DE3108386C2

DE3108386C2 -

Info

Publication number: DE3108386C2
Application number: DE3108386A
Authority: DE
Inventors: Peter Lindsay Northwood New South Wales Au Rogers; David Edward Maroubra New South Wales Au Tribe
Original assignee: Unisearch Ltd
Current assignee: Unisearch Ltd
Priority date: 1980-03-05
Filing date: 1981-03-05
Publication date: 1989-02-02
Also published as: FR2477571B1; BR8101335A; NZ196399A; GB2074188A; CA1173381A; GB2074188B; US4403034A; FR2477572B1; ZA811435B; CA1174191A; DE3108384A1; FR2477571A1; JPS6357039B2; US4443544A; JPS56164790A; BR8101334A; ZA811434B; FR2477572A1; DE3108386A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol (Alkohol) unter Verwendung des Bakteriums Zymomonas mobilis.

Es ist bekannt, das Bakterium Zymomonas mobilis zur Herstellung von Äthanol zu verwenden, und dieses Bakterium wird zur Herstellung von Palmwein und anderen alkoholischen Getränken in tropischen Ländern verwendet. Es ist weiterhin bekannt, daß die Herstellung von Äthanol unter Verwendung dieses Bakteriums theoretisch gewisse Vorteile hat verglichen mit Hefen, welche üblicherweise zur Herstellung von Alkohol durch Vergärung von Zuckern, Stärken und anderen Kohlenhydrat-Substraten verwendet werden. Diese Vorteile schließen die Tatsache mit ein, daß Zymomonas mobilis verglichen mit Hefen weniger Biomasse erzeugt, was zurückzuführen ist auf die für das Wachstum zur Verfügung stehende geringere Energie, die dem Entner-Doudoroff-Weg zu eigen ist, welchen das Bakterium beschreitet, und der nur 1 Mol ATP pro Mol metabolisierter Glucose liefert, zum Unterschied zu dem glycolytischen Weg, der von den Hefen beschritten wird, und der 2 Mol ATP pro Mol Glucose liefert. Ein weiterer potentieller Vorteil ist es, daß Zymomonas mobilis anaerob wächst.

Die Erfinder haben nun gefunden, daß die Äthanolproduktion stark erhöht werden kann, wenn man bestimmte Zymomonas mobilis-Stämme unter Zellen-Recycling kontinuierlich kultiviert. Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß eine kontinuierliche Kultur von Zymomonas mobilis ATCC 31821, 31822 oder 31823 unter Zellen-Recycling nicht mit den Schwierigkeiten behaftet ist, welche eine kontinuierliche Kultur von üblichen Hefen unter Zellen-Recycling zeigt. Diese Schwierigkeiten beinhalten die Notwendigkeit der Verwendung von sterilem Sauerstoff, um die Ertragskraft der Hefe zellen bei hohen Hefekonzentrationen zu erhalten, und die Wahrscheinlichkeit der Kontamination durch unerwünschte Bakterien während des verlängerten Zeitraums der kontinuierlichen Arbeitsweise. Gegenstand der Erfindung ist daher das Verfahren gemäß Patentanspruch 1.

Für die Vergärung mit dem erfindungsgemäß verwendeten Zymomonas mobilis unter Verwendung einer kontinuierlichen Kultur mit Zellen-Recycling, mit der man außerdem, verglichen mit anderen Zymomonas mobilis-Vergärungs techniken und mit der Hefegärung eine höhere Äthanolproduktion erreicht, ist zur Erhaltung der Ertragskraft bei hohen Zellenkonzentrationen Sauerstoff nicht erforderlich. Weiterhin wurde gefunden, daß aufgrund der höheren Geschwindigkeiten der Zuckeraufnahme und der erhöhten Äthanoltoleranz im Vergleich zu Hefen während verlängerter Zeiträume der konti nuierlichen Arbeitsweise keine Kontaminierung erfolgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20°C bis 50°C durchgeführt, insbesondere bei 25 bis 40°C, und bei einem pH-Wert zwischen 3,7 und 8, insbesondere zwischen 4,5 und 6,5. Das Medium enthält vor zugsweise 100 bis 400 g/l eines vergärbaren Kohlenhydrats, und insbesondere 150 bis 300 g/l.

Die bevorzugten Kohlenhydrate zur Verwendung als vergärbare Substrate im Kulturboden umfassen neben Glucose einfache Zucker, wie z. B. Fructose, Lactose und Sucrose, Stärke und Stärkehydrolysate, und Cellulose-Rohmaterialien. Es ist festzustellen, daß wahrscheinlich nicht jeder der genannten Zymomonas mobilis-Stämme alle diese Substrate vergärt, und deshalb sollte für einen bestimmten Stamm ein geeignetes, vergärbares Substrat ausgewählt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Zymomonas mobilis-Stämme besitzen eine hohe spezifische Äthanol-Produktivität, eine hohe spezifische Glucoseaufnahmegeschwin digkeit und eine hohe Alkoholtoleranz.

Die Abtrennung der Zellen aus dem abgeführten Teil des Kul turbodens kann auf irgendeine geeignete Weise erfolgen. Die Zellen können z. B. unter Verwendung eines Querstrom- Mikrofiltrations-Membran-Systems abgetrennt werden, vorzugsweise unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße in der Größenordnung von 0,6 Mikron.

Alternativ können die Zellen in einer Zentrifuge oder in Hydroclon-Serien abgetrennt werden. Wenn flockenartige Zymomonas mobilis-Zellen verwendet werden, können diese vom Kulturboden abgetrennt werden, indem man sie in einem Absetzgefäß oder in Hydroclon-Serien absetzen läßt.

Die Zymomonas mobilis-Stämme, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, wurden in der Amerikanischen Sorten- Kultursammlung (American Type Culture Collection), 12301 Park Lawn Drive Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt und wurden mit den folgenden Hinterlegungsnummern und Daten gekennzeichnet:

Beispiele

In den folgenden Beispielen wurde das Bakterium Zymomonas mobilis in einem Gärungsmedium kultiviert, welches die folgenden Nährstoffkonzentrationen enthielt:

100-300 g/l
Glucose
5 g/l	Hefeextrakt
1 g/l	(NH₄)₂SO₄
1 g/l	KH₂PO₄
0,5 g/l	MgSO₄ · 7 H₂O

Die Kulturen der verschiedenen Zymomonas mobilis-Stämme wurden durch wöchentliches Aufbringen auf frische Agar-Platten, welche 20 g Glucose, 10 g Hefeextrakt und 20 g Agar enthielten, bei einem pH-Wert von 5,0 und Lagerung bei Raumtemperatur aufrechterhalten.

Das kontinuierliche Gärungssystem wurde bei einer Temperatur von 30°C und einem pH-Wert von 5,0 in einem 1-l-Gärgefäß belassen. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 N NaOH ge steuert.

In diesen Versuchen wurde das Zellen-Recycling unter Verwendung eines Querstrom-Mikrofiltrations-Membran-System, welches eine "Millipore"-Membran BD mit einer nominalen Porengröße von 0,6 Mikron enthielt, durchgeführt. Diese Membran hielt alle Zellen zurück und der durch die Membran gehende Durchfluß war frei von Zellen und enthielt die gleiche Äthanolkonzentration wie der Inhalt des Gärbottichs (Fermenter).

Die Fig. 1 zeigt die Anordnung des Fermenters und des Zellen-Recycling-Systems. In dieser Figur bedeutet 10 den Fermenter, der mit dem Rührer 11 versehen ist. Der Nährboden wird in den Fermenter 10 durch die Leitung 12 einge bracht und durch die Leitung 13 zu einer Pumpe 14 abge führt und von dort zu einem Tangentialfluß-Mikrofilter 15. Der Durchsatz durch das Filter 15 wird über die Leitung 16 zur Lagerung abgeführt, bevor das Äthanol daraus gewonnen wird, während das zurückgehaltene Zellenkonzentrat über die Leitung 17 in den Fermenter 10 zurückgeführt wird. Eine Überflußleitung 18 ist vorgesehen.

Die Tabelle I zeigt die stark verbesserte maximale Äthanol- Produktivität für 2 der erfindungsgemäß mittels Zellen-Recycling kontinuierlich kultivierten Zymomonas mobilis-Stämme im Vergleich zu zwei Stämmen der Hefe Saccharomyces Cerevisiae.

Tabelle I

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die kontinuierlichen Kulturen von Zymomonas mobilis mittels Zellen-Recycling Produktivitäten ergeben können, welche 200 bis 300% höher sind als die für unter ähnlichen Bedingungen ausgeführten Hefegärungen. Das bedeutet, daß die Größe der Gärbottiche zur Herstellung von Äthanol in einem entsprechenden Ausmaß verringert werden kann.

Der Organismus Zymomonas mobilis ZM 481 wurde aus dem Stamm CP 4 wie folgt erhalten:

Der Stamm CP 4 wurde statisch bei 30°C bis zur exponentiellen Wachstumsphase gezüchtet. Dann wurde Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugefügt und die Kultur 30 min bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit salzhaltigem Phosphatpuffer gewaschen und nochmals über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die Kultur wurde dann auf Böden aufgebracht, die 10% (v/v) Äthanol enthielten. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 30°C bildeten sich Mutantenkolonien in einer Häufigkeit von ca. 10^-7, und diese wurden auf einem ähnlichen Medium gereinigt und dann auf ihre Wachstums- und Äthanolproduktionsgeschwindigkeiten mit 100, 200 und 250 g/l Glucose bei 30°C in Röhrchen ge testet. Die Kultur, welche in der kürzesten Zeit das meiste Äthanol produzierte, wurde als ZM 48 bezeichnet.

Eine zweite ähnliche Mutagenese wurde mit dem Stamm ZM 48 durchgeführt, aber die Zellen wurden mit 15% (v/v) Äthanol überzogen. Der Mutant, der in der kürzesten Zeit das meiste Äthanol produzierte, wurde als ZM 481 bezeichnet.

Die Verwendung von flockenartigen Zymomonas mobilis-Stämmen im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft. Tabelle II vergleicht die Verwendung eines flockenartigen Stammes von Zymomonas mobilis unter Verwendung einer Absetzsäule mit einem flockenartigen Stamm von Saccharomyces Cerevisiae.

In der folgenden Tabelle werden die mit dem flockenartigen Zymomonas mobilis-Stamm erhaltenen Ergebnisse verglichen mit den Ergebnissen für einen flockenartigen Stamm von Saccharomyces Cerevisiae.

Tabelle II

Die flockenartige Mutante ZM 401 wurde wie folgt isoliert: eine Kultur des Stammes CP 4 wurde in einem reichen Medium, RM (20 g/l Glucose, 10 g/l Hefeextrakt, 2 g/l KH₂PO₄) statisch bei 30°C bis zur exponentiellen Wachstumsphase gezüchtet. Dann wurde Nitrosoguanidin (NTG) bis zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugefügt und die Kultur 1 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal in salz haltigem Phosphatpuffer gewaschen, und statisch über Nacht in RM bei 30°C inkubiert. Nach dieser Zeit waren am Boden der Flasche einige kleine körnige Flocken sichtbar. Das überstehende Medium mit der Mehrheit der Zellen wurde vor sichtig entfernt, und frisches Medium zugefügt. Nach alle 24 h wiederholter Tochterkultivierung während 7 Tagen in der gleichen Weise wurde eine offensichtlich reine Kultur von körnigen Flocken erhalten. Diese Kultur wurde an RM-Platten zweimal abgestrichen, um sie durch Einzel kolonie-Isolation weiter zu reinigen. Eine Einzelkolonie wurde dann in flüssigem Medium nochmals getestet, und war noch flockenartig. Sie wurde als der flockenartige Stamm gewählt und als ZM 401 bezeichnet.

Aus der Tabelle geht hervor, daß ZM 401 in bezug auf erhöhte Produktivitäten gegenüber Stämmen von flockenartiger Hefe erhebliche Vorteile besitzt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus einem ein vergärbares Kohlehydrat enthaltendem Medium durch kontinuierliche Fermentation mit einem das Kohlenhydrat unter Ethanolbildung vergärenden Mikroorganismus, wobei man einen Teil des Kulturbodens kontinuierlich oder periodisch abführt und durch einen frischen Kulturboden ersetzt, aus dem abgeführten Teil die Zellen abtrennt und in den Kulturboden zurückführt und das in dem Teil des Kulturbodens, von dem die Zellen abgetrennt wurden enthaltene Ethanol gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Zymomonas mobilis ATCC 31821, 31822 oder 31823 verwendet und anaerob kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Zellen von dem abgeführten Teil des Kulturbodens durch Filtration abgetrennt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Zellen flockenartig sind und von dem abgeführten Teil des Kulturbodens in einem Absetzgefäß abgetrennt werden.