DE3046979C2

DE3046979C2 -

Info

Publication number: DE3046979C2
Application number: DE3046979A
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Cais; Moshe Haifa Il Shimoni
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 1979-12-12
Filing date: 1980-12-12
Publication date: 1989-05-18
Also published as: ZA807508B; SE8008664L; JPS6228681B2; FR2471204A1; IT1141126B; JPS56161801A; IT8026541A0; GB2064357B; IL58943A; CA1158839A; NL189801B; SE448403B; FR2471204B1; BE886517A; DE3046979A1; GB2064357A; NL8006730A; IL58943A0; US4454231A; NL189801C

Description

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstand und sie ist auf Stoffaustausch- und Trennprozesse zwischen zwei im wesentlichen miteinander nicht mischbaren flüssigen Phasen gerichtet.

Derartige Massentransferphänomene werden überall in der Natur angetroffen und sie spielen auch auf allen wissenschaftlichen und technischen Gebieten eine wichtige Rolle. Zum Massentransfer gehört z. B. die Molekulardiffusion, der durch Konvektion bewirkte Transport und einfaches Mischen. Ein Massentransfer findet überall dort statt, wo chemische Reaktionen erfolgen, sei es in einem Industriereaktor, einem biologischen System oder einem Forschungslaboratorium. Die reagierenden Substanzen müssen zusammenkommen, wenn die Reaktion ablaufen soll. In vielen Fällen verlangsamt sich die Reaktion oder sie kommt zum Stillstand, wenn das oder die Reaktionsprodukte nicht entfernt werden. Die Massentransferrate kann die chemische Umwandlung vollständig bestimmen, wenn die Reaktionspartner aus einer Phase in eine andere überführt werden müssen, um die Reaktion ablaufen zu lassen. Bei reversiblen Reaktionen wird die Umwandlung verbessert, wenn das gewünschte Produkt durch Massentransfer kontinuierlich entfernt wird in eine zweite Phase, in welcher keine Reaktion stattfindet. Ferner können die relativen Massentransferraten der verschiedenen Reaktionspartner und Verfahrensprodukte die Selektivität stark beeinflussen, wenn konkurrierende Reaktionen ablaufen.

Flüssig-Flüssigphasenoperationen, in denen ein Massentransfer erfolgt, werden in der Regel in Gefäßen durchgeführt, deren Prinzip darauf beruht, daß nach einem innigen Vermischen oder Kontaktieren einer Phase mit der anderen die beiden Phasen trennen gelassen und voneinander entfernt werden. Die für diesen Zweck allgemein bekannte Laboreinrichtung ist ein Scheidetrichter, dessen Nachteile u. a. in den sehr zahlreichen manuellen Handgriffen zu sehen ist, die zur Trennung der beiden Phasen erforderlich sind. Für das Arbeiten in industriellem Maßstab sind zwei Haupttypen von Vorrichtungen in Gebrauch, nämlich Misch-Absitzbehälter und andere Typen von Säulen. Dabei wird die Leichtigkeit des Mischens von der Grenzflächenspannung, den relativen Dichten und der Viskosität der Phasen beeinflußt und die Trennung der beiden Phasen kann durch Schwerkraft oder Zentrifugalkraft bewirkt werden. Die Leichtigkeit der Trennung hängt hauptsächlich vom Unterschied in der Dichte der beiden Phasen und deren Viskosität ab und kann merklich beeinflußt werden durch das Vorliegen von Verunreinigungen, welche Emulsionen stabilisieren können. Diese Erscheinung tritt z. B. bei Misch-Absetzbehältern auf.

Außer durch Mischen kann der Massentransfer auch durch Fließenlassen der beiden flüssigen Phasen im Gegenstrom oder im Gleichstrom in horizontalen Röhren oder Leitungen bewirkt werden, wobei die weniger dichte Phase im oberen Abschnitt der Röhre fließt, oder in vertikalen Röhren oder Leitungen, wobei die dichtere Phase an der Röhrenwand nach unten fließt, während die weniger dichte Phase durch den Mittelabschnitt der Röhre nach oben fließt. Sowohl beim horizontalen als auch beim vertikalen Vorrichtungstyp wird der erweiterte Kontaktbereich durch eine ausreichende Länge der Vorrichtung erzielt. Beide Typen von Flüssig-Flüssigextraktionsvorrichtungen sind jedoch mit zahlreichen Nachteilen behaftet. Im Falle des Misch-Absetzbehälters macht z. B. die intensive Rührbewegung oder der turbulente Fluß die nachfolgende Trennung der flüssigen Phasen im Absitztank in der Regel schwierig aufgrund der geringen Größe und der großen Stabilität der Tröpfchen der dispersen Phase, so daß die Trennung sehr langsam erfolgt und größere Gefäße erforderlich sind. Im Falle von Säulen ist die Kapazität der Vorrichtung durch die Tatsache begrenzt, daß die Fließrate der beiden Phasen langsam genug sein muß, um ein Vermischen der Phasen zu vermeiden, da sowohl das Kontaktieren als auch das Trennen der Phasen im gleichen Teil der Vorrichtung erfolgt. Aus Vorstehendem ergibt sich die Wichtigkeit des gründlichen Vermischens der Phasen, um eine wirksame Überführung einer oder mehrerer Komponenten aus einer Phase in die andere zu erzielen.

Aus der US-PS 25 24 362 ist eine Ampulleninjektionsspritze bekannt, aus einem zylindrischen Bauteil mit einem in diesem bewegbaren Hohlkolben, der an der Innenwand der Ampulle gleitend eingreift. Wird der Kolben in den zylindrischen Bauteil gedrückt, so fließt Flüssigkeit durch die axiale Durchflußöffnung im Kolben und wird durch eine Nadel am Ende der Ampulle ausgestoßen.

Basierend auf dem gleichen Prinzip ist aus der US-PS 35 12 948 eine Reagenzglasfiltervorrichtung bekannt, bei der der oben genannte Kolben durch einen Hohlkolben ersetzt ist, der einen als Filter dienenden porösen Bodenteil aufweist. Eine spezielle Verwendung dieser auf dem angegebenen Prinzip beruhenden Vorrichtung zur Trennung von Blutfraktionen wurde später in einigen US- und DE-Patentschriften beschrieben, z. B. in den DE-PS 24 15 618 und 24 54 918 und den diesen entsprechenden US-PS 40 21 352 und GB-PS 15 08 844. Gemäß diesen Druckschriften wird das koagulierte Blut, das durch Ausfällen oder Zentrifugation in Blutkörperchen und Blutplasma getrennt wurde, in ein zylindrisches Gefäß eingebracht und ein Hohlkolben, der an seinem untern Ende eine Scheibe aus z. B. gesintertem Glas aufweist, wird nach unten in das zylindrische Gefäß gedrückt, bis er sich oberhalb der Grenzflächen zwischen den beiden Fraktionen befindet, ohne daß er diese Grenzfläche erreicht. Zum Sammeln des Blutplasmas, das durch die obere Öffnung des Kolbens auftritt, ist oberhalb des zylindrischen Gefäßes ein Sammelbehälter vorgesehen. Beim Gebrauch dieser Vorrichtung muß jedoch besonders sorgfältig darauf geachtet werden, daß ein Vermischen der beiden Phasen während der Abwärtsbewegung des Kolbens vermieden wird, so daß nur eine teilweise Entfernung des Plasmas erzielbar ist.

Ähnlich ausgebildet und mit ähnlichen Nachteilen behaftet ist die in der US-PS 33 55 098 beschriebene Serumtrennvorrichtung, bei der der innere, im Probe- oder Zentrifugenröhrchen gleitende Hohlkolben am unteren Ende durch eine Kautschukbodenplatte abgeschlossen ist, durch die ein darin befestigter flexibler Kappillarschlauch ragt, dessen anderes Ende aus dem oben offenen Hohlkolben herausgeführt und in einen separaten Sammelbehälter eingeführt werden kann. Die obere von zwei zuvor getrennten nicht mischbaren flüssigen Phasen kann somit durch vorsichtiges Einführen des Hohlkolbens bis zur Phasengrenzfläche durch den Kapillarschlauch in den Sammelbehälter überführt werden, was allerdings aufgrund der geschilderten baulichen Ausgestaltung nicht quantitativ gelingt.

Erfindungsgemäß gelingen demgegenüber Massentransferoperationen und physikalische Trennung bei zwei flüssigen Phasen quantitativ im gleichen Teil der integral ausgestalteten Vorrichtung; die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich auch durch eine extreme Vielseitigkeit aus und ist sowohl im Laboratoriums- als auch in industriellem Maßstab anwendbar entweder im kleinen mit Mikroliter-Volumina oder im großen mit Hunderten oder sogar Tausenden von Litern.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vielseitig verwendbar in den verschiedensten Verfahren, die mit Massentransferoperationen zu tun haben, und ihre Anwendbarkeit wird im folgenden für Lösungsmittelextraktion und Immunoassay-Technik unter besonderer Betonung der letzteren erläutert, da gerade hier, insbesondere wenn es sich um nicht-homogene Techniken handelt, alle üblichen bekannten Methoden mit schwerwiegenden Nachteilen unterschiedlichen Typs behaftet sind. Demgegenüber ist es erfindungsgemäß möglich, in sehr einfacher Weise zu sehr genauen Ergebnissen zu kommen, wobei als weiterer Vorteil hinzukommt, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung aufgrund ihres geringen Preises zum einmaligen Gebrauch bestimmt sein kann.

Der als Mischbehälter dienende erste Behälter A der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann jede beliebige geeignete geometrische Form aufweisen und entsprechend der Ausgestaltung dieses Behälters A besitzt die Mischer-Separator-Einheit B eine entsprechende Ausgestaltung.

Zur Erläuterung der Erfindung sei z. B. angenommen, daß eine wäßrige Lösung vorliegt, die einen gelösten Stoff enthält, der in irgendeinem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, löslich ist. Diese wäßrige Lösung wird in den ersten Behälter A in solcher Weise eingebracht, daß sie etwa ein Viertel des Volumens des Behälters A einnimmt. Ein geeignetes organisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar und zur Aufnahme des gelösten Stoffes bestimmt ist, wird sodann in den Mischbehälter A eingeführt, wobei dessen Menge je nach Volumenkapazität des ersten Behälters variieren kann. Das spezifische Gewicht des organischen Lösungsmittels kann größer oder kleiner sein als dasjenige der wäßrigen Lösung.

Die beiden Phasen werden sodann sorgfältig gemischt durch Bewegen der Mischer-Separator-Einheit B in den Behälter A und aus diesem heraus. Gewünschtenfalls kann dieses Vermischen auch mit Hilfe eines Vibrationsmischers oder Magnetrührers oder irgendeiner anderen geeigneten Mischvorrichtung während eines kurzen Zeitraums erfolgen. Nach dem Vermischen wird das System während einer angemessenen Zeitspanne stehen gelassen, wobei die zwei nicht-mischbaren Phasen als obere und untere Phase erhalten werden. Die Mischer-Separator-Einheit B wird nach unten gedrückt unter Eintritt der oberen flüssigen Phase durch den Kanal C in den Sammelbehälter E und das Eindrücken dieser Einheit B erfolgt bis zum Erreichen der Phasengrenzfläche, so daß die obere Phase, welcher den zuvor in der wäßrigen Phase vorliegenden gelösten Stoff enthält, vollständig entfernt wird.

Die auf diese Weise abgetrennte obere Phase kann sodann in ein geeignetes Meßgefäß überführt werden zur Bestimmung der Menge an gelöstem Stoff aus der unteren Phase, und die gleiche Meßoperation kann mit der unteren Phase, welche im ersten Behälter A zurückbleibt, durchgeführt werden.

Handelt es sich bei dem ursprünglich in der wäßrigen Phase vorliegenden gelösten Stoff um ein Gammastrahlung-emittierendes Radioisotop, so wird die Operation wie angegeben ausgeführt und das ganze System in den Schacht eines Gammazählerinstruments in solcher Weise eingesetzt, daß nur die emittierende Strahlung der im Behälter A verbleibenden Phase gezählt wird. Da die Gesamtstrahlungsmenge schon vorher bekannt ist, ergibt der Zählwert der im Behälter A verbleibenden unteren Phase den Verteilungsgrad des im gelösten Stoff vorliegenden Gamma-emittierenden Radioisotops zwischen den beiden Phasen.

Dieses Analyseverfahren erweist sich als besonders vorteilhaft zur Entwicklung von Immunoassay-Techniken, die winzige Konzentrationen chemischer Substanzen in biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen gestatten. Als Beispiele für chemische Substanzen, die sich für eine derartige Analysenmethode anbieten, können genannt werden:

Alkaloide, wie Morphin, Codein, Dihydrocodein, Heroin, Oxymorphon, Metopon und Pholcodin
Barbiturate, wie Veronal, Luminal, Seconal, Phenobarbital und Barbital
Steroide und Östrogene, wie β-Östradiol, Östron, Östriol, 17α-Äthyinyl-Östradiol und dgl., Androgene, Progestogene und adrenocorticoide Hormone
Cannabinoide und deren Metabolite
Vitamine, wie Carotin, Riboflavin, Thiamin, Niacin, Ascorbinsäure, Tocopherol und Phytyl-1,4-naphtochinon
Aminosäuren und Polypeptide
Zucker einschließlich Saccharide und Polysaccharide
Tranquilizer, wie Meprobamat, Valium, Oxazepam und Phenothiazine

Zusätzlich zu den obigen Haptenen können verschiedene andere Verbindungen, z. B. Cocain, Prostaglandin, Antibiotica wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin und Nucleinsäure und Nucleotide, Insecticide, Fungicide, Bacteriocide und Nematocide wie Malation, Carbamate und dgl., mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung bestimmt werden. In der Regel bieten sich Antigene, Haptene und deren Antikörper, Hormone, Vitamine, Arzneimittel, Metabolite und deren Receptoren und Bindematerialien für die erfindungsgemäße Bestimmung an.

Von den erfindungsgemäß bestimmbaren speziellen Verbindungen seien z. B. genannt:

kompensiertes T₄:
Cortisol;
Digoxin;
Folat;
h G H;
T₃-Aufnahme;
Insulin;
Trÿodthyronin;
Thyroxin (gesamt-T₄);
T S H;

Der Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ferner besonders geeignet in den Fällen, wo das Markierungsmittel ein fluoreszierendes Markierungsmaterial ist, wobei die Messung mit einem geeigneten Spektrometer durchgeführt wird. Handelt es sich beim verwendeten Markierungsmittel um ein Gammastrahlung-emittierendes Radioisotop wie Jod-125 und besteht die obere Phase aus einem organischen Lösungsmittel, so enthält die wäßrige Phase, welche im ersten Behälter A nach der Trennung durch die Mischer-Separator-Einheit B vorliegt, den Antikörper-Antigen-Komplex und die gesamte Vorrichtung kann in den Schacht des Gammazählers in solcher Weise eingesetzt werden, daß nur die untere Phase vom Instrument gezählt wird. Das gleiche gilt auch dann, wenn die untere Phase aus einem organischen Lösungsmittel besteht und beim Einsetzen der gesamten Vorrichtung in den Schacht des Gammazählers wird der in das organische Lösungsmittel überführte freie ungebundene Ligand gezählt.

Dieses Verfahren ist für jede Immunoassay-Technik anwendbar, z. B. für Radioimmunoassay-, freie Radikalassay-, Fluoreszenzimmunoassay-, Enzymimmunoassay- oder Metallimmunoassay-Techniken (wie sie z. B. in der US-PS 42 05 952 beschrieben werden). Ganz besonders geeignet ist die erfindungsgemäße Vorrichtung für die verschiedenen auf dem Markt befindlichen Kits und Verpackungseinheiten zur Durchführung dieser Techniken.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäße Vorrichtung ist die Trennung von freiem Antigen von gebundenem Antigen-Antikörper-Komplex im Falle von Proteinen, Zellen und anderen hochmolekularen Verbindungen, wenn zwei wasserlösliche, jedoch miteinander unverträgliche Polymere zur Induzierung des Entmischens dienen. Dies erzeugt zwei wäßrige Phasen, zwischen denen verschiedene Spezien verteilt sein können. Bezüglich dieses Phänomens vgl. z. B. P. A. Albertson et al., Nature 184, 1465, 1959 und G. Johnson et al. Hur. J. Biochem. 33, 379, 1973). Miteinander unverträgliche Paare von Polymeren gibt es viele (vgl. z. B. A. Dobry et al. J. Polym. Sci. 2, 90, 1947). Erfindungsgemäß können sodann die beiden entmischten wäßrigen Phasen in der angegebenen Weise getrennt werden.

Der Einsatz der Vorrichtung nach der Erfindung erweisen sich ferner hochgradig geeignet in der Atomabsorptionsspektrometrie zur Analyse von Spurenmetallen. Dabei ist es oftmals notwendig, eine Extraktion durchzuführen, bei der das organische Lösungsmittel ein chelatbildendes Mittel enthält zur Extraktion des Metallions aus dem wäßrigen Medium. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung stellt eine sehr einfache und wirksame Extraktionsmethode dar und nach der Abtrennung der organischen Phase im Sammelbehälter E der Vorrichtung ist es möglich, diese organische Phase direkt für die Atomabsorptionsmessungen zu verwenden. Diese Vorrichtung kann auch leicht in automatische Systeme zum Einspritzen von Proben in Atomabsorptionsspektrometer eingebaut werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und deren Einsatz zeichnen sich somit durch technische Einfachheit, Geschwindigkeit und Billigkeit aus und bieten eine ideale Methode in der Flüssig-Flüssigextraktion im allgemeinen und in der Immunoassay-Technik im besonderen. Das seit langem bestehende Bedürfnis nach einer derartigen Vorrichtung und einem derartigen Verfahren wird auch durch das bekannte Fachbuch W. D. Odell und W. H. Daughaday "Principles of competive protein-binding assays", Verlag J. P. Lippincott Co. Philadelphia und Toronto 1971, bestätigt, wo es in Kapitel XI auf Seite 303 heißt, daß die Tatsache, daß so viele verschiedene Trenntechniken vorgeschlagen wurden, für eine gewisse Unbefriedigung mit den bestehenden Methoden spricht.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnung mit den Fig. 1 bis 5 näher veranschlicht.

In Fig. 1 wird eine vorteilhafte Ausführungsform der Vorrichtung schematisch dargestellt. Die Vorrichtung besteht aus den vier Hauptkomponenten erster Behälter A, Mischer-Separator-Einheit B, Sammelbehälter E und Verschluß S. Der Verschluß S kann sich entweder in geschlossener oder offener Stellung befinden.

In Fig. 1a wird die Vorrichtung mit den beiden flüssigen Phasen, nämlich der oberen Phase U und der unteren Phase L, gezeigt, wie sie vor der Massentransferoperation vorliegen.

In Fig. 1b ist dargestellt, wie die Mischer-Separator-Einheit B vollständig in den Behälter A eingedrückt ist, wobei die beiden Phasen innig miteinander vermischt werden. Während der Ab- und Aufbewegungen der Mischer-Separator-Einheit B ist der Verschluß S geschlossen. Dies führt zur Bildung eines Vakuums im Behälter A und zu einem erhöhten Druck im Sammelbehälter E. Die Kombination dieser beiden Effekte bewirkt ein besonders wirksames Mischen und eine entsprechend hochwirksame Massentransferoperation. Nach beendetem Mischen wird die Mischer-Separator-Einheit B in der oberen Stellung (wie in Fig. 1a gezeigt) belassen, der Verschluß S geöffnet zur Aufhebung des Luftdruckes und die vermischten Flüssigkeiten spontan in eine obere und untere Phase trennen gelassen.

Fig. 1c zeigt die Vorrichtung bei eingedrückter Mischer-Separator-Einheit B in den ersten Behälter A nach Trennung der beiden flüssigen Phasen in eine obere Phase U und eine untere Phase L. Die Mischer-Separator-Einheit B kann bis zu einem gewünschten Niveau herabgedrückt werden, so daß nur wenig oder überhaupt keine obere Phase im Kanal C verbleibt. Bei geöffnetem Verschluß S kann die obere flüssige Phase U gewünschtenfalls in ein anderes Gefäß geschüttet werden. Keine der im Kanal C verbliebenden Phasen wird während dieser Entfernung der oberen Phase U mit ausgeschüttet aufgrund des Vakuums, das im Mischbehälter A erzeugt wurde.

Fig. 2 zeigt eine weitere Ausgestaltung der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung, bei der sich der Kanal C nicht längs der gesamten Länge der Mischer-Separator-Einheit B erstreckt. Die Fig. 2a, 2b und 2c erläutern die Wirkungsweise der Vorrichtung wie für Fig. 1 beschrieben. Die in diesen Figuren veranschaulichte Ausführungsform der Vorrichtung zeigt ferner einen unterschiedlichen Typ des Verschlusses S.

Fig. 3 stellt eine andere vorteilhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar, wonach nur der untere Teil Bb der Mischer-Separator-Einheit B in den ersten Behälter A eingepaßt ist. Außerdem ist der Behälter A mit einer kalibrierten Skala G für Volummessungen versehen. Selbstverständlich kann eine derartige Kalibrierung auch bei den in den anderen Figuren gezeigten Ausführungsformen vorliegen. Der eng eingepaßte Teil Bb, bei dem es sich um einen integralen Teil der Mischer-Separator-Einheit B handelt, kann auch in solcher Weise vorliegen, daß er durch eine Schraubverbindung oder ein anderes geeignetes Mittel austauschbar ist. Die Wirkungsweise der in den Fig. 3a und 3c dargestellten Vorrichtung entspricht derjenigen, wie sie in den Fig. 1a, 2a bzw. 1c und 2c gezeigt ist.

In Fig. 1 wird eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Es handelt sich dabei um eine Konstruktion, die das glatte Gleiten der Mischer-Separator-Einheit B in den ersten Behälter A noch weiter erleichtern soll. Diese Ausführungsform erweist sich insbesondere in den Fällen als vorteilhaft, in denen die Vorrichtung aus einem Material besteht, bei dem der Gleiteffekt nicht leicht erzielt wird. Wie aus Fig. 4b ersichtlich, weist der erste Behälter Ac mindestens zwei sich in Längsrichtung erstreckende Führungsvertiefungen auf, die in den Wänden des Behälters Ac vorgesehen sind. Fig. 4c zeigt einen Querschnitt des Behälters Ac, in dem vier derartige sich in Längsrichtung erstreckende Vertiefungen vorliegen. Die in Fig. 4a dargestellte Mischer-Separator-Einheit Bc hat natürlich eine entsprechende Zahl von Erhebungen, wobei ein Querschnitt derselben in Fig. 4d gezeigt ist. Die Zahl der Erhebungen an der Mischer-Separator-Einheit (vgl. Fig. 4a) muß im Einklang stehen mit der Zahl der Längsvertiefungen oder -aussparungen im ersten Behälter Ac. Beim Eindrücken der Mischer-Separator-Einheit Bc in den ersten Behälter Ac wird der gleiche enge Einpassungseffekt erzielt wie bei der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung.

Fig. 5 zeigt eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, gemäß welcher wiederum die vier Hauptkomponenten vorliegen, nämlich ersten Behälter A (Fig. 5b), Mischer-Separator-Einheit B, Sammelbehälter E und Verschluß S. Für die Mischer-Separator-Einheit B sind zwei Modifikationen gezeigt. Gemäß einer dieser Modifikationen (Fig. 5a) ist der Sammelbehälter E Teil der Mischer-Separator-Einheit B und gemäß der zweiten Modifikation (Fig. 5c) kann der Sammelbehälter E′ von der Mischer-Separator-Einheit B′ abgenommen werden, was die Verwendung eines Sammelbehälters E′ aus einem anderen, z. B. für bestimmte Meßmethoden geeigneten Material ermöglicht, wie weiter unten noch näher erläutert wird. Die Mischer-Separator-Einheit B bzw. B′ weist am unteren Endbereich ein Abdichtungselement auf, das zum Gleiten längs der Innenwände des ersten Behälters A ausgestaltet ist. Das Abdichtungselement besitzt mindestens eine Öffnungsbohrung, die dessen Dickenabmessung durchdringt und mit dem Kanal C bzw. C′ in Verbindung steht. Verschiedene Modifikationen sind in bezug auf Lage und Ausgestaltung des Abdichtungselements im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich. So kann z. B. das Abdichtungselement aus einem Kautschuk-O-Ring mit einer Öffnungsbohrung bestehen, der längs der Innenwände des ersten Behälters A zu gleiten vermag. Durch Eindrücke der Mischer-Separator-Einheit B wird die obere Flüssigkeitsschicht durch die Öffnungsbohrung und den Kanal C gesaugt und speichert sich im Sammelbehälter E. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist der Kautschuk-O-Ring etwas oberhalb des Fußpunkts der Mischer-Separator-Einheit B angeordnet, so daß der Kautschuk nicht in Kontakt mit der unteren flüssigen Phase aus dem ersten Behälter A gelangt. In diesem Falle bestehen in bezug auf den Kautschuktyp keine Beschränkungen. Der Verschluß S, der das Abschließen des Sammelbehälters E bzw. E′ ermöglicht, weist einen inneren perforierten Deckel auf, der es ermöglicht, daß die eingeschlossenen Flüssigkeitstropfen in den Sammelbehälter E durch die Löcher dieses Deckels zurückkehren. Selbstverständlich können diese Löcher jede beliebige Gestalt und Größe aufweisen, ohne die Wirkungsweise der Vorrichtung zu beeinträchtigen. Die Wirkungsweise und Handhabung dieser Vorrichtung ist ähnlich derjenigen, wie sie in Fig. 1 beschrieben ist.

Wie bereits erwähnt, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung erfolgreich auf dem allgemeinen Gebiet der Flüssig-Flüssigextraktion anwendbar, und zwar sowohl in kleinem als auch großem Maßstab. In kleinem Maßstab kann sie in der Grundlagenforschung zur Lösungsmittelauswahl verwendet werden oder zur Bestimmung der Grenzbedingungen der Verteilungskoeffizienten eines bestimmten Lösungsmittels. In großem Maßstab konkurriert sie sehr vorteilhaft mit den Standard-Misch-Absitzapparaturen oder den bekannten Typen von Säulen aufgrund der Leichtigkeit und Effizienz des mit ihr erzielbaren Massentransfers.

Als einer der Hauptvorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die vollständige Abwesenheit von hydraulischen Verbindungsstücken und die Trennung der Mischoperation von der Ansaugfunktion gelten, so daß jede dieser Operationen unabhängig von der anderen nach jeweils den eigenen Erfordernissen erfolgen kann unter Ausschaltung der Gefahr eines Rückvermischens.

Mit anderen Worten, die erfindungsgemäße Vorrichtung ergibt die hohe Effizienz des Massentransfers, die in der Regel bei Verwendung eines Mischers erzielt wird, ist aber gleichzeitig frei von den Nachteilen, die bei Verwendung einer Mischvorrichtung auftreten. Die Ausgestaltung der einzelnen Elemente der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann je nach speziellem Verwendungszweck variiert werden. Auch das Volumen des Behälters A und des Sammelbehälters E kann je nach Erfordernis, daß sich aus den Volumina der beiden im jeweiligen Trennprozeß beteiligten flüssigen Phasen ergibt, variiert werden. Beim Sammelbehälter E kann es sich um ein Aufnahmegefäß in jeder gewünschten geometrischen Form und Größe handeln, sofern dafür gesorgt wird, daß es ab einer bestimmten geeigneten Höhe vom oberen Ende der Mischer-Separator-Einheit B breiter ist als der Außendurchmesser des ersten Behälters A, um gewünschtenfalls die quantitative Aufnahme eines vorbestimmten Flüssigkeitsvolumens zu erzielen.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist ein Ring D zwischen dem oberen Ende des ersten Behälters A und dem Sammelbehälter E vorgesehen, der auf die Mischer-Separator-Einheit B gleiten kann und damit das Niveau des Eindrückens der Mischer-Separator-Einheit B bestimmt und entsprechend auch die Grenzfläche zwischen den beiden flüssigen Phasen, so daß eine vollständige Entfernung der oberen Phase aus dem ersten Behälter A sichergestellt wird. Auf dem gleichen Prinzip beruhend können auch zwei oder mehrere Ringe für unterschiedliche Positionen der Grenzflächenlagen vorgesehen sein. Ein derartiger, mit dem Bezugszeichen D versehener Ring ist z. B. in den Fig. 1, 2 und 4 dargestellt.

Ein weiterer Vorteil der zur Verfahrensdurchführung verwendbaren erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt darin begründet, daß sie in einer Reihe von Apparaturen eingesetzt werden kann, die sich hervorragend zur Automatisierung eignen, ohne daß sich komplizierte Hilfseinrichtungen als notwendig erweisen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann aus einem beliebigen inerten Material bestehen, z. B. aus Glas, Polyäthylen oder einem anderen geeigneten Kunststoffmaterial und selbst Metall kann für spezielle Zwecke ins Auge gefaßt werden.

Die erfindungsgemäße Trennung zweier flüssigen Phasen wird im folgenden durch Beispiele aus der Immunoassay-Technik erläutert, bei der eine klare Trennung absolut erforderlich ist.

Der Einfachheit halber werden im folgenden mit "Separator" die erfindungsgemäße Vorrichtung, mit "Behälter A" der erste Behälter A und mit "Einheit B" die Mischer-Separator-Einheit B bezeichnet.

Beispiel 1 Extraktionseffizienzstudien unter Verwendung eines Radioisotop-Tracers

Um festzustellen, wie geeignet ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch für die Extraktion einer Verbindung aus einer wäßrigen Lösung ist, wurde das folgende Verfahren entwickelt, das sehr rasche und genaue Ergebnisse liefert. 12 Behälter A wurden mit 1 bis 12 durchnumeriert. In jedem Behälter A wurden 500 µl EDTA-Phosphatpufferlösung eingebracht und anschließend 200 µl einer Lösung, die ein Digoxinderivat enthielt, das mit dem Radioisotop Jod-125 markiert war (diese Lösung wurde hergestellt durch Neuansatz eines handelsüblichen Digoxin-J 125-Derivats (Ames) mit 12 ml des EDTA-Phosphatpuffers, pH 7,4, der 1,2 g Dinatriumphosphat und 0,6 g Dinatrium-EDTA in 100 ml deionisiertem Wasser enthielt). Die Radioaktivität der Behälter A 1 bis 12 wurde gemessen in einem Gammazähler, wobei diese Zählung zweimal durchgeführt wurde, und zwar jedesmal 30 s lang. Zu jedem Behälter A wurden sodann 1,4 ml der folgenden Lösungsmittel zugesetzt:

a) Rohre 1 und 2: tert-Amylalkohol,
b) Rohre 3 und 4: ein Gemisch aus tert-Amylalkohol/Methylisobutylketon (MIBK) in einem Volumenverhältnis von 9 : 1
c) Rohre 5 und 6: tert-Amylalkohol/MIBK im Volumenverhältnis 3 : 1
d) Rohre 7 und 8: tert-Amylalkohol/MIBK im Volumenverhältnis von 1 : 1
e) Rohre 9 und 10: MIBK und
f) Rohre 11 und 12: tert-Butylmethyläther

Alle angegebenen Lösungsmittel und Lösungsmittelgemische wurden zuvor mit dem gleichen EDTA-Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt.

Nach Zugabe der Lösungsmittel wurde eine Einheit B des Separators wie ein Stöpsel in den Oberteil jedes Behälters A 1 bis 12 eingesetzt und jeder dieser zusammengesetzen Separatoren wurde 30 s lang in einer Vortex-Apparatur behandelt, was durch Verwendung eines geeigneten Trogs gleichzeitig erfolgen konnte. Nach dem Vermischen mit der Vortex-Apparatur wurden die Separatoren 10 min lang stehen gelassen, worauf sich eine obere und eine untere flüssige Phase gebildet hatte. Sodann wurde die Einheit B jedes Separators 1 bis 12 vorsichtig in den Behälter A so weit wie es ging gedrückt (die zur Durchführung dieser Versuche verwendeten Separatoren waren so konstruiert, daß beim maximalen Niederdrücken der Einheit B 0,5 ml der unteren flüssigen Phase im Behälter A verblieben, 0,2 ml im Kanal C waren und die gesamte obere Phase (1,4 ml) sich im Sammelbehälter E befand). Jeder der Separatoren 1 bis 12 wurde sodann in den Hohlraum des Gammazählers eingesetzt und die Radioaktivität der unteren Phase, welche im Behälter A verblieb wurde wie zuvor gezählt, d. h. zweimal für jeden Behälter und jeweils 30 s lang.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt und sie zeigen, daß die Genauigkeit der Messungen hochgradig befriedigt. Versuche, die zur Bestimmung der Meßgenauigkeit durchgeführt wurden, zeigten, daß aufgrund der instrumentellen Schwankungen in der Hohlraumgeometrie des Gammazählers Abweichungen von bis zu 1% in der Genauigkeit der Bestimmung der Extraktionseffizienz eintreten können.

Tabelle 1

Extraktionseffizienz

Beispiel 2 Extraktionseffizienzstudien unter Verwendung von Fluoreszenz-Tracers

Dieser ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführte Versuch zeigte, daß die obere Phase, welche im Sammelbehälter E des Separators abgetrennt ist, für die Messungen verwendbar ist. Die Ergebnisse beziehen sich auf die Bestimmung der Extraktionseffizienz von Lösungsmitteln unter Verwendung von Fluoreszenz-Tracern, doch ist diese Arbeitsweise auch für andere Bestimmungen geeignet, z. B. für Nichtisotopen-Immunoassay-Techniken unter Verwendung von fluoreszierenden Markierungsmitteln oder anderen Nichtisostopen-Markierungsmitteln sowie Radioisotop-Markierungsmitteln, wenn die freie, nicht gebundene Fraktion bestimmt werden soll.

Es wurden zwei Standard-Stammlösungen von 5 × 10^-4 M Rhodamin B hergestellt, die eine in doppelt destilliertem Wasser und die andere in tert-Amylalkohol. Diese Lösungen wurden zur Verdünnung unter Erzielung von Arbeitslösungen der gewünschten Konzentrationen von 5 × 10^-5M, 4,5 × 10^-5 M, 4,0 × 10^-5 M, 2,5 × 10^-5 M, 2,25 × 10^-5 M, 2,0 × 10^-5 M, 1,0 × 10^-5 M und 0,5 × 10^-5 M verwendet. Kalibrierkurven wurden mit Hilfe dieser Lösungen erhalten unter Verwendung eines handelsüblichen Fluoreszenz-Spektrophotometers (Perkin-Elmer Modell MPF-44B) mit einer Anregungswellenlänge von 430 nm und einer Emissionswellenlänge von 615 nm.

16 Behälter A des Separators wurden mit 1 bis 16 durchnumeriert. In die Behälter 1 und 2 wurden zum Vergleich 0,7 ml Wasser eingebracht. Dann wurden in die Rohre3 bis 16 0,7 ml der angegebenen Arbeitslösungen von Rhodamin B in Wasser eingebracht und jede der oben angegebenen sieben Konzentrationen als Doppelbestimmung. Danach erfolgte die Zugabe von 1,4 ml tert-Amylalkohol (vorgesättigt mit Wasser) zu jedem Behälter A 1 bis 16.

Eine Einheit B des Separators wurde wie ein Stopfen im Oberteil jedes Behälters A eingesetzt, worauf alle 16 Anordnungen der Separatoren 20 s lang mit einem Vortex-Mischer behandelt wurden. Nach 10 min langem Stehen wurde die Einheit B jeder Anordnung 1 bis 16 vorsichtig in den Behälter A geschoben, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die obere Phase, welche in den Sammelbehälter E jedes Separators floß, wurde in eine Spektrophotometerzelle geschüttet und das Fluoreszenzsignal wurde gemessen. Die Konzentration an Rhodamin B in jedem Röhrchen wurde aus der Eichkurve bestimmt durch Interpolation des wie angegebenen erhalten Fluoreszenzsignal und unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (2 : 1), der bei diesen Versuchen zur Anwendung gelangte. Die Ergebnisse zeigen, daß die Extraktion von Rhodamin B in das tert-Amylalkohol-Lösungsmittel in einem Ausmaß von 90-93% Effizient erfolgte.

In Abänderung der beschriebenen Versuche kann auch ein Separator eingesetzt werden, der in der Weise auszugestalten ist, daß der Sammelbehälter E der Einheit B einen separaten Bauteil darstellt (vgl. Fig. 5), der z. B. aus Quarz oder Pyrex oder einem anderen für Fluoreszenzmessungen geeigneten Material besteht und an der Einheit B vor der Phasentrennung befestigt wird. Sobald sich nach der Phasentrennung die obere Phase in dem Sammelbehälter E befindet, kann der gesamte Separator in einen modifizierten Zellhalter des Fluoreszenz-Spektrophotometers eingesetzt werden. Auf diese Weise braucht auch die obere Phase nicht in eine eigene Meßzelle geschüttet zu werden und die gesamte Operation kann leicht automatisiert werden. Wie zu Beginn dieses Beispiels bereits erwähnt, kann die gleiche Arbeitsweise auch dann angewandt werden, wenn z. B. ein Tritium-markiertes Material als Tracer verwendet wird. Nachdem sich nach der Phasentrennung die obere Phase, in welche der Tritium-markierte Tracer extrahiert wurde, im Sammelbehälter E befindet, kann diese Phase in die Szintillationsflüssigkeit geschüttet und in einem Szintillationszähler auf Radioaktivität getestet werden.

Beispiel 3 Digoxin - Radioimmunoassay

Um das vorteilhafte Verhalten, die Zuverlässigkeit, Einfachheit und andere Vorteile der Verwendung des erfindungsgemäßen Separators in Immunoassay-Techniken zu zeigen, wurden zwei Parallelversuche wie folgt ausgeführt:

1. Ein handelsüblicher Kit oder Fertigpack für Digoxin-Radioimmunoassay (Handelsname RIALYZE von Ames) wurde verwendet, bei dem Chromatographieröhrchen als Trennsystem zur Trennung der freien und gebundenen Fraktionen diente;
2. die gleichen Fertigpack-Reagentien wurde verwendet, wobei jedoch die Bestimmung mit Hilfe des Separators erfolgte.

Alle Fertigpack-Komponenten wurden nach den Gebrauchsanweisungen frisch hergestellt. Doppel-Fertigpack-Proberöhrchen wurden markiert für die Gesamtzählung, nämlich Standardproben A, B, C, D und E. Ferner wurden Doppel-Proberöhrchen I, II und III markiert für jedes DADE-Kontrollserum (Handelsbezeichnung TRI-YAC, Trilevel Radioimmunoassay Kontrollen, Level I, Level II und Level III).

Für die Parallelversuche mit dem Separator wurden jeweils für Doppelbestimmungen Behälter A des Separators markiert für die Gesamtzählungen, Null-Standard und Standard-Proben A, B, C, D und E. Ferner wurden für Dreifachbestimmungen Behälter A des Separators für jedes DADE-Kontrollserum I, II und III markiert.

Jeweils 100 µl des frisch bereiteten J 125-Digoxin-Reagens wurde zu jedem Proberöhrchen zugegeben. Pufferlösung (50 µl) wurde zu den Proberöhrchen für Gesamtzählungen und Null-Standard zugesetzt. Zu den entsprechend markierten Standardröhrchen wurden 50 µl jedes Standards und 50 µl jedes Kontrollserums zu den mit I, II und III bezeichneten Röhrchen zugegeben.

Ein Volumen von 100 µl frisch bereitetem Antiserum wurde zu allen Röhrchen zugesetzt außer zu dem Gesamtzählungsröchen, welche mit 100 µl der für die Bestimmung verwendeten Pufferlösung versetzt wurden. Alle Röhrchen wurden 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde jeder Versuchsansatz unterschiedlich weiterverarbeitet, nämlich:

1. Auf jedes Teströhrchen des handelsüblichen Fertigpacks wurde ein Chromatographierohr aufgesetzt und nach 10 min langem Stehenlassen wurden 0,8 ml Pufferlösung auf jedes Teströhrchen aufgebracht, worauf weitere 10 min lang stehengelassen wurde. Die Röhrchen wurden sodann in einem Gammazählrohrinstrument auf Radioaktivität getestet.
2. Zu jedem Behälter A des Fertigpacks wurden 350 µl Pufferlösung (zur Volumeneinstellung) und anschließend 1,4 ml des Extraktionslösungsmittelgemisch (tert-Amylalkohol/MIBK im Verhältnis 3 : 1), das zuvor mit dem zur Bestimmung verwendeten Puffer gesättigt worden war, zugegeben. Eine Einheit B des Separators wurde wie ein Stopfen auf den Kopfteil jedes der Behälter A aufgesetzt und alle Separatoranordnungen wurden 30 s lang mit einem Vortex-Mischer behandelt.

Die Testanordnung wurden zur Trennung der Flüssigphasen 10 min lang stehen gelassen und die Einheit B jedes Separators wurde vorsichtig so weit es ging in den Behälter A eingedrückt. Die Separatoren wurden in den Schacht des Gammazählrohrs eingesetzt zur Messung der Radioaktivität der wäßrigen Phase, welche am Boden des Behälters A verblieben war. Die Ergebnisse der Radioaktivitätszählung wurden berechnet als frei/gesamt für den handelsüblichen Fertigpack (wie in den Gebrauchsanweisungen beschrieben) und als gebunden/gebunden-null für den Separator.

Die Mittelwerte aller Ergebnisse und eine Zusammenfassung der gefundenen Werte für die Kontrollsera im Vergleich zu anderen handelsüblichen Fertigpacks sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 zusammengefaßt. Wie die für die Kontrollseren bestimmten Werte der Digoxin-Konzentration zeigen, erweist sich das erfindungsgemäße Separatorsystem als voll befriedigend für den Digoxin-Radioimmunoassay.

Tabelle 2

Jod 125-Digoxin-Radioimmunoassay mit gekanntem Kit bzw. Separator

Tabelle 3

Bezugskontrollwerte (ng/ml) berechnet aus Ergebnissen in Tabelle 2 und Vergleich mit bekannten DADE-Werten

Claims

1. Vorrichtung zur Durchführung von Stoffaustausch- und Trennprozessen zwischen zwei im wesentlichen miteinander nicht mischbaren flüssigen Phasen, die einen ersten Behälter zur Aufnahme der beiden flüssigen Phasen mit einem darin verschiebbaren Kolben aufweist, wobei der Kolben mit mindestens einem längs seiner Vertikalachse sich erstreckenden Kanal versehen ist, der in einem Sammelbehälter endet, dadurch gekennzeichnet, daß der Sammelbehälter (E) mit Kanal (C) eine in seinem unteren Teil in den ersten Behälter (A) eng eingepaßte und darin verschiebbare feste Mischer-Separator-Einheit (B) bildet, wobei der Sammelbehälter (E) über einen Verschleiß (S) absperrbar ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischer-Separator-Einheit (B) am unteren Endbereich mit einem Abdichtelement versehen ist, das mindestens eine durch dessen Dicke reichende zentrale Öffnungbohrung aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdichtelement aus einem Kautschuk-O-Ring besteht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nur der untere Abschnitt der Mischer-Separator-Einheit (B) in den ersten Behälter (A) eng eingepaßt ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Kanal (C) nur längs des unteren Abschnitts der Vertikalachse der Mischer-Separator-Einheit (B) erstreckt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Behälter (A) mindestens zwei in Längsrichtung verlaufende Vertiefungen in seinen Wänden aufweist, die mit der gleichen Zahl von an der Mischer-Separator-Einheit (B) vorgesehenen Vorsprüngen im Eingriff stehen.

7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Behälter (A) mit einer kalibrierten Skala zur Volumenmessung versehen ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem oberen Ende des ersten Behälters (A) und dem mit der Mischer-Separator-Einheit (B) gleitenden Sammelbehälter (E) ein Ring (D) zur Begrenzung des Eindruckniveaus der Mischer-Separator-Einheit (B) in den ersten Behälter (A) vorgesehen ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Sammelbehälter (E) ab einer bestimmten Höhe im oberen Ende der Mischer-Separator-Einheit (B) einen größeren Außendurchmesser aufweist als der erste Behälter (A).

10. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Einsatz für Immunoassay-Techniken, insbesondere in Form einer Verpackungseinheit.