DE3206723C2 - - Google Patents
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- Y10S435/805—Test papers
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft einen quantitativ
arbeitenden Analysenfilm für die quantitative Untersuchung
der Transaminase-Aktivität und insbesondere einen
Film für die quantitative Analyse, der eine Reagens
schicht aufweist, die ein Substrat für Transaminase,
Brenztraubensäure-Oxidase, eine Farbindikator-Zusammen
setzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid und ein
anionisches Polymerisat zur Fixierung des gebildeten
Farbstoffs enthält, und der für quantitative Untersuchungen
der Transaminase eingesetzt wird.
Bekannt und z. B. in der JP-OS 13 068/80 (DE-OS 29 11 481)
offenbart sind Methoden zur analytischen Untersuchung
verschiedener Transaminase-Aktiviäten; diese
Methoden umfassen die direkte Erzeugung von Brenz
traubensäure durch Reaktionen verschiedener Transami
nasen mit den entsprechenden Substraten oder die Erzeugung
von Brenztraubensäure auf indirektem Wege durch
chemische Reaktion(en), an denen ein oder mehrere
andere Enzyme beteiligt sind oder durch chemische Reak
tion(en), an denen kein Enzym beteiligt ist, die
Reaktion der so gebildeten Brenztraubensäure mit Brenz
traubensäure-Oxidase und einer Farbindikator-Zusammensetzung
zum Nachweis von Hydrogenperoxid, die Peroxidase
enthält, und die anschließende kolorimetrische Bestimmung
der Brenztraubensäure. Die in der genannten Anmeldung
offenbarten Methode umfaßt eine Reihe
chemischer Reaktionen in wäßriger Lösung und erfordert
genaue Wägungen oder Volumenmessungen und die komplizierte
Handhabung einer wäßrigen Lösung und bedingt
dementsprechend relativ lange Zeitspannen für die
analytischen Arbeiten. Eine derartige Methode ist als
Methode für klinische Analysen, bei denen es auf kurze
Analysenzeiten, aber auch auf hohe Genauigkeit der Ana
lysenergebnisse ankommt, unzureichend.
Verschiedenartige Filme für die quantitative Analyse,
insbesondere aus mehreren Schichten bestehende Analysen
filme, die kolorimetrische Methoden der analytischen
Bestimmung von Hydrogenperoxid auf trockenem Wege möglich
machen, wurden vorgeschlagen, und einige von ihnen
werden auch praktisch eingesetzt. Unter ihnen gibt es
quantitativ arbeitende Analysenfilme für die Analyse
von Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Cholinesterase,
Kreatin etc. im lebenden Organismus mittels eines
trockenanalytischen Verfahrens, das die nachstehende
Sequenz umfaßt:
Reaktion der betreffenden Substanz mit dem entsprechenden oxydierenden Enzym oder Reaktion des im Laufe einer Enzymreaktion gebildeten Reaktionsprodukts mit dem entsprechenden oxydierenden Enzym,
Reaktion des dadurch freigesetzten Hydrogenperoxids mit einem Farbindikator unter Bildung einer Färbung und
anschließende Messung der entstandenen Färbung.
Reaktion der betreffenden Substanz mit dem entsprechenden oxydierenden Enzym oder Reaktion des im Laufe einer Enzymreaktion gebildeten Reaktionsprodukts mit dem entsprechenden oxydierenden Enzym,
Reaktion des dadurch freigesetzten Hydrogenperoxids mit einem Farbindikator unter Bildung einer Färbung und
anschließende Messung der entstandenen Färbung.
Die Zielsetzungen der Erhöhung der Geschwindigkeit der
Untersuchung, der Vermeidung komplizierter Arbeitsgänge
und der Verminderung der Kosten haben eine steigende
Nachfrage nach trocken arbeitenden Analysenfilmen für
quantitative Analysen, insbesondere auf dem Gebiet klinischer
Untersuchungen, bewirkt. Infolgedessen wurden
quantitativ arbeitende Analysenfilme, nach Art der
Test-Papierstreifen, entwickelt, die für die quantitative
Analyse vorgesehen sind, hohe Analysengenauigkeit
aufweisen und eine einzige Schicht oder mehrere Schichten
umfassen.
Insbesondere werden aus mehreren Schichten bestehende,
verbundstoffartige Filme für die quantitative Analyse
in der JP-OS 53 888/74 (entsprechend der US-PS 39 92 158)
und in der US-PS 40 42 335 sowie 41 66 093 offenbart;
diese Filme weisen gegenüber konventionellen Analysen
filmen für quantitative Analysen von der Art der Test-
Papierstreifen, die eine einzelne Schicht oder eine
Doppelschicht besitzen, eine erheblich verbesserte
Analysengenauigkeit auf. Zum Zwecke der weiteren Ver
besserung der Analysengenauigkeit und entsprechend dem
zu untersuchenden Analyten wurden auch Hydrogenperoxid-
Indikatoren mit hoher Nachweisempfindlichkeit in Form
solcher mehrschichtiger, verbundstoffartiger Filme für
die quantitative Analyse hergestellt; Beispiele für
solche Indikatoren zum Nachweis von Hydrogenperoxid und
für Schichtstrukturen für solche mehrschichtigen
Analysenfilme wurden in den JP-OSen 40 191/76, 1 31 089/78,
29 700/79, 1 24 499/80 etc. offenbart.
Die in diesen, nach einem Verfahren auf trockenem Wege
arbeitenden Filme für die quantitative Analyse verwenden
Indikatoren zum Nachweis des Hydrogenperoxids
basieren auf denjenigen Indikatoren zum Nachweis des
Hydrogenperoxids, die in der üblichen quantitativen
Analyse mittels Trockenverfahren angewandt werden, und
die zugrundeliegenden Prinzipien sind die gleichen.
US-PS 41 53 668 beschreibt ein Multizonen-Analyse-Element
zur Bestimmung von proteinartigen oder proteinge
bundenen Substanzen, die in Flüssigkeiten vorhanden
sind. Das Element enthält ein anionisches Polymer in
einer Spreitungsschicht, das hier den als "Chromato
graphie-Effekt" bezeichneten Nachteil beheben soll.
Beim normalen Menschen liegt der Bereich der Normalwerte
für den Transaminase-Gehalt etwa so, daß sie im gesamten
Blut maximal 20 IU/l betragen; die Substratmenge,
die eine katalytische Transaminase-Wirkung während
einer Zeit von einigen zehn Minuten, wie sie für die
üblicherweise eingesetzten Meßmethoden erforderlich ist,
erleiden, liegt auch unter günstigen Bedingungen
bei einer Konzentration in der Größenordnung von
10-4 mol/l. Um eine kolorimetrische Messung einer der
artigen Spurenmenge eines Substrats durch gekoppelte
Enzymreaktionen zu ermöglichen, ist es erforderlich,
daß
- (1) die betreffende Reaktion in ausreichendem Umfang stattfindet,
- (2) die Licht-Extinktion eines dabei gebildeten Farb stoffs groß ist,
- (3) der Farbstoff bis zur Beendigung der Messung stabil ist und
- (4) in dem Fall, in dem die kolorimetrische Bestimmung unter Verwendung eines Films für die quantitative Analyse durchgeführt wird, vor der Beendigung der Messung keine Verluste eines erzeugten Farbstoffs infolge Mobilisierung oder Diffusion eintreten.
Aufgrund eingehender Untersuchungen seitens der Anmelderin
wurde nunmehr gefunden, daß ein hoher Reaktions
wirkungsgrad, eine große Licht-Extinktion eines erzeugten
kationischen Farbstoffs und eine ausgeprägt hohe
Empfindlichkeit der Messung der Transaminase-Aktivität
dadurch erreicht werden, daß ein System gewählt wird,
in dem ein Reaktionsprodukt durch eine Transaminase-
Enzymreaktion oder eine Kombination einer Transaminase-
Enzymreaktion mit einer oder mehreren anderen Enzymre
aktionen, die mit dieser gekoppelt sind, auf dem Wege
über die Brenztraubensäure in Hydrogenperoxid umgewandelt
wird, daß als Farbindikator-System zum Nachweis
des Hydrogenperoxids ein solches System gewählt wird,
bei dem ein kationischer Farbstoff gebildet wird, und
daß eine Kombination aus 4-Aminoantipyrin oder einem
N,N-disubstituierten p-Phenylendiamin als Wasserstoff-
Donator und einem N,N-disubstituierten Anilin-Derivat
als Kuppler verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Film für
die quantitative Analyse, der zur Bestimmung der Trans
aminase-Aktivität auf trockenem Wege befähigt ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein
zur Bestimmung der Transaminase-Aktivität befähigter
Film für die quantitative Analyse mit hoher Nachweis
empfindlichkeit, bei dem ein kationischer Farbstoff mit
hoher Licht-Extinktion gebildet wird, der als Farbindikator
zum Nachweis des Hydrogenperoxids dient, und die
Färbung kolorimetrisch bestimmt wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein
zur Bestimmung der Transaminase-Aktivät mit hoher
Genauigkeit befähigter Film für die quantitative Analyse
mit hoher Nachweisempfindlichkeit, bei dem ein kat
ionischer Farbstoff mit hoher Licht-Extinktion gebildet
wird, der als Farbindikator zum Nachweis des Hydrogen
peroxids dient, und die Mobilisierung und Diffusion des
entstandenen Farbstoffs durch ein anionisches Polymerisat
verhindert wird.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf
- (1) einen Analysenfilm für die quantitative Analyse,
enthaltend eine Reagensschicht, welche
- a) Transaminasesubstrat;
- b) Brenztraubensäureoxidase, die zur Bildung von Hydrogenperoxid befähigt ist;
- c) eine einen kationischen Farbstoff bildende Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid, und
- d) ein anionisches Polymerisat zur Fixierung des gebildeten Farbstoffs enthält;
- (2) der in (1) genannte Film für die quantitative Analyse, in dem weiterhin eine Oxalacetat-Decarboxylase enthalten ist;
- (3) der in (1) oder (2) genannte Film für die quantitative Analyse, in dem die Reagensschicht weiterhin eine als Phosphat-Quelle dienende Verbindung, Flavin-Adenin-Dinucleotid, Thiamin-Pyrophosphat und ein zwei- bis dreiwertiges Metallion enthält;
- (4) der in (1), (2) oder (3) genannte Film für die quanti tative Analyse, in dem die Farbindikator-Zusammen setzung zum Nachweis des Hydrogenperoxids eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität, einen Wasserstoff- Donator und einen Kuppler enthält, wobei der Wasserstoff-Donator und der Kuppler eine zur Bildung eines kationischen Farbstoffs befähigte Kombination sind;
- (5) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (4) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht aus einer einzigen Schicht besteht;
- (6) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (4) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht mindestens aus zwei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Transaminase- Substratschicht ist, die ein Substrat für Transaminase enthält;
- (7) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (4) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht mindestens aus zwei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Farbstoff- Fixierschicht ist, die ein anionisches Polymerisat enthält und eine eine Transaminasesubstratschicht ist, die ein Transaminasesubstrat enthält;
- (8) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (4) und (7) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem die Reagensschicht aus mindestens drei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine eine Farbstoff-Fixierschicht ist, die ein anionisches Polymerisat enthält,
- (9) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (4) und (7) und (8) genannte Film, bei dem die Reagens schicht aus mindestens drei Schichten zusammen gesetzt ist, von denen eine eine Transaminase substratschicht ist, die Transaminasesubstrat enthält und eine eine Farbstoff-Fixierschicht ist, die ein anionisches Polymerisat enthält,
- (10) der im Vorstehenden unter einer der Ziffern (1) bis (9) genannte Film für die quantitative Analyse, bei dem auf einer Seite der Reagensschicht ein Träger und auf der anderen Seite der Reagensschicht eine poröse Schicht angebracht ist, wobei die poröse Schicht an der Reagensschicht in fließfähiger Berührung in Form eines einheitlichen Verbundstoffes haftet.
Verschiedene Transaminasen, deren Aktivitäten gemäß der
vorliegenden Erfindung gemessen werden können, sind
bekannt. Von diesen sind die Glutamyl-Pyruvat-Transaminase
(GPT) und die Glutamyl-Oxaloacetat-Transaminase
(GOT) von Bedeutung.
GPT und GOT sind Enzyme, die jeweils die nachstehend
bezeichneten Reaktionen katalysieren:
Die quantitative analytische Bestimmung der Aktivitäten
von GPT und GOT spielt eine bedeutsame Rolle bei der
Diagnose von Lebererkrankungen, da erhöhte GPT- und
GOP-Konzentrationen im Blut Maßzahlen für Lebererkran
kungen sind.
Als in der vorliegenden Erfindung verwendete Brenztrauben
säure-Oxidase (im folgenden als "POP" (Pyruvat-Oxidase) bezeichnet) kann
jedes Enzym verwendet werden, sofern es Reaktionen ka
talysiert, die Acetylphosphat, Kohlenstoffdioxid und
Hydrogenperoxid aus Brenztraubensäure, anorganischem
Phosphat und Sauerstoff bilden; zu den bevorzugten Beispielen
gehören POP, das durch Kultivierung von zur
Gattung Pediococcus gehörigen Bakterien, zur Gattung
Streptococcus gehörigen Bakterien und zur Gattung Aero
coccus gehörigen Bakterien erhalten werden. Eine Methode
zur Sammlung von POP wird beispielsweise in der
JP-OS 13 068/80 beschrieben. POP ist im Handel erhältlich
und leicht zugänglich.
POP benötigt (1) eine als Phosphat-Quelle dienende Ver
bindung, (2) Coenzyme (Thiaminpyrophosphat und Flavin
adenin-dinucleotid) und (3) Schwermetallionen, wie in
der Fachwelt wohlbekannt ist. Um die POP-Aktivität hervor
zurufen, müssen neben dem POP diese drei Bestandteile
anwesend sein. In der Beschreibung wird ein Gemisch,
das eine als Phosphat-Quelle dienende Verbindung,
Coenzyme, Schwermetallionen und POP enthält, als
POP-Gemisch bezeichnet.
Als Phosphat-Quelle dienende Verbindungen sind Verbindungen,
die befähigt sind, Phosphat-Ionen zu liefern
oder freizusetzen und in der Fachwelt wohlbekannt sind.
Als Phosphat-Quellen können Phosphat-Ionen PO₄3-, sauren
Wasserstoff enthaltende Phosphat-Ionen (HPO₄2-,
H₂PO₄-), deren Säuren oder deren Salze eingesetzt werden.
Phosphorsäureester oder -komplexe, die durch Hydrolyse
Phosphat-Ionen oder sauren Wasserstoff enthaltende
Phosphat-Ionen freisetzen können, können ebenfalls
eingesetzt werden. Zu speziellen Beispielen für
als Phosphat-Quellen dienende Verbindungen zählen Phosphor
säure (H₃PO₄), Trinatriumphosphat, Dinatriumhydro
genphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Trikaliumphosphat,
Dialkaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphos
phat, Aluminiumhydrogenphosphat, Calciumhydrogenphos
phat, Manganphosphat, Manganhydrogenphosphat, Magnesium
hydrogenphospat, Eisenhydrogenphosphat, Cobalthy
drogenphosphat, etc.. Als Phosphat-Quellen fungierende
Verbindungen können auch in Form von Pufferlösungen
verwendet werden. Die als Phosphat-Quellen dienenden
Verbindungen können in einem Bereich von 0,1 µmol bis
10 µmol, vorzugsweise von 0,3 µmol bis 5 µmol, berechnet
als Phosphat-Ionen, bezogen auf 1 U POP, einge
setzt werden (eine Aktivität, bei der 1 µmol Hydrogen
peroxid im Laufe von 1 min bei 37°C gebildet wird, wird
als 1 Einheit (U) definiert).
Flavin-adenindinucleotid (im folgenden kurz als "FAD"
bezeichnet) kann in einem Bereich von 0,1 nmol bis
50 nmol, vorzugsweise von 0,3 nmol bis 30 nmol, bezogen
auf 1 U POP, eingesetzt werden.
Als Thiaminpyrophosphat (TPP) können Thiamindiphosphat
(TDP) und Thiamintriphosphat (TTP) eingesetzt werden;
von diesen Thiamindiphosphat bevorzugt. Thiaminpyro
phosphat kann in einem Bereich von 5 nmol bis 500 nmol,
vorzugsweise von 10 nmol bis 300 nmol, bezogen auf 1 U
POP, eingesetzt werden.
Zwei- oder dreiwertige Metallionen sind solche zwei-
oder dreiwertigen Metallionen, die die POP-Wirkung ak
tivieren können; spezielle Beispiele hierfür sind Ca2+,
Co2+, Mg2+ und Al3+. Diese Metallionen können auch in
Form ihrer Salze und Komplexe, die diese Metallionen
enthalten und freisetzen, verwendet werden. Falls Phos
phate oder Hydrogenphosphate in Form von Salzen, die
zwei- oder dreiwertige Metallionen enthalten, verwendet
werden, können die als Phosphat-Quelle dienende Verbindung
und die Metallionen in Form einer einzigen Verbindung
eingesetzt werden, die beide Bestandteile gemeinsam
enthält. Zu Beispielen für Salze, die zwei- oder
dreiwertige Metallionen enthalten, zählen Chloride,
Sulfate, Nitrate, Phosphate, Hydrogensulfate, Hydrogen
phosphate, Carbonate, Hydrogencarbonate und Acetate.
Bevorzugte Metallionen sind Mn2+ und Mg2+, und bevorzugte
Metallsalze sind Chloride, Phosphate und Hydrogen
phosphate. Spezielle Beispiele bevorzugter Metall
salze sind Mangan(II)chlorid, Mangan(II)phosphat, Mangan
(II)hydrogenphosphat, Magnesium(II)chlorid und Mag
nesium(II)hydrogenphosphat. Die zwei- oder dreiwertigen
Metallionen können in einer Menge von 5 nmol bis
10 µmol, vorzugsweise von 10 nmol bis 5 µmol, bezogen
auf 1 U POP, eingesetzt werden.
Die Farbindikator-Zusammensetzung zum Nachweis des Hy
drogenperoxids kann in geeigneter Weise unter solchen
Indikatoren, die für die kolorimetrische Messung einer
gebildeten Färbung (Auftreten oder Veränderung einer
Färbung) oder einer Fluoreszenz geeignet sind, ausgewählt
und für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Bei dem Film für die quantitative Analyse gemäß
der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein einen
kationischen Farbstoff bildender Farbindikator zum
Nachweis des Hydrogenperoxids, der zur Bildung eines
kationischen Farbstoffs aufgrund einer chemischen Wechsel
wirkung in Gegenwart von Hydrogenperoxid befähigt
ist, und in Verbindung mit diesem ein anionisches Poly
merisat eingesetzt.
In der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff "Reagens
schicht" zur Bezeichnung einer solchen Schicht ver
wendet, in der ein Analyt in eine chemisch nachweisbare
Species umgewandelt wird und die zu einer Verbesserung
der Nachweisbarkeit der chemisch nachweisbaren Species
beiträgt. Die Reagensschicht enthält eine einen kationischen
Farbstoff bildende Farbindikator-Zusammensetzung
zum Nachweis von Hydrogenperoxid und ein anionisches
Polymerisat.
Der Begriff "Farbbildungsreaktions-Schicht" bezeichnet
eine Schicht, in der ein Analyt in eine chemisch nach
weisbare Species umgewandelt wird.
Der Begriff "Farbstoff-Fixierschicht" bezeichnet eine
Schicht, die zur Verbesserung der Nachweisbarkeit der
chemisch nachweisbaren Species beiträgt.
Die Reagensschicht kann eine ein TA-Substrat (wie es im
Folgenden definiert wird) enthaltende, Farbbildungsre
aktions- und Farbstoff-Fixierschicht sein, wenn diese
Reagensschicht aus einer einzigen Schicht besteht; die
Reagensschicht kann jedoch auch in zwei oder mehr
Schichten unterteilt sein, von denen eine eine TA-Substrat-
Schicht ist und eine oder mehrere andere eine
Farbstoff-Fixierschicht, Farbbildungsreaktions-Schicht
etc. ist/sind. Mit anderen Worten können eine TA-Substrat-
Schicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht, eine
Farbstoff-Fixierschicht etc. auch gemeinsam als "Rea
gensschicht" bezeichnet werden.
Die chemisch nachweisbare Species ist direkt oder indirekt
eine Nachweisgröße für die Anwesenheit und/oder
Konzentration eines interessierenden Analyten oder eines
Reaktions- oder Zersetzungsproduktes des Analyten.
Der Begriff "Substanz mit Peroxidase-Aktivität" ist so
zu verstehen, daß er eine Substanz bezeichnet, die die
Oxidation eines Wasserstoff-Donators mit Hydrogenper
oxid (als Substrat) katalysiert, und in der Fachwelt
wohlbekannt (I. Yamazaki et al, Molecular & Cellular
Biochemistry, Band 2(1), Seiten 39-52 (1973)). Die Substanz
mit Peroxidase-Aktivität nimmt an der Oxidation
eines Wasserstoff-Donators mit Hydrogenperoxid nach dem
folgenden Reaktionsschema teil:
Der Begriff "Wasserstoff-Donator" bezeichnet eine Ver
bindung, die ein Sauerstoff-Akzeptor ist, der im oxydierten
Zustand mit den N,N-disubstituierten Anilinen
der Formel (1) (vgl. Seite ) kuppelt.
Die kationische farbstoffbildende Farbindikator-Zusam
mensetzung zum Nachweis des Hydrogenperoxids, die einen
Bestandteil enthält, der zur Bildung eines kationischen
Farbstoffs durch chemische Wechselwirkung in Gegenwart
von Hydrogenperoxid befähigt ist (im folgenden als
"Farbindikator zum Nachweis von Hydrogenperoxid" be
zeichnet), ist eine Indikator-Zusammensetzung, die als
Hauptbestandteile eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität,
einen Wasserstoff-Donator und ein N,N-disubstituiertes
Anilin enthält.
Beispiele für Substanzen mit Peroxidase-Aktivität sind
unter anderem Peroxidase, die aus verschiedenartigen
Organismen extrahiert wurde, synthetisierte Peroxidase
sowie andere, aus Organismen extrahierte chemische Substanzen,
die eine Aktivität zeigen, die derjenigen der
Peroxidase ähnlich ist, wie sie in der JP-OS 137192/75
(entsprechend der US-PS 39 83 005) offenbart wurden.
Von diesen wird Peroxidase bevorzugt.
Als Wasserstoff-Donatoren, die in den Farbindikatoren
enthalten sind, können 4-substituierte Antipyrine (4-
substituierte 2,3-Dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-one),
wie sie in der JP-OS 50991/74 (entsprechend der US-PS
38 86 045) offenbart wurden, wie andere bekannte 4-
substituierte Antipyrine, N,N-disubstituierte o- oder
p-Phenylendiamine, wie sie in der JP-OS 137192/75 of
fenbart wurden, sowie andere bekannte N,N-disubstituierte
o- oder p-Phenylendiamine, 2-Hydrazonobenzothia
zoline, wie sie in der JP-OS 20471/80 offenbart wurden,
und andere bekannte 2-Hydrazonobenzothiazoline, p-Halo
genophenole, wie sie in der JP-OS 148100/80 offenbart
wurden, sowie andere p-Halogenophenole und N,N-disub
stituierte Phenylendiamine der Formel (2)
eingesetzt werden, in der R⁵ und R⁶ gleich oder verschieden
sein können und für Alkyl, Alkoxyalkyl, Hy
droxyalkyl, Cyanoalkyl, Halogenoalkyl oder Acylamino
alkyl stehen und R⁷ Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder
Halogen bezeichnet.
Spezielle Beispiele für einsetzbare 4-substituierte
Antipyrine sind (in Klammern ist die CAS-Registriernummer
angegeben):
4-Aminoantipyrin (83-07-8),
4-(Dimethylamino)antipyrin (Pyramidon) (58-15-1),
4-Ethylaminoantipyrin (15166-10-6),
4-Methylaminoantipyrin (Noramidopyrin) (519-98-2)
4-(Natriumsulfonatomethylamino)antipyrin (Sulphamipyrine) (129-89-5),
4-(Natriumsulfonatomethyl)(isobtuyl)aminoantipyrin (Dibupyrone) (1046-17-9)
4-Natriumsulfonatomethyl)(methyl)aminoantipyrin (Methampyrone) (5907-38-0)
und 4-Isopropylantipyrin (Propiphenazon) (479-92-5).
4-(Dimethylamino)antipyrin (Pyramidon) (58-15-1),
4-Ethylaminoantipyrin (15166-10-6),
4-Methylaminoantipyrin (Noramidopyrin) (519-98-2)
4-(Natriumsulfonatomethylamino)antipyrin (Sulphamipyrine) (129-89-5),
4-(Natriumsulfonatomethyl)(isobtuyl)aminoantipyrin (Dibupyrone) (1046-17-9)
4-Natriumsulfonatomethyl)(methyl)aminoantipyrin (Methampyrone) (5907-38-0)
und 4-Isopropylantipyrin (Propiphenazon) (479-92-5).
Als andere Verbindungen mit ähnlichen Strukturen kommen
4-Amino-2,3-dimethyl-1-p-tolyl-3-pyrazolin-5-on
(56430-10-5) und
4-Amino-1,3-diphenyl-2-methyl-3-pyrazolin-5-on) (52744-73-7)
in Betracht. Auch 2-Dimethylamino-5-phenyl-2-oxazolin-4-on (Tozalinone) (1046-17-9) kann verwendet werden.
4-Amino-1,3-diphenyl-2-methyl-3-pyrazolin-5-on) (52744-73-7)
in Betracht. Auch 2-Dimethylamino-5-phenyl-2-oxazolin-4-on (Tozalinone) (1046-17-9) kann verwendet werden.
In den Fällen, in denen ein oder beide Substituenten R⁵
und R⁶ in den durch die Formel (2) dargestellten N,N-
disubstituierten p-Phenylendiaminen Alkyl-Gruppen sind,
können diese Alkyl-Gruppen geradkettige oder kettenver
zweigte niedere Alkyl-Gruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoff-
Atomen sein; Beispiele hierfür sind eine Methyl-Gruppe,
Ethyl-Gruppe, Propyl-Gruppe, Butyl-Gruppe, Pentyl-Gruppe,
Isopropyl-Gruppe, Isobutyl-Gruppe, Isoamyl-Gruppe,
t-Butyl-Gruppe und Neopentyl-Gruppe. Im Falle einer
Substitution durch Alkoxyalkyl-Gruppen besteht die be
treffende Alkoxyalkyl-Gruppe aus einer niederen Alkyl-
Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine
niedere Alkoxy-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff-Atomen
substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür sind eine
Methoxymethyl-Gruppe, 2-Methoxyethyl-Gruppe, 1-Methoxy
ethyl-Gruppe, 3-Methoxypropyl-Gruppe, 2-Methoxypropyl-
Gruppe, Ethoxypropyl-Gruppe und 2-Ethoxyethyl-Gruppe.
Im Falle einer Substitution durch Hydroxyalkyl-Gruppen
besteht die betreffende Hydroxyalkyl-Gruppe aus einer
geradkettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-
Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine
Hydroxy-Gruppe substituiert ist; spezielle Beispiele
hierfür sind eine Hydroxymethyl-Gruppe, 2-Hydroxyethyl-
Gruppe, 1-Hydroxyethyl-Gruppe, 3-Hydroxypropyl-Gruppe,
2-Hydroxypropyl-Gruppe, 4-Hydroxybutyl-Gruppe und 5-Hy
droxypentyl-Gruppe. Im Falle einer Substitution durch
eine Cyanoalkyl-Gruppe besteht die betreffende Cyano
alkyl-Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenver
zweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-
Atomen, die durch eine Cyano-Gruppe substituiert ist;
spezielle Beispiele hierfür sind eine Cyanomethyl-Gruppe,
2-Cyanoethyl-Gruppe, 1-Cyanoethyl-Gruppe, 3-Cyano
propyl-Gruppe, 2-Cyanopropyl-Gruppe und 5-Cyanopentyl-
Gruppe. Im Falle einer Substitution durch eine Halogeno
alkyl-Gruppe besteht die betreffende Halogenoalkyl-
Gruppe aus einer geradkettigen oder kettenverzweigten
niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen,
die durch ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atom als
Halogen-Atom substituiert ist; spezielle Beispiele
hierfür sind eine Fluoromethyl-Gruppe, Chloromethyl-
Gruppe, Bromomethyl-Gruppe, 2-Fluoroethyl-Gruppe, 1-
Chloroethyl-Gruppe, 2-Chloroethyl-Gruppe, 2-Bromoethyl-
Gruppe und 2-Chloropropyl-Gruppe. Im Falle einer Sub
stitution durch eine Acylamino-Gruppe besteht die be
treffende Acylamino-Gruppe aus einer geradkettigen oder
kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5
Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Acetamido-Gruppe,
Propionamido-Gruppe, Benzamido-Gruppe, Toluamido-Gruppe,
Methansulfonamido-Gruppe, Benzolsulfonamido-Gruppe
oder Toluolsulfonamido-Gruppe als Acylamino-Gruppe mit
1 bis 10 Kohlenstoff-Atomen substituiert ist; Beispiele
hierfür sind eine Acetamidomethyl-Gruppe, Propionamido
methyl-Gruppe, Benzamidomethyl-Gruppe, p-Toluamidome
thyl-Gruppe, Methansulfonamidomethyl-Gruppe, Ethansul
fonamidomethyl-Gruppe, Benzolsulfonamidomethyl-Gruppe,
p-Toluolsulfonamidomethyl-Gruppe, 2-Acetamidoethyl-
Gruppe, 2-Propionamidoethyl-Gruppe, 2-Benzamidoethyl-
Gruppe, 2-p-Toluamidoethyl-Gruppe, 2-Methansulfonamido
ethyl-Gruppe, 2-(Ethansulfonamido)ethyl-Gruppe, 2-(Ben
zolsulfonamido)ethyl-Gruppe, 2-(p-Toluolsulfonamido)
ethyl-Gruppe, 3-Acetamidopropyl-Gruppe und 3-Benzamido
propyl-Gruppe.
Zu den bevorzugten Substituenten R⁵ und R⁶ zählen beispiels
weise die nachstehenden Gruppen:
Methyl, Ethyl, Methoxymethyl, 2-Methoxyethyl, Ethoxy methyl, 2-Ethoxyethyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, Acetamidomethyl, 2- Acetamidoethyl, Methansulfonamidomethyl, 2-Methansul fonamidoethyl, Chloromethyl, 2-Chloroethyl, Cyanomethyl und 2-Cyanoethyl.
Methyl, Ethyl, Methoxymethyl, 2-Methoxyethyl, Ethoxy methyl, 2-Ethoxyethyl, Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, Acetamidomethyl, 2- Acetamidoethyl, Methansulfonamidomethyl, 2-Methansul fonamidoethyl, Chloromethyl, 2-Chloroethyl, Cyanomethyl und 2-Cyanoethyl.
In dem Fall, in dem der Substituent R⁷ in den durch die
Formel (2) dargestellten N,N-disubstituierten p-Phenylendiaminen
eine Alkylgruppe ist, sind spezielle Beispiele
hierfür die gleichen wie die speziellen Beispiele
in den Fällen, in denen R⁵ und R⁶ Alkyl-Gruppen
sind. In dem Fall, in dem R⁷ eine Alkoxy-Gruppe ist,
enthält die betreffende Alkoxy-Gruppe eine geradkettige
oder kettenverzweigte niedere Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5
Kohlenstoff-Atomen; spezielle Beispiele hierfür sind
eine Methoxy-Gruppe, Ethoxy-Gruppe, Propoxy-Gruppe,
Isopropoxy-Gruppe, Butoxy-Gruppe, Isobutoxy-Gruppe,
Pentyloxy-Gruppe und Isoamyloxy-Gruppe. In dem Fall, in
dem R⁷ ein Halogen-Atom ist, sind spezielle Beispiele
ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iod-Atom.
Als Substituenten R⁷ bevorzugt werden ein Wasserstoff-
Atom, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen
und ein Halogen-Atom; hiervon werden eine Methyl-,
Ethyl- und Propyl-Gruppe als Alkyl-Gruppe und ein
Fluor- oder Chlor-Atom als Halogenatom besonders be
vorzugt.
Spezielle Beispiele für die N,N-disubstituierten p-Phe
nylendiamine der Formel (2) sind die folgenden Verbindungen:
N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin,
N,N-Diethyl-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-ethoxyethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-methansulfonylaminoethyl)-3-methyl-4- aminoanilin,
N-Ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-3-methyl-4-aminoanilin,
N-Ethyl-N-(β-cyanoethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-chloroethyl)-p-phenylendiamin,
N,N-Diethyl-3-chloro-4-aminoanilin,
N,N-Bis(β-cyanoethyl)-p-phenylendiamin.
N,N-Diethyl-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-ethoxyethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-methansulfonylaminoethyl)-3-methyl-4- aminoanilin,
N-Ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-3-methyl-4-aminoanilin,
N-Ethyl-N-(β-cyanoethyl)-p-phenylendiamin,
N-Ethyl-N-(β-chloroethyl)-p-phenylendiamin,
N,N-Diethyl-3-chloro-4-aminoanilin,
N,N-Bis(β-cyanoethyl)-p-phenylendiamin.
Als Wasserstoff-Donatoren werden 4-substituierte Anti
pyrine und N,N-disubstituierte p-Phenylendiamine der
Formel (2) bevorzugt. Von diesen werden 4-Aminoantipy
rin, N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin und N,N-Diethyl-p-
phenylendiamin besonders bevorzugt.
Das N,N-disubstituierte Anilin ist eine Verbindung, die
durch die nachstehende Formel (1) bezeichnet wird:
In der Formel (1) stehen R¹ und R² jeweils für ein Wasserstoff-
Atom, eine Alkyl-Gruppe oder eine Alkoxy-Gruppe,
und R¹ und R² können gleich oder voneinander ver
schieden sein. R³ und R⁴ stehen jeweils für eine Alkyl-
Gruppe, eine Alkoxyalkyl-Gruppe, eine Hydroxyalkyl-
Gruppe, eine Aminoalkyl-Gruppe, eine Cyanoalkyl-Gruppe,
eine Halogenoalkyl-Gruppe oder eine Acylaminoalkyl-
Gruppe, und R³ und R⁴ können gleich oder voneinander
verschieden sein.
In dem Fall, in dem die Substituenten R¹ und R² in dem
durch die Formel (1) dargestellten N,N-disubstituierten
Anilin eine Alkyl-Gruppe oder Alkoxy-Gruppe bezeichnen,
sind spezielle Beispiele dafür die gleichen Gruppen,
die als spezielle Beispiele für Alkyl- bzw. Alkoxy-
Gruppen bei den Substituenten R⁵ und R⁶ des durch die
Formel (2) dargestellten N,N-disubstituierten p-Phenylen
diamins angeführt wurden.
In dem Fall, in dem die Substituenten R³ und R⁴ eine
Alkyl-Gruppe, Alkoxyalkyl-Gruppe, Hydroxyalkyl-Gruppe,
Cyanoalkyl-Gruppe, Halogenoalkyl-Gruppe oder Acylamino
alkyl-Gruppe bezeichnen, sind spezielle Beispiele dafür
die gleichen Gruppen, die als spezielle Beispiele für
Alkyl-, Alkoxyalkyl-, Hydroxyalkyl-, Cyanoalkyl, Halogeno
alkyl bzw. Acylaminoalkyl-Gruppen bei den vorgenannten
Substituenten R⁵ und R⁶ angeführt wurden. In
dem Fall, in dem R³ und R⁴ eine Aminoalkyl-Gruppe bezeichnen,
besteht die Aminoalkyl-Gruppe aus einer gerad
kettigen oder kettenverzweigten niederen Alkyl-Gruppe
mit 1 bis 5 Kohlenstoff-Atomen, die durch eine Amino-
Gruppe substituiert ist; spezielle Beispiele hierfür
sind eine Aminomethyl-Gruppe, 2-Aminoethyl-Gruppe,
1-Aminoethyl-Gruppe, 3-Aminopropyl-Gruppe und 2-Amino
propyl-Gruppe.
Als Substituenten R¹ und R² bevorzugt werden ein Wasser
stoff-Atom, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 5 Kohlen
stoff-Atomen, eine Alkoxy-Gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoff-
Atomen; spezielle Beispiele für die Alkyl-Gruppen
sind Methyl, Ethyl und Propyl, und spezielle Beispiele
für Alkoxy-Gruppen sind Methoxy und Ethoxy.
Als Substituenten R³ und R⁴ bevorzugt werden eine Alkyl-
Gruppe, eine Alkoxyalkyl-Gruppe, eine Hydroxyalkyl-
Gruppe, eine Cyanoalkyl-Gruppe und eine Halogenalkyl-
Gruppe; zu den speziellen Beispielen hierfür zählen
Methyl, Ethyl, Propyl, Methoxymethyl, 2-Methoxyethyl,
3-Methoxypropyl, Ethoxymethyl, 2-Ethoxyethyl, Hydroxy
methyl, 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl,
3-Hydroxypropyl, Cyanomethyl, 2-Cyanoethyl, Chloro
methyl, 1-Chloroethyl, 2-Chloroethyl, 2-Chloropropyl,
3-Chloropropyl, Bromomethyl, 2-Bromoethyl, Fluoromethyl
und 2-Fluoroethyl.
Spezielle Beispiele für die durch die Formel (1) dargestellten
N,N-disubstituierten Aniline sind die folgenden
Verbindungen:
N,N-Dimethylanilin,
N,N-Diethylanilin,
N-Methyl-N-hydroxymethylanilin,
N-Methyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin,
N-Methyl-N-(2-methoxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-ethoxyethyl)anilin,
N,N-Dimethyl-m-toluidin,
N,N-Diethyl-m-toluidin,
N,N-Bis(hydroxymethyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(2-hydroxypropyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(3-hydroxypropyl)-m-toluidin,
N-Methyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Methyl-N-methoxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-methoxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)-m-toluidin,
N-Cyanomethyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Methyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin,
N-(2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Dimethyl-m-anisidin,
N,N-Diethyl-m-anisidin.
N,N-Diethylanilin,
N-Methyl-N-hydroxymethylanilin,
N-Methyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)anilin,
N-Methyl-N-(2-methoxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)anilin,
N-Ethyl-N-(2-ethoxyethyl)anilin,
N,N-Dimethyl-m-toluidin,
N,N-Diethyl-m-toluidin,
N,N-Bis(hydroxymethyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(2-hydroxypropyl)-m-toluidin,
N,N-Bis(3-hydroxypropyl)-m-toluidin,
N-Methyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Methyl-N-methoxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-methoxymethyl-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-methoxyethyl)-m-toluidin,
N-Cyanomethyl-N-hydroxymethyl-m-toluidin,
N-Methyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-chloroethyl)-m-toluidin,
N-(2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Dimethyl-m-anisidin,
N,N-Diethyl-m-anisidin.
Von diesen Verbindungen sind bevorzugte N,N-disubstituierte
Aniline die folgenden:
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-(2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Dimethyl-m-anisidin,
N,N-Diethyl-m-anisidin.
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-Ethyl-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N-(2-Cyanoethyl)-N-(2-hydroxyethyl)-m-toluidin,
N,N-Dimethyl-m-anisidin,
N,N-Diethyl-m-anisidin.
Das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte anionische
Polymerisat ist ein Polymerisat, das die anionische
Gruppierung in dem Polymerengerüst selbst oder in
Form eines Atoms bzw. einer Atom-Gruppierung enthält,
die an das Polymerengerüst gebunden ist. Neben den üblichen
anionischen Polymerisaten können auch Kationen
austauschharze des Säure-Typs als anionische Polymerisate
eingesetzt werden; vorzugsweise sind die üblichen
anionischen Polymerisate oder Kationenaustauschharze
wasserlösliche Polymere oder solche Polymere, die mit
Wasser quellbar sind. Die anionischen Polymerisate können
einzeln oder in Form einer Kombination aus zweien
oder mehreren verwendet werden. Es können sowohl an
ionische Polymerisate mit der Fähigkeit zur Filmbildung
als auch solche ohne diese Fähigkeit eingesetzt werden,
jedoch wird bevorzugt, Polymerisate ohne die Fähigkeit
zur Filmbildung in Kombination mit als Bindemitteln
wirkenden Polymerisaten einzusetzen, die die Fähigkeit
zur Filmbildung besitzen.
Zu speziellen Beispielen für derartige anionische Poly
merisate zählen Polymerisate oder Copolymerisate mit
einer Struktur, an der eine Carboxylat-Gruppe (-COO-),
eine Sulfonat-Gruppe (-SO₃-) oder eine Phosphonat-Gruppe
(-PO₃2-) als anionische Atomgruppierung gebunden
ist, oder aber die genannte anionische Atomgruppierung
ist zusammen mit einem Gegen-Kation an sämtliche der
sich wiederholenden Struktureinheiten (im folgenden als
"CRU" bezeichnet) der hochmolekularen Kette oder einen
Teil der CRU gebunden, wobei die Anordnung eine geordnete
oder zufällige sein kann. Gegen-Kationen sind Al
kalimetall-Ionen (z. B. Li⁺, Na⁺, K⁺, Cs⁺), Erdalkali
metall-Ionen (z. B. Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+) und Ammo
nium-Ionen (NH₄⁺).
Diese anionischen Polymerisate werden durch die Formel
(AP) dargestellt
Org-Q-Z⁻ A⁺ (AP)
in der Org eine organische Gruppe bezeichnet, die einen
Teil des Polymerengerüsts bildet, Q für eine (oder mehrere)
chemische Bindung(en) oder eine chemische Gruppe
steht, die Z⁻ mit Org verbindet, Z⁻ eine Carboxylat-
Gruppe (-COO⁻), eine Sulfonat-Gruppe (-SO₃⁻) oder eine
Phosphonat-Gruppe (-PO₃2-) bezeichnet und A⁺ ein Gegen-
Kation wie oben erwähnt ist.
Zu speziellen Beispielen für die anionischen Polymerisate,
die die vorgenannten CRU enthalten, zählen die
folgenden:
Alkali-Hydrolysate eines Methylvinylether-Maleinsäure anhydrid-Copolymerisats (wobei das Copolymerisat Dilithium-, Dinatrium oder Dikalium-ethylen-1,2-di- carboxylat als CRU enthält);
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer Poly acrylsäure;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines Poly- N-(β-sulfo-α,α-dimethylethyl)acrylamids;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer Polystyrol- p-sulfonsäure;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines Copoly merisats aus Styrol-p-sulfonsäure und einem hydrophilen Vinyl-Monomeren, Beispiel für solche hydrophilen Vinyl-Monomeren sind:
Acrylsäure, Acrylsäure-alkylester (z. B. Meth acrylat), Acrylsäure-hydroxyalkylester (z. B. β-Hydroxyethylacrylat), Acrylamide (z. B. Acrylamid, N-Methylacrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-(β-Sulfonato-α,α-dimethylethyl)acrylamid, N-Ethyl-N-isopropyl-acrylamid, Acrylmorpholid
Alkali-Hydrolysate eines Methylvinylether-Maleinsäure anhydrid-Copolymerisats (wobei das Copolymerisat Dilithium-, Dinatrium oder Dikalium-ethylen-1,2-di- carboxylat als CRU enthält);
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer Poly acrylsäure;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines Poly- N-(β-sulfo-α,α-dimethylethyl)acrylamids;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einer Polystyrol- p-sulfonsäure;
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz eines Copoly merisats aus Styrol-p-sulfonsäure und einem hydrophilen Vinyl-Monomeren, Beispiel für solche hydrophilen Vinyl-Monomeren sind:
Acrylsäure, Acrylsäure-alkylester (z. B. Meth acrylat), Acrylsäure-hydroxyalkylester (z. B. β-Hydroxyethylacrylat), Acrylamide (z. B. Acrylamid, N-Methylacrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-(β-Sulfonato-α,α-dimethylethyl)acrylamid, N-Ethyl-N-isopropyl-acrylamid, Acrylmorpholid
N-Acryloylpiperidin,
N-Acryloylpiperadin, N-Acryloylpiperazin),
Methacrylsäure-hydroxyalkylester (z. B. β-Hy
droxyethyl-methacrylat), Methacrylamide (z. B.
Methacrylamid, Methacrylmorpholid);
Alkalimetallsalze einer Polyvinylphosphonsäure der Formel
Alkalimetallsalze einer Polyvinylphosphonsäure der Formel
in der M Lithium, Natrium oder Kalium ist;
Carboxymethylcellulose;
Carboxyethylcellulose;
Alginsäure und ihre Alkalisalze.
Carboxymethylcellulose;
Carboxyethylcellulose;
Alginsäure und ihre Alkalisalze.
Typische Beispiele für bevorzugte anionische Polymerisate
sind die folgenden:
Kalium-Polystyrol-p-sulfonat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylmorpholid-Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylamid-Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-N-Isopropylacrylamid- Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-N-Ethyl-N-isopropyl acrylamid-Copolymerisat;
Kalium-Poly-N-(β-sulfonato-α,α-dimethyl)acrylamid;
Kalium-N-(β-Sulfonato-α,α-dimethyl)acrylamid-β-Hy droxyethylacrylat-Copolymerisat;
Kalium-N-(β-Sulfonato-α,α-dimethyl)acrylamid-N- Ethylacrylamid-Copolymerisat.
Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylmorpholid-Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-Acrylamid-Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-N-Isopropylacrylamid- Copolymerisat;
Kalium-Styrol-p-sulfonat-N-Ethyl-N-isopropyl acrylamid-Copolymerisat;
Kalium-Poly-N-(β-sulfonato-α,α-dimethyl)acrylamid;
Kalium-N-(β-Sulfonato-α,α-dimethyl)acrylamid-β-Hy droxyethylacrylat-Copolymerisat;
Kalium-N-(β-Sulfonato-α,α-dimethyl)acrylamid-N- Ethylacrylamid-Copolymerisat.
Von diesen anionischen Polymerisaten werden anionische
Polymere des Polystyrol-Typs (bei denen in der Formel
(AP) Q eine Phenylen-Gruppe darstellt) besonders bevorzugt.
Das anionische Polymerisat kann in eine Schicht, die
den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids
enthält, eingearbeitet werden, oder eine Farbstoff-
Fixierschicht, die das anionische Polymerisat - jedoch
keinen anderen Reagens-Bestandteil - enthält, kann auch
in Form einer getrennten Schicht von derjenigen
Schicht, die den Farbindikator zum Nachweis des Hydro
genperoxids enthält, eingesetzt werden. Weiterhin kann
das anionische Polymerisat auch sowohl in eine den
Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende
Schicht als auch in die Farbstoff-Fixierschicht
eingearbeitet werden. Das anionische Polymerisat kann
auch, falls erwünscht und erforderlich, als eine Kombi
nation zweier oder mehrerer Schichten eingesetzt werden,
obwohl nur eine solche im allgemeinen ausreichend
ist.
In dem Falle, in dem das anionische Polymerisat sowohl
in die den Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenper
oxids enthaltende Schicht als auch in die Farbstoff-
Fixierschicht eingearbeitet ist, können die betreffenden
anionischen Polymerisate gleich oder voneinander
verschieden sein. Weiterhin kann das anionische Poly
merisat auch in eine andere Schicht als eine den Farb
indikator zum Nachweis des Hydrogenperoxids enthaltende
Schicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet
werden.
Zur quantitativen Bestimmung der Transaminase-Aktivität
sind verschiedene Substrate für Transaminase (im folgenden
als "TA-Substrate" bezeichnet) oder Zusammenset
zungen, die TA-Substrat enthalten (im folgenden als
("TA-Substrat-Zusammensetzung" bezeichnet) in den Analy
senfilmen der vorliegenden Erfindung enthalten. In dem
Fall, in dem die Transaminase Glutamyl-Pyruvat-Trans
aminase (GPT) ist, wird das TA-Substrat in Form einer
Kombination aus Alanin und α-Ketoglutarsäure, und in
dem Fall, in dem die Transaminase Glutamyl-Oxaloacetat-
Transaminase (GOT) ist, in Form einer Kombination aus
Asparaginsäure und α-Ketoglutarsäure eingesetzt; in dem
Fall, in dem die GOT-Aktivität quantitativ untersucht
werden soll, wird außerdem zusätzlich Oxaloacetat-De
carboxylase eingesetzt, durch die GOT auf ihr Substrat
als ein Katalysator wirkt, und die entstandene Oxalessig
säure (oder ein Salz derselben) wird dann unter Bil
dung von Brenztraubensäure (oder eines Salzes derselben)
decarboxyliert. Das TA-Substrat oder die TA-Sub
strat-Zusammensetzung (im folgenden gemeinsam unter der
letzteren Bezeichnung zusammengefaßt) kann in die gleiche
Schicht, die auch die POP-Zusammensetzung enthält,
oder in eine getrennte Schicht eingearbeitet werden.
Wenn TA-Substrat-Zusammensetzung und POP-Zusammensetzung
in die gleiche Schicht eingearbeitet sind, können
beide Zusammensetzungen einfach miteinander vermischt
werden, oder beide Zusammensetzungen können in die
gleiche Schicht eingebracht werden, nachdem sie einzeln
für sich pulverisiert wurden.
In dieser Darlegung wird der Begriff "Reagensschicht"
so verwendet, daß er sowohl eine einzelne Schicht, die
die vier Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-
Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-
Nachweis und anionisches Polymerisat enthält, bezeichnet,
als auch als Sammelbegriff für eine Vielzahl von
Schichten gebraucht wird, die irgendeine der vorgenannten
Zusammensetzungen enthalten und weiterhin eine
(oder mehrere) strukturunterstützende Schicht(en)
und/oder eine (oder mehrere) die analytische Funktion
unterstützende(n) Schicht(en) einschließen können, die
gegebenenfalls nach Bedarf vorgesehen werden. Im allgemeinen
bezeichnet der Ausdruck "Schicht" in dieser Beschreibung,
daß in dieser Schicht eine Zusammensetzung
oder Verbindung enthalten ist; das heißt, das eine die
TA-Substrat-Zusammensetzung enthaltende Schicht als
eine TA-Substrat-Schicht, eine die POP-Zusammensetzung
enthaltende Schicht als eine POP-Schicht, eine den
Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende
Schicht als Farbbildungsreaktions-Schicht, eine eine
anionische Polymerisat-Schicht enthaltende Schicht als
Farbstoff-Fixierschicht, eine die drei Bestandteile
POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-
Nachweis und ein anionisches Polymerisat enthaltende
Schicht als POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixier
schicht, eine die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator
zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Schicht
als POP-Farbbildungsreaktions-Schicht, eine den Hydrogen
peroxid-Farbindikator und ein anionisches Polymerisat
enthaltende Schicht als Farbbildungsreaktions-
Farbstoff-Fixierschicht, eine die drei Bestandteile
TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung und
Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende
Schicht als TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-
Schicht bezeichnet wird, und dergleichen.
Bei den Analysenfilmen der vorliegenden Erfindung kann
eine einzelne Schicht verwendet werden, die die vier
Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammen
setzung, Farbindikator zum Nachweis des Hydrogenper
oxids und anionisches Polymerisat enthält, aber es können
auch mindestens vier Schichten zur Anwendung gelangen,
die sich aus einer TA-Substrat-Schicht, die die
TA-Substrat-Zusammensetzung enthält, einer POP-Schicht,
die die POP-Zusammensetzung enthält, einer Farbbildungs
reaktions-Schicht, die den Farbindikator zum Nachweis
des Hydrogenperoxids enthält, und einer Farbstoff-
Fixierschicht, die das anionische Polymerisat enthält,
zusammensetzen. Weiterhin können zwei Schichten, die
sich aus einer TA-Substrat-Schicht und einer POP-Farb
bildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht, die die drei
Bestandteile POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum
Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches Polymerisat
enthält, zum Einsatz gelangen. Die Zahl der Reagens
schichten als solche (von einer einzigen Schicht bis zu
vier oder mehr Schichten) und ihre Anordnung können in
geeigneter Weise je nach den Arten der zu analysierenden
Transaminasen, der in dem Analysenfilm enthaltenen
Stoffe und der von dem Analysenfilm verlangten Leistungsfähigkeit
oder Genauigkeit gewählt werden.
Sofern eine in dem Analysenfilm gemäß der vorliegenden
Erfindung enthaltene Kombination aus dem Wasserstoff-Donator
und dem Kuppler zur Bildung eines kationischen
Farbstoffs befähigt ist, wird ein kationischer Farbstoff
gebildet, der durch die Formel (CD)
dargestellt wird, in der R¹ bis R⁴ die gleichen Bedeutungen
wie in Formel (1) haben, X- für ein Anion steht
und OHD die oxydierte Wasserstoff-Donator-Struktureinheit
bezeichnet, wenn eine flüssige Probe auf den Analysenfilm
getropft wird, und dieser kationische Farbstoff
wird dann durch das anionische Polymerisat fixiert,
das weiterhin in dem Analysenfilm enthalten ist.
Bei dem Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung
wird bevorzugt ein Bindemittel-Polymerisat in eine
(oder mehrere) Schicht(en) eingearbeitet, die frei von
anionischen Polymeren ist (sind). Jedoch kann ein als
Bindemittel dienendes Polymerisat auch in eine (oder
mehrere) anionische Polymere enthaltende Schicht(en)
eingearbeitet werden. Als Bindemittel-Polymerisate
können bekannte hydrophile Polymerisate eingesetzt
werden. Spezielle Beispiele für hydrophile Polymerisate
sind Gelatine, Casein, Agarose, Stärke, Polyvinylalkohol,
Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid, Polyethylenglycol
etc.. Übliche Härter (Härtungsmittel oder Vernetzungsmittel)
können ebenfalls zusammen mit hydrophilen
Polymeren verwendet werden. Jede der vorbeschriebenen
Schichten kann dadurch hergestellt werden, daß eine
die entsprechende Zusammensetzung oder Komponente(n)
enthaltende Lösung oder Dispersion mittels bekannter
Beschichtungstechniken auf einen Träger aufgetragen und
die Beschichtung anschließend getrocknet wird. Weiter
kann auch die Oberfläche oder das Innere eines porösen
Trägers mit einer die entsprechende Zusammensetzung
oder Komponente(n) enthaltenden Lösung oder Dispersion
getränkt oder imprägniert werden, wodurch ein ähnlicher
Effekt erzielt wird. In diesem Falle können als Bindemittel
dienende Polymerisate oft fortgelassen werden.
Wenn die Schichten mit Hilfe von Beschichtungstechniken
auf einen Träger aufgebracht werden, liegt die Dicke
einer Reagensschicht im allgemeinen zwischen 3 µm und
100 µm, vorzugsweise zwischen 5 µm und 50 µm, wenn es
sich um eine Einzelschicht handelt; im Falle einer Kombination
von zwei oder mehr Schichten liegt die Dicke
jeder Schicht im allgemeinen zwischen 1 µm und 50 µm,
vorzugsweise zwischen 2 µm und 30 µm.
Der Analysenfilm gemäß der vorliegenden Erfindung kann,
je nach der vorgesehenen Verwendung, der für die quantitative
Untersuchung geforderten Genauigkeit etc. verschiedenartige
Schichtstrukturen aufweisen. Die vorliegende
Erfindung wird im Folgenden unter Bezug auf die
beigefügten Zeichnungen näher erläutert, die bevorzugte
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.
Fig. 1 zeigt einen Analysenfilm, der aus einem mit dem
Reagens imprägnierten Träger 25 besteht, der durch Imprägnieren
der Oberfläche und des Inneren eines selbsttragenden
porösen Trägers mit sämtlichen der Bestandteile
TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung,
Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und einem
anionischen Polymerisat erhalten wurde.
Als selbsttragende poröse Träger können bekannte film-,
folien- oder blattartige Träger wie Filterpapier, gewöhnliches
Papier, Vliestuch, Membranfilter, poröse
Kunststoffolie etc. eingesetzt werden. Wenn der Film
für die quantitative Analyse mit einem Diapositiv-Rahmen
eingefaßt werden soll, wie dies in den JP-OSen
1 56 079/79 und 1 60 296/79, der JP-GBM-Anmeldung 41 787/80
und der JP-Patentanmeldung 1 31 800 etc. offenbart wurde,
können neben den oben genannten Materialien auch biegsame
Materialien wie Textilstoffe als poröse Träger
verwendet werden. Ein derartiger Film für die quantitative
Analyse kann in der Weise verwendet werden, daß er
an einem film-, folien- oder blattartigen Träger haftend
befestigt wird, und die Schichtstruktur ist in
diesem Falle ähnlich derjenigen eines in Fig. 2 dargestellten
Films für die quantitative Analyse, wie er im
Folgenden beschrieben wird.
Fig. 2 zeigt einen Film für die quantitative Analyse
mit einer solchen Struktur, bei der die Reagensschicht
20, die die vier Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung,
POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis
und anionisches Polymerisat enthält,
auf einem film-, folien- oder blattartigen Träger 10
vorliegt. Der Träger 10 kann entweder durchsichtig oder
lichtundurchlässig sein.
Fig. 3 zeigt einen Film für die quantitative Analyse
mit einer solchen Struktur, bei der die POP-Farbbildungsreaktions-
Farbstoff-Fixierschicht 21, die die drei
Bestandteile POP-Zusammensetzung, Farbindikator zum
Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches Polymerisat
enthält, und die TA-Substrat-Schicht 23, die die TA-
Substrat-Zusammensetzung enthält, in dieser Reihenfolge
auf einen film-, folien- oder blattartigen Träger aufgebracht
vorliegen. Der Träger kann entweder durchsichtig
oder lichtundurchlässig sein, ist jedoch vorzugsweise
ein durchsichtiger Träger.
Bei den Filmen für die quantitative Analyse, wie sie in
den Fig. 4 bis 8 dargestellt sind, werden eine Reagensschicht,
eine TA-Substrat-Schicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht,
eine Farbbildungsreaktions-Farbstoff-
Fixierschicht oder eine Farbstoff-Fixierschicht
zwischen einem Träger und einer porösen Schicht aufgebracht,
und die poröse Schicht wird in "fließfähige
Berührung" (die Definition dieses Begriffs wird in der
im Vorstehenden erwähnten JP-OS 40 191/76 gegeben) mit
der Reagensschicht, der TA-Substrat-Schicht, der Farbbildungsreaktions-Schicht,
der Farbbildungsreaktions-
Farbstoff-Fixierschicht oder der Farbstoff-Fixierschicht
gebracht; vorzugsweise besitzt der Analysenfilm
eine solche Struktur, daß diese Schichten in Form einer
Einheit aneinander haften.
die poröse Schicht wird in Form einer porösen Spreitungsschicht
(porous spreading layer) oder einer porösen
Schicht konstanter Fläche (constant area porous
layer) eingesetzt, die die nachstehende Funktion besitzen:
Wenn eine flüssige Probe aufgetüpfelt wird, wird
diese Flüssigkeitsprobe einer darunter liegenden
Schicht zugeführt, und die Funktion besteht vorzugsweise
darin, daß die Menge der Flüssigkeitsprobe pro Flächeneinheit
annähernd konstant gehalten wird (im Falle
der porösen Spreitungsschicht), oder daß sie bis auf
die gleiche Größe ihrer Form ausgebreitet wird und dadurch
die Menge der Flüssigkeitsprobe pro Flächeneinheit
annähernd konstant gehalten wird (im Falle der
porösen Schicht mit konstanter Fläche), wobei in beiden
Fällen die Flüssigkeitsprobe einer darunter liegenden
Schicht zugeführt wird.
Eine andere Ausführungssform kann darin bestehen, daß
das Innere einer porösen Schicht (einer porösen Spreitungsschicht
oder einer porösen Schicht bestimmter Flächengröße)
mit der TA-Substrat-Zusammensetzung imprägniert
wird, ohne daß eine TA-Substrat-Schicht in Form
einer unabhängigen, separaten Schicht aufgebracht wird.
Die poröse Schicht hat eine definierte Flächengröße,
die so festgelegt wird, daß ihr eine Flüssigkeitsprobe
in einer Menge zugeführt werden kann, die größer ist
als die Menge des Wassers, das in der porösen Schicht
gehalten werden kann; sie wird oft als "poröse Schicht
definierter Flächengröße" bezeichnet.
Fig. 4 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur,
der aus einem film-, folien- oder blattartigen
Träger 10 besteht, auf den, in dieser Reihenfolge, die
die vier Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung, POP-
Zusammensetzung, Farbindikator zum Hydrogenperoxid-
Nachweis und ein anionisches Polymerisat enthaltende
Reagensschicht 20 und die poröse Spreitungsschicht 31
aufgebracht sind.
Fig. 5 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur,
der aus einem film-, folien- oder blattartigen
Träger 10 besteht, auf den, in dieser Reihenfolge, die
POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschiicht 21,
die die drei Bestandteile POP-Zusammensetzung, Farbindikator
und ein anionisches Polymerisat enthält, die
die TA-Zusammensetzung enthaltende TA-Substrat-Schicht
23, eine licht-reflektierende oder licht-blockierende
Schicht 40 und die poröse Spreitungsschicht 31 aufgebracht
sind.
Als poröse Spreitungsschicht des in Fig. 4 oder Fig. 5
dargestellten Films für die quantitative Analyse können
verschiedenartig aufgebaute poröse Schichten Verwendung
finden, so eine poröse Schicht, in der in einem als
Bindemittel wirkenden Polymerisat feinteilige poröse
Pulver wie allgemein sogenannte "Trübpolymerisate"
(blush polymers, Membranfilter), Diatomeenerde, mikrokristalline
Stoffe (z. B. mikrokristalline Cellulose wie
"Avicel", Handelsbezeichnung der FMC-Corporation) dispergiert
sind, poröse Aggregate, die dadurch gebildet
werden, daß man kleine kugelförmige Perlen aus Glas
oder Polymeren dazu bringt, in Punkt-zu-Punkt-Berührung
aneinander zu haften, eine nicht-faserförmige isotrope
poröse Schicht wie eine aggregierte dreidimensionale
Teilchen-Gitterstruktur, die dadurch gebildet wird, daß
man kleine kugelförmige Teilchen aus in Wasser nichtquellbaren
organischen Polymerisaten unter Verwendung
eines wasserunlöslichen Klebstoffs dazu bringt, in
Punkt-zu-Punkt-Berührung aneinander zu haften etc., wie
sie in der JP-OS 90 589/80 offenbart wurde, eine faserförmige
anisotrope Schicht aus hydrophil gemachten Textilstoffen,
wie sie in der JP-OS 1 64 356/80 offenbart
wurde, Textilstoffe, die auf physikalischem Wege hydrophil
gemacht wurden (z. B. durch Glimmentladung, Plasma-
Behandlung, Corona-Entladung, Ultraviolett-Bestrahlung,
Flammenbehandlung etc., wie sie in der JP-OS 1 40 532/80
offenbart wurden, Filterpapier etc.
Das Aufbringen einer nicht-faserförmigen isotropen porösen
Schicht als poröse Spreitungsschicht auf die Reagensschicht
20 oder die lichtreflektierende Schicht 40
kann mittels einer Arbeitsweise erfolgen, wie sie in
den oben erwähnten JP-OSen 53 888/74 und 90 589/80 etc.
beschrieben wurde, und das Aufbringen der faserförmigen
anisotropen porösen Spreitungsschicht auf die Reagensschicht
20 oder die lichtreflektierende Schicht 40 kann
mittels einer Arbeitsweise erfolgen, wie sie in der
oben erwähnten JP-OS 1 64 356/80 und der genannten JP-Patentanmeldung
1 40 532/80 beschrieben wurde.
Die poröse Schicht mit konstanter Fläche kann unter
Verwendung von Materialien (z. B. Textilstoffen, Papier,
Membranfiltern) und mittels der Arbeitsweise hergestellt
werden, die für die poröse Schicht in der JP-GBM-Anmeldung
1 20 299/80 offenbart wurden. Als Materialien
für die poröse Schicht mit konstanter Fläche können
die gleichen Materialien wie für die poröse Spreitungsschicht
verwendet werden, und darüber hinaus kann
jedes Material verwendet werden, dessen Inneres porös
ist und eine Flüssigkeit wie etwa Wasser zurückhalten
kann und dessen Poren sich durchgehend von der einen
Hauptoberfläche zu der anderen Hauptoberfläche hin erstrecken.
Das Aufbringen der porösen Schicht mit konstanter
Fläche auf eine Reagensschicht, eine lichtreflektierende
Schicht oder dergleichen kann mittels des
Verfahrens erfolgen, das in der JP-GBM-Anmeldung
11 20 299/80 offenbart wurde, oder mittels des oben beschriebenen
Verfahrens zum Aufbringen der porösen
Spreitungsschicht.
Als licht-reflektierende (oder licht-blockierende)
Schicht 40 können verschiedene Schichten eingesetzt
werden, so etwa eine Schicht, in der in einem hydrophilen
Bindemittel ein oder mehrere weiße Pigmente wie
feinteiliges Titandioxid-Pulver, feinteiliges Bariumsulfat-
Pulver oder dergleichen dispergiert sind, wie
sie in den JP-OSen 53 888/74, 40 191/76, 1 64 356/80 etc.
offenbart wurde, eine Trübpolymerisat-Schicht (Membranfilter),
in der ein oder mehrere weiße Pigmente wie
feinteiliges Titandioxid, feinteiliges Bariumsulfat
oder dergleichen dispergiert sind, wie sie in der JP-OS
53 888/74 etc. offenbart wurde, eine Trübpolymerisat-Schicht,
wie sie in der JP-OS 53 888/74 etc. offenbart
wurde, eine wasserdurchlässige, aus einer porösen Metallschicht
bestehende Schicht, wie sie in der JP-OS
26 428/80 offenbart wurde, oder eine wasserdurchlässige,
ein oder mehrere Metallpulver enthaltende Schicht, wie
sie in der JP-OS 26 429/80 etc. offenbart wurde; die
Arbeitsweisen zur Herstellung dieser Schichten können
den Verfahren entsprechen, die in den vorgenannten Veröffentlichungen
beschrieben wurden.
Fig. 6 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur,
die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge,
die TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht 22,
die die drei Bestandteile TA-Substrat-Zusammensetzung,
POP-Zusammensetzung und Farbindikator zum Hydrogenperoxid-
Nachweis enthält, die ein anionisches Polymerisat
enthaltende Farbstoff-Fixierschicht 24, die lichtreflektierende
Schicht 40 und die poröse Spreitungsschicht
31 umfaßt. Sofern in dem Farbindikator zum
Nachweis des Hydrogenperoxids nicht eine solche kationische
Verbindung enthalten ist, die die kolorimetrische
Analyse durch Lichtabsorption in dem Wellenlängenbereich
stört, in dem der entstehende kationische Farbstoff
absorbiert, kann die relative Lage der Schicht,
die die TA-Substrat-Zusammensetzung, die POP-Zusammensetzung
und den Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis
enthält, zu der Farbstoff-Fixierschicht frei gewählt
werden. Dementsprechend ist die in Fig. 6 dargestellte
Schichtstruktur insbesondere in dem Falle von
Vorteil, in dem die Schicht, die die TA-Substrat-Zusammensetzung,
die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator
zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthält, als eine untere
Schicht vorliegen soll, damit sie nicht mit der
Luft in Berührung gelangt, etwa weil der Farbindikator
zum Hydrogenperoxid-Nachweis einen (oder mehrere) Bestandteil(e)
enthält, die durch Luft oxydiert werden
können.
Fig. 7 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur,
die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge,
die ein anionisches Polymerisat enthaltende Farbstoff-
Fixierschicht 24, die TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-
Schicht 22, die die drei Bestandteile TA-Substrat-
Zusammensetzung, POP-Zusammensetzung und Farbindikator
zum Hydrogenperoxid-Nachweis enthält, sowie
weiterhin, in dichter Berührung mit dieser, eine poröse
Schicht 32 mit definierter Flächengröße umfaßt; letztere
Schicht ist so bemessen, daß sie der darunter liegenden
Schicht eine Flüssigkeitsprobe in einer Menge
zuführen kann, die größer ist als die Wassermenge, die
in der porösen Schicht zurückgehalten werden kann. Im
einzelnen wird die Fläche der porösen Schicht so festgelegt,
daß die Menge einer in der porösen Schicht gehaltenen
Flüssigkeitsprobe durch die betreffende Fläche
definiert wird, und die auf diese Weise festgelegte
Menge der Flüssigkeitsprobe wird, in der gleichen Menge
und auf der gleichen Fläche, auf die darunter befindliche
Schicht (gewöhnlich eine Reagensschicht) übertragen,
da eine mögliche Ausdehnung der porösen Schicht
infolge des Gehalts der Flüssigkeitsprobe in Richtung
ihrer Breite, im Vergleich zu ihrer Dicke, vernachlässigbar
ist.
Es genügt, wenn die poröse Schicht Leerräume besitzt,
um den Transport der Flüssigkeitsprobe zu ermöglichen,
jedoch wird im allgemeinen bevorzugt, daß das Leerraum-Volumen
der porösen Schicht in einem Bereich von etwa
30% bis etwa 85% liegt. Das Leerraum-Volumen kann
mittels einer Chalkley, Journal of the National
Cancer Institute 4, S. 47 (1943), beschriebenen Arbeitsweise
berechnet werden und durch direkte Wägung
und Bestimmung des Verhältnisses des tatsächlichen Gewichts
der betreffenden Struktur und des Gewichts eines
gleichen Volumens des kompakten festen Stoffes.
Der eine poröse Schicht definierter Flächengröße aufweisende
Analysenfilm ist besonders geeignet für die
quantitative Analyse der Transaminase-Aktivität in einer
wäßrigen Lösung, die Transaminase nur in kleinerer
Menge enthält. Eine licht-reflektierende Schicht (oder
eine licht-blockierende Schicht) kann zwischen der TA-
Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht und der porösen
Schicht mit definierter Flächengröße eingefügt
werden. Weiterhin kann die relative Lage der TA-Substrat-
POP-Farbbildungsreaktions-Schicht zu der Farbstoff-
Fixierschicht umgekehrt werden, wie in dem Fall
des in Fig. 6 dargestellten Analysenfilms. An Stelle
der TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktionsschicht 22
kann eine POP-Farbbildungsreaktions-Schicht, die die
POP-Zusammensetzung und den Farbindikator zum Nachweis
von Hydrogenperoxid enthält, eingesetzt werden.
Fig. 8 zeigt einen Analysenfilm mit einer Schichtstruktur,
die auf einem Träger 10, in dieser Reihenfolge,
die POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht
21, die die drei Bestandteile POP-Zusammensetzung,
Farbindikator zum Hydrogenperoxid-Nachweis und anionisches
Polymerisat enthält, die licht-reflektierende
(oder licht-blockierende) Schicht 40 und die poröse
Schicht 32 definierter Flächengröße umfaßt. Es ist, im
Falle eines Analysenfilms zur Bestimmung von GOT, auch
möglich, das TA-Substrat in die poröse Schicht definierter
Flächengröße und die Oxaloacetat-Decarboxylase
in die POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht
einzuarbeiten. In den Fig. 7 und 8 ist die poröse
Schicht definierter Flächengröße so dargestellt,
daß sie kleiner ist als die übrigen Schichten. Es ist
jedoch ausreichend, wenn die Schicht definierter Flächengröße
nach Form und Größe so beschaffen ist, daß
sie nicht breiter als die Dimensionen einer der Reagensschichten
ist; dementsprechend kann sie ohne
Schwierigkeiten die gleiche Form und Größe wie jede der
Reagensschichten besitzen.
Als Träger für die in den Fig. 2 bis 8 dargestellten
Filme für die quantitative Analyse können Filme oder
Folien aus einer Vielzahl von Polymerisaten verwendet
werden, wie etwa Polyethylenterephthalat, Celluloseester
(Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat,
Celluloseacetat-propionat etc.), Polycarbonate (Polycarbonate
des Bisphenols A etc.), Polymethylmethacrylat,
Polystyrol etc.; die Dicke dieser Folien beträgt
etwa 25 µm bis 0,3 mm, vorzugsweise etwa 50 µm bis etwa
0,2 mm.
Träger, die farblos und durchsichtig sind oder für
Licht der betreffenden Wellenlängen durchlässig sind,
bei denen der aus dem Farbindikator zum Hydrogenperoxid-
Nachweis gebildete kationische Farbstoff absorbiert,
können verwendet werden. Außerdem können auch
Träger verwendet werden, die durch Einarbeiten von Pigmenten
(z. B. feinteiliges Titandioxid-Pulver, feinteiliges
Bariumsulfat-Pulver, feinteiliges Zinkoxid-Pulver,
Ruß etc.) licht-blockierend gemacht worden sind.
Wenn licht-blockierende Träger verwendet werden, kann
die kolorimetrische Messung durchgeführt werden, nachdem
der Träger im Anschluß an die kolorimetrische Bestimmung
des von der trägerfreien Seite reflektierten
Lichts abgestreift und entfernt wurde. Die Verwendung
eines licht-blockierenden Trägers ist von Vorteil in
denjenigen Fällen, in denen Reagensbestandteile, die
der Gefahr unterliegen, durch Licht zersetzt zu werden,
in eine Reagensschicht, eine Farbbildungsreaktions-Schicht
oder eine Farbstoff-Fixierschicht eingearbeitet
sind.
Zu bevorzugten Ausführungsformen des Analysenfilms gemäß
der vorliegenden Erfindung zählen eine Schichtstruktur
aus zwei Reagensschichten, die aus einer TA-
Substrat-Schicht und einer POP-Farbbildungsreaktions-
Farbstoff-Fixierschicht bestehen, und eine Schichtstruktur
aus drei Reagensschichten, die aus einer TA-
Substrat-Schicht, einer POP-Farbbildungsreaktions-Schicht
und einer Farbstoff-Fixierschicht bestehen. Bei
der letzteren ist vorzugsweise das anionische Polymerisat
nur in der Farbstoff-Fixierschicht oder aber sowohl
in der POP-Farbbildungsreaktions-Schicht als auch in
Farbstoff-Fixierschicht enthalten.
In den Fällen, in denen der Film für die quantitative
Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung, einschließlich
der in den Fig. 2 bis 8 dargestellten Ausführungsformen,
aus einer mehrschichtigen Verbundstoff-Struktur
besteht, können zur Herstellung derselben die
Verfahren eingesetzt werden, die in den vorerwähnten
JP-OSen 53 888/74, 40 191/76, 90 859/80 und 1 64 356/80, der
JP-Patentanmeldung 1 40 352/80, den JP-OSen 26 428/80 und
26 429/80, der JP-GBM-Anmeldung 1 20 299/80 etc. beschrieben
wurden. Andernfalls kann der Film für die quantitative
Analyse auch mit Hilfe der verschiedenen Beschichtungsverfahren
hergestellt werden, die zur Herstellung
gebräuchlicher lichtempfindlicher Materialien für die
Farbphotographie oder lichtempfindlicher Materialien
für die Schwarzweiß- oder Color-Sofortbildphotographie
eingeführt sind, wobei diese Verfahren als solche oder
mit geringfügigen Abänderungen eingesetzt werden.
Im Anschluß an die vorstehende allgemeine Beschreibung
wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden
Beispiele weiter erläutert.
Ein farbloser transparenter Film aus Polyethylenterephthalat
(PET) als photographischer Träger wurde mit
einer wäßrigen Lösung, die eine isoelektrische Menge
Gelatine und Kalium-polystyrol-4-sulfonat enthielt,
beschichtet, so daß die Dicke der trockenen Schicht
5 µm betrug. Nach dem Trocknen wurde eine Farbstoff-Fixierschicht
darauf aufgebracht.
Eine die POP-Zusammensetzung und den Farbindikator zum
Hydrogenperoxid-Nachweis enthaltende Beschichtungs-Lösung
der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:
Zusammensetzung der Beschichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht | |
N,N-Bis(β-hydroxyethyl)-m-toluidin|5,6 mg | |
4-Aminoantipyrin | 8,0 mg |
Gelatine | 500 mg |
Peroxidase | 300 Einheiten |
Brenztraubensäure-Oxidase | 80 Einheiten |
FAD | 7,5×10-3 mg |
Thiaminpyrophosphat (TDP) | 3 mg |
Mangan(II)chlorid | 2,9 mg |
Na₂HPO₄ · 12 H₂O | 109 mg |
NaH₂PO₄ · 2 H₂O | 30 mg |
Wasser | 3000 mg |
Oberflächenaktives Mittel 10G® | 4 mg |
Bis(vinylsulfonylmethyl)ether, 1gew.-proz. wäßrige Lösung | 500 mg |
Die Beschichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktions-
Schicht wurde auf die Farbstoff-Fixierschicht
aufgetragen, so daß die Dicke der trockenen Schicht
15 µm betrug, und getrocknet.
Eine eine GPT-Substrat-Zusammensetzung enthaltende Lösung
der nachstehenden Formulierung wurde hergestellt:
Zusammensetzung der Lösung für die GPT-Substrat-Schicht | |
α-Ketoglutarsäure|150 mg | |
L-Alanin | 3 g |
Na₂HPO₄ · 12 H₂O | 2,18 g |
NaH₂PO₄ · 2 H₂O | 0,60 g |
Polyacrylamid, 5 gew.-proz. wäßrige Lösung | 5 g |
Wasser | 45 g |
Oberflächenaktives Mittel 10G®, 50gew.-proz. wäßrige Lösung | 200 mg |
Ein Filterpapier mit glatter Oberfläche (Dicke 200 µm,
Gewicht 33 g/m²) für die Elektrophorese wurde mit der
Lösung für die GPT-Substrat-Schicht imprägniert. Danach
wurde die überschüssige Lösung dadurch abgequetscht,
daß das Filterpapier zwischen Walzen aus Silikongummi
mit einem Walzenabstand von 300 µm hindurchgeschickt
wurde. Das Filterpapier wurde auf die Oberfläche einer
ebenen Glasplatte gelegt und trocknen gelassen. Die
GPT-Substrat-Zusammensetzung, mit der das Filterpapier
getränkt worden war, war gleichmäßig in demselben verteilt.
Das mit der GPT-Substrat-Zusammensetzung imprägnierte
Filterpapier wurde auf die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht,
die zuvor mit einer 50fach verdünnten wäßrigen
Lösung des oberflächenaktiven Mittels 10G befeuchtet
worden war, gelegt und leicht angedrückt, um dadurch
das Filterpapier als die TA-Substrat-Zusammensetzung
enthaltende poröse Schicht zu befestigen. Auf diese
Weise wurde ein Analysenfilm für die analytische
Bestimmung von GPT erhalten.
Dieser Analysenfilm wurde in kreisförmige Testblättchen
mit einem Durchmesser von 9 mm zerschnitten, und zur
Durchführung der Analysen wurden auf die poröse Schicht
(Filterpapier) wäßrige Lösungen verschiedener Konzentrationen
des GPT-Enzyms aufgetropft.
Die analytische Bestimmung wurde folgendermaßen durchgeführt:
20 µl einer Kochsalzlösung, die GPT im Mengenverhältnis 46 IU/l enthielt, wurden auf den Analysenfilm aufgetropft. Der Analysenfilm wurde in einen verschließbaren Diapositivrahmen mit Kunststoffenstern hineingebracht, um eine Verdunstung der Feuchtigkeit zu verhindern, und bei 37°C inkubiert. Die Farbdichte änderte sich im Laufe der Zeit und wurde mittels eines Reflexions-Densitometers gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt.
20 µl einer Kochsalzlösung, die GPT im Mengenverhältnis 46 IU/l enthielt, wurden auf den Analysenfilm aufgetropft. Der Analysenfilm wurde in einen verschließbaren Diapositivrahmen mit Kunststoffenstern hineingebracht, um eine Verdunstung der Feuchtigkeit zu verhindern, und bei 37°C inkubiert. Die Farbdichte änderte sich im Laufe der Zeit und wurde mittels eines Reflexions-Densitometers gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt.
Inkubationszeit (min) | |
Optische Dichte | |
5 | |
0,35 | |
10 | 0,49 |
15 | 0,61 |
20 | 0,74 |
Weiterhin wurden jeweils 20 µl einer Kochsalzlösung mit
verschiedenen GPT-Aktivitäten auf den Analysenfilm aufgetropft,
und der Analysenfilm wurde 10 min bei 37°C
inkubiert. Nach weiteren 10 min wurde die reflektierte
optische Dichte gemessen. Die Ergebnisse sind in der
nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.
GPT-Aktivität (IU/l) | |
Optische Dichte (Reflexion) | |
20 | |
0,33 | |
46 | 0,49 |
72 | 0,68 |
100 | 0,82 |
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu entnehmen, daß
zwischen der GPT-Aktivität und der mittels Reflexion
gemessenen optischen Dichte eine annähernd lineare Beziehung
besteht. Es ist somit klar, daß die GPT-Aktivität
unter Verwendung dieses Analysenfilms mittels der
kolorimetrischen Methode der Messung des reflektierten
Lichtes quantitativ bestimmt werden kann.
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden ein Filterpapier,
ein Glasfaser-Filterpapier, ein Baumwolltuch,
ein Tuch aus einer PET-Baumwolle-Mischung, ein Membranfilter
etc. mit der Lösung der GPT-Substrat-Zusammensetzung
getränkt und jeweils auf die POP-Farbbildungsreaktionsschicht
des Analysenfilms, der aus der Farbstoff-Fixierschicht
und der POP-Farbbildungsreaktions-Schicht
bestand und gemäß Beispiel 1 hergestellt worden
war, gelegt und mit der Schicht in Haftverbindung gebracht.
Auf diese Weise wurden mehrschichtige Analysenfilme
zur Analyse der GPT-Aktivität erhalten.
Auf jedem der Analysenfilme bildete sich die Färbung in
ähnlicher Weise wie in Beispiel 1. Es wurden optische
Reflexionsdichten gemessen, die mit den GPT-Aktivitäten
korrelierten.
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurde ein aus der
Farbstoff-Fixierschicht und der POP-Farbbildungsreaktions-Schicht
zusammengesetzter Analysenfilm hergestellt.
Eine wäßrige Dispersion von feinteiligem Titandioxid-Pulver
in Gelatine wurde auf die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht
als licht-blockierende Schicht
mit einer Dicke der trockenen Schicht von 5 µm aufgetragen
und anschließend getrocknet.
Zusammensetzung der wäßrigen Dispersion für die licht-blockierende Schicht | |
feinteiliges TiO₂-Pulver|19,5 g | |
Gelatine | 6,8 g |
Oberflächenaktives Mittel 10G® | 0,9 g |
Wasser | 87 g |
Danach wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 ein
Analysenfilm zur quantitativen Bestimmung der GPT-Aktivität
hergestellt. Kochsalzlösungen, die GPT in verschiedenen
Konzentrationen enthielten, wurden wie in
Beispiel 1 auf die Analysenfilme aufgetropft, damit
sich die Färbung bildete. Die Farbbildung konnte auf dem
weißen Hintergrund beobachtet werden. Die Messungen der
optischen Reflexionsdichte lieferten fast die gleichen
Ergebnisse wie in Beispiel 1.
Zu einer Beschichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht
mit der gleichen Zusammensetzung wie
in Beispiel 1 wurden 400 µl einer 5proz. wäßrigen Lösung
eines anionischen Polymerisats vom pH 6,5 bis 7,0,
das durch Hydrolyse eines Methylvinylether-Maleinsäureanhydrid-
Copolymerisats (Gantrez AN 169®, hergestellt
von der GAF Corporation) zusammen mit einer äquimolaren
Menge Kaliumhydroxid hinzugefügt.
Danach wurde mit der Beschichtungslösung
- (A) ein photographischer Träger, der aus einem farblosen transparenten PET-Film bestand, dessen Oberflächenhaftung verbessert worden war, beschichtet;
- (B) die Farbstoff-Fixierschicht wie in Beispiel 1 beschichtet; und
- (C) zu Vergleichszwecken wurde eine Beschichtungslösung für die POP-Farbbildungsreaktions-Schicht der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 auf den gleichen photographischen Träger wie bei (A) aufgebracht.
Weiterhin wurde eine licht-blockierende Schicht in
gleicher Weise wie in Beispiel 3 auf die mehrschichtigen
Analysenfilme (A), (B) und (C) aufgebracht, und
anschließend wurden diese getrocknet, wodurch einsetzbare
Analysenfilme (A), (B) und (C) erhalten wurden.
Jeder dieser Analysenfilme wurde in quadratische
Blättchen von 15 mm Seitenlänge geschnittten, und darauf
wurden kreisförmige Scheibchen aus Filterpapier (Dicke
200 µm) mit einem Durchmesser von 9 mm (als poröse
Schicht mit definierter Fläche) gelegt. Auf jeden dieser
Analysenfilme wurden jeweils 20 µl einer wäßrigen
Lösung von Kaliumpyruvat einer Konzentration von
10-3 mol/l getropft. Nach 10 min Stehenlassen bei Raumtemperatur
(25°C) wurde die optische Reflexionsdichte
der gebildeten Färbung gemessen. Die Ergebnisse sind in
der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Analysenfilm | |
Optische Dichte | |
(A) | |
1,05 | |
(B) | 1,23 |
(C) | 0,54 |
Bei dem Analysenfilm (A) wurde der gebildete kationische
Farbstoff durch das anionische Polymerisat in der
POP-Farbbildungsreaktions-Schicht oder in der Farbstoff-
Fixierschicht fixiert. Bei dem Analysenfilm (B)
wurde der gebildete kationische Farbstoff durch das
anionische Polymerisat in der Farbstoff-Fixierschicht
fixiert. Dementsprechend diffundierten kaum Anteile des
kationischen Farbstoffs in das Filterpapier (die poröse
Schicht definierter Fläche), so daß die durch Messung
des reflektierten Lichts bestimmte optischen Dichten
hoch waren. Bei dem Analysenfilm (C) diffundierte jedoch
ein Teil des gebildeten kationischen Farbstoffs in
das Filterpapier. Dieser in das Filterpapier abdiffundierte
Teil lieferte keinen Beitrag zu der optischen
Dichte der entstandenen Färbung, so daß die durch Messung
des reflektierten Lichts bestimmte optische Dichte
ausgeprägt niedrig war. Aus diesem Experiment geht klar
hervor, daß anionische Polymerisate, die in dem Analysenfilm
gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten
sind, in wirkungsvoller Weise kationische Farbstoffe zu
fixieren vermögen.
Eine Beschichtungslösung einer Enzym-Substrat-Zusammensetzung
wurde auf einen mehrschichtigen Analysenfilm
(B) (einen solchen, bei dem kein Filterpapier auf die
licht-blockierende Schicht aufgebracht worden war), der
in Beispiel 4 erhalten worden war, in einer Dicke der
trockenen Schicht von 80 µm aufgebracht und anschließend
getrocknet, wodurch eine GOT-Substrat-Schicht gebildet
wurde.
Zusammensetzung der Lösung für die GOT-Enzym-Substrat-Schicht | |
L-Asparaginsäure|2,5 g | |
α-Ketoglutarsäure | 120 mg |
Na₂HPO₄ · 12 H₂O | 1,09 g |
NaH₂PO₄ · 2 H₂O | 0,30 g |
Polyacrylamid, 5gew.-proz. wäßrige Lösung | 100 g |
Nichtionisches oberflächenaktives Mittel (Isooctylphenyl-polyethoxyethanol, Handelsbezeichnung "Triton X-100", hergestellt von Rohm und Haas Co., Ltd.) | 100 mg |
Die GOT-Substrat-Schicht des so hergestellten mehrschichtigen
Films wurde mit einer 1 Gew-% Triton X-100
enthaltenden wäßrigen Lösung befeuchtet, und ein Membranfilter
einer Dicke von 180 µm und einer Fläche von
50 mm² wurde leicht angedrückt und in haftende Verbindung
mit der GOT-Substrat-Schicht gebracht, wodurch ein
Analysenfilm zur Bestimmung der GOT-Aktivität erhalten
wurde.
Auf die poröse Schicht mit definierter Fläche der so
hergestellten Analysenfilme wurden jeweils 10 µl einer
wäßrigen Kochsalzlösung, die GOT (in Konzentrationen
von 40, 70, 105 und 205 IU/l) enthielt, aufgetropft,
und anschließend wurde 20 min bei 37°C inkubiert. Danach
wurden die optischen Reflexionsdichten auf der
Seite des PET-Films gemessen. Die optischen Dichten
sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
GOT-Aktivität (IU/l) | |
Optische Dichte (Reflexion) | |
40 | |
0,31 | |
70 | 0,62 |
105 | 0,78 |
205 | 1,18 |
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu entnehmen, daß
zwischen der GOT-Aktivität und der mittels Reflexion
gemessenen optischen Dichte eine Korrelation besteht
und die GOT-Aktivität unter Verwendung dieses Analysenfilms
mittels der kolorimetrischen Methode der Messung
der optischen Reflexionsdichte auf der Grundlage einer
Eichkurve quantitativ bestimmt werden kann.
Menschliches Blutserum wurde jeweils auf die Analysenfilme
für die analytische Bestimmung der GPT-Aktivität
und der GOT-Aktivität, die in den Beispielen 1 bzw. 5
erhalten wurden, aufgetropft, und die Untersuchung wurde
durchgeführt. Als Ergebnisse wurden mit n=5 ein
Mittelwert der optischen Reflexionsdichte von 0,30 für
die GPT-Aktivität und ein Mittelwert der optischen Reflexionsdichte
von 0,28 für die GOT-Aktivität erhalten.
Vier verschiedenartige poröse Materialien, nämlich ein
Filterpapier mit einer Dicke von 185 µm, ein Membranfilter
(mittlere Porengröße 5 µm, hergestellt von der
Fuji Photo Film Co., Ltd., Handelsbezeichnung "Microfilter
FMR 500") mit einer Dicke von 150 µm, ein Baumwolltuch
(Popelingewebe, broad cloth) und ein Glasfaser-
Filterpapier mit einer Dicke von 200 µm, wurden
mit einer wäßrigen Lösung einer GOT-Substrat-Zusammensetzung
der nachstehenden Formulierung imprägniert
und dann getrocknet.
Zusammensetzung der Lösung für die GOT-Enzym-Substrat-Schicht | |
L-Asparaginsäure|2,5 g | |
α-Ketoglutarsäure | 120 mg |
Na₂HPO₄ · 12 H₂O | 1,09 g |
NaH₂PO₄ · 2 H₂O | 0,30 g |
Polyacrylamid, 5gew.-proz. wäßrige Lösung | 5 g |
Wasser | 40 g |
Oberflächenaktives Mittel 10G 50proz. wäßrige Lösung | 200 mg |
Danach wurde der Analysenfilm (B) (der mehrschichtige
Analysenfilm (B), bei dem kein Filterpapier auf der
licht-blockierenden Schicht aufgebracht wurde), der in
Beispiel 4 erhalten wurde, mit einer 50fach verdünnten
wäßrigen Lösung des oberflächenaktiven Mittels 10G befeuchtet,
und nach Zerschneiden der mit der GOT-Substrat-
Zusammensetzung imprägnierten porösen Materialien
in Stücke von 100 mm² wurden diese jeweils leicht darauf
gedrückt und so daran befestigt, wodurch mehrschichtige
Analysenfilme für die Bestimmung der GOT-Aktivität,
die poröse Schichten mit definierter Flächengröße
imprägniert mit der GOT-Substrat-Zusammensetzung
aufwiesen, hergestellt wurden.
Auf die porösen Schichten mit definierter Flächengröße
jedes dieser vier Analysenfilme wurde jeweils eine wäßrige
Kochsalzlösung mit einer GOT-Konzentration von
50 IU/l aufgetropft, und zwar in einer Menge von 40 µl
auf poröse Schicht definierter Flächengröße aus dem
Popelingewebe und von jeweils 20 µl auf die porösen
Schichten definierter Flächengröße aus den drei
anderen Materialien. Die Inkubation erfolgte 60 min bei
37°C; während dieser Zeit wurden die optischen Dichten
der entstandenen Färbungen in Intervallen von jeweils
5 min auf der Seite des PET-Films gemessen. Es wurde
festgestellt, daß bei allen vier Analysenfilmen die
optischen Dichten der entstandenen Färbungen während
der Inkubationszeit von 5 min bis 30 min linear zunahmen.
Aus den vorstehenden Ergebnissen wird deutlich, daß
unter Verwendung dieser vier mehrschichtigen Analysenfilme
für GOT die GOT-Aktivitäten während einer Inkubationszeit
im Bereich von 5 min bis 30 min auf der
Grundlage einer Eichkurve quantitativ bestimmt werden
können.
Die Fig. 1 bis 8 zeigen Querschnitte von Ausführungsformen
des Analysenfilms der vorliegenden Erfindung. In
den Fig. 1 bis 8 haben die Bezugszahlen die nachstehend
angegebenen Bedeutungen:
10: Träger
20: Reagensschicht
21: POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht
22: TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht
23: TA-Substrat-Schicht
24: Farbstoff-Fixierschicht
25: Mit dem Reagens imprägnierter Träger
31: Poröse Spreitungsschicht
32: Poröse Schicht mit definierter Flächengröße
40: Lichtreflektierende Schicht.
20: Reagensschicht
21: POP-Farbbildungsreaktions-Farbstoff-Fixierschicht
22: TA-Substrat-POP-Farbbildungsreaktions-Schicht
23: TA-Substrat-Schicht
24: Farbstoff-Fixierschicht
25: Mit dem Reagens imprägnierter Träger
31: Poröse Spreitungsschicht
32: Poröse Schicht mit definierter Flächengröße
40: Lichtreflektierende Schicht.
Claims (10)
1. Analysenfilm enthaltend eine Reagensschicht, welche
- a) Transaminasesubstrat;
- b) Brenztraubensäureoxidase, die zur Bildung von Hydrogenperoxid befähigt ist;
- c) eine einen kationischen Farbstoff bildende Farbindikator- Zusammensetzung zum Nachweis von Hydrogenperoxid und
- d) ein anionisches Polymerisat zur Fixierung des gebildeten Farbstoffs enthält.
2. Analysenfilm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Analysenfilm zusätzlich eine Oxalacetat-Decarboxylase
enthält.
3. Analysenfilm nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reagensschicht eine als Phosphatquelle
dienende Verbindung, Flavin-Adenin-Dinucleotid,
Thiamin-Pyrophosphat und ein zwei- oder dreiwertiges
Metallion enthält.
4. Analysenfilm nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet, daß die Farbindikatorzusammensetzung
eine Substanz mit Peroxidase-Aktivität
einen Wasserstoff-Donator und einen Kuppler enthält,
wobei der Wasserstoff-Donator und der Kuppler eine zur
Bildung eines kationischen Farbstoffs befähigte Kombination
sind.
5. Analysenfilm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus einer
einzelnen Schicht besteht.
6. Analysenfilm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus mindestens
zwei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine
eine Transaminasesubstratschicht ist, die Transaminasesubstrat
enthält.
7. Analysenfilm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus mindestens
zwei Schichten zusammengesetzt ist, von denen eine
eine Transaminasesubstratschicht ist, die ein Transaminasesubstrat
enthält und eine eine Farbstoff-Fixierschicht
ist, die ein anionisches Polymerisat enthält.
8. Analysenfilm nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 7,
dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht aus
mindestens drei Schichten zusammengesetzt ist, von
denen eine eine Farbstoff-Fixierschicht ist, die ein
anionisches Polymerisat enthält.
9. Analysenfilm nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 7
und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht
aus mindestens drei Schichten zusammengesetzt ist, von
denen eine eine Transaminasesubstratschicht ist, die
Transaminasesubstrat enthält und eine eine Farbstoff-Fixierschicht
ist, die ein anionisches Polymerisat
enthält.
10. Analysenfilm nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagensschicht auf ihrer einen
Oberfläche einen Träger und auf ihrer anderen Oberfläche
eine poröse Schicht besitzt, wobei die poröse
Schicht an der Reagensschicht in fließfähiger Berührung
in Form eines einheitlichen Verbundstoffes haftet.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56028159A JPS57144996A (en) | 1981-02-27 | 1981-02-27 | Film for quantitative analysis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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