gruppe, Halogenoalkyl-Gruppe oder eine Acylaminoalkyl-Gruppe bezeichnen.

5. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff-Donator 4-Aminoantipyrin ist.

6. Mittel nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sich für die quantitative Analyse die einzelnen Reagenzien des Mittels in einer einem Träger zugeordneten Reagensschicht befinden.

7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht weiterhin aus einer Farbbildungsreaktions-Schicht und einer Farbstoff-Fixierschicht zusammengesetzt ist.

8. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht eine einzelne Schicht ist.

9. Mittel nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht zwischen einem Träger und einer porösen Schicht angebracht ist und die poröse Schicht sich in fließfähiger Berührung mit der Reagensschicht befindet, so daß die beiden Schichten in integrierter Form vorliegen.

10. Mittel nach Anspruch 6, 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien in einem polymeren Bindemittel enthalten sind.

11. Mittel nach Anspruch 6, 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht weiterhin ein ein anionisches Polymerisat oder ein kationisches Polymerisat enthaltendes Beizmittel enthält.

12. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoff-Fixierschicht weiterhin ein ein anionisches Polymerisat oder ein kationisches Polymerisat enthaltendes polymeres Beizmittel enthält.

13. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger porös und mit den Reagenzien imprägniert ist.