DE3103826C2 - Immuno-Testverfahren - Google Patents

Description

Es besteht seit langem ein Bedürfnis für hochvolumige Screening-Tests, um die Gegenwart oder Abwesenheit von antigenen Stoffen, Antikörpern und Analysensubstanzen in einer großen Zahl unterschied­ licher Proben festzustellen. In der Vergangenheit ist eine Reihe von Versuchsmethoden, ein­ schließlich Gaschromatografie, Massenspektroskopie, Flüssigchromatografie und verschiedene Bioassaymethoden, durchgeführt worden. Diese Methoden sind häufig zeit­ raubend, teuer und können nicht für in großem Maß­ stab durchgeführte Untersuchungsprogramme wirksam an­ gewendet werden.

Man hat schon vorgeschlagen, für solche Trennverfah­ ren Immunoassaymethoden anzuwenden, weil Immunoassays bekanntlich sehr speziell und hochempfindlich sind und leicht durchgeführt werden können. Radioimmuno­ assays finden z. B. bei der klinischen Diagnostik weite Anwendung. RIA-Verfahren sind jedoch häufig nicht mit Untersuchungsprogrammen im großen Maßstab verträg­ lich. Radiotracer haben von Haus aus eine limitierte Stabilität und spezielle Entsorgungsverfahren und Personalauswahl sind erforderlich. Außerdem benötigt man häufig hochkomplizierte Instrumente. Bei ge­ wissen Anwendungen stellt RIA auch eine potentielle Gefahr dar, z. B. bei nahrungsmittelverarbeitenden Betrieben.

Andere Verfahren sind schon entwickelt worden, z. B. Fluoreszenz- oder enzymatische Immunoassayverfahren, die deshalb brauchbar sind, weil man potentiell ge­ fährliche Reagentien vermeiden kann. Bei diesen Ver­ fahren muß man jedoch Trennverfahren in Filtrations- oder Zentrifugationsstufen anwenden. Solche Trennver­ fahren verlangsamen das Testverfahren und sind auch nur schwer zu automatisieren.

Gemäß einer jüngeren Entwicklung verwendet man enzym­ markierte Antigene, die keine Abtrennung in gebundene und freie Spezies benötigen und die man deshalb schnell und mit einer hohen Empfindlichkeit durchfüh­ ren kann. Ein solches System kann man automatisieren und für hochvolumige Untersuchungen anwenden, wie in dem EMIT-System von Rosenthal A. F. ,Vargas M. G., und Klass C.S. (1976) Clin. Chem. 22, 1899. Bei diesem Verfahren wird ein Antigen an ein Enzym gekuppelt, wobei dieses Verfahren sehr kritisch ist und dazu führen kann, daß das System nicht ausreichend für verschiedene Analysenmethoden angepaßt ist, sofern man nicht für jedes neue System sorgfältige Entwicklun­ gen vornimmt.

Kürzlich wurde von Liposomen berichtet, die Enzyme oder Substrate tragen können und die mit Antigenen oder Antikörpern markiert sind. Liposome die mit Anti­ genen an ihrer äußeren Oberfläche markiert sind und die in ihrem inneren Volumen ein Enzym eingefangen enthalten, werden mit verwandten Antikörpern und Komplementen vermischt, um zu entscheiden, ob die Liposome die Freilassung des eingefangenen Enzyms er­ möglichen oder nicht. Diese Entscheidung wird durch den Nachweis der Enzymaktivität getroffen, welche physikalisch aus den Liposomen nach der Abtrennung der Liposome aus dem umgebenden Medium freigegeben wird (siehe Uemura K. und Kinsky S. C., 1972, Bio­ chemistry, 11, 4085-4094 und Kataoka T., Williamson J. und Kinsky S., 1973, Biochimica et Biophysica Acta 298, 158-179). Es ist jedoch nicht erkannt worden, daß solche Liposome, wenn sie in geeigneter Weise mit einem geeigneten hohen Signal-zu-Rausch-Ver­ hältnis gebildet werden, für Immunoassayverfahren ge­ eignet sind, bei denen man Abtrennstufen vermeidet und man den Test in Reaktionen in homogener Phase durch­ führen kann. Außerdem wird über Schwierigkeiten bei der Herstellung von immunospezifischen Liposomen berichtet (siehe G.H. Strejan, P. M. Smith, C. W. Grant und D. Surlan, "Naturally Occurring Antibodies To Liposomes", The Journal of Immunology, Bd. 123, Nr. 1, Juli 1979, 370-378. Außerdem ist seit langem bekannt, daß die Diffusion von Makromolekülen, wie Enzymen, durch Läsionen, die durch Komplement in zweischichtigen Membranen gebildet werden, sehr viel langsamer ist als von kleinen Molekülen (Green H., Barrow P. und Goldberg B, 1959, J. Exp. Med., 110, 699).

Aus der DE-A-29 19 835 ist ein Immuntest zur Bestimmung eines Analyten sowie ein Reagens und eine Testpackung zur Durchführung dieses Tests bekannt; der Marker kann ein Enzym sein, das als Konjungat mit einer lypophilen Verbindung eingesetzt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Immuno- Testverfahren bereitzustellen, das eine schnelle und einfache Durchführung ermöglicht und mit dem man quantitativ und/oder qualitativ die Gegenwart oder die Abwesenheit von antigenen Stoffen oder Antikörpern bestimmen kann.

Das Immuno-Testverfahren soll insbesondere auch durch verhältnismäßig untrainiertes Personal durchgeführt werden können; die Ergebnisse sollen in einer einzigen Stufe erhalten und durch einfaches Ablesen festgestellt werden können, ohne daß irgendeine Trennstufe nach der Testreaktion erforderlich ist.

Die Bestimmung soll deshalb möglichst in homogener Phase und ohne vorherige mechanische Abtrennungs- oder Reinigungsstufe durchgeführt werden, wobei Antigen- oder Antikörper-markierte, enzymbeladene Liposome immunospezifisch veranlaßt werden, Enzym in Gegenwart von verwandten Antigenen oder Antikörpern und aktivem Komplement freizugeben.

Weitere Aufgabenstellung ist die Bereitstellung eines immunoreaktiven Liposoms zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren, daß in Gegenwart eines Komplements ein Signal/Rausch-Verhältnis von nicht weniger als 5 zeigt, und das vorzugsweise eine Stabilität von wenigstens ca. 60 Tagen bei Aufbewahrung in einer Flüssigkeit aufweist.

Diese Aufgabenstellungen werden mit der vorliegenden Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist ein Immuno-Testverfahren gemäß Patentanspruch 1.

Eine zweckmäßige Ausführungsform davon ist Gegenstand des Anspruchs 2.

Weiterer Gegenstand ist die Verwendung eines immunoreaktiven Liposoms gemäß Patentanspruch 3.

Ein weiterer Gegenstand ist ein Test-Satz zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern gemäß Patentanspruch 4.

Zweckmäßige Ausführungsformen dieses Test-Satzes sind Gegenstand der Ansprüche 5 und 6.

Das erfindungsgemäß verwendete immunoreaktive Liposom wird mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert und trägt ein Enzym, und zeigt in Gegenwart eines Komplements vorzugsweise ein Signal/Rausch-Verhältnis von nicht weniger als 5, und insbesondere von nicht weniger als 10. Das Enzym ist innerhalb des Liposoms eingekapselt. Vorzugsweise wird das Liposom in einem flüssigen Medium gelagert und ist während eines Zeitraums von wenigstens 60 Tagen stabil. Das Signal/Rausch-Verhältnis ist möglichst hoch und soll in erster Linie oberhalb 60 liegen, und die Stabilität in einer Inertgasatmosphäre bei 4°C beträgt insbesondere mehr als 6 Monate.

In Form eines Test-Satzes wird das erfindungsgemäße Liposom zusammen mit Ampullen mit verwandten Antikörpern oder Antigenen, die für das Antigen oder den Antikörper, der sich an der Oberfläche des Liposoms befindet, immunospezifisch ist und mit einer das Komplement enthaltenden Ampulle zusammen verkauft.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gemisch aus (a) Liposomen, die mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert sind, und ein Enzym eingeschlossen enthalten und in Gegenwart eines Komplements ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis von vorzugsweise nicht weniger als 10 zeigen, (b) einem Substrat für das Enzym, (c) einem Testmaterial, das auf spezifische Antigene oder Antikörper untersucht wird, und (d) einem Komplement gebildet.

Das Gemisch wird untersucht und die Gegenwart einer Enzymaktivität kann durch für das Auge sichtbare Veränderung der Farbe, spektroskopisch oder in ähnli­ cher Form nachgewiesen werden. Vorzugsweise gibt man zusätzliches, verwandtes Antigen oder Antikörper, wie sie an die Liposomen gebunden sind, zu dem Gemisch und die Untersuchung wird dann für die gleichen Anti­ gene oder Antikörper durchgeführt, wie sie an die Liposome gebunden sind. Wenn die gesuchten immunospezifischen Antigene oder Antikörper, in dem Untersuchungs­ material vorhanden sind, dann reagiert der Antikörper oder das Antigen in dem Gemisch mit dem Antigen bzw. Antikörper, das bzw. der intakt das Liposom verläßt und ver­ hindert dadurch einen Komplementangriff, während in dem Fall, daß artverwandte Antikörper bzw. Antigene nicht in dem Testmaterial vorhanden sind, die Lipo­ sommarkierung reagiert und die Enzymaktivität nachweis­ bar wird. Die Menge an artverwandtem Antigen bzw. Anti­ körper in der Testprobe, sofern sie vorhanden ist, ermöglicht einen gewissen Komplementangriff, wenn sie nicht ausreicht, mit den gesamten freien verwandten Antikörpern oder Antigenen in dem Testgemisch zu rea­ gieren und ein Teil der Enzymaktivität kann dann nach­ gewiesen werden.

In einigen Fällen kann die Immunoassaymethode direkt angewendet werden, um die Elemente aus der Gruppe Antigen und Antikörper nachzuweisen.

Bei dieser direkten Methode wird eine unvollständige Mischung, die eines der Elemente aus der Gruppe Antigen und Anti­ körper enthält, hergestellt und die Gegenwart des nicht vorhandenen Elementes in einer zu untersuchenden Probe wird durch das Ausmaß nachgewiesen, in dem bei der Zugabe der Probe zu der unvollständigen Mischung eine Lyse des Lipo­ soms durch immunspezifischen Angriff auf die Liposom­ membranen oder das Freilegen von eingekapseltem Enzym zu der Flüssigkeit um das Liposom beschleunigt. Wenn das zu untersuchende Testmaterial auf Antikörper oder Antigene untersucht wird, die verwandt sind zu denen, die als Markierung des Liposoms dienen, muß man kein Antigen oder keinen Antikörper zu dem Gemisch zugeben. Eine direkte Immunoassaymethode für Antigene oder Antikörper würde ein Gemisch der folgenden Zusam­ mensetzung umfassen:

• (a) mit einem Antigen oder dessen verwandten Antikörper markierte Liposome, die ein Enzym markierte Liposome, die ein Enzym tragen und in Gegenwart eines Komplements ein Signal-zu-Rausch- Verhältnis von vorzugsweise nicht weniger als 10 zeigen,
• (b) ein Substrat für das Enzym,
• (c) das auf ein Antigen oder einen verwandten Antikörper zu untersuchende Testmaterial und
• (d) Komplement.

In einem bevorzugten Immuno-Testverfahren stellt man folgende Mischung her:

• (a)Liposome, die mit einem Antigen oder dessen artverwandtem Antikörper markiert sind und ein Enzym tragen und in Gegenwart eines Komplements ein Signal-zu-Rausch- Verhältnis von vorzugsweise nicht weniger als 10 haben,
• (b) ein Substrat für das Enzym,
• (c) das auf ein Antigen oder einen artverwandten Antikörper zu untersuchende Testmaterial,
• (d) Komplement und
• (e) freies Artverwandtes zu dem anderen des Antigens oder Antikörpers,

wobei man die Gegenwart oder Abwesenheit von Enzymaktivität in dem Gemisch nachweist. Bei diesem Verfahren kann das nachzuweisende Antigen zum markieren der verwendeten Liposome oder der freien Artverwandten verwendet werden. Alternativ kann der nachzuweisende Antikörper zum Markieren des verwendeten Liposoms und des freien artverwandten Antikörpers verwendet werden.

Vorzugsweise wird das Verfahren als Einstufenverfahren durchgeführt und alle Stoffe werden in ein einziges Fläschchen gegeben, in dem eine Inkubierung unter standardimmunologischen Bedingungen, z. B. bei 37°C oder in einem Bereich von 4 bis 45°C, in Zeiträumen zwischen etwa 1 Sekunde und 120 Minuten, durchgeführt wird. Alternativ kann man alle Stoffe bis auf das Enzymsubstrat abmischen und 5 bis etwa 120 Minuten oder länger inkubieren und dieses Gemisch gibt man dann zu dem Enzymsubstrat und stellt das Ergebnis fest.

Ein Test-Satz zum Nachweis von entweder einem Anti­ gen oder dessen artverwandtem Antikörper besteht vorzugs­ weise aus einem ersten Behälter, in dem sich das Liposom befindet, welches mit entweder dem Antigen oder dessen artverwandtem Antikörper markiert ist, und das in einem geeigneten Puffer suspendiert ist. Ein zweiter Behälter enthält pulverisierten lyophili­ sierten oder gefrorenen, konzentrierten Antikörper oder Antigen, die artverwandt zu dem des Liposoms sind. Ein drittes Fläschchen trägt pulverisiertes oder gefrorenes konzentriertes Komplement, das in Form von Meerschweinchenserum vorliegen kann, und ein vier­ ter Behälter enthält ein Enzymsubstrat für das Enzym, das in flüssiger oder Pulverform vorliegen kann. In einem weiteren Behälter befindet sich Puffer.

Eine Einstufenmethode kann man anwenden, wenn alle Komponenten abgemischt und inkubiert sind. In einigen Fällen kann man das Verfahren jedoch in zwei oder mehr Stufen durchführen, wobei einige der Materialien zusammen inkubiert werden, bevor man das Mischen ver­ vollständigt. In allen Fällen wird nach der Immunreaktion oder in Abwesenheit davon keine Trennung durch­ geführt, und eine direkte Ablesung wird an den Reaktions­ materialien durchgeführt, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen oder Antikörper in der Test­ probe festzustellen, indem man die Enzymaktivität oder -reaktion mit dem Substrat nachweist.

Es ist ein Merkmal der Erfindung, daß die Untersuchung schnell durch untrainiertes Personal mit verhältnismäs­ sig niedrigen Kosten durchgeführt werden kann. Die Ablesung kann subjektiv erfolgen, beispielsweise vi­ suell durch Farbänderung, wenn qualitative Ablesungen gewünscht werden. Halbqualitative Ablesungen kann man subjektiv erhalten, wenn Farbänderungen von stark nach schwach eintreten. Spektrofotometrische Methoden und dergleichen kann man anwenden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Enzymaktivität in Gegenwart von Substrat zu bestimmen, was die Lyse des Liposoms oder einen immunspezifischen Angriff auf die Liposomenmembran anzeigt, wodurch das Enzym dem Substrat ausgesetzt wird. Die Freigabe der Enzymaktivität findet statt, wenn eine Immunreak­ tion, unter Bildung eines Immunkomplexes abläuft und die Doppelschicht oder die enzymumgebende Membran der Liposomen beeinträchtigt. Wenn der Antikörper oder das Antigen, je nachdem was hier vorliegt, in dem System mit dem jeweilig anderen, mit dem das Liposom markiert ist, in Gegenwart von aktivem Komplement reagiert, so wird Enzym freigegeben. Wenn jedoch die Testprobe das nachzuweisende Antigen oder den nachzuweisenden Antikörper enthält, wird die Reaktion des Artver­ wandten in dem Medium mit der artverwandten Markie­ rung verhindert oder vermindert und dadurch wird der Nachweis des aufzufindenden Enzyms in dem Substrat verhindert, was ein positives Anzeichen für das nach­ zuweisende Antigen oder den Antikörper darstellt.

Die bei der vorliegenden Erfindung vewendeten Liposome werden manchmal als smektische Mesophase oder synthetische Bläschen bezeichnet. Sie sind tatsächlich trockene Lipidfilme, suspendiert in einem wäßrigen Medium, entsprechend der Beschreibung von Uemura K. und Kinsky S. C. (1972) Biochemistry 11, 4085-4094. Liposome bestehen wahrscheinlich aus Lipid-Doppelschichten, die eine innere wäßrige Abteilung von einem äußeren wäßrigen Medium abtrennen, und sind Prototypen biologischer Membranen. Die Liposome haben ähnliche Eigenschaften wie biologische Membranen. Bekanntlich kann man sie so herstellen, daß sie entweder Enzymsubstrate oder Enzyme enthalten. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung enthalten die Liposome Enzym und haben eine äußere Oberfläche, die im wesentlichen frei von Enzym ist, wobei diese äußere Oberfläche das Enzym einschließt, so daß die katalytische Wirkung des Enzyms nicht nachweisbar wird, bis die die Membran einkapselnde äußere Oberfläche aufreißt, die mit einem Antigen oder einem artverwandten Antikörper, je nach der Art des durch­ zuführenden Tests, markiert ist. Wenn man den Anti­ körper sucht, dann wird das Liposom vorzugsweise mit dem Antikörper markiert, und wenn man das Antigen sucht, so wird das Liposom vorzugsweise mit den Antigen markiert
Liposomen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Verwendung eines immunoreaktiven Liposoms in einem erfindungsgemäßen Immuno-Testverfahren, bei der das Liposom an seiner äußeren Oberfläche gebunden ein Antigen oder einen Antikörper trägt, und in seinem Innenraum ein Enzym eingeschlossen enthält, und das in Gegenwart eines Komplements ein Signal/Rausch-Verhältnis von nicht weniger als 5 zeigt, ist aus dem Stand der Technik aber nicht bekannt. Dies liegt vermutlich daran, daß man bisher die Vorteile solcher Liposome für die Verwendung in Immuno-Testverfahren nicht erkannt hat.

Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis soll vorzugsweise 10 oder mehr und insbesondere wenigstens 60 betragen und kann auch 1000 oder mehr betragen, wobei die Liposome das Enzym enthalten und vom Substrat abschirmen. In Abwesenheit des Antigen-Antikörper-Komplexes oder eines Immunkomplexes, der sich beim Aufreißen oder Poröswerden der Liposommembran bildet, tritt keine nachweisbare Enzymaktivität auf. In einigen Fällen kann das Signal-zu-Rausch-Verhältnis 5 oder mehr betragen, solange keine nachweisbare Enzymaktivität in Abwesenheit eines gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes oder eines Immunkomplexes stattfindet. Das Signal-zu- Rausch-Verhältnis ist als solches bekannt und wird erhalten, indem man ein erstes Fläschchen oder ein Rauschfläschchen, das ein mit einem Antigen oder einem artverwandten Antikörper markiertes Liposom, suspendiert in einem isotonischen Puffer, in Gegen­ wart eines Enzymsubstrates enthält, mit einem zwei­ ten oder einem Signalfläschchen vergleicht, das Enzymsubstrat, Liposom der vorerwähnten Art und ein bekanntes Freigabemittel, z. B. ein starkes Detergens, enthält. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis ist das Testergebnis der beobachteten Enzymreaktion. Vor­ zugsweise ist das Rauschen in dem Gefäß, in dem sich kein Freigabemittel befindet, so niedrig wie möglich, wodurch wenig oder gar keine Enzymaktivität angezeigt wird.

Vorzugsweise wird das Rauschen während einer möglichst langen Zeit niedrig oder nicht vorhanden gehalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Rauschniveau nach Lagerung von wenigstens 60 Tagen bei Null oder in der Nähe davon, oder das Signal-zu-Rausch-Verhältnis ist nicht kleiner als 10. Dies ergibt eine gute Lagerfähigkeit, die dann wünschenswert ist, wenn man Test-Sätze für die Anwendung der vorliegenden Erfindung verkauft.

Im erfindungsgemäßen Immuno-Testverfahren schirmt das Liposom das Enzym vom Substrat ab und durch die Vermittlung eines immunospezifisch aktivierten Komplements tritt eine ansonsten latente Enzymaktivität in Erscheinung. Das Liposom kapselt das Enzym ein, d. h. daß das Enzym physikalisch einge­ fangen ist innerhalb eines Raumes, der durch eine zweischichtige Membran umgrenzt ist. Die physikalische Einkapselung dient auch dazu, die Enzymaktivität zu maskieren. p-Nitrophenylphosphat (pNPP) ist ein Sub­ strat für das Enzym Alkaliphosphatase (AP) Unter alkalischen Bedingungen (pH größer als 7) wird durch AP die Phosphatgruppe von pNPP (das farblos ist) ab­ gespalten und es bildet sich p-Nitrophenol, das unter alkalischen Bedingungen eine intensive Gelbfärbung aufweist. Wenn man daher eine wäßrige Lösung von pNPP herstellt, so ist diese Lösung farblos. Gibt man AP zu dieser Lösung, so erhält man sehr schnell eine intensive Gelbfärbung. Die erfindungsgemäß verwende­ ten Liposome sind derart, daß sie AP einkapseln und dieses AP von dem pNPP in der umgebenden wäßrigen Lösung maskieren. Auf diese Weise können die Liposome mit dem eingekapselten AP in pNPP-Lösungen disper­ giert werden, wobei nur in geringem Maße eine Gelb­ färbung erfolgt, wogegen in dem Fall, daß die gleiche Menge an AP, die eingekapselt wurde, direkt einge­ führt würde, sich sehr schnell eine beachtliche Farbtönung entwickeln würde.

Aus obigem Grund werden für den Aufbau der Liposome Enzyme ausgewählt, deren Aktivität wirksam durch die intakte Lipid-Doppelschicht abgeschirmt wird, und bei denen man ein Signal-zu-Rausch-Verhältnis von mehr als 5 erhält. Vorzugsweise werden solche Enzyme nicht verwendet, die

• (a) an der äußeren Oberfläche der Liposom­ membran absorbiert würden und auf diese Weise immer gegenüber dem Substrat in dem umgebenden Medium frei vorlägen,
• (b) die in die Doppelschicht selbst eingeschlos­ sen sind und auf diese Weise sowohl das innere wie das äußere Medium überbrücken würden und daher in gleicher Weise gegenüber dem Substrat in dem umgebenden Medium frei vorlägen,
• (c) die mit dem Substrat, das leicht durch die intakte Lipid-Doppelschicht diffundieren kann, reagie­ ren (diese Lipid-Doppelschicht ist typischerweise unpolar, lipidlöslich und hat eine kleine Molekülgröße). In diesem Fall könnte, obwohl das Enzym eingekapselt sein kann, dessen Aktivität nicht abge­ schirmt werden, weil das Substrat in dem umgebenden Medium durch die Diffusion durch die Lipid-Doppelschicht zu dem eingekapselten Enzym Zutritt erhielte.

Die Struktur der Maskierung ist wichtig im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Immunoassaymethode. Weil diese Maskierung immunospezifisch aufgebrochen werden kann, kann man einen homogenen Assay erhalten, d. h. es ist nicht erforderlich, eine physikalische Trennung der gebundenen von der signalfreien Form durch Zentri­ fugieren, Chromatografieren, Filtrieren, Festphasen­ immobilisierung und dergleichen, vorzunehmen. Solche Trennungen sind zeitraubend, machen spezielle Instrumente oder Vorrichtungen erforderlich und lassen sich nur schwierig automatisieren.

Liposome werden aus amphiphilen Lipiden herge­ stellt. Lipide kann man allgemein als Moleküle mit mittlerem Molekulargewicht (150 bis 3000 Dalton), die hauptsächlich aus gesättigten oder ungesättigten und/oder aromatischen oder aliphatischen Kohlenwasser­ stoffresten bestehen, bezeichnen. Amphiphile Lipide sind solche, die sowohl wasserlösliche als auch wasser­ unlösliche Regionen aufweisen.

Small (J. Am. Oil Chem. Soc., 45, 108-117, 1968) hat eine Klassifizierung der Lipide aufgestellt, die auf deren Reaktion mit Wasser und zwar sowohl in Substanz als auch an der Oberfläche beruht. Für die vorliegende Erfindung geeignete Lipide werden nachfolgend ange­ geben:

Klasse I - unlösliche, nichtquellende amphiphile Lipide: Di- und Triglyzeride, langkettige protonierte Fettsäuren, Sterolester, langkettige Alkohole, Phytole, Retinale, Vitamin Ä, Vitamin K, Vitamin E und viele Sterole, wie Cholesterin, Desmosterol, Vitamin D und eine Anzahl von Hormonen.

Klasse II - unlösliche, quellende amphiphile Li­ pide: Lecithine, Phosphatidylethanolamine, Phosphati­ dylinosit, Sphingomyelin. Cerebroside, phosphatidische Säuren, Plasmalogene, phosphatidylisches Serin, Cardio­ lipine und gewisse Pflanzensulfolipide.

Klasse IIIA - lösliche Amphiphile, Typ A: bilden flüssige kristalline Phasen bei der Zugabe von gerin­ gen Mengen Wasser (lyotropischer Mesomorphismus). Schließt zahlreiche klassische anionische, kationi­ sche und nichtionische Detergentien ein.

Klasse IIIB - lösliche Amphiphile, Typ B: bilden keine Flüssigkristalle, haben keine ausgesprochene Polarität - Gallensalze.

Klasse II-Lipide sind besonders für die Bildung von Lipo­ somen geeignet und die letzteren kann man häufig aus solchen Lipiden allein herstellen. Recht große Bläschen erhält man aus Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylserin nach Papahadjopoulus, Annals N.Y. Acad. of Sci. 308, 1978. In einigen Fällen ist es je­ doch nützlich, Lipide der Klasse I oder III in die Bläschendoppelschicht aus Strukturgründen zuzugeben, um weniger flüssige Doppelschichten zu bilden, z. B. durch Inkorporieren von Cholesterin oder um einen größeren Abstand zwischen anliegenden Doppelschichten zu bewirken, z. B. durch elektrostatische Abstoßung, die durch die Inkorporierung von anionische Diacetyl­ phosphat- oder kationischen Stearylaminlipiden in die Zwischenschicht erfolgt. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Bläschenstrukturen sind beschrie­ ben worden (Szoka und Papahadjopouols Proc. Nat. Acad. Sci. 75, 4194-4198, 1978). Viele dieser Strukturen mit entsprechenden Abänderungen können für die vor­ liegende Erfindung angewendet werden. Bei der Auswahl von geeigneten Herstellungsverfahren werden vorzugs­ weise Kriterien der folgenden Art angewendet:

• (1) Durch die Art der Inkorporierung der Enzyme in die Liposome sollte keine Inaktivierung oder De­ naturierung der Enzyme erfolgen. Deshalb muß ein länge­ res Aussetzen bei erhöhten Temperaturen oder gegenüber denaturisierenden organischen Lösungsmitteln vermieden werden.
• (2) Die Liposome sollen ausreichend groß ein, um eine Enzymaktivität zu inkorporieren. Strukturen, die weniger als 0,005-0,01 µm (50 bis 100Å) Durchmesser haben, können nur einige wenige Enzymmoleküle einkapseln und sind deshalb in den meisten Fällen nicht bevorzugt.
• (3) Die liposomische Doppelschicht soll stabil und verhältnismäßig undurchdringlich sein. Von Kitigawa T. und Inoue K., Nature 254, 254-6 (1975), wurde gezeigt, daß durch die Inkorporierung von Lipiden der Klasse I, wie Sterolen,, eine Kondensierung der Zwischenschicht erfolgt mit einer sich daraus er­ gebenden größeren Härte und Stabilität, die einer durch Komplement hervorgerufenen Lyse zugänglicher sind.

Bei der Herstellung von Liposomen ist es erforderlich, daß Lipide, wie solche der Klasse II, die wasserun­ löslich sind, in eine wäßrige Umgebung eingeführt werden. Dies kann durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden.

Nach einem bekannten Verfahren werden Lipide physika­ lisch in einer wäßrigen Lösung dispergiert. Ein trockener, dünner Lipidfilm wird auf die innere Ober­ fläche eines geeigneten Gefäßes aufgebracht. Die wäßrige Lösung, welche die in die Liposome einzu­ schließenden Substanzen enthält, wird dann in das Gefäß eingebracht und kommt in Kontakt mit dem Lipid­ film. Der Lipidfilm wird dann durch kräftiges Rühren in dem Gefäß (Glasperlen von ungefähr 0,1 mm Durch­ messer können zur Beschleunigung der Dispergierung zugegeben werden) in die wäßrige Lösung dispergiert. Die Dispergierung des Lipidfilms kann auch durch Be­ schallen, durch Eintauchen eines Beschallers in das Gefäß oder durch Einführen einer Sonde eines Beschal­ lers in die wäßrige Lösung beschleunigt werden. Eine zu starke Beschallung kann das Enzym inaktivieren und kann sehr kleine Liposome bilden.

Alternativ können die Lipide in einer wäßrigen Lösung, die ein Detergenzlipid der Klasse IIIA oder IIIB, wie Laurylsulfat oder Natriumdeoxycholat, enthält, gelöst werden. Das Detergenz wird dann entfernt (z. B. durch Dialyse) und es bildet sich die Liposom-Doppelschicht. Enoch und Strittmatter (Proc. Nat. Acad. Sci. 76, 145-149) haben die Herstellung von Einzel-Doppelschicht- Liposomen unter Verwendung von Deoxycholat als Deter­ genz, das dann dialysiert wurde, mit einer Größe von 0,1 µm (1000 Å) Durchmesser beschrieben.

Nach einem anderen bekannten Verfahren gibt man eine wäßrige Lösung zu einem Gemisch aus einem Lipid und einem flüssigen organischen Lösungsmittel und entfernt das Lösungsmittel anschließend durch Ver­ dampfen unter vermindertem Druck. Szoka und Papahad­ jopoulos (Proc. Nat. Acad. Sci. 75, 4194-4198, 1978) haben die Herstellung von Liposomen mit sehr großem inneren, wäßrigen Raum durch Verdampfen von orga­ nischen Lösungsmitteln, wie Diethylether oder Isopro­ pylether, beschrieben.

Die physikalischen und Detergenzdialyseverfahren sind für die vorliegende Erfindung besonders geeignet, weil diese leicht große Bläschen bilden und sehr milde ablaufen und dadurch die Enzyme nicht leicht inakti­ viert werden. Wendet man das Verdampfen von organi­ schen Lösungsmitteln an, so ist es erforderlich, daß das einzukapselnde Enzym gegenüber dem Lösungsmittel unempfindlich ist. Beispielsweise kann man Bläschen dieser Art herstellen, die Alkaliphosphatase enthal­ ten, denn ein solches Enzym wird nicht durch Diethyl­ ether, wie er bei diesem Verfahren verwendet wird, denaturiert
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Enzyme sind alle solche, die niedrige Rauschniveaus er­ geben. Eine große Anzahl bekannter Enzyme kann für die Erfindung verwendet werden. Diese variieren erheb­ lich hinsichtlich ihrer Substrate, der Natur, der zu katalysierenden Reaktion, der Stabilität, hinsicht­ lich des Umsatzes und der optimalen Reaktionsbedingun­ gen (pH, Ionenstärke, Temperatur) und dergleichen. Die International Union of Biochemists haben verschie­ dene Enzyme nach der Natur der zu katalysierenden Reak­ tion klassifiziert.

Es gibt eine Anzahl von Kriterien, die man bei der Auswahl eines gegebenen Enzyms für die praktische An­ wendung beachten muß. Solche Enzyme, die derzeit zur Verfügung stehen, jedoch nur in Spurenmengen, sind weniger wünschenswert als solche, die in großen Mengen vorkommen und die im Handel erhältlich sind. Das Enzym sollte bei Temperaturen, wie sie üblicher­ weise in technischen Anlagen vorherrschen, z. B. bei 4°C, während wenigstens etwa 3 Monaten stabil sein. Die katalytische Aktivität oder die Umsatzzahl des Enzyms soll ausreichend hoch sein, um eine nachweisbare Reak­ tion innerhalb einer kurzen Zeit zu ergeben, d. h. innerhalb weniger Sekunden bis zu 120 Minuten. Die katalytische Aktivität des Enzyms sollte leicht für den praktischen Verwerter nachweisbar sein, d. h. daß die katalysierte Reaktion z. B. eine Erhöhung oder Erniedrigung der Lichtabsorption im Ultraviolettbe­ reich oder im sichtbaren Bereich, d. h. im Bereich von 250 bis 750 nm, bewirken soll.

Vorzugsweise soll das Enzym ein solches sein, das nicht in erheblichen Mengen in der zu prüfenden Probe vorhan­ den ist und das nicht durch solche Substanzen, wie sie üblicherweise in den Proben gefunden werden, inhi­ biert wird.

Das Enzym sollte nicht durch die bei der Liposomher­ stellung verwendeten Lipide inaktiviert werden, noch während der Liposomherstellung inaktiviert oder dena­ turiert werden. Das auszuwählende Enzym soll ein solches sein, das vollständig eingekapselt ist. Solche Enzyme werden in der Natur in dem zellularen Cytoplasma ge­ funden oder zirkulieren frei in extrazellularen Flüs­ sigkeiten. Nicht wünschenswert sind die natürlichen Membranproteine. Diese werden in der Natur zusammen mit zellularen Membranen gefunden und haben eine oder mehrere hydrophobe Oberflächen, durch welche sie an die Doppelschicht verankert werden. Sehr häufig überbrücken solche Enzyme die Doppelschicht, wobei deren katalytische Stellen dem umgebenden wäß­ rigen Medium ausgesetzt sind.

In der nachfolgenden Aufstellung werden Enzyme von besonderem Interesse, die nach der International Union of Biochemists klassifiziert worden sind, genannt:

1.
Oxidoreduktasen
1.1	wirken auf die CH-OH-Gruppe eines Donors,
1.1.1.	mit NAD oder NADP als Akzeptor.
	1. Alkoholdehydrogenase
	6. Glyzerindehydrogenase
	26. Dioxalatreduktase
	27. L-Lactatdehydrogenase
	37. Malatdehydrogenase
	49. Glukose-6-phosphatdehydrogenase
	17. Mannit-1-phosphatdehydrogenase
1.1.2.	mit Cytochrom als Akzeptor
	3. L-Lactatdehydrogenase
1.1.3.	mit O₂ als Akzeptor
	4. Glukoseoxidase
	9. Galaktoseoxidase
1.2.	wirken auf die CH-NH₂-Gruppe des Donors,
1.4.3.	mit O₂ als Akzeptor
	2. L-Aminosäureoxidase
	3. Deaminosäureoxidase
1.6.	wirken auf reduziertes NAD oder NADP als Donor
1.6.99	mit anderen Akzeptordiaphorasen
1.10.	wirken auf Diphenole und ähnliche Substanzen als Donor,
1.10.3.	mit O₂ als Akzeptor
	1. Polyphenoloxidase
	3. Ascorbatoxidase
1.11.	wirken auf H₂O₂ als Akzeptor
1.11.1. @		6. Katalase
	7. Peroxidase
3.	Hydrolasen
3.1.	wirken auf Esterbindungen
3.1.1.	Carbonsäureesterhydrolasen
	7. Cholinesterase
3.1.3.	Phosphormonoesterhydrolase
	1. Alkaliphosphatase
3.1.4.	Phosphordiesterhydrolase
	3. Phospholipase C
3.2.	wirken auf Glykosylverbindungen
3. 2. 1.	Glykosidhydrolasen
	1. α-Amylase
	4. Zellulase
	17. Lysozym
	23. β-Galaktosidase
	27. Amyloglukosidase
	31. β-Glukuronidase
3.4.	wirken auf Peptidbindungen
3.4.2.	Peptidyl-aminosäurehydrolase
	1. Carboxypeptidase A
3.4.4.	Peptidyl-peptidhydrolase
	5. α-Chymotrypsin
	10. Papain
3.5.	wirken auf C-N-Bindungen, die keine Peptidbindungen sind
3.5.1.	in linearen Amiden
	5. Urease
3.6.	wirken auf Säureanhydridbindungen
3.6.1.	in Phosphoryl enthaltenden Anhydriden
	1. anorganische Pyrophosphatase
4.	Lyasen
4.1.	Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen
4.1.2.	Aldehydlyasen
	7. Aldolase
4.2.	Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen
4.2.1.	Hydrolasen
	1. Karbon-anhydrase
4.3.	Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen
4.3.1.	Ammoniumlyasen
	3. Histidase

Erfindungsgemäß geeignete Substrate sind solche, die mit dem ausgewählten Enzym reaktiv sind und schlies­ sen beispielsweise ein p-Nitrophenylphosphat und 4-Methylumbelliferylphosphat für Alkaliphosphatase; 4-Aminosalicylsäure oder o-Dianisidin und Wasserstoff­ peroxid für Peroxidase; und o- oder p-Nitrophenyl­ glykoside für Glykosidasen. Weitere geeignete Substrate sind solche, wie sie von Bergmeyer, Methods for Encymatic Analysis, Academic Press N.Y. 1965, beschrieben werden. Nicht wünschenswert sind solche Substrate, die leicht durch die intakte Membran-Doppelschicht diffundieren. Im allgemeinen sind solche Substrate kleine Moleküle, die in Lipidlösungsmitteln löslich sind.

Antigene, die zu prüfen sind oder die als Markierung für die Liposome für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind zahlreich vorhanden. Es gibt eine Reihe von Antigenen, deren quantitative Feststellung bei der klinischen Diagnostik von Bedeutung ist. Viele von diesen werden derzeit durch Radioisotopenmethoden nach­ gewiesen. Nachweise für solche Antigene nach dem erfindungsgemäßen Verfahren würden eine beachtliche Verbesserung bedeuten, weil gefährliche und instabile Reagentien nicht verwendet werden müssen.

Die vorliegende Erfindung kann mit Vorteil für den Nachweis und für die Bestimmung von zirkulierenden Hormonen als Indikatoren für endokrine Funktionen ver­ wendet werden. Eine teilweise Aufzählung solcher Produkte schließt folgende ein:

• Thyroidhormone
  - Thyroxin und Trÿodothyoinin, p-thyroidhormon und Calcitonin.
• Pancreashormone
  - Insulin, Proinsulin und Gluka­ gon.
• Hypophysenhormone
  - Prolaktin, adrenocortiocotropes Hormon, Tyrotropin, Oxytocin und Vasopressin.
• Uterus- und Plazentahormone
  - chorionisches Gonadotropin, Pla­ zentalactogene, chorionisches Thyro­ tropin und Relaxin.
• Steroidhormone
  - Östradiol, Östron, Östriol, Testo­ steron und Dihydrotestosteron.
• Wachstumsfaktoren
  - Urogastron, Nervenwachstumsfaktor und Somatomedine.

Das Verfahren ist geeignet für intrazellulare Boten, zyklische Nukleotide und Prostaglandine.

Die Erfindung ist auch anwendbar zur Aufgliederung von zirkulierenden Mengen an therapeutischen Arzneimit­ teln, z. B. von Herzglykosiden, Digoxin, Digitoxin, Anti­ konvulsantien, Diphenylhydantoin, Mesantoin, Pheno­ barbital und Mephobarbital. Von besonderem Interesse sind solche Arzneimittel, die einen engen therapeuti­ schen Index haben, d. h. bei denen ein gewisses minimal­ zirkulierendes Niveau erforderlich ist, um eine thera­ peutische Wirkung zu erzeugen, während etwas höhere Niveaus toxische oder schädliche Reaktionen hervor­ rufen.

Das Verfahren kann auch für die Überprüfung von Anti­ biotika, wie Penicillin, Streptomycin und Tetracyclinen, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, sowie Tetracyclin, Chloramphenicol, Erytromycin, Caromycin und Polymyxin B angewendet werden. Die aminoglykosidischen Antibiotika Gentamycin, Amikacin, Tobramycin, Kanamycin und Neo­ mycin, die zum Bekämpfen von aeroben gram-negativen Bazilleninfektionen verwendet werden, können durch die vorliegende Erfindung leicht untersucht werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zum Nachweis und für die Bestimmung von schädlichen Drogen, wie den Opiaten Morphin, Heroin, Meperidin und Methadon, Mutterkornalkaloiden, wie Lysersäurediethylamid, Marÿuana, Barbituraten und Kokain und dessen Deriva­ ten verwendet werden.

Da die vorliegende Erfindung sehr einfach durchzufüh­ ren ist und man keine instabilen oder gefährlichen Reagentien benötigt, kann die Untersuchungsmethode in solchen Umgebungen angewendet werden, die schlechter und weniger gut ausgerüstet sind als Diagnoselabo­ ratorien. Die Untersuchungsmethode kann z. B. für die Untersuchung von Nahrungsmitteln und Umgebungsgiften angewendet werden. Bei der Untersuchung von Nahrungs­ mitteln sind wichtige Antigene Mycotoxin und natür­ liche Gifte. Auf diesem Gebiet kommen als Haupttoxine solche in Frage, wie Aflatoxine, Achratoxin, Patulin, Penicillinsäure, Zearelonon; und Tricothecentoxine, sowie auch toxische Metaboliten, wie Ipomeameron, die natürlich in Nahrungsmitteln vorkommen. Neben den natür­ lichen Giftstoffen gibt es eine große Anzahl von um­ gebungsverseuchenden Substanzen, deren Anwesenheit in Nahrungsmitteln, selbst in Spurenmengen, erhebliche Gefahren für die Menschheit bringen. Dies können Neben­ produkte der Industrie oder Pestizide sein, z. B. poly­ chlorierte Biphenyle, chlorierte Dibenzo-p-dioxine, chlorierte Dibenzofurane, Heptachlorepoxid, Dieldrin und DDT 1,1′-2,2,2-Trichlorethyliden)-bis[3-chlorbenzol]; 1,1,1-Trichlor-2,2-bis-(p-chlorphenyl)-ethan.

Andere gefährliche nahrungsmittelverseuchende Substan­ zen sind Antibiotika, wie Penicillin, Chloramphenicol und Tetracyclin.

Das Verfahren ist nicht auf kleine Moleküle beschränkt, denn es wurde von Humphries und McConnell in Proc. Nat. Acad. Sci., 71, 1691-1694, 1974, gezeigt, daß makro­ molekulare Antigene, wie Eialbumin, an die Oberfläche von immunoreaktiven Liposomen gekuppelt werden können. Das heißt, daß die vorliegende Erfindung auch für den Nachweis von markomolekularen Antigenen, wie Plasma­ proteinen, häpatitisassoziierten Antigenen und Histokom­ patibilitäts-Markierungen geeignet ist.

Antigene und antigenische Materialien, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zu analysieren sind, sind alle solche, die selbst oder mit anderen Produk­ ten artverwandte Antikörper bilden und die durch die Immunreaktion nachweisbar sind. Zum Beispiel kann man Digoxin als Antigen ansehen, da es mit einem ande­ ren Material Antikörper bildet und zwar derart, daß der Antikörper zu Digoxin in einem Versuch verwendet werden kann mit entweder dem Antikörper oder dem als Markierung verwendeten Digoxin, je nachdem, ob man nach dem Digoxin oder dem artverwandten Antikörper sucht. Materialien, wie Rinderserumalbumin, Schlüssel­ loch-Limpet-heomocyanin (key hole limpet heomocyanin) oder andere makromolekulare Träger werden kovalent an das Digoxin oder ein anderes "Antigen" unter Aus­ bildung von Antikörpern gekuppelt. Das Wort "Antigen" wie es hier verwendet wird, soll deshalb alle antigenen Materialien einschließen, unabhängig davon, ob sie selbst Antigene sind oder ob sie in Kombination mit anderen Materialien artverwandte Antikörper in Lebe­ wesen, wie bei Menschen, Kaninchen, Gänsen, Schafen, Meerschweinchen, Rindern oder anderen Säugetieren, bilden.

Die Erfindung kann angewendet werden, um spezifische Antikörper, die gegen verschiedene Antigene gerichtet sind, nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Anwesen­ heit und auch die Menge solcher Antikörper kann als ein Indikator angesehen werden für eine mögliche Immunität gegen zahlreiche Infektionskrankheiten, für bereits durchgemachte Krankheiten oder für eine aktive Infektion.

Beispielsweise kann man durch die vorliegende Er­ findung leicht Syphillis-Antikörper (gerich­ tet gegen Treponema Palladium ) nachweisen, da diese Antikörper reaktiv sind gegen Cardiolipin (das aus Rinderherzen extrahiert wird), das leicht in Liposomen inkorporiert wird.

Antikörper, die gegen infektiöse Krankheitserreger gerichtet sind - Viren, Bakterien, Parasiten und der­ gleichen - kann man nachweisen, indem man ihre ober­ flächlichen antigenen Markierungen auf die Liposomenoberfläche kuppelt.

In einigen Fällen wird durch die Gegenwart von Anti­ körpern, die gegen spezifische Makromoleküle gerichtet sind, eine autoimmune Störung angezeigt - z. B. sind Antikörper, die reaktiv gegenüber Nukleinsäuren, Polydeoxyribonukleinsäuren und Polyribonukleinsäuren, Kollagen, Gammaglobulinen, Thyroglobulinen, parathyroiden Antigenen, mitochondrinalen Antigenen und Antigenen der glatten Muskeln reaktiv sind, alle potentiale Indikatoren für autoimmune Krankheiten.

Antikörper werden gebildet durch Einführen von immuno­ genen Substanzen in den Blutstrom eines lebenden Tieres. Das Tier reagiert mit der Bildung von Antikör­ pern, die an das Immunogen in einer ersten Stufe bei der Entgiftung des Immunogens binden. Viele Antigene sind direkt immunogen und bewirken direkt eine Antikörperbildung. Eine Reihe von Substanzen ist jedoch nicht selbst immunogen und benötigt eine Modifizierung (Kupplung an einen geeigneten Träger). Verfahren zur Herstellung von Antikörpern werden sehr ausführlich von Landsteiner in "Specificity of Serological Reactions", Dover Publications N.Y. 1962 und von Weir beschrieben.

Ein erfindungsgemäß verwendetes Komplement (eine Gruppe aus wenigstens neun ver­ schiedenen Proteinen) ist eine Schlüsselverbindung bei der Immunverteidigung eines Wirts gegen eindringende zellulare Pathogene. Ist das Komplement einmal akti­ viert (aufnahmefähig für die Anwesenheit von zellula­ ren Eindringlingen), bindet es sich an die äußere Membran und verursacht kleine Verletzungen dieser Membran. Tatsächlich kerbt das Komplement kleine Löcher über die gesamte Oberfläche der Membran. Diese Löcher sind sehr klein und in der Größenordnung von 0,01 µm (100 Å) im Durchmesser. Sehr kleine Moleküle, wie Wasser oder einfache Salze, können leicht durch diese Verletzungen eindringen. Makromoleküle, wie Proteine, sind im allgemeinen von der gleichen Größe oder größer als diese Läsionen - 0,004 bis 0,025 µm (40 bis 250 Å) - so daß Makromoleküle nicht durch diese Läsionen diffun­ dieren können oder nur außerordentlich langsam, wie Green H., Barrow P. und Goldberg B, (1956) in J. Exp. Med. 110, 699 beschreiben.

Durch die erfindungswesentliche Verwendung eines Komplements ist es möglich, durch eine Antigen- Antikörper-Reaktion Löcher in der Kapselwand des Liposoms auszubilden. Es wird angenommen, daß dadurch das Substrat in die Liposomen-Doppelschicht eindringen kann und mit dem darin befindlichen Enzym reagiert. Auf diese Weise erfolgt dann eine enzymatische Reaktion, und zwar auch dann, wenn keine vollständige Auflösung der Doppelschicht stattfindet. Durch die erfindungsgemäße Verwendung eines Komplements, dessen Anwesenheit entweder die Lyse unterstützt oder die Ausbildung von Löchern bewirkt, wird somit eine Umsetzung auch ohne Lyse ermöglicht. Der Ausdruck "Lyse", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Ausbildung von Störstellen in oder eine vollständige Zerstörung der Liposomen- Doppelschicht, sowie auch die durch in der Doppelschicht durch die Immunreaktion ausgebildete Löcher ermöglichte Freisetzung des eingekapselten Enzyms gegenüber dem Substrat.

Ein typischer Test-Satz zum Nachweis von Antigen um­ faßt ein Fläschchen mit Liposomen, die mit einem Anti­ gen markiert sind und in einem geeigneten Puffer suspendiert sind, z. B. in einem Volumen von 0,1 bis 10 ml. Die Konzentration des Liposoms in dem Puffer liegt im allgemeinen zwischen etwa 1 bis 50 mMol. Geeignete Puffer sind phosphatgepufferte Kochsalzlö­ sung oder andere isotonische Puffer. Ein zweites Fläsch­ chen enthält in Form eines lyophilisierten Pulvers oder eines gefrorenen Konzentrats den artverwandten Antikörper zu dem Antigen. In dem Fall, wo der Anti­ körper durch die Direktmethode nachzuweisen ist, stellt das Fläschchen die positive Kontrolle für die Untersuchung dar. Ein drittes Fläschchen ent­ hält lyophilisiertes Pulver oder gefrorenes Konzen­ trat des Komplements. Übliches Komplement für den zu bildenden Antigen-Antikörper-Komplex, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, wird verwendet. Ein solches Komplement kann z. B. Meerschweinchenserum sein. Ein weiteres Fläschchen enthält das Enzymsubstrat, das flüssig oder pulverförmig oder in einer anderen Form vorliegen kann, und zwar in einer ausreichenden Konzentration, um leicht eine enzymatische Aktivität nachzuweisen, wenn das Enzym, das in dem Liposom ent­ halten ist, freigegeben wird. Ein weiteres Fläschchen kann einen Puffer enthalten, den man verwendet, um die Materialien während des erfindungsgemäßen Tests zu verdünnen.

Im einfachsten Falle und bei dem am meisten bevorzug­ ten Test werden alle Materialien einschließlich dem Substrat in eine einzige Flasche gegeben, inkubiert und eine Farbänderung oder die Abwesenheit einer Farb­ änderung festgestellt, um zu bestimmen, ob das zu untersuchende Material, das z. B. das Serum eines Individuums sein kann, ein spezifisches Antigen oder einen spezifischen Antikörper enthält oder nicht. In einigen Fällen werden alle Materialien mit Ausnahme des Substrats in eine einzige Flasche gegeben, inku­ biert und dann mit den Enzymsubstraten vermischt, und eine Farbänderung oder die Abwesenheit einer Farbände­ rung wird festgestellt für die Untersuchung, ob das Testmaterial, das z. B. das Serum eines Individuums sein kann, ein spezifisches Antigen oder einen spezifi­ schen Antikörper enthält oder nicht. Besonders ge­ eignete Enzyme sind Alkaliphosphatase und Peroxidase weil deren Reaktion mit p-Nitrophenylphosphat und 4-Aminosalicylsäure eine Farbreaktion ergibt, die mit dem Auge leicht erkennbar sind.

In solchen Fällen, in denen eine Inhibierung der Komplement­ lyse für eine analytische Quantifizierung verwendet wird, liegen gewisse Begrenzungen in der Zugabereihen­ folge vor. Dies beruht auf der Tatsache, daß in dem Moment, in dem Liposome, die Antigen oder Antikörper enthalten, Komplement und der Partnerantikörper oder das Partnerantigen zusammengebracht werden, eine Lyse eintritt. Für Zwecke einer genauen Quantifizierung wird es vorgezogen, daß die zu untersuchende Probe in das Fläschchen gegeben wird, bevor das Komplement wirken kann. Eine vernünftige Reihenfolge in der Zugabe ist dann folgende: (1) Antikörper, (2) Liposomen, (3) Probe, (4) Komplement. Die Zugaben (1), (2) und (4) können variieren, aber die Probe wird immer zugegeben, bevor Antikörper, Komplement und Liposomen miteinander vereint werden.

In allen Fällen zieht man es vor, einen bekannten positiven Test als Vergleichstest durchzuführen. Wenn z. B. der Test ein Test auf Digoxin ist, so wird eine Ampulle mit einem Standarddigoxin in den Test-Satz eingeschlossen. Wenn die Untersuchung eine quantitative und eine qualitative Untersuchung beinhaltet, dann kann der Test-Satz eine Reihe von Proben des zu untersuchen­ den Materials in verschiedenen Konzentrationen enthal­ ten, so daß eine Farbänderung, sofern eine auftritt, in der Testprobe verglichen werden kann mit der Farb­ änderung oder einer anderen enzymatischen Aktivität bei jeder Standardprobe, sofern man die Standards zusammen mit der zu untersuchenden Probe in einem Analysenverfahren untersucht.

Die Bestimmung der Enzymaktivität ist für eine große Anzahl von Enzymen bekannt. Solche bekannten Tests können zur Überwachung der Enzymaktivität im Anschluß an die erfindungsgemäße Untersuchung durchgeführt werden. Eine Liste von Untersuchungsmethoden wird für viele Versuche von Bergmeyer in Methods for Enzymatic Analysis, Academic Press N.Y. 1965, beschrieben. Besonders bevorzugte Untersuchungsmethoden sind solche, bei denen entweder eine hohe Empfindlichkeit vorliegt oder die eine besonders einfache Verpackung ermöglichen.

Zur Bestimmung der Aktivität von Malatdehydrogenase (E.C. 1.1.1.40) wird das Enzym mit den Substraten L-Apfelsäure und Nikotinamidadenindinukleotid umgesetzt und das Fortschreiten der Umsetzung wird bei 340 nm in folgender Weise überwacht.

In Küvetten wird folgendes eingefüllt:

Vor der Zugabe des Substrats wird das Instrument mit einer Kontrollküvette bei einer Absorption von 0,200 geeicht. Ablesungen werden in 15 Sekunden-Intervallen während 2 Minuten vorgenommen und die Anfangsgeschwin­ digkeit der Veränderung der Absorption pro Minute wird bestimmt.

Dieses Enzym hat eine sehr hohe Durchlaufszeit und ergibt deshalb hochempfindliche Untersuchungsergebnisse.

Viele andere Enzymuntersuchungen könnten ausgewählt wer­ den, weil sie sich für geeignete Untersuchungsformen oder Substratverpackungen eignen. Dazu gehören: Alkali­ phosphatase (E.C. 3.1.3.1.). Das synthetische Substrat p-Nitrophenylphosphat wird verwendet und kann leicht in Kapselform verpackt werden.

Man pipettiert 3,0 ml des Substrats in jeweils zwei 1 cm-Küvetten. Dann wird das Spektrophotometer auf eine Null-Absorption bei 410 mµ eingestellt.
Enzym: verdünnt mit Wasser auf annähernd 0,005 mg/ml,
mg/ml = A₂₇₈ × 1,43 (Plocke et al, 1962),
Substrat: 0,001M p-Nitrophenylphosphat in 1,0M tris- Puffer, pH 8,0.

Zur Zeit Null gibt man 0,1 ml der Enzymlösung zu der Testküvette und zeichnet die Absorptionsänderung auf. Der molare Absorptionsindex für p-Nitrophenyl in 1,0M tris, pH 8,0, ist 1,62 × 10⁴. Eine Einheit ist die Aktivität, die 1 Mikromol p-Nitrophenol pro Minute unter den angegebenen Bedingungen bei 25°C freigibt. Bei dieser Reaktion wird ein gelbgefärbtes Produkt ge­ bildet, das durch direkte visuelle Untersuchung nach­ weisbar ist.

Wegen seiner leichten Zugänglichkeit ist auch das Enzym Meerrettichperoxidase (E.C. 1.11.1.7.) geeignet. Eine große Anzahl an Substraten und Untersuchungs­ formen ist für dieses Enzym geeignet. Ein Beispiel da­ für ist: Man gibt 0,05 ml eines Farbstoffs zu 6,0 ml Substrat. Man gibt 2,9 ml in eine Testküvette und gießt den Rest in eine Kontrollküvette. Zur Zeit Null gibt man 0,1 ml des verdünnten Enzyms hinzu. Dann füllt man das Enzym in die Küvette aus einer 0,1 ml Pipette, mit der Spitze unter der Oberfläche, ein. Dann schüttelt man, indem man die Küvette mit Wachspapier abdeckt und umdreht. Die Absorption wird in 15 Sekun­ den-Intervallen während 1 bis 2 Minuten aufgezeich­ net und der Grad der Änderung pro Minute wird bestimmt.
Substrat: Vorratslösung: 1 ml 30%-iges H₂O₂ (Merck′s Superoxol) verdünnt mit 100 ml H₂O. Für den Gebrauch verdünnt man 1 ml der H₂O₂- Vorratslösung auf 100 ml mit 0,1M Phosphatpuffer, pH 6,0 (wird täglich frisch zubereitet).
Farbstoff: 1% o-Dianisidin in Methylalkohol (frisch in einer braunen Flasche).
Enzym: Vorratslösung: 1 mg/ml in Wasser. Unmittel­ bar vor der Verwendung verdünnt man 0,1 ml auf 250 ml.

Eine Einheit Peroxidaseaktivität ist die Menge an Enzym, die ein Mikromol Peroxid pro Minute bei 25°C zersetzt.

Damit die Liposomen in Immunoassays wirksam sind, ist es erforderlich, daß man sie sensibilisiert und an ihrer Oberfläche mit geeigneten Antigenen markiert. Antigene können kovalent gebunden sein oder liegen in anderen Formen an der Oberfläche von vorgebildeten Lipo­ somen vor. Alternativ kann das Antigen kovalent an eine geeignete amphiphile Substanz gebunden sein und dieser Komplex wird in das Lipidgemisch, aus dem sich die Liposomen bilden, gegeben. Im letzteren Fall wird die amphiphile Substanz in eine Lipid-Doppelschicht inkorporiert und das daran haftende Antigen erstreckt sich in die umgebende wäßrige Lösung.

Werden Liposome vorgebildet, so können sie an ihrer äußeren Oberfläche verschiedene chemische Funktionen aufweisen, mittels welcher die Antigene kovalent gebunden werden können. Die wichtigsten solcher Funk­ tionalitäten sind: Aminogruppen aus Phosphatidyl­ ethanolamin, Hydroxylgruppen aus Phosphatidylinosit, sowie Carboxylgruppen die sich von Fettsäuren oder Phosphatidylserin ableiten. Dies sind genau die Funktionalitäten, die an Proteinen zur Verfügung ste­ hen und die man beim Kuppeln von kleinen Antigenen unter Ausbildung von Immunogenen ausnützt. Man kann somit die Antigene an vorgebildete Liposome durch traditionelle chemische Reaktionen unter Verwendung von bifunktionellen Kupplungsmitteln kuppeln, z. B. von Kupplungsmitteln, wie Glutaraldehyd, Diimidester, aromatische und aliphatische Diisocyanate, Bis-p- nitrophenylester von Dicarbonsäuren, aromatische Disulfonylchloride und bifunktionelle Arylhalogenide, wie 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzol; p,p′-Difluoro­ m,m′-dinitrodiphenylsulfon. Geeignete Reaktionen, die man bei solchen Kupplungen anwenden kann, werden von Williams et al in Methods in Immunology and Immunochemistry, Bd. 1, Academic Press, New York, 1967, beschrieben.

In einigen Fällen kann man Antigene auf den Liposom­ oberflächen adsorbieren. Dies ist bei gewissen Lipo­ polysacchariden der Fall, wie Uemura und Kinsky ge­ zeigt haben (Biochemistry 11, 4085-4094, 1972). Dabei erhält man auch Antigene, die mit amphiphilem Lyso­ lecithin der Klasse III gekuppelt sind.

Die Tatsache, daß man ein Antigen zuerst an ein ausge­ wähltes Amphiphil, z. B. ein Phosphatidylethanolamin, Serin oder Inosit binden kann und dann zu der Lipid­ mischung gibt, aus welcher die Liposomen gebildet wer­ den, ist insofern äußerst bedeutungsvoll, als diese Kupplungsreaktion in einer Vielzahl von Lösungsmit­ teln durchgeführt werden kann. Beim Kuppeln von Anti­ genen an vorgeformte Liposome oder an Proteine (wie bei der Herstellung von Antigen) muß die Umsetzung immer in wäßrigen Lösungen durchgeführt werden, weil orga­ nische Lösungsmittel die Proteine oder Liposome de­ naturieren oder zerstören. Wenn man z. B. ein einen Carboxylrest enthaltendes Antigen kuppeln möchte, so kann man das Säurechlorid des Antigens unter Verwen­ dung von Thionylchlorid herstellen. Dieses Säurechlorid kann man dann an Phosphatidylethanolamin in Benzol als Lösungsmittel kuppeln. Diese Flexibilität bei der Auswahl des Lösungsmittels ermöglicht es, daß man einen breiten Bereich von Antigenen an Liposome kuppeln kann.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Zur Herstellung von immunoreaktiven Liposomen, die an ihrer Oberfläche mit Dinitrophenylgruppen markiert sind, stellt man eine Mischung, enthaltend 40 mg L-α-Lecithin, 11,6 mg Cholesterin, 2,18 mg Dicetylphosphat und 2 mg N-Dinitrophenylaminocaproyl­ phosphatidyIethanolamin in 6 ml Chloroform her. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe) in einem 50 ml Kolben über einem Rotationsverdampfer unter Bildung eines dünnen Filmes des trockenen Lipids an der inneren Oberfläche des Kolbens verdampft. Um eine vollständige Entfernung des Lösungs­ mittels sicherzustellen, wird das Verdampfen 30 Minu­ ten bis zu dem Punkt fortgesetzt, bei dem der Lipidfilm sichtbar trocken ist. In den Kolben gibt man dann eine Lösung aus 4 mg Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1.) in 4 ml 0,01M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,3M Glukose, und spült den Kolben mit Argon und versiegelt ihn dann. Der versiegelte Kolben wird zum Dispergie­ ren des Lipidfilms vorsichtig geschüttelt. Der Lipid­ film verschwindet langsam von der Oberfläche des Kolbens und die wäßrige Phase wird sichtbar trübe. Zu diesem Zeitpunkt wird der Kolben 2 Stunden bei 4°C gehalten. Liposome, die eingefangene Alkaliphosphatase enthalten, werden dann aus dem Enzym durch Zentrifugie­ ren mit 27 000 G während 60 Minuten freigesetzt. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und das Granu­ lat, welches die Liposome enthält, wird in einer isoto­ nischen Kochsalzpufferlösung (0,01M Phosphat, pH 7,5, enthaltend 0,15M Natriumchlorid) wieder suspendiert. Eine weitere Reinigung kann man durch wiederholtes Zen­ trifugieren und Resuspendieren erreichen.

Das Ausmaß, in dem das Enzym innerhalb solcher Liposome eingekapselt ist, wird durch die Detergenz­ lysisuntersuchung bestimmt. In Gegenwart des Detergenz Triton X-100, ein Produkt der Rohm & Haas Co., werden die Liposome aufgerissen und der Inhalt freigesetzt. Ein 10 µl Aliquot der gereinigten Liposome wird zu 1 ml von 1%-igem Triton X-100 in entionisiertem Wasser gegeben. Zur Kontrolle werden 10 µl der Liposome zu 1 ml isotonischer Kochsalzlösung gegeben. Das Enzym wird dann gemessen, indem man 50 bis 100 µl Aliquote dieser Verdünnungen zu 1 ml einer Lösung aus 0,4 mg/ml eines Substrates, nämlich p-Nitrophenylphosphat in 0,1M Borat bei pH 9,0 gibt. Die Hydrolyse des Substrates wird durch das Auftreten von p-Nitrophenol und eine zunehmende Lichtabsorption bei 410 nm überwacht. Man läßt die Reaktion während 10 Minuten ablaufen und be­ endet sie dann durch Zugabe von 1 ml 2N NaOH. Die durch die Detergenzlysis verursachte Enzymaktivität wird dann mit einer Kontrolle verglichen, zum Messen der Signal/Rausch-Charakteristik der Liposome. Für die vorerwähnte Zubereitung beträgt dieses Verhält­ nis mehr als 150, d. h. daß die Absorptionszunahme, die im Laufe von 10 Minuten durch das mittels des Detergenz gelösten Liposoms, 1,5 betrug, wobei die Kontrolle weniger als 0,01 Einheiten an Absorptions­ zunahme ergab.

In nachfolgenden Versuchen wurden ähnliche Liposome durch Gelfiltrationschromatografie anstelle durch Zentrifugieren gereinigt. 3 ml der Liposomzubereitung wurden auf eine Säule von 40 × 1 cm von Sephadex G-200, die mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, geschickt. Die Liposome wurden dann aus der Säule nach einem Leer­ volumen (annähernd 50 ml) eluiert und waren gut getrennt von dem freien Enzym, das bei 30 ml zum Vorschein kam.

Beispiel 2

Liposome werden durch eine Detergenzdialysemethode hergestellt. Ein Trockenfilm aus einem Gemisch aus 50 mg Eilecithin, 3,5 mg Cholesterin und 0,5 mg Dinitro­ phenylaminocaproylphosphatidylethanolamin in Chloro­ form wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Zu diesem Film wurden 5,5 ml einer Lösung gegeben, die 1 mg/ml Alkaliphosphatase in 0,05M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt und zusammen mit der Zugabe wurden auch 3,6 ml 10 mM Natriumdeoxycholat in Wasser gegeben. Der dieses Gemisch enthaltende Kolben wurde in ein Sonicatorbad während 5 Minuten bei 35°C eingetaucht und unter Argon beschallt. Man erhielt eine transpa­ rente opaleszierende Suspension. Das Deoxycholatdeter­ genz wurde durch Diafiltration unter Verwendung von Millipore-Immersible-Separator entfernt. 30 Volumina von 0,05M Phosphat, pH 7,5, wurden in die Suspension ausgetauscht unter Aufrechterhaltung eines konstanten Volumens von 9,1 ml. Die Liposome wurden weiter durch Gelfiltrationschromatografie gemäß Beispiel 1 gerei­ nigt. In diesem Fall erhielt man ein Signal/Rausch- Verhältnis von 225.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird versucht zu zeigen, daß mit geeignet zubereiteten Liposomen Antikörper, die gegen ein spezifisches Antigen gerichtet sind, durch Frei­ geben von Enzymaktivität, die gleichzeitig mit einer immunospezifischen Lyse auftritt, nachgewiesen wer­ den können. Multilamellare Bläschen wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt und mit N-Dinitrophenylamincaprylphosphatidylethanolamin (5%-ige Lecithinkonzentration) markiert. 5 µl davon wurden mit 100 µl Komplement (Meerschweinchenserum), 345 µl Puffer aus 50 mM tris-(Hydroxymethyl)-amino­ methan, pH 7,5, enthaltend 0,15 Mol Natriumchlorid, 0,15 mM Kalziumchlorid und 0,5 mM Magnesiumchlorid, sowie mit 50 µl verschiedener Verdünnungen von Kaninchen­ antiserum bis zu dinitrophenyliertem Rinderserum­ albumin vermischt. Als Kontrollen wurden Gemische eingeschlossen, bei denen normales Kaninchenserum durch Immunserum ersetzt worden war. Als weitere Kontrolle wurden Mischungen hergestellt, bei denen das Komple­ ment durch Inkubieren bei 56°C während 30 Minuten in­ aktiviert worden war. Diese Mischungen wurden 15 Minuten bei 25°C inkubiert und dann wurden 100 µl Aliquote entfernt und zu den Röhrchen gegeben, die 1 ml einer Lösung aus 0,4 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1M Natriumborat, pH 9,0, enthielten. Diese Röhr­ chen wurden 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Phospha­ tasereaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 2M Natrium­ hydroxid beendet. Die Absorption von verschiedenen Röhrchen bei 410 nm wurde dann spektrophotometrisch festgestellt. Je größer die Absorption ist, umso größer ist die Menge an freigegebener Phosphatase und umso größer ist das Ausmaß der immunospezifischen Lysis.

Gemisch
Absorption bei 410 nm
Kontrolle:
Mischung enthaltend nichtimmunes (normales) Kaninchenserum	0,01
Kontrolle: @	Mischung enthaltend Wärmeinaktiviertes (normales) Kaninchenserum	0,01
Testmischung enthaltend Antiserum gegenüber dinitrophenyliertem Rinderserumalbumin	1,2

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die immunospezifische Lyse von Liposomen zur Bestimmung der relativen Konzentratio­ nen von spezifischen Antikörpern verwendet. Alle Be­ dingungen sind identisch mit denen in Beispiel 3, aber es wurden verschiedene Verdünnungen von DNP-BSA- Antiserum verwendet, um die Wirkung der unterschied­ lichen Antikörperkonzentration auf das Ausmaß der durch das Komplement hervorgerufenen Lysis zu bestim­ men.

Das Ausmaß der Absorptionszunahme bei 410 nm in 5 Mi­ nuten wurde mit verschiedenen Verdünnungen untersucht und aufgezeichnet:

Antiserumverdünnung
410 nm
1 : 50
1,5
1 : 75	1,4
1 : 100	1,15
1 : 200	0,65
1 : 300	0,30

Man kann somit diese Methode verwenden, um spezifische Antikörperniveaus zu bestimmen.

Beispiel 5

Um festzustellen, ob Antigen durch eine komplement­ bewirkte Lysis inhibiert wird und ob eine solche Inhibierung zur quantitativen Bestimmung von Antigen­ mengen in einer Testprobe verwendet werden kann, wurde die Verfahrensweise gemäß Beispiel 3 modifiziert und 50 µl von DNP-Lysin-Lösungen unterschiedlicher Konzen­ trationen zu dem anfänglichen Inkubierungsgemisch ge­ geben. Wenn man eine Absorptionszunahme bei 410 nm in Abwesenheit von freiem DNP-Lysin als 100%-ige Lysis festlegt, dann wurden mit unterschiedlichen Mengen an freiem Antigen die folgenden Prozentsätze einer Lysis festgestellt:

Freies DNP-Lysin (Picomole)
% Lyse
6
83
9	69
13,5	56
18	48
27	33
36	23

In diesem Bereich besteht eine lineare Beziehung zwi­ schen dem Prozentsatz der Lysis und dem Logarithmus der Antigenkonzentration. Analysiert durch lineare kleinste Quadratregression (linear least squares re­ gression) wird die lineare Beziehung durch folgende Parameter ausgedrückt:
Steigung = 33,3
y-Abschnitt = 143
Korrelationskoeffizient = 0,998
50%-iges Auftreten bei 16,2 Picomol.

Beispiel 6

Ein quantitativer Immunoassay wird nach einem Einstu­ fenverfahren durchgeführt, d. h. daß alle Reagentien einschließlich dem Enzymsubstrat auf einmal zusammen­ gemischt werden, so daß gleichzeitig die lytische und die enzymatische Reaktion stattfinden. Eine solche Einstufenmethode ist in der Praxis einfach durchzufüh­ ren und kann auch leicht automatisiert werden.

25 mg L-α-Lecithin-Dipalmitoyl, 8,6 mg Cholesterin, 1,6 mg Dicetylphosphat und 1,5 mg Dinitrophenyl­ aminocaproylphosphatidylethanolamin wurden in einem Chloroformlösungsmittel vermischt. Das Lösungs­ mittel wurde unter vermindertem Druck auf einem Dreh­ verdampfer entfernt und dabei bildete sich ein dünner Lipidfilm auf der Innenfläche eines 50 ml Rundkolbens. Dieser Film wurde dann in einer wäßrigen Lösung, enthal­ tend 5 mg Alkaliphosphatase in 3 ml PBS- Dextrosepuffer dispergiert. Dann wurden die Liposome durch Zentrifugieren wie in den vorhergehenden Beispie­ len isoliert.

In ein einzelnes Reagenzglas wurden 2 Mikroliter dieser Liposome (20 Nanomol Phospholipid), 100 Mikroliter Meerschweinchenkomplement (verdünnt 1,8 in Komplement­ lysepuffer), 50 Mikroliter Kaninchenantiserum gegen­ über DNP, 100 Mikroliter Puffer oder Standardlösung und 1 ml Phosphatasesubstrat gegeben. Das Reaktionsge­ misch wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert und dann wurde zur Beendigung der Enzymreaktion 1 ml 0,5N Natrium­ hydroxid zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wurde spektrophotometrisch gemessen. Das Ausmaß, in dem die Reaktion von der Menge an DNP-Lysin abhängig war wird nachfolgend gezeigt:

Menge von DNP-Lysin (pmol)
Absorption bei 405 nm
0
0,95
2,0	0,902
2,5	0,811
4	0,573
5	0,430
6	0,311
7	0,257

Trägt man die 405 nm Absorption gegen den Logarithmus der Menge an DNP-Lysin auf, so erhält man eine gerade Linie mit einer Neigung von 66,8, einem Abschnitt (intercept) bei 143 und einen Korrelationskoeffizienten von 0,995. Eine 50%-ige Inhibierung der Lyse wird mit 4 pmol DNP-Lysin erzielt.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird eine kinetische quantitative Bestimmung von Liposomen, wie sie in dem vorhergehen­ den Beispiel beschrieben wurde, zur quantitativen Bestimmung von Antigenen während der Messung des Grades der Enzymreaktion verwendet. In diesem Fall werden die Reagentien in den in Beispiel 6 angegebenen Men­ gen in einer Spektrophotometerküvette vermischt. Der Zeitverlauf der Enzymreaktion wird dann direkt über­ wacht. Nach einer typischen Verzögerungsphase nimmt der Grad der Absorptionszunahme bei 405 nm eine lineare Funktion der freien Antikörperkonzentration an. Typi­ scherweise gibt man in eine Spektrophotometerküvette 0,75 ml Phosphatasesubstratlösung, 50 Mikroliter Antikörper, 0,1 ml Komplement und 5 Mikroliter Liposome. Die Küvette wird dann in einen in einem Thermostat be­ findlichen Spektrophotometer gegeben und die Absorption bei 405 nm wird aufgezeichnet. Eine charakteristische Verzögerungsphase von 2 bis 3 Minuten wird festgestellt, während der sich die Absorption nur wenig verändert. Nach dieser Verzögerung nimmt die Absorption schnell zu. In weniger als 5 Minuten ist der Grad der Erhöhung eine Funktion der Menge an verfügbarem Antikörper.

Proteine und andere Makromoleküle können an Liposome gekuppelt werden. Solche Liposome mit an deren Außen­ oberfläche anhaftenden Proteinen unterliegen einer durch Komplement bewirkten Lyse in Gegenwart von Antikörpern zu den eingebrachten Proteinen. Liposome lassen sich herstellen, die innerhalb der Membran zweischichtige Lipide haben, die geeignet sind zum Kuppeln mit Proteinen und anderen Makromolekülen. Typi­ sche Lipide, wie Phosphatidylethanolamin, Phosphati­ dylserin oder Phosphatidylinosit wären geeignet.

Beispiel 8

Die in Beispiel 1 angewendete Methode wird zur Her­ stellung von Alkaliphosphatase enthaltenden Liposomen verwendet. In diesem Fall besteht das, Lipidgemisch aus 25 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin, 10 mg Phosphatidyl­ ethanolamin und 8,6 mg Cholesterin. Diese Liposome werden durch wiederholtes Zentrifugieren gereinigt und danach werden sie in 2 ml 0,1M Boratpuffer von pH 8,5 resuspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 20 Mikro­ liter 25%-igen Glutaraldehyd. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch über Nacht gegen 2 l Boratpuffer dialysiert. Die aktivierten Liposome gibt man dann zu 2,4 mg Rinderserumalbumin in 1 ml Borat­ puffer. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend werden die Liposome mit dem daran befindlichen Protein von ungebundenem Protein durch 30-minütiges Zentrifugieren mit 25 000 G abgetrennt. Arbeitet man nach der Bestimmungsmethode gemäß Bei­ spielen 3 und 4 unter Verwendung von Kaninchenanti­ körper gegenüber Rinderserumalbumin, so kann man eine Immunolyseuntersuchung vornehmen, durch welche Albumin quantitativ in Mengen von 0,1 bis 2 µg/1 ml bestimmt werden kann.

Beispiel 9

Zur Bestimmung des Herzglykosids wurde Digoxin an Dipalmitoylphosphatidylethanolamin gekuppelt. Zu diesem Endgemisch, enthaltend 0,5 g (0,64 mM) Digoxin in 20 ml Ethanol/Dioxan (4 : 1 V/V) wurden 60 ml 0,1M Na­ triummetaperjodat gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minu­ ten bei Raumtemperatur gerührt und dann wurden 4,5 ml Ethylenglykol zugegeben. Das Gemisch wurde 1/2 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der zurückgebliebene Feststoff wurde dreimal mit 50 ml Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegeben (Gesamtvolumen 150 ml) und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abge­ dampft, wobei man 0,9 g eines öligen Rückstandes erhielt. 25 mg dieses Rohproduktes von Digoxindialdehyd in 1 ml Ethanol/Chloroform (1 : 4) wurden zu 20 mg Dipalmi­ toylphosphatidylethanolamin in 1 ml Ethanol/Chloroform (1 : 2) gegeben. Dann wurden 4 Tropfen Triethylamin zu­ gegeben und das Reaktionsgemisch (pH 9) wurde über Nacht bei 37°C inkubiert und schließlich wurde bis zu einem trockenen Rückstand unter vermindertem Druck einge­ dampft. Dieser Rückstand wurde in 2 ml Ethanol/Chloroform (1 : 1) suspendiert und dazu wurden 4 mg Natriumborhydrid gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und dann bis zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethanol trituriert und dann filtriert, wobei man ein Filtrat erhielt, aus dem 45 mg des verbundenen Produktes Dipalmitoylphosphatidyl-Phos­ phatidylethanolamin-Digoxin erhalten wurden.

Beispiel 10

Das verbundene Produkt aus Digoxin und Dipalmitoyl­ phosphatidylethanolamin wird zur Herstellung von Liposomen mit Digoxin verwendet. In diesem Fall werden 22 mg Dimyristoylphosphatidylcholin, 8,6 mg Cholesterin, 1,6 mg Dicetylphosphat und 2,5 mg Digoxin-Dipalmitoyl­ phosphatidylethanolamin-Konjugat in 3 ml Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft, wobei sich die Lipide als dünner Film auf der Innenwand eines 100 ml Rundkolbens absetzen. Dieser Lipidfilm wird dispergiert, wie in Beispiel 1, und gereinigt wie in Beispiel 1.

Untersuchungen wurden wie in Beispiel 6 vorgenommen. Eine Inhibierung durch Digoxin in Proben wurde im Be­ reich von 0,5 bis 10 ng/ml Digoxin in der Testprobe beobachtet.

Liposome kann man erfolgreich gefrieren, wenn man sie zuerst in einem isotonischen Medium, wie 0,01M Phos­ phatpuffer, enthaltend 0,15M Natriumchlorid, suspendiert.

Geeignet sind auch Lösungen, die im Bereich von pH 4 bis pH 10 gepuffert sind und 0,3M Glukose oder ähnliche Kohlehydrate enthalten. Liposome, die in einem proteinhaltigen Medium gefroren sind und die beispielsweise Rinderserumalbumin oder Kaninchen-Gamma­ globuline enthalten, werden nicht bevorzugt, weil sie erhöhte Niveaus an Enzymaktivität in Abwesenheit von lytischen Reagentien, wie Detergentien oder Komplement plus Antikörper, ergeben. Die besten Ergebnisse er­ zielt man durch Schnellgefrieren mit einer Geschwin­ digkeit von wenigstens 5°C/min. Vor dem Gefrieren wer­ den die Liposome in einem isotonischen Medium in Konzentrationen von 1 bis 10 mg/ml suspendiert. Bei­ spielsweise kann man die Liposome, wie sie in Beispiel 1 hergestellt wurden, in 0,01M Natriumphosphatpuffer, enthaltend 0,15M Natriumchlorid, suspendieren. Diese Suspension enthält 2,5 mg Gesamtlipid in 1 ml Flüssig­ keit. 0,1 ml Aliquote dieser Mischung werden in eine 5 ml Ampulle gegeben. Sie werden dann auf -20°C mit einer Geschwindigkeit von 5°C/min gefroren. Die Lipo­ some können aufgetaut werden und auch nach längerer Lagerung verwendet werden.

Es sind zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung hier beschrieben worden, aber für den Fachmann ist es ersichtlich, daß zahlreiche Änderungen möglich sind. Bestimmte Konzentrationen, Kombinationen oder Ma­ terialien können variiert werden, solange das Signal­ zu-Rausch-Verhältnis-Minimum gemäß der Erfindung aufrechterhalten bleibt, um falsche Ablesungen zu ver­ hindern. Eine große Anzahl von Materialien kann in einem weiten Bereich von hochvolumigen Nachweisreaktionen durch verhältnismäßig unqualifiziertes Personal untersucht werden.

Die zu untersuchenden Materialien können Körperflüs­ sigkeiten oder Mischungen aller Art sein. Wird Serum getestet, so wird es vorzugsweise chemisch behandelt und/oder auch erhitzt, um eine unerwünschte Inhibie­ rung auszuschließen. Eine vorherige Behandlung mit Aminogruppen stellt eine solche chemische Methode dar. Typischerweise gibt man 0,1 ml von 2,54M Ammoniak zu 1,9 ml Serum zu und neutralisiert dann durch Zugabe von 0,1 ml 2,54M Chlorwasserstoffsäure. Auch Sulfhydryl- Blockungsmittel können brauchbar sein. In diesem Fall gibt man zu 1 ml Serum 0,1 ml 0,2M mercaptoethanolin­ phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Dann gibt man 1 ml 0,2M Jodoacetamid hinzu. Ähnlich geeignet ist auch der Sulfonsäureazofarbstoff Chlorazol-Echtrosa, der selek­ tiv eine Humankomplementaktivierung, jedoch nicht Meerschweinchenkomplement inhibiert. Eine Wärmebehand­ lung von wenigstens 30 bis vorzugsweise 60 Minuten bei etwa 58°C ist gleichfalls geeignet, um eine uner­ wünschte Inhibierung der Komplementreaktion zu ver­ meiden.

Claims (7)

1. Ein Immuno-Testverfahren, bei dem man eine Mischung herstellt aus:

• (a) einem Liposom, das an seiner äußeren Oberfläche gebunden ein Antigen oder einen Antikörper trägt und in seinem Innenraum ein Enzym eingeschlossen enthält,
• (b) ein Substrat für das Enzym,
• (c) ein auf die spezifische Aktivität des Antigens oder des Antikörpers dazu zu prüfendes Testmaterial, und
• (d) Komplement,

und die Enzymaktivität quantitativ oder qualitativ bestimmt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in homogener Phase und ohne vorherige mechanische Abtrennungs- oder Reinigungsstufe durchgeführt wird.

3. Verwendung eines immunoreaktiven Liposoms in einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom an seiner äußeren Oberfläche gebunden ein Antigen oder einen Antikörper trägt und in seinem Innenraum ein Enzym eingeschlossen enthält, und das in Gegenwart eines Komplements ein Signal/Rausch- Verhältnis von nicht weniger als 5 zeigt.

4. Test-Satz zum Nachweisen von Antigen oder Antikörpern, der ein Liposom, das an seiner äußeren Oberfläche gebunden ein Antigen oder einen Antikörper trägt und in seinem Innenraum ein Enzym eingeschlossen enthält, ein Substrat für das Enzym und ein Komplement in einem oder mehreren Behältern enthält.

5. Test-Satz gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein dem Antikörper oder dem Antigen artverwandter Stoff vorhanden ist.

6. Test-Satz gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er eine vorbestimmte Konzentration des zu dem Antikörper oder Antigen artverwandten Stoffs enthält.