DE3108386A1 - Kontinuierliches verfahren zur herstellung von aethanol mittels zellen-recycling - Google Patents

Kontinuierliches verfahren zur herstellung von aethanol mittels zellen-recycling

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Description

Patentanwälte Dip't.-lHs. H.-WEicKM-jtNNf-DiPL.-PHYS. Dr. K. Ftncke
Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.Ing. H.Liska 3100386
8000 MÜNCHEN 86, DEN H/SM/Hl POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
UNISEARCH LIMITED,
221-227 Anzac Parade, Kensington, New South Wales, Australien
Kontinuierliches Verfahren zur. Herstellung von Äthanol mittels Zellen-Recycling
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol (Alkohol) unter Verwendung des Bakteriums Zymomonas mobilis.
Es ist bekannt, das Bakterium Zymomonas mobilis zur Herstellung von Äthanol zu verwenden, und dieses Bakterium wird zur Herstellung von Palmwein und anderen alkoholischen Getränken in tropischen Ländern verwendet. Es ist weiterhin bekannt, daß die Herstellung von Äthanol unter Verwendung dieses Bakteriums theoretisch gewisse Vorteile hat verglichen mit Hefen, welche üblicherweise zur Herstellung von Alkohol durch Vergärung von Zuckern, Stärken und anderen Kohlenhydrat-Substraten verwendet werden. Diese Vorteile schließen die Tatsache mit ein, daß Zymomonas mobilis verglichen
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mit Hefen weniger Biomasse erzeugt, was zurückzuführen ist auf die für das Wachstum zur Verfügung stehende geringere Energie/ die dem Entner-Doudoroff-Weg zu eigen ist, welchen das Bakterium beschreitet, und der nur 1 Mol ATP pro Mol metabolisierter Glucose liefert, zum Unterschied zu dem glycolytischen Weg, der von den Hefen beschritten wird, und der 2 Mol ATP pro Mol Glucose liefert. Ein weiterer potentieller Vorteil ist es, daß Zymomonas mobilis anaerob wächst.
Die Erfinder haben nun gefunden, daß die Äthanolproduktion stark erhöht werden kann, wenn man Zymomonas mobilis unter Zellen-Recycling kontinuierlich kultiviert. Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß eine kontinuierliche Kultur von Zymomonas mobilis unter Zellen-Recycling nicht mit den Schwierigkeiten behaftet ist, welche eine kontinuierliche Kultur von üblichen Hefen unter Zellen-Recycling zeigt. Diese Schwierigkeiten beinhalten die Notwendigkeit der Verwendung von sterilem Sauerstoff, um die Ertragskraft der Hefezellen bei hohen Hefekonzentrationen zu erhalten, und die Wahrscheinlichkeit der Kontamination durch unerwünschte Bakterien während des verlängerten Zeitraums der kontinuierlichen Arbeitsweise.
Für die Vergärung mit Zymomonas mobilis unter Verwendung einer kontinuierlichen Kultur mit Zellen-Recycling, mit der man außerdem, verglichen mit anderen Zymomonas mobilis-Vergärungstechniken und mit der Hefegärung eine"höhere Äthanolproduktion erreicht, ist zur Erhaltung der Ertragskraft bei hohen Zellenkonzentrationen Sauerstoff nicht erforderlich. Weiterhin wurde gefunden, daß aufgrund der höheren Geschwindigkeiten der Zuckeraufnähme und der erhöhten Äthanoltoleranz im Vergleich zu Hefen während verlängerter Zeiträume der kontinuierlichen Arbeitsweise keine Kontaminierung erfolgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel-
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lung von Äthanol aus einem ein vergärbares Kohlenhydrat enthaltenden Medium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Zymomonas mobilis im Kulturboden kontinuierlich kultiviert, einen Teil des Kulturbodens kontinuierlich oder periodisch abführt und durch einen frischen Kulturboden ersetzt, von dem abgeführten Teil des Kulturbodens die darin enthaltenen Zellen von Zymomonas mobilis abtrennt, diese Zellen in den Kulturboden zurückführt, und das in dem Teil des Kulturbodens, von dem die Zellen abgetrennt wurden, enthaltene Äthanol gewinnt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 2O°C bis 5O°C durchgeführt, insbesondere bei 2 5 bis 40°C, und bei einem pH-Wert zwischen 3,7 und 8, insbesondere zwischen 4,5 und 6,5. Das Medium enthält vorzugsweise 100 bis.400 g/l eines vergärbaren Kohlenhydrats, und insbesondere 150 bis 300 g/l.
Die bevorzugten Kohlenhydrate zur Verwendung als vergärbare Substrate im Kulturboden umfassen neben Glucose einfache Zucker, wie z.B. Fructose, Lactose und Sucrose, Stärke und Stärkehydrolysate, und Cellulose-Rohmaterialien. Es ist festzustellen, daß wahrscheinlich nicht jeder Stamm von Zymomonas mobilis alle diese Substrate vergärt, und deshalb sollte für einen bestimmten Stamm ein geeignetes, vergärbares Substrat ausgewählt werden.
Vorzugsweise wird im Verfahren ein Zymomonas mobilis-Stamm verwendet, der eine hohe spezifische Äthanol-Produktivität besitzt, eine hohe spezifische Glucoseaufnahmegeschwindigkeit und eine hohe Alkoholtoleranz. Ein besonders geeigneter Organismus ist CP4 aus der Sortenkultursainmlung (Type Culture Collection) von:
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Dr. J. De Ley
Laboratorium für Mikrobiologie Ledeganckstraat 35,
B - 900 Gent
Belgien
Es wurde auch gefunden, daß Mutanten dieses Stammes für die Durchführung des Verfahrens besonders geeignet sind und ein breiteres Spektrum der damit vergärbaren Substrate als CP4 selbst besitzen können. Die Mutanten-Stämme können durch Mutationen eines Stammes, z.B. unter Verwendung von Ü.V.Strahlung oder von Nitrosoguanidin, erhalten werden. Gewünschte. Eigenschaften können in die Zymomonas mobilis-Stämme auch eingeführt werden durch Plasmaübertragung (plasmid transfer) von anderen Bakterien, z.B. unter Verwendung von Membranfilter-Abquetsch-Techniken (membrane filter mating techniques).
Die Abtrennung der Zellen aus dem abgeführten Teil des Kulturbodens kann auf irgendeine geeignete Weise erfolgen. Die Zellen können z.B. unter Verwendung eines Querstrom-Mikrofiltrations-Membran-Systems (cross-flow microfiltration membrane system) abgetrennt werden, vorzugsweise unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße in der Größenordnung von 0,6 Mikron.
Alternativ können die Zellen in einer Zentrifuge oder in Hydroclon-Serien (series of hydroclones) abgetrennt werden. Wenn flockenartige Zymomonas mobilis-Zellenverwendet werden, können diese vom Kulturboden abgetrennt werden, indem man sie in einem Absetzgefäß oder in Hydroclon-Serien absetzen läßt.
Die Zymomonas mobilis-Stämme, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, wurden in der Amerikanischen Sorten-Kultur Sammlung (American Type Culture Collection), 12301 Park Lawn Drive Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt
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und wurden mit den folgenden Hinterlegungsnummern und Daten gekennzeichnet:
Spezifikation ATCC-Hinterlegungs- Hinterlegungs-Nummer " Datum
26.Februar 1981 26.Februar 1981 26.Februar 1981
CP 4 31821
ZM481 51823
ZM4O1 31822
Beispiele
In den folgenden Beispielen wurde das Bakterium Zymomonas mobilis in einem Gärungsmedium kultiviert, welches die folgenden Nährstoffkonzentrationen enthielt:
100-300 g/l Glucose
5 g /1 Hefeextrakt
1 g /1 (NH4)2SO4
1 g /1 KH2PO4
0,5 g/l MgSO4.7H2O
Die Kulturen der verschiedenen Zymomonas mobilis-Stämme wurden durch wöchentliches Aufbringen auf frische Agar-Platten (agar slants), welche 20 g Glucose, 10 g Hefeextrakt und 20 g Agar enthielten, bei einem pH-Wert von 5,0 und Lagerung bei Raumtemperatur aufrechterhalten.
Das kontinuierliche Gärungssystem wurde bei einer Temperatur von 30 C und einem pH-Wert von 5,0 in einem 1 1-Gärgefäß belassen. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2 N NaOH gesteuert.
In diesen Versuchen wurde das Zellen-Recycling unter Verwendung eines Querstrom-Mikrofiltrations-Membran-Systems, welches eine "Millipore"-Membran BD mit einer nominalen Porengröße von
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0,6 Mikron enthielt, durchgeführt. Diese Membran hielt alle Zellen zurück und der durch die Membran gehende Durchfluß war frei von Zellen und enthielt die gleiche Äthanolkonzentration wie der Inhalt des Gärbottichs (fermenter).
Die Figur 1 zeigt die Anordnung des Fermenters und des Zellen-Recycling-Systems. In dieser Figur bedeutet 10 den Gärbottich, der mit dem Rührer 11 versehen ist. Der Nährboden wird in den Fermenter 10 durch die Leitung 12 eingebracht und durch die Leitung 13 zu einer Pumpe 14 abgeführt und von dort zu einem Tangentialfluß-Mikrofilter 15. Der Durchsatz durch das Filter 15 wird über die Leitung 16 zur Lagerung abgeführt, bevor das Äthanol daraus gewonnen wird, während das zurückgehaltene Zellenkonzentrat über die Leitung 17 in den Fermenter 10 zurückgeführt wird. Eine Überflußleitung 18 ist vorgesehen.
Die Tabelle I zeigt die stark verbesserte maximale Äthanol-Produktivität von drei mittels Zellen-Recycling kontinuierlich kultivierten Zymomonas mobilis-Stämmen im Vergleich zu zwei Stämmen der Hefe Saccharomyces Cerevisiae.
Tabelle I
Organismus Glucose
Konz.
(g/i)		 Äthanol
Konz.
(g/i)		 Maximale
Produktivität
(g/i/h)
S. Cerevisiae
(ATCC 4126)		 100 43 29
S. Cerevisiae
(NRRL Y-132)		 150 61 32
Z. Mobilis
(ATCC 10988)		 100 45 120
Z. Mobilis
(CP4)		 140 65 200
Z. Mobilis
(ZM481)		 180 85 85 '
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Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die kontinuierlichen Kulturen von Zymomonas mobilis mittels Zellen-Recycling Produktivitäten ergeben können, welche 200 bis 300 % höher sind als die für unter ähnlichen Bedingungen ausgeführten Hefegärungen. Das bedeutet, daß die Größe der Gärbottiche zur Herstellung von Äthanol in einem entsprechenden Ausmaß verringert werden kann.
Der Organismus Zymomonas mobilis ZM481 wurde aus dem Stamm CP4 wie folgt erhalten:
Der Stamm CP4 wurde statisch bei 30 C bis zur exponentiellen Wachstumsphase gezüchtet. Dann wurde Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 /ug/ml zugefügt und die Kultur 30 min bei 300C inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit salzhaltigem Phosphatpuffer gewaschen und nochmals über Nacht bei 30 C gezüchtet. Die Kultur wurde dann auf Böden aufgebracht, die 10 % (v/v) Äthanol enthielten. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 30 C bildeten sich Mutantenkolonien in einer Häufigkeit von ca. 10 , und diese wurden auf einem ähnlichen Medium gareinigt und dann auf ihre Wachstums- und Äthanolproduktionsgeschwindigkeiten mit 100, 200 und 250 g/l Glucose bei 30°C in Röhrchen getestet. Die Kultur, welche in der kürzesten Zeit das meiste Äthanol produzierte, wurde als ZM4 8 bezeichnet.
Eine zweite ähnliche Mutagenese wurde"mit dem Stamm ZM48 durchgeführt, aber die Zellen wurden mit 15 % (v/v) Äthanol überzogen. Der Mutant, der in der kürzesten Zeit das meiste Äthanol produzierte, wurde als ZM481 bezeichnet, und wurde als ein Äthanol—toleranter Stamm in der Sortenkultursammlung (Type Culture Collection) in der School of Biotechnology, University of New South Wales, Sydney, New South Wales, Australia, aufbewahrt.
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Die Verwendung von flockenartigen Zymomonas mobilis-Stämmen im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft. Tabelle II vergleicht die Verwendung eines flockenartigen Stammes von Zymomonas mobilis unter Verwendung einer Absetzsäule mit einem flockenartigen Stamm von Saccharomyces Cerevisiae,
In der folgenden Tabelle werden die mit einem flockenartigen Zymomonas mobilis-Stamm erhaltenen Ergebnisse verglichen mit den Ergebnissen für einen flockenartigen Stamm von Saccharomyces Cerevisiae.
Tabelle II Äthanol
Konz.
(g/i) -		 Maximale
Produktivität
(g/l/h)
Organismus Glucose
Konz.
(g/i)		 43 29
S. Cerevisiae 100
(ATCC 4126) 45 51
Z. Mobilis 100
(ZM4O1)
Die flockenartige Mutante ZM401 wurde wie folgt isoliert: eine Kultur des Stammes CP4 wurde in einem reichen Medium, IM (20 g/l Glucose, 10 g/l Hefeextrakt, 2 g/l KH2PO4) sLatisch bei 30 C bis zur exponentiellen Wachstumsphase gezüchtet. Dann wurde Nitrosoguanidin (NTG) bis zu.einer Endkonzentrabion von 50 /ug/ml zugefügt und die Kultur 1 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal in salzhaltigem Phosphatpuffer gewaschen, und statisch über Nacht in RM bei 30 C inkubiert. Nach dieser Zeit waren am Boden der Flasche einige kleine körnige Flocken sichtbar. Das
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überstehende Medium mit der Mehrheit der Zellen wurde vorsichtig entfernt, und frischen Medium zugefügt. Nach alle 24 h wiederholter Tochterkultivierung (subculturing) während 7 Tagen in der gleichen Weise wurde eine offensichtlich reine Kultur von körnigen Flocken erhalten. Diese Kultur wurde an RM-Platten zweimal abgestrichen, um sie durch Einzelkolonie-Isolation (single colony isolation) weiter zu reinigen. Eine Einzelkolonie wurde dann in flüssigem Medium nochmals getestet, und war noch flockenartig. Sie wurde als der flockenartige Stamm gewählt und als ZM4O1 bezeichnet.
Aus der Tabelle geht hervor, daß ZM4O1 in bezug auf erhöhte Produktivitäten gegenüber Stämmen von flockenartiger Hefe erhebliche Vorteile besitzt.
Die Tabelle III zeigt die stark erhöhte Äthanolproduktivität bei Verwendung einer kontinuierlichen Kultur mit Zellen-Recycling von Zymomonas mobilis (ATCC 10988), verglichen mit der Ansatzkultur und kontinuierlichen Kultur ohne Zellen-Recycling des gleichen Organismus, alle in einem Medium, das 100 g/l Glucose enthält.
Tabelle III
Kultivierungsart Äthanol-Produktivität
(g/l/h)
Ansatz 5
kontinuierlich ' "11
kontinuierlich mit Zellen-Recycling 120
Es ist ersichtlich, daß zwischen der kontinuierlichen Kultur des Organismus und der kontinuierlichen Kultur mit Zellen-Recycling eine 10-fache Erhöhung in der Äthanolproduktivität liegt.
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Leerseite

Claims (7)

  1. Patentanwälte Dirt..-lNck jHXJWkÜskiäaän;: Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
    Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Hober Dr. Ing. H. Liska
    8000 MÜNCHEN 86, DEN-K POSTFACH 860 820 D
    H/SM/Hl MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
    28974
    UN-ISEARCH LIMITED,
    221-227 Anzac Parade, Kensington, New South Wales, Australien
    Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Äthanol mittels Zellen-Recycling
    Patentansprüche
    Verfahren zur Herstellung von Äthanol aus einem ein vergärbares Kohlenhyärat enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man Zymomonas mobilis im Kulturboden kontinuierlich kultiviert, einen Teil des" Kulturbodens kontinuierlich oder periodisch abführt und durch einen frischen Kulturboden ersetzt, von dem abgeführten Teil des Kulturbodens die darin enthaltenen Zellen von Zymomonas mobilis abtrennt, diese Zellen in den Kulturboden zurückführt, und das in dem Teil des Kulturbodens, von dem die Zellen abgetrennt wurden, enthaltene Äthanol gewinnt.
    130064/0633
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das vergärbare Kohlenhydrat ausgewählt ist aus der Gruppe Glucose, Fructose und Sucrose.
  3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Zymomonas mobilis-Stamm ausgewählt ist aus der Gruppe CP4, ZM481 und ZM4O1.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bi.s 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von dem abgeführten Teil des Kulturbodens durch Filtration abgetrennt werden.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen flockenartig sind und von dem abgeführten Teil des Kulturbodens in einem Absetzgefäß abgetrennt werden.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kulturboden bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 C gehalten wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Kulturbodens zwischen 3,7 und 8 gehalten wird.
    130064/0633
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