DE3108384A1 - Verbessertes verfahren zur hestellung von aethanol - Google Patents

Verbessertes verfahren zur hestellung von aethanol

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DE3108384A1 DE19813108384 DE3108384A DE3108384A1 DE 3108384 A1 DE3108384 A1 DE 3108384A1 DE 19813108384 DE19813108384 DE 19813108384 DE 3108384 A DE3108384 A DE 3108384A DE 3108384 A1 DE3108384 A1 DE 3108384A1
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Description

Patentanwälte Dipi/.-Ing. H. Veickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
Dipl.-Ing. RA-Veickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
dr.ing.h.liska j 31.08384
8000 MÜNCHEN 86, DEN
H/SM/Hl POSTFACH 860 820
28964 MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
UNISEARCH LIMITED,
221-227 Anzac Parade, Kensington, New South Wales, Australien
Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Äthanol
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol.
Äthanol wird in herkömmlicher Weise durch Vergärung von Zuckern durch Hefen hergestellt. Solche Verfahren werden zur Herstellung alkoholischer Getränke wie z.B. Bier oder Wein verwendet. Es ist jedoch bekannt, daß gewisse Bakterien auch die Fähigkeit besitzen, Zucker und Stärkehydrolysate zu Äthanol zu vergären. Ein solches Bakterium ist Zymomonas mobilis.
Zymomonas mobilis benützt den Entner Doudoroff-Weg des Glucosemetabolismus und kann bis zu 1,9 Mol Äthanol pro Mol vergärter Glucose erzeugen. Eine Folge dieser Methode, mit der Zymomonas mobilis Glucose vergärt, ist es, daß nur 1 Mol ATP pro Mol Glucose produziert wird, verglichen mit 2 Mol ATP, welche pro Mol vergärter Glucose durch Hefe nach dem glykolytischen Weg entstehen. Die geringere Energie, die nach dem Gärungsprozeß für Zymomonas mobilis verfügbar ist, bedeutet, daß weniger
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Biomasse während des Gärungsprozesses erzeugt wird. Wegen der geringen Produktivität der bisher untersuchten Stämme von Zymomonas mobilis, ihrer niedrigen Alkoholtoleranz, und ihrer niedrigen.spezifischen Zuckeraufnahmegeschwindigkeit waren diese natürlichen Vorteile aber nicht ausreichend, um Zymomonas mobilis für eine großtechnische Äthanolproduktion zu verwenden. Die Erfinder konnten nun Stämme von Zymomonas mobilis isolieren, die in allen drei dieser Kriterien eine ausreichende Verbesserung zeigen, und damit zur Herstellung von Äthanol Vorteile gegenüber den konventionellen Hefen zeigen. Während es bereits als überraschend angesehen werden muß, wenn eines der oben genannten Kriterien deutlich erhöht werden kann, so muß es als besonders überraschend gelten, daß alle drei der Kriterien gleichzeitig verbessert werden konnten, und ohne irgendwelche ernsthafte nachteilige Veränderungen im Organismus.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Äthanol aus einem Medium, welches Glucose oder andere vergärbare Kohlenhydrate enthält, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Medium einen Stamm von Zymomonas mobilis, der eine spezifische Äthanolproduktivität bei 3O°C und pH 5 in einem Medium, welches 200 g/l Glucose enthält, von mindestens 4,0 g/g/h, eine spezifische Glucoseaufnahmegeschwindigkeit bei 30°C und pH 5 in einem Medium, welches 200 g/l Glucose enthält, von mindestens 8,0 g/g/h, und eine Äthanoltoleranz bei 300C und pH 5 in einem Medium, welches 300 g/l Glucose enthält, von mindestens 120 g/l Äthanol in einer Ansatzkultur, oder von mindestens 60 g/l Äthanol in einer kontinuierlichen Kultur- bei 30°C und pH 5 in einem Medium,
welches 150 g/l Glucose enthält"ert, und das so hergestellte Äthanol isoliert.
Das erfindüngsgemäße Verfahren,kann mit einer Ansatzkultur des Mikroorganismus ausgeführt werden, oder alternativ als kontinuierliches oder semi-kontinuierliches Verfahren mit oder ohne Zellenrecycling.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 50° C durchgeführt, insbesondere bei 2S bis 4-.00C, . und bei einem pH-Wert zwischen 3,7 und 8, insbesondere 4,5 bis 6,5. Das Medium enthält vorzugsweise 100 bis 400 g/l eines vergärbaren Kohlenhydrats, insbesondere 150 bis 300 g/l.
Die bevorzugten Kohlenhydrate zur Verwendung als vergärbare Substrate in dem Kulturmedium umfassen neben Glucose einfache Zucker wie z.B. Fructose,iunä: Sucrose, Stärke und Stärke-· hydrolysate, und Celluloserohmaterialien. Es muß festgestellt werden, daß vermutlich nicht jeder beliebige Stamm von Zymomonas mobilis alle diese Substrate vergärt, und deshalb sollte für irgendeinen bestimmten Stamm ein geeignetes, vergärbares Substrat ausgewählt werden.
Bevorzugt besitzen die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stämme von Zymomonas mobilis eine spezifische Äthanolproduktion von mindestens 5,0 g/g/h und eine spezifische Glucoseaufnähme von mindestens 10 g/g/h unter den definierten Bedingungen.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren'bevorzugte Stamm von Zymomonas mobilis ist CP4, wie er in der Sortenkultursammlung von ' .
Prof. J. de Ley,
Laboratorium für Mikrobiologie,
Ledeganckstraat 35,
B-900 Gent, Belgien
aufbewahrt wird.
Es wurde gefunden, daß auch Mutanten dieses Stammes sich besonders gut für die Durchführung des Verfahrens eignen, und insbesondere ein breiteres Spektrum von vergärbaren
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Substraten als CP4 selbst besitzen. Die Mutantenstämme können durch Mutationen eines Stammes, z.B. unter Verwendung von Ü.V.Bestrahlung oder Nitrosoguanidin/ hergestellt werden. Erwünschte Eigenschaften können in Zymomonas mobilis-Stämme auch durch Plasmaübertragung (plasmid transfer) eingebracht werden, z.B. unter Verwendung von Membranfilter-Abquetschtechnik (membrane filter mating techniques).
Die Stämme von Zymomonas mobilis, auf die in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, wurden in der Amerikanischen Sortensammlung (American Type.Culture Collection)> 12301 Park Lawn Drive Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt und wurden mit den folgenden Hinterlegungsnummern und Daten bezeichnet:
Spezifikation ATCC-Hinterlegungs-Nr. Hinterlegungsdatum
cp4 31821 26.Februar 1981
ZM481 31823 26.Februar 1981
Beispiele
Die Beispiele zeigen einen Vergleich zwischen dent früher untersuchten Zymomonas mobilis ATCC 10988 und dem erfindungsgemäß ausgewählten Stamm CP4, welcher zuerst aus Zuckerrohrsaft isoliert wurde. .. ■ .
Die Zymomonas mobilis-Stämme wurden zuerst bei 30°C während 24 h ohne Bewegung vermehrt durch Zugabe einzelner Kolonien aus der Vorratskultur (stock culture slant) zu 50 ml eines vorgekeimten (preseed) Kulturbodens, der 100 g/l Glucose und 10 g/l Hefeextrakt enthält. 10 ml der Kulturbrühe wurden dann zu 90 ml eines gekeimten (seed) Kulturbodens gegeben. Nach 12 bis 18-stündiger Inkubation wurde er 900 ml des Gärmediums eingeimpft, welches enthält:
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ίΟΟ - 300 g/l Glucose; 10 g/l Hefeextrakt; 1 g/l KH2PO4; 1 g/l (NH4)2SO4; 0,5 g/l MgSO4-7H2O. Die Kultur würde dann unter Luftaus'schluß bei 30°C und pH 5 gezüchtet. ;. .
Die Tabelle 1 zeigt einen Vergleich der kinetischen Parameter der Hefe S. Cerevisiae, von Zymomonas mobilis ATCC 10988 und von Zymomonas mobilis CP4, welche . unter den obigen Bedingungen bei der angegebenen Glucosekonzentration gezüchtet wurden.
Tabelle 1
S. Cerevisiae Z. mobilis Z. mobilis (ATCC 26602) (ATCC 10988). (CP4)
Spezifische Äthanolproduktion
qp (g/g/h)(250 g/l Glucose) 0,87 2,5 '5,4
Spezifische Glucoseaufnähme, · ·
qo (g/g/h) (250 g/l Glucose) 2,1 . ".- 5,5 . 11,9
Maximale Äthanolkonzentration
(g/l) (300 g/l Glucose) 115 102 127
Ein weiterer Vergleich zwischen den zwei Stämmen wird in Fig. 1 aufgezeigt, welche graphisch die kinetischen Parameter für die kontinuierliche Kultur von Zymomonas mobilis ATCC.10988 und von Zymomonas mobilis CP4 zeigt. Bei letzterem wurden gleichbleibende Ergebnisse für 60, 100, 135 und 170 g/l Glucosemedien erzielt. Wie aus der Fig. 1 hervorgeht, sind sowohl die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit als auch die spezifische Geschwindigkeit der Äthanolproduktion für den Stamm CP4 höher und werden durch eine gegebene Alkoholkonzentration weniger beeinflußt.
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Ein weiterer hochproduktiver Stamm von Zymomonas mobilis wurde aus dem Stamm CP4 wie folgt entwickelt:
Stamm CP4 wurde statisch bei 3O°C bis zur exponentiellen Wachstumsphase gezüchtet. Dann wurde^Nitrosoguanidin bis■zu einer Endkonzentration von 50 /ug/ml' zμgegeben und. die Kultur 30 min bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden dann. zweimal", .-mit salzhaltigem Phosphatpuffer gewaschen und abermals'über'"* Nacht bei 30°C gezüchtet. Die Kultur wurde dann auf Böden.r , . aufgebracht, die, ,10 % (v/v) Äthanol enthielten;. Nach feiner ...γ. Inkubation von mehreren Tagen bei 300C .erschienen Mutantenkolonien mit einer Häufigkeit von ca. 10 , die auf einem ähnlichen Medium gereinigt wurden und dann auf ihre Wachstums-, und Äthanolproduktionsgeschwindigkeit mit 100, 2QO und 250 g/l Glucose bei 30°C in Röhrchen getestet wurden. Die Kultur, die in der kürzesten Zeit die höchste Äthanolmenge produzierte, wurde als ZM48 bezeichnet. :.--- : ■' ' -
Eine zweite ähnliche Mutagenes'e wurdet mit dem. Stariim" ZM48 "durchgeführt, aber die'Zellen wurden mit 15 %. (v/v) Äthanol überzogen..Die Mutante, welche in der kürzesten Zeit die höchste : Äthanölmehge produzierte, wurde mit ZM481' bezeichnet, und r als ein Äthariolrverträglicher. Stamm in-der. Sortenku.1 türen- "· Sammlung ' (Type Culture Collection) in der School of"Bio-^ ' -. technology, university of New South Wales, Sydney, New ... . . South Wales, Australia, aufbewahrt.
Die Tabelle 2 zeigt einen Vergleich der durch verschiedene Stämme von Zymomonas mobilis in kontinuierlichen Kulturen bei einer Verdünnungsrate D = 0,1 hr erhaltenen maximalen gleichbleibenden Äthanolkonzentrationen.
130052/0702
mobilis ATCC1O988 - 9 - 3108
mobilis CP 4 Tabelle 2
mobilis ZM481 Glucose-
Konzentration
(g/i)		 Äthanolkonzen
tration
(g/i)
150 60
Stamm 170 70
Z. 180 85
Z.
Z.
Die Tabelle 3 zeigt einen Vergleich der Ertragskraft von Zymomonas mobilis-Stämmen nach 24-stündiger Gärung auf 250 g/l Glucose Medium in einer Ansatzkultur.
Tabelle 3 % Ertragskraft
Stamm Äthanol-
Konzentration		 40
AOO
Z. mobilis CP4
Z. mobilis ZM481		 120
120
Tabelle 4 vergleicht die kinetischen Parameter von Zymomonas mobilis ATCC 10988 und Zymomonas mobilis CP4 auf verschiedenen Glucosemedien in einer Ansatzkultur unter Luftausschluß.
130052/07Ü2
Tabelle 4 Kinetische Parameter ATCC 10988 CP4
(1) 150 g/l Glucose
Spezifische Glucoseaufnahme-
geschwindigkeit q (g/g/h) 5,2 9,3
Spezifische Geschwindigkeit der
Äthanolproduktion
qp (g/g/h) 2,5 - 4,2
Maximale Äthanolkonzentration 77,0 - 78,0
(g/i)
(2) 200 g/l Glucose
^S 5,2 10,4
qP 2,5 5,0
Äthanol-Konz. 100 105
(3) 250 g/l Glucose
qs 5,5 11,9
qP 2,5 5,4
Äthanol-Konz. 102 117
(4) 300 g/l Glucose
qs 8,1
qP 3,6
Äthanol-Konz. 127
1300S2/07Ö2

Claims (8)

  1. Patentanwälte B-:?l;--Ing."H". Weicrmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke
    Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. LisKA ο-in £5 QQ/
    8000 MÜNCHEN 86, DEN «' ΜαΓΖ 198t H/SM/Hl POSTFACH 860 820
    MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22 28964
    ÜNISEARCH LIMITED,
    221-227 Anzac Parade, Kensington, New South Wales, Australien
    Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Äthanol
    Patentansprüche
    Verfahren zur Herstellung von Äthanol aus einem Medium, welches Glucose oder andere vergärbare Kohlenhydrate enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Medium einen Stamm von Zymomonas mobilis, der eine spezifische Äthanolproduktion bei 3O°C und pH 5 in einem Medium, welches 200 g/l Glucose enthält, von mindestens 4,0 g/g/h, eine spezifische Glucoseaufnahmegeschwxndigkeit bei 30°C und pH 5 in einem Medium,welches 200 g/l Glucose enthält, von mindestens 8,0 g/g/h und eine Äthanol-Verträglichkeit bei 3O°C und pH 5 in einem Medium, welches 300 g/l Glucose enthält, von mindestens 120 g/l Äthanol in einer Ansatzkultur oder von mindestens 60 g/l Äthanol in einer kontinuierlichen Kultur bei 30°C und pH 5 in einem
    Medium, das 150 g/l Glucose enthältv/^ihrtjttfiert, und das so erhaltene Äthanol isoliert.
    130052/0762
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Zymomonas mobilis eine spezifische Äthanolproduktion bei 30 C und pH 5 in einem Medium, das 200 g/l Glucose enthält, von mindestens 5,0 g/g/h besitzt.
  3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Zymomonas mobilis eine spezifische Glucoseaufnahme bei 30°C und pH 5 in einem Medium, welches 200 g/l Glucose enthält, von mindestens 10 g/g/h besitzt.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe Glucose, Fructose ·, Sucrose, Lactose, Stärke und Cellulosehydrolysate·
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von Zymomonas mobilis CP4 ist.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Zymomonas mobilis ZM481 ist.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Ansatzverfahren (batch) oder halbkontinuierlich ( semi-batch) durchgeführt wird.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren kontinuierlich oder semikontinuierlich durchgeführt wird. ·
    130052/07-02
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