DE3135196A1 - Verfahren, mittel und vorrichtung zur bestimmung biologischer komponenten - Google Patents

Verfahren, mittel und vorrichtung zur bestimmung biologischer komponenten

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DE3135196A1
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Hans Rune Dipl.-Ing. Dr. 58248 Linköping Arwin
Norbert Dr. 6100 Darmstadt Hennrich
Kurt Ingemar Prof. Dipl.-Ing. Dr. 58252 Linköping Lundström
Erwin Dr. 6104 Seeheim-Jugenheim Rieke
Günter Dr. 6140 Bensheim Sielaff
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LUNDSTROEM, KURT INGEMAR, PROF.DR., 58252 LINKOEPI
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Merck Patent GmbH
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
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    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property

Description

Merck Patent Gesellschaft 3. September 19 81 mit beschränkter Haftung Darmstadt
Verfahren, Mittel und Vorrichtung zur Bestimmung biologischer Komponenten
;:; j ι
Merck Patent Gesellschaft
mit beschränkter Haftung
6100 Darmstadt
Verfahren, Mittel und Vorrichtung zur Bestimmung biologischer Komponenten
Die Erfindung betrifft Verfahren, Mittel und Vorrichtungen zur Bestimmung einer Komponente aus einer Gruppe, bestehend aus spezifisch bindenden Rezeptoren und Substanzen, die von diesen Rezeptoren spezifisch gebunden werden können, mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung, insbesondere Verfahren, Mittel und Vorrichtungen zur immunologischen Bestimmung von Antikörpern, Antigenen und Haptenen.
Die gebräuchlichsten Verfahren zur empfindlichen immunologischen Bestimmung von Antikörpern, Antigenen und Haptenen basieren auf der Verwendung von Markierungssubstanzen wie Radioisotope, Enzyme oder Fluorochrome, die chemisch an eine der Komponenten gekuppelt werden. Die Notwendigkeit, Antikörper, Antigene oder Haptene mit einer Markierungssubstanz zu kuppeln, beinhaltet jedoch eine Reihe wesentlicher Nachteile: durch die chemische Verknüpfung eines Antikörpers (Antigens) mit z.B.
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einem Enzym wird der Antikörper (Antigen) in seinem Bindungsverhalten gestört, d.h. die Bindungsaffinität nimmt ab; durch die chemische Verknüpfung eines Enzyms mit einem Antikörper (Antigen) wird die enzymatische Aktivität wesentlich vermindert; die Stabilität der Konjugate ist geringer als die Stabilität der Einzelsubstanzen; die Konjugate stellen sehr heterogene Verbindungen mit breitem Molekülargewichtsspektrum dar, wodurch eine reproduzierbare Herstellung außerordentlich erschwert wird; im Falle der Bindung der Konjugate an eine feste Phase wird die enzymatische Aktivität durch die Diffusion von Substraten und Produkten beeinflußt.
Aufgrund der geschilderten Nachteile besteht ein Bedürfnis nach einfacheren Methoden, die z.B. eine"direkte Messung der immunologischen Reaktion zulassen. Es sind zwar schon solche Verfahren bekannt, diese sind jedoch entweder wie die Trübungsmessung nicht empfindlich genug oder, wie die Bestimmung von Antigen-Antikörperschichten auf Metalloberflächen durch Ellipsometrie, zu aufwendig und zu kompliziert.
Eine gegenüber einem konventionellen Eilipsometer etwas vereinfachte Meßanordnung zur Bestimmung von dünnen Schichten wird in der europäischen Patentanmeldung 19 088 beschrieben, wobei im wesentlichen nur der Kompensator eines Eilipsometers durch eine Referenzoberfläche ersetzt ist. In der deutschen Offenlegungsschrift 26 38 250 wird ein einfaches Verfahren zur Erfassung von Antigen-Antikörperschichten auf mit Metallkügelchen beschichteten Gläsern beschrieben, das zwar die Schwierigkeiten der Ellipsometrie umgeht, jedoch nur semiquantitative Aussagen liefert.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren, Mittel und Vorrichtungen zur Bestimmung von Antikörpern, Antigenen und Haptenen zur Verfugung zu stellen, mit denen die geschilderten Nachteile vermieden werden können.
Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man eine dieser Komponenten auf einer reflektierenden Oberfläche immobilisiert, mit der zu bestimmenden Komponente inkubiert, bestrahlt und anhand der reflektierten Strahlung die Konzentration ermittelt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Komponente aus einer Gruppe, bestehend aus spezifisch bindenden Rezeptoren und Substanzen, die von diesen Rezeptoren spezifisch gebunden werden können, mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine der Komponenten nach Immobilisierung auf der Oberfläche eines Materials, dessen Brechungsindex sich von dem der Komponenten unterscheidet, mit der jeweils anderen Komponente und gegebenenfalls weiteren Komponenten, die markiert sein können, inkubiert, die Oberfläche mit elektromagnetischer, parallel zur Einfallsebene polarisierter Strahlung bestrahlt, wobei der Einfallswinkel der Strahlung nahe oder gleich dem Winkel Φ ist, bei dem die Intenc sität der von der unbeschichteten oder vorbeschichteten Oberfläche reflektierten Strahlung ein Minimum erreicht, und die Intensität der reflektierten Strahlung als Maß für die zu bestimmende Konzentration ermittelt.
Ferner betrifft die Erfindung Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens, enthaltend Plättchen oder Scheibchen des Materials, auf dessen Oberfläche eine der Komponenten immobilisiert ist sowie Standardlösungen bekannter Kon-
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zentrationen der zu bestimmenden Komponente und gegebenenfalls weitere Komponenten, die markiert sein können.
Weiterhin betrifft die Erfindung Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens, die gekennzeichnet sind durch einen Block (1) zur Aufnahme eines Lichtquellengehäuses (2) und eines Detektorgehäuses (3) wobei sich die optischen Achsen (5) und (6) beider Einheiten auf der zu untersuchenden Oberfläche des Materials (4) unter dem Winkel Φ zur Oberflächennormalen schneiden und im Lichtquellengehäuse (2) oder im Detektorgehäuse (3) ein Polarisationsfilter (7) angeordnet ist, das nur den parallel zur Einfallsebene polarisierten Teil der Strahlung der Auswertung zuführt.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein sehr einfacher quantitativer Nachweis immunologischer Reaktionen gefunden wurde, indem die Ermittlung der ellipsometrischen Winkel entfällt und durch eine rein photometrische Detektion ersetzt wird, bei der weder Manipulationen am Gerät, wie Änderungen des Einfallswinkels oder Rotationen der Polarisatoren bzw. des Kompensators, noch aufwendige Berechnungen zur Bestimmung der gesuchten Konzentration notwendig sind. Das Verfahren ist mit geringem technischen Aufwand durchführbar, die erforderlichen Vorrichtungen sind ganz wesentlich kleiner, kostengünstiger, störungsunanfälliger und einfacher zu bedienen, als bisher bekannte ellipsometrische Vorrichtungen, und es liefert für inkubierte Plättchen oder Scheibchen in kürzester Zeit konzentration proportionale Meßwerte, wodurch es sich auch gut zur Automatisierung sowie zur Simultanbestimmung mehrerer immunologischer Parameter eignet.
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Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist, daß der Brechungsindex des Materials, auf dessen Oberfläche das Antigen/Hapten oder der Antikörper immobilisiert werden soll, sich deutlich vom Brechungsindex der zu messenden Antigen/Hapten-Antikörperschicht unterscheidet und ein ausgeprägtes Minimum in der Darstellung des Reflektionskoeffizienten für parallel zur Einfallsebene polarisierte Strahlung gegen den Einfallswinkel Φ aufweist.
Bei diesem Einfallswinkel wird vorzugsweise monochromatisches Licht auf die mit der Antigen/Hapten-Antikörperschicht bedeckte Oberfläche gestrahlt; die Intensität des von der Oberfläche reflektierten Lichtes, und zwar des Teils, der parallel zur Einfallsebene polarisiert
-ic ist, wird gemessen.
Geeignete Materialien für die Immobilisierung der Komponenten sind solche, die eine ebene reflektierende Oberfläche aufweisen und deren Brechungsindex größer als 1,5, vorzugsweise größer als 2 ist. Das Material
2Q kann für die verwendete Strahlung undurchlässig oder durchlässig sein. Es können dafür vor allem Halbleiter, Dielektrika, Metalle oder damit überzogene Träger verwendet werden. Bevorzugte Materialien sind Halbleiter wie Silizium oder Germanium, Gläser, Kunststoffe, z.B.
Polymethylmethacrylat, Polystyrol, insbesondere mit Silizium überzogene Träger aus Glas oder Kunststoff sowie beliebige Träger, die mit einer Metallschicht überzogen sind.
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Die Oberfläche des gewählten Materials kann vor der Immobilisierung einer der Komponenten vorbeschichtet sein. So ist es z.B. möglich, die Oberfläche mit einem dünnen Polymerfilm zu überziehen, der sich gut für die anschließende Immobilisierung einer der Komponenten eignet. Weiterhin ist es möglich, z.B. bei Verwendung von Silizium oder Germanium, eine dünne Oxidschicht auf der Oberfläche aufzubringen. An dieser Oxidschicht kann dann eine der Komponenten gegebenenfalls nach chemischer Aktivierung des Oxids, in an sich bekannter Weise immobilisiert werden. Andererseits kann diese Oxidschicht auch mit reaktiven Silanen umgesetzt werden, wobei die Immobilisierung auch durch chemische Umsetzung mit noch reaktiven Gruppen des Silans durchgeführt werden kann.
Die auf der Oberfläche des Materials präformierte dünne Schicht führt neben ihrer Eignung für die Immobilisierung auch zu einer Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Zur Durchführung des Verfahrens wird auf der Oberfläche 2η eines oben beschriebenen Materials eine Antigen/Hapten-Schicht bzw. eine" Antikörperschicht immobilisiert. Das geschieht am einfachsten durch Inkubation der vorzugsweise gereinigten Oberfläche des Materials mit einer Lösung der zu bestimmenden Komponente. Wird die so gebildete Schicht 25" in Kontakt mit einer Antikörperlösung bzw. einer Antigen/ Haptenlösung gebracht, so bindet die erste Schicht spezifisch einen Teil der Moleküle aus dieser Lösung, so daß sich eine mehr oder weniger ausgeprägte zweite Schicht auf der ersten Schicht ausbildet. Der Grad der Bedeckung in dieser zweiten Schicht hängt von der Konzentration der Moleküle in der jeweiligen Lösung sowie von der Inkubationsdauer ab. Es hat sich überraschenderweise
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gezeigt, daß bei geeigneter Wahl des Materials für die Immobilisierung der Antigen/Haptenschicht bzw. der Antikörperschicht sowie eines definierten Einfallswinkels der Bedeckungsgrad in der zweiten Schicht durch eine einfache Messung der Intensität des von der Oberfläche reflektierten Lichtes gemessen werden kann, vorausgesetzt man verwendet Licht, das vor oder/und nach der Reflektion parallel zur Einfallsebene polarisiert ist.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können prinzipiell alle organischen Substanzen, zu denen ein Bindungspartner existiert, quantitativ bestimmt werden. So lassen sich z.B. in analoger Weise wie im Fall Antikörper-Antigen/Hapten auch Bestimmungen mit den Systemen Hormon-Hormonrezeptor, Lektin-Saccharid, Lektin-Glycoprotein, Enzym-Enzyminhibitor oder ähnlicher Systeme durchführen.
Neben der Konzentrationsbestimmung einer dieser Komponenten über die Messung der Intensität der von der zweiten Schicht reflektierten Strahlung sind noch andere Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens durchführbar. So kann die Bestimmung von Haptenen dadurch erleichtert werden, daß man das zu bestimmende Hapten mit einem Konjugat aus dem Hapten und einer weiteren immunchemisch indifferenten, großvolumigen Substanz um die Bindung an den Oberflächen gebundener Antikörper kompetitieren läßt. In diesem Fall bewirkt die an die Antikörperschicht gebundene großvolumige Substanz eine Signalerhöhung, wobei die Intensität des reflektierten Lichtes umgekehrt proportional zur Konzentration des Haptens in der Untersuchungslösung ist.
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, j ο ι 9
-XT-«
Eine weitere Modifikation besteht darin, daß man das Hapten der Untersuchungslösung mit einer bekannten Menge an Antikörper reagieren läßt und dann den noch nicht im Komplex befindlichen Antikörper mit oberflächengebundenem Hapten umsetzt. Hierbei ist es auch möglich, den eingesetzten Antikörper vorher mit einer großvolumigen Substanz wie Ferritin oder mit Partikeln wie Latex-Partikeln zu markieren, um eine Signalverstärkung zu erhalten.
In einer weiteren Variante kann das erfindungsgemäße Verfahren auch nach der sogenannten Sandwich-Methode durchgeführt werden. Dabei reagiert das Antigen der Untersuchungslösung zunächst mit dem oberflächengebundenen Antikörper. In einer weiteren Reaktion kann die entstandene (partielle) Doppelschicht mit dem gleichen oder einem anderen gegen das Antigen gerichteten Antikörper umgesetzt werden, wobei eine dreifache Schicht erhalten wird. Auch dieser Antikörper kann mit einem großvolumigen Molekül oder einem Partikel markiert sein, wobei die ausgewählten Partikel auch Metallpartikel sein können. Die Möglichkeiten zur Signalverstärkung durch eine oder mehrere Antikörper, die gegen die schon gebundene Komponente gerichtet sind oder durch andere Komponenten, die an die schon gebundene Komponen-
25' te binden oder von diesen gebunden werden, sind durch die obigen Beispiele nicht begrenzt; es können z.B. auch andere Bindungssysteme wie Avidin-Biotin oder Glycoprotein-Lectin verwendet werden.
Das Mittel nach der Erfindung besteht im wesentlichen aus Plättchen oder Scheibchen des genannten Materials, auf dessen Oberfläche eine Schicht aus der einen Komponente immobilisiert ist, sowie Standardlösungen mit bekannten
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Konzentrationen der anderen Komponente und gegebenenfalls eine Lösung einer der Komponenten, die mit einem dritten voluminösen Molekül konjugiert sein kann. Die Bestandteile liegen vorzugsweise in Form einer Testpackung vor.
Die Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, zeichnet sich durch einen sehr einfachen und kompakten Aufbau aus; sie wird anhand der Abbildungen 1 bis 3 näher erläutert. Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung einer solchen Vorrichtung, die Abbildungen 2 und 3 zeigen vorteilhafte Ausführungsformen.
Die in Abbildung 1 dargestellte Vorrichtung besteht aus einer Lichtquelle (9), einem Polarisationsfilter (7) und einem Fotodetektor (10), wobei der Einfallswinkel Φ und die Durchlaßrichtung des Polarisationsfilters (7) so eingestellt sind, daß die mit dem Detektor (10) nachweisbare Lichtintensität ein Minimum für ein bestimmtes, unbeschichtetes oder vorbeschichtetes Material (4) aufweist. Das Polarisationsfilter (7) kann unter den oben genannten Bedingungen selbstverständlich auch in den Strahlengang (6) anstelle des Strahlengangs (5) gebracht werden; werden 2 Polarisationsfilter (7) und (7') verwendet, so ist die Durchlassrichtung des Analysators (7') senkrecht zur Einfallsebene zu wählen. Ferner ist es zweckmäßig, wenn auch nicht zwingend, einen Monochromator (8), z.B. ein Filter, in den Strahlengang (5) einzubringen oder einen schmalbandigen Strahler (9) oder einen schmalbandigen Detektor (10) zu verwenden.
Die in Abbildung 2 dargestellte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung besteht aus einem Block (1), der unter dem Einfalls- bzw. Reflektionswinkel Φ je eine Bohrung zur
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Aufnahme des Lichtquellengehäuses (2) und des Detektorgehäuses (3) aufweist, wobei die optischen Achsen (5) und (6) sich in der Auflageebene (11) für das Material (4) schneiden. Wird als Material Silizium verwendet, das mit der gewünschten ebenen, hochreflektierenden Oberfläche erhältlich ist, so sind lediglich eine Glühlampe (9), das Polarisationsfilter (7) und ein Bleisulfid-Infrarotdetektor als Beispiel für einen schmalbandigen Fotoempfänger (10) als optische Teile der erfindungsgemäßen Vorrichtung er-
"IO forderlich. Als Lichtquelle eignen sich auch Laser, Laserdioden usw.
Eine weitere besonders vorteilhafte Ausführungsform ist in Abbildung 3 dargestellt. Der einfache, kompakte Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung gestattet es, mit zwei Teilstrahlen (5) und (5') zwei Materialien (4) und (4') bei ein und derselben Ausrichtung des Polarisationsfilters (7) simultan zu bestrahlen und die reflektierten Teilstrahlen (6) und (6') simultan mit 2 Detektoren (10) und (10') nachzuweisen. Hierdurch wird eine Relativmessung zwischen zwei mit unterschiedlichen Rezeptoren beschichteten, sonst aber gleichen Materialien (4) und (4') möglich und somit die Selektivität der Bestimmung erhöht. Weiterhin bietet die erfindungsgemäße Vorrichtung die Möglichkeit, mit einer Vielzahl von Teilstrahlen
25" eine entsprechende Vielzahl von Rezeptor- und Substanz-Gruppen simultan zu bestimmen.
Neben den beschriebenen Ausführungsbeispielen der Vorrichtung sind selbstverständlich weitere, an sich bekannte fotometrische Techniken anwendbar; so lassen sich Relativmessungen auf ein und demselben Materialscheibchen oder Mehrkomponentenbestimmmungen auf mehreren Scheibchen auch durch Scannen des Lichtstrahls oder durch Scannen der Materialscheibe(n)
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ausführen, und es lassen sich die Methoden zur Verbesserung der Signal/Rauschverhältnisse, z.B. Wechsellichtverstärker mit Phasenabstimmung oder Gleichtaktverstärker, die mit der Modulationsfrequenz synchronisiert sind, anwenden.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die einfach zu bewerkstelligende Mechanisierbarkeit; durch Verschieben oder Drehen des Materials (4) auf der Auflageebene (11) können mit geringem Aufwand eine hohe Zahl von Materialscheibchen ausgemessen werden, ohne daß aufwendige Justiervorrichtungen erforderlich wären.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
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Q '· Q ίΓ 1 Q C ν-, ι ^i U ι J U
Beispiel 1
Bestimmung von anti-Human-Serumalbumin
a) Silanisierung von Siliziumplättchen
Silizxumplättchen (10 χ 5 χ 0,3 mm) wurden 10 Minuten in einer Lösung von 10 % Dichlordimethylsilan in Trichlorethylen stehen gelassen und anschließend mit Trichlorethylen gewaschen.
b) Beschichtung mit Human-Serumalbumin (HSA)
Die silanisierten Plättchen wurden 30 Minuten in einer l%igen Lösung von HSA in Saline (0,15 M Natriumchloridlösung) stehen gelassen und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen.
c) Inkubation mit Kaninchen-anti-HSA-Serum (anti-HSA)
Die mit einer Monoschicht an HSA überzogenen Siliziumplättchen wurden 1 Stunde in verschiedene Verdünnungen von Kaninchen-anti-HSA-Serum in Phosphatgepufferter Saline (pH 7,4) mit 10 % normalem Kaninchenserum inkubiert und anschließend mit dest. Wasser gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.
d) Auswertung
Die Plättchen wurden mit zur Einfallsebene parallel polarisiertem Licht unter einem Einfallswinkel von 76,13° bestrahlt und die Intensität des reflektierten Lichtes wurde mit einem photosensitiven Empfänger gemessen. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, ist die gemessene Lichtintensität proportional der Konzentration des Antiserums.
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Verdünnung des Antiserums 8 Meßeinheiten
1 : 16 130,35
1 : 32 120,67
1 : 64 85,01
1 : 128 60,99
1 : 256 40,28
1 : 20,37
Beispiel 2
Bestimmung von anti-Human-Fibrinogen
Die Silanisierung der Siliziumplättchen wurde analog Beispiel 1 a) durchgeführt. Die Beschichtung mit Human-Fibrinogen wurde wie in Beispiel 1 b) beschrieben durchgeführt, wobei statt einer l%igen HSA-LÖsung eine 0,l%ige Fibrinogenlösung verwendet wurde. Die Inkubation mit Ziegen-anti-Human-Fibrinogen erfolgte analog Beispiel Ic), wobei hier Antiserum der Ziege gegen Fibrinogen eingesetzt wurde.
Die Auswertung der Plättchen erfolgte analog Beispiel 1 d) Auch hier ist die gemessene Lichtintensität proportional der Konzentration des Antiserums, wie die nachstehende Tabelle zeigt.
Verdünnung des Antiserums
Meßeinheiten
1 1 1 1 1
16
32
64
128
201,77
120,03
94,68
70,55
59,19
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I Ö
Beispiel 3
Bestimmung von anti-Human-Serumalbumin
Zur Aufbringung einer Oxidschicht auf ein Siliziumplättchen wurden Siliziumplättchen zunächst 30 Minuten lang unter strömendem Sauerstoffgas bei 900 0C im Ofen stehen gelassen. Danach wurde der Ofen noch 5 Minuten bei 900 0C mit Argongas gespült. Die Silanisierung der so behandelten Siliziumplättchen, die Beschichtung mit HSA und die Inkubation mit anti-HSA erfolgte analog Beispiel 1 a) - c).
Die Auswertung der Plättchen wurde wie in Beispiel 1 d) beschrieben durchgeführt. Aus der nachstehenden Tabelle ist erschichtlich, daß die Aufbringung einer Oxidschicht von ca. 120 S Dicke mit einer Empfindlichkeitssteigerung verbunden ist.
Verdünnung des Antiserums
Meßeinheiten
1 Beispiel 4 : 15
1 : 30
1 • 60
1 : 120
1 ■ 240
1 480
51,33
32,75
19.61
12,94
9,53
3,11
Kreuzreaktion mit Fibrinogen-Siliziumplättchen
Die Silanisierung der Siliziumplättchen erfolgte analog
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- yr-
Beispiel 1 a), und die anschließende Beschichtung mit Fibrinogen analog Beispiel 2b). Zur Untersuchung der Kreuzreaktion von anti-Fibrinogen und anti-HSA wurden die mit Fibrinogen beschichteten Plättchen wie in Beispiel 1 c) beschrieben, mit anti-HSA bzw. anti-Fibrinogen inkubiert.
Die Auswertung der Plättchen wurde analog Beispiel 1 d) durchgeführt. Wie aus den nachstehenden Tabellen hervorgeht, ist bei den mit anti-HSA inkubierten Plättchen keine Zunahme der Lichtintensität zu verzeichnen.
Verdünnung des Antiserums (anti-Fibrinogen)
Meßeinheiten
1 : 8 : 8 75,75
1 : 16 : 16 63,18
1 : 32 : 32 50,37
Verdünnung des Antiserums Meßeinheiten
(anti-HSA)
1 1,01
1 0,51
1 2,34
GSPHA29 I-ol-j
_ ier -
Beispiel 5
Bestimmung von Human-Serumalbumin (HSA) im Sandwich-Verfahren
Die Silanisierung der Siliziumplättchen erfolgte analog Beispiel la). Zur Beschichtung mit anti-HSA wurden die silanisierten Plättchen für 2 Stunden in einer Lösung von 100 pg/ml anti-HSA-IgG in Saline stehen gelassen und anschließend mit dest. Wasser gewaschen. Die so beschichteten Plättchen wurden dann 1 Stunde mit verschieden konzentrierten Lösungen von HSA in Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 0,1 % Rinderserumalbumin stehen gelassen und anschließend mit Phosphatpuffer gewaschen. Die Inkubation mit anti-HSA-Serum wurde wie in Beispiel Ic) durchgeführt, wobei das Antiserum 1 : 8 verdünnt wurde und die Inkubationszeit 3 Stunden betrug.
Die Auswertung der Plättchen wurde wie in Beispiel 1 d) durchgeführt. Wie aus der folgenden Tabelle ersichtlich ist, korreliert die gemessene Lichtintensität mit der Menge an HSA in der Inkubatxonslösung.
HSA [μg/ml] Meßeinheiten
2,40 142,50
1,60 128,89
1,20 114,31
1,00 98,26
0,80 86,99
0,60 70,02
0,40 46,76
0,20 24,17
0,10 15,32
0,05 6,68
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-XT-Jf
Beispiel 6
Bestimmung von HSA im Sandwich-Verfahren mit einem anti-HSA-Ferritin-Konjugat
Die Silanisierung der Siliziumplättchen, die Beschichtung mit anti-HSA und die Inkubation mit HSA erfolgte analog Beispiel 5. Die Inkubation mit anti-HSA-Ferritin-Konjugat wurde wie in Beispiel 1 c) beschrieben durchgeführt, wobei die Lösung des mit Ferritin konjugierten Antikörpers 1 : 10 verdünnt wurde.
Die Auswertung der Plättchen wurde wie in Beispiel 1 d) durchgeführt. Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, korreliert die gemessene Lichtintensität mit der Menge an HSA in der Inkubationslösung.
HSA [μg/ml] Meßeinheiten
1,30 202,44
0,80 148,51
0,40 . 87,97'
0,20 50,03
0,10 28,59
0,05 18,18
0,025 7,23
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Beispiel 7
Bestimmung von Human-Serumalbumin (HSA) im Kompetitionsverfahren
Die Silanisierung der Siliziumplattchen und die Beschichtung mit HSA erfolgte analog Beispiel la) und 1 b). Zur Inkubation mit HSA und anti-HSA wurde zunächst eine Verdünnungsreihe von Humanseren in Phosphatpuffer, der 1 % Rinderserumalbumin enthielt, hergestellt. Zu 1 ml der jeweiligen Verdünnung wurden 0,25 ml anti-HSA (5 mg Antikörper/ml Phosphatpuffer) gegeben und die nach Beispiel la) präparierten Plättchen wurden in diese Lösung getaucht. Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden wurden die Plättchen gewaschen und getrocknet.
Die Auswertung der Plättchen wurde wie in Beispiel 1 d) durchgeführt. Wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, ist das Meßsignal umgekehrt proportional zur Konzentration des Humanserums. In analoger Weise konnte statt anti-HSA ein anti-HSA-Ferritin-Konjugat eingesetzt werden.
20 Verdünnung des Humanserums
Meßeinheiten
1 8
1 16
1 32
1 64
1 : 128
1 : 256
18,62
41,08
60,00
81,93
109,19
128,94
GSPHA29 I-ol-j
'■"'<\ -λ Ί MK
il I ν» O I J U
Beispiel 8
Bestimmung von L--Thyroxin im Kompetitionsverfahren
Die Silanisierung der Siliziumplättchen erfolgte analog Beispiel 1 a). Zur Herstellung eines L-Thyroxin-Ferritin-Konjugates wurden 500 mg Ferritin in 250 ml dest. Wasser gelöst und mit 10 mg L-Thyroxin (Natriumsalz) versetzt. Die Lösung wurde bei einem pH-Wert von 5,5 mit 12 mg N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid in 5 ml Wasser versetzt und 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsprodukt wurde zehnmal gegen 5 Liter Wasser mit 0,9 % Benzylalkohol dialysiert. Nach Zentrifugation wurde die Lösung lyophilisiert. Die Plättchen wurden dann analog Beispiel 1 b) mit einer Lösung von 100 μg/ml Kaninchenanti-L-Thyroxin-Antikörpern beschichtet. Zur Inkubation
-]5 mit L-Thyroxin und L-Thyroxin-Ferritin-Konj ugat wurde zunächt eine Verdünnungsreihe (5-100 ng/ml) von L-Thyroxin in Phosphatpuffer mit 1 % Rinderserumalbumin (je 1 ml) hergestellt. In diese Lösungen wurden die mit anti-L-Thyroxin beschichteten Plättchen gegeben und 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 20 μΐ einer Lösung von L-Thyroxin-Ferritin-Konjugat (1 mg/ml) zugegeben und nochmals 2 Stunden inkubiert. Danach wurde gewaschen und getrocknet.
Die Plättchen wurden wie in Beispiel 1 d) beschrieben gemessen. Aus der nachstehenden Tabelle geht hervor, daß die Konzentration an L-Thyroxin umgekehrt proportional der Lichtintensität ist.
GSPHA29 I-ol-j
- /if
L-Thyroxin [ng/ml] Meßeinheiten
100 5,33
80 6,10
60 8,05
40 10,96
20 14,49
10 17,71
5 19,83
Beispiel 9
Bestimmung von Human-Immunoglobulin (h-IgG) im Sandwich-Verfahren mit Immunobeads Kaninchen-antihuman-IgG (a-h-IgG)
Die Silanisierung der Siliziumplättchen erfolgte analog Beispiel la). Zur Beschichtung mit Kaninchen-antihuman-IgG wurden die silanisierten Plättchen für 2 Stunden in einer Lösung von 100 μg/ml a-h-IgG in Saline stehen gelassen und anschließend mit dest. Wasser gewaschen. Die so beschichteten Plättchen wurden dann 1 Stunde mit verschieden konzentrierten Lösungen von IgG in Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 0,1 % Rinderserumalbumin stehen gelassen und anschließend mit Phosphatpuffer gewaschen. Die Inkubation mit Immunobeads Kaninchen-antihuman-IgG wurde wie in Beispiel 1 c) durchgeführt, wobei die Immunobeads in einer Konzentration von 1 mg/ml eingesetzt wurden. Es wurde 3 Stunden unter ständigem Schütteln inkubiert.
Die Auswertung erfolgte analog Beispiel 1 d). Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, korreliert die gemessene Lichtintensität mit der Menge an h-IgG in der Inkubationslösung.
GSPHA29 I-ol-j
h-IgG [ng/ml] Meßeinheiten
80,0 172,51
40,0 115,10
20,0 71,82
10,0 42,18
5,0 28,33
2,5 16,71
1,0 8,27
0,5 5,06
GSPHA29 I-ol-j
Leerseite

Claims (9)

Merck Patent Gesellschaft mit beschränkter Haftung Darmstadt Patentansprüche
1. ;. Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Komponente
: ' —'. aus einer Gruppe, bestehend aus spezifisch bindenden Rezeptoren und Substanzen, die von diesen Rezeptoren spezifisch gebunden werden können, mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der Komponenten nach Immobilisierung auf der Oberfläche eines Materials, dessen Brechungsindex sich von dem der Komponenten unterscheidet, mit der jeweils anderen Komponente und gegebenenfalls weiteren Komponenten, die markiert sein können, inkubiert, die Oberfläche mit elektromagnetischer, parallel zur Einfallsebene polarisierter Strahlung bestrahlt, wobei der Einfallswinkel der
■j 5 Strahlung nahe oder gleich dem Winkel Φ ist, bei dem die Intensität der von der unbeschichteten oder vorbeschichteten Oberfläche reflektierten Strahlung ein Minimum erreicht, und die Intensität der reflektierten Strahlung als Maß für die zu bestimmende Konzentration ermittelt.
GSPHA29 I-ol-j
2. Verfahren nach Anspruch Ix dadurch gekennzeichnet, daß als Material ein solches mit einem hohen Brechungsindex verwendet wird.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch ge-
kennzeichnet, daß als Material Halbleiter, Dielektrika, Metall oder damit überzogene Träger verwendet werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Material Silizium oder ein mit Silizium überzogener Träger verwendet wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Materials mit einer Oxidschicht, einem Polymerfilm oder durch Silanisierung vorbeschichtet wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe eines zweiten Strahls eine zweite Oberfläche des gleichen, jedoch nicht inkubierten Materials bestrahlt wird und aus der Differenz der beiden reflektierten Intensitäten die zu bestimmende Konzentration ermittelt wird.
7. Verfahren nach den. Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe mehrerer Strahlen auf mit unterschiedlichen Komponenten beschichtete Materialien eingestrahlt wird und aus den Intensitäten der reflektierten Strahlen die Konzentrationen dieser Komponenten simultan bestimmt werden.
GSPHA29 I-ol-j
8. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 7, enthaltend Plättchen oder Scheibchen des Materials, auf dessen Oberfläche eine der Komponenten immobilisiert ist sowie Standardlösungen bekannter Konzentrationen der zu bestimmenden Komponente und gegebenenfalls weitere Komponenten, die markiert sein können.
9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 7, gekennzeichnet durch einen Block
(1) zur Aufnahme eines Lichtguellengehäuses (2) und eines Detektorgehäuses (3) wobei sich die optischen Achsen (5) und (6) beider Einheiten auf der zu untersuchenden Oberfläche des Materials (4) unter dem Winkel Φ zur Oberflächennormalen schneiden und
-|5 im Lichtquellengehäuse (2) oder im Detektorgehäuse (3) ein Polarisationsfilter (7) angeordnet ist, das nur den parallel zur Einfallsebene polarisierten Teil der Strahlung der Auswertung zuführt.
GSPHA29 I-ol-j
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