DE3046979A1

DE3046979A1 - Verfahren und vorrichtung fuer massentransferoperationen auf immunoassay- und anderen anwendungsgebieten

Info

Publication number: DE3046979A1
Application number: DE19803046979
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Cais; Moshe Haifa Shimoni
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 1979-12-12
Filing date: 1980-12-12
Publication date: 1981-10-01
Also published as: ZA807508B; IL58943A0; IT8026541A0; FR2471204A1; IT1141126B; CA1158839A; IL58943A; FR2471204B1; DE3046979C2; NL189801C; GB2064357A; BE886517A; SE8008664L; NL189801B; NL8006730A; JPS6228681B2; JPS56161801A; GB2064357B; SE448403B; US4454231A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstand und sie ist auf die überführung einer oder mehrerer Komponenten aus einer flüssigen Phase in eine andere flüssige Phase, die miteinander praktisch unmischbar sind, gerichtet.

Massentransferphänomene werden überall in der Natur angetroffen und sie spielen auch auf allen wissenschaftlichen und technischen Gebieten eine wichtige Rolle. Mit "Massentransfer" wird die durch irgendein Potential oder eine "Antriebskraft" bewirkte Bewegung von Molekülen oder Fluidumselementen bezeichnet und dazu gehört z.B. die Molekulardiffusion, der durch Konvektion bewirkte Transport und einfaches Mischen. Ein Massentransfer findet überall dort statt, wo chemische Reaktionen erfolgen, sei es in einem Industriereaktor, einem biologischen System oder einem Forschungslaboratorium. Die reagierende Substanzen müssen zusammenkommen, wenn die Reaktion ablaufen soll. In vielen Fällen verlangsamt sich die Reaktion oder sie kommt zum Stillstand, wenn das oder die Reaktionsprodukte nicht entfernt werden. Die Massentransferrate kann die chemische Umwandlung vollständig bestimmen, wenn die Reaktionspartner aus einer Phase in eine andere überführt werden müssen, um die Reaktion ablaufen zu lassen. Bei reversiblen Reaktionen wird die Umwandlung verbessert, wenn das gewünschte Produkt kontinuierlich entfernt wird durch Massentransfer in eine zweite Phase, in welcher keine Reaktion stattfindet. Ferner können die relativen Massentransferraten der verschiedenen Reaktionspartner und Verfahrensprodukte die Selektivität stark beeinflussen, wenn konkurrierende Reaktionen ablaufen.

Prinzipiell kann davon ausgegangen werden, daß Massentransferoperationen und Trennungen zwischen einer stationären immobilisierten Phase und einer mobilen flüssigen Phase, z.B. in Ionenaustauscherverfahren, oder zwischen zwei flüssigen Phasen, z.B.

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in Flüssig-Flüssig-Extraktionsverfahren, auftreten. Dem Fachmann ist bekannt, daß die Trennung zwischen diesen Phasen eine der wichtigsten und kritischsten Verfahrensstufen in zahlreichen laboratoriumsmäßigen und industriellen Verfahren darstellt.

Flüssig-Flüssigphasenoperationen, in denen ein Massentransfer erfolgt, werden in der Regel in Gefäßen durchgeführt, deren Prinzip darauf beruht, daß nach einem innigen Vermischen oder Kontaktieren einer Phase mit der anderen die beiden Phasen trennen gelassen und voneinander entfernt werden. Die für diesen Zweck allgemein bekannte Laboreinrichtung 1st ein Scheidetrichter. Einer der Nachteile des Scheidetrichters ist in den zahlreichen manuellen Handgriffen zu sehen, die zur Trennung der beiden Phasen erforderlich sind. Für das Arbeiten in industriellem Maßstab sind zwei Haupttypen von Vorrichtungen bekannt, nämlichMisch-Absitzbehälter und Säulen. Beide Vorrichtungstypen versuchen einen großen Kontaktbereich zwischen den Phasen zu gewährleisten, da die Überführungsrate der verteilten Komponente zu diesem Bereich direkt proportional ist. Die Differenzierung zwischen den verschiedenen Vorrichtungstypen basiert auf der zur Kontaktierung der flüssigen Phasen verwendeten Methode. Das Vermischen der beiden Phasen durch Unterteilen und Dispergieren einer Phase führt zur Bildung neuer Oberflächen unter raschem Transfer des gelösten Stoffes über dem breiten Kontaktbereich. Die Leichtigkeit des Mischens hängt von der Grenzflächenspannung zwischen den beiden Phasen, den relativen Dichten der beiden Phasen und der Viskosität jeder Phase ab. Die Trennung der beiden Phasen, nachdem sie miteinander in Kontakt gebracht wurden, kann durch Schwerkraft oder Zentrifugalkraft bewirkt werden. Die Leichtigkeit der Trennung der beiden Phasen hängt hauptsächlich vom Unterschied in der Dichte der beiden Phasen und deren Viskositäten ab und kann merklich beeinflußt werden durch das Vorliegen von Verunreinigungen, welche Emulsionen stabilisieren können. Dies trifft z.B. für Misch-Absitzbehälter zu.

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Ein wahlweises Verfahren zur Erzielung eines großen Kontaktbereichs besteht darin, eine Phase nach der anderen fließen zu lassen ohne Versuche zum Vermischen der beiden Phasen zu unternehmen. Die zum Kontaktieren der beiden Phasen verwendete Vorrichtung wirkt auch als Separator und ein Vermischen der beiden Phasen ist unerwünscht. DiesesVerfahren beruht auf der erhöhten Länge des Fließweges zur Erzielung eines großen Kontaktbereichs und in der Regel erfordert es einen geringeren Energieverbrauch als beim Vermischen der beiden Phasen, wie dies im oben genannten Vorrichtungstyp der Fall ist. Ein derartiger erweiterter Kontaktbereich zwischen Phasen ist erzielbar durch Fließenlassen der beiden flüssigen Phasen im Gegenstrom oder im Gleichstrom in horizontalen Röhren oder Leitungen, wobei die weniger dichte Phase im oberen Abschnitt der Röhre fließt, oder in vertikalen Röhren oder Leitungen, wobei die dichtere Phase an der Röhrenwand nach unten fließt, während die weniger dichte Phase durch den Mittelabschnitt der Röhre nach oben fließt. Sowohl beim horizontalen als auch beim vertikalen Vorrichtungstyp wird der erweiterte Kontaktbereich dadurch erzielt, daß die Vorrichtung in ausreichender Länge ausgestaltet ist. Dies trifft für Säulen zu. Beide Typen von Flüssig-Flüssigextraktionsvorrichtungen sind jedoch mit zahlreichen Nachteilen behaftet. Im Falle des Misch-Absitzbehälters macht z.B. beim Rühren, wodurch eine der Flüssigkeiten in der anderen dispergiert wird, die intensive Rührbewegung oder der turbulente Fluß die nachfolgende Trennung der flüssigen Phasen im Absitztank in der Regel schwierig aufgrund der geringen Größe und der großen Stabilität der Tröpfchen der dispersen Phase. Als Folge davon ist die Trennung sehr langsam und erfordert große Gefäße. Im Falle von Säulen ist die Kapazität der Vorrichtung durch die Tatsache begrenzt, daß die Fließrate der beiden Phasen langsam genug sein muß, um ein Vermischen der Phasen zu vermeiden, da sowohl das Kontaktieren als auch das Trennen der Phasen im gleichen Teil der Vorrichtung erfolgt. Eine generelle Schlußfolgerung, die aus dem Prinzip der Massentransferoperation gezogen werden kann, ist die Wichtigkeit des gründlichen Ver-

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mischens der Phasen, um eine wirksame überführung einer oder mehrerer Komponenten aus einer Phase in die andere zu erzielen.

Aus der US-PS 2 524 362 ist eine Ampulleninjektionsspritze bekannt, aus einem zylindrischen Bauteil mit einem in diesem bewegbaren Hohlkolben, der an der Innenwand der Ampulle gleitend eingreift. Wird der Kolben in den zylindrischen Bauteil gedrückt, so fließt Flüssigkeit durch die axiale Durchflußöffnung im Kolben und wird durch eine Nadel am Ende der Ampulle ausgestoßen.

Basierend auf dem gleichen Prinzip ist aus der US-PS 3 512 948 eine Reagenzglasfiltervorrichtung bekannt, bei der der oben genannte Kolben durch einen Hohlkolben ersetzt ist, der einen als Filter dienenden porösen Bodenteil aufweist. Eine spezielle Verwendung dieser auf dem angegebenen Prinzip beruhenden Vorrichtung zur Trennung von Blutfraktionen wurde später in einigen US- und DE-Patentschriften beschrieben, z.B. in den DE-Patentschriften 2 415 618 und 2 454 918 und den diesen entsprechenden US-Patentschrift 4 021 352 und GB-PS 1 508 844. Gemäß diesen Druckschriften wird das koagulierte Blut, das durch Ausfällung oder Zentrifugation in eine Fraktion höherer Dichte aus roten Blutkörperchen und eine Fraktion geringerer Dichte aus Blutplasma getrennt wurde, in ein zylindrisches Gefäß eingebracht und ein Hohlkolben, der an seinem unteren Ende eine Scheibe aus z.B. gesintertem Glas aufweist, wird nach unten in das zylindrische Gefäß gedrückt, bis er sich oberhalb der Grenzflächen zwischen den beiden Fraktionen befindet, ohne daß er diese Grenzfläche erreicht. Um die Blutfraktion geringerer Dichte (Blutplasma) sammeln zu können, welche durch die obere öffnung des Kolbens austritt, ist oberhalb des zylindrischen Gefäßes ein Sammelbehälter vorgesehen. Beim Gebrauch dieser Vorrichtung muß jedoch besonders sorgfältig darauf geachtet werden, daß ein Vermischen der beiden Phasen während der Abwärtsbewegung des Kolbens vermieden wird, so daß nur eine teilweise Entfernung des Plasmas erzielbar ist.

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Erfindungsgemäß gelingen demgegenüber Massentransferoperationen und physikalische Trennung bei zwei flüssigen Phasen im gleichen Teil der Vorrichtung. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich auch durch eine extreme Vielseitigkeit aus und ist sowohl im Laboratoriums- als auch in industriellem Maßstab anwendbar entweder im kleinen mit Mikroliter-Volumina oder im großen mit Hunderten oder sogar Tausenden von Litern. Als weiterer Vorteil kommt hinzu, daß die Massentransferoperation und die physikalische Trennung zweier Phasen im gleichen Teil der Vorrichtung in quantitativer Weise erzielt wird.

Der Mischbehälter (A) der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann jede beliebige geeignete geometrische Form aufweisen. Entsprechend der Ausgestaltung des Mischbehälters (A) besitzt der Mischer-Separator (B) eine entsprechende Ausgestaltung.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vielseitig verwendbar in den verschiedensten Verfahren, die mit Massentransferoperationen zu tun haben. Seine Anwendbarkeit wird im folgenden für Lösungsmittelextraktion und Immunoassay-Technik unter besonderer Betonung der letzteren erläutert, obwohl natürlich die Anwendungsmöglichkeiten damit keineswegs erschöpft sind.

In der US-Patentanmeldung 124 691 wird die Verwendung der Flüssig-Flüssigextraktionstechnik für spezifische Bindungsassays beschrieben. Dabei zeigt es sich, daß die Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels und unter speziellen Bedingungen eine generelle Methode zur Trennung der gebundenen und freien Liganden in Immunoassay-Techniken geschaffen wird ohne die Bindefähigkeit des Bindeproteins oder das Bindeprotein-Ligandgleichgewicht nachteilig zu beeinflussen. Dabei wird ferner betont, daß dieses Verfahren besonders geeignet für Radioimmunoassay-Techniken in solchen Fällen ist, wo keine physikalische Trennung erfolgen soll und das Zählen des γ-Radioisotops in der entsprechenden gebundenen oder freien Phase erfolgt.

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In den nicht-homogenen Iiranunoassay-Techniken ist es jedoch in der Regel erforderlich, eine Trennung des freien markierten Antigens von demjenigen, das an den spezifischen Antikörper gebunden ist, durchzuführen. Ein hierfür ideales Verfahren sollte nicht nur eine klare Trennung dieser Komponenten bewirken, sondern auch unbeeinflußt von den im Reaktionsgemisch vorliegenden biologischen Flüssigkeiten und anderen nicht-spezifischen Substanzen sein. Der Stand der Technik lehrt die folgenden Kategorien von Trennmethoden für gebundene und freie Fraktionen:

1. Elektrophoretische und chromatoelektrophoretische Methoden

2. Gelfiltration

3. nicht-spezifische Ausfällung von Hormon-Protein-Komplexen

4. Immunopräzipitation von löslichen Hormon-Protein-Komplexen

5. Festphasenabsorption von Hormonen und

6. Festphasenabsorption von Antikörpern.

Alle diese bekannten Methoden sind jedoch mit sehr schwerwiegenden Nachteilen behaftet. So erfordert z.B. die Chromatoelektrophorese speziellenRaum- und technischen Zeitaufwand. Klare Trennungen und beste Ergebnisse werden dann erzielt, wenn diese Trennungen in kalten Räumen oder großen Kühlanlagen durchgeführt werden, die nicht ohne weiteres verfügbar sind. Die bei dieser Methode erforderlichen Streifenzähler unterliegen mechanischem Fehlverhalten und die meisten liefern mit Jod-125 schlechte Ergebnisse. Da die meisten Papiere eine begrenzte Kapazität haben, die in der Regel unter 200 μΐ liegt, werden für eine genaue Zählung hohe spezifische Aktivitäten des markiorten Hormons benötigt.

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Die Gelfiltration ist unpraktisch, da die Vorbereitung der einzelnen Säulen viel Zeit und Raum benötigt. Außerdem erfordert das Sammeln der Eluate aus den Kolonnen eine sorgfältige technische überwachung.

Bei der nicht-spezifischen Ausfällung von Hormon-Protein-Komplexen können beträchtliche Mengen an freiem Antigen
in dem Niederschlag eingeschlossen werden und geringfügige Änderungen in den Verfahrensbedingungen führen zu einer
Änderung des Trennungsgrads. Der technische Zeitaufwand, der selbst für verbesserte Modifikationen dieses Verfahrens erforderlich ist, scheint größer zu sein als für einige der
anderen in Betracht gezogenen Methoden und die veröffentlichten Ergebnisse erscheinen nicht ausreichend verbessert, um den Einsatz dieses Verfahrens zu rechtfertigen.

Die Immunopräζipitation von Antigen-Antikörper-Komplexen
hat zahlreiche Nachteile, z.B. insofern als

(1) Erfahrung und Sorgfalt erforderlich sind beim Ansaugen oder Dekantieren der überstehenden Lösung, wobei gelegentlich ein Niederschlag in einem Fibringewebe am Meniscus eingeschlossen und versentlich verworfen werden kann;

und

(2) Humanserum die zweite Antikörperreaktion in vielfältiger Weise störend beeinflussen kann, wobei einige zweite
Antikörper mit menschlichem γ-Globulin bis zu einem solchen Grade eine Kreuzreaktion eingehen können, daß der Niederschlag des ersten Antikörpers beeinträchtigt wird, und wobei ferner schwerwiegende Änderungen im Grad der Immunopräzipitation zwischen Serum und heparinisiertem Plasma erfolgen können.

Auf der Festphasenabsorption von freiem Antigen basierende Methoden, bei denen z.B. Aktivkohle, Harz, Siliciumdioxid,

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Magnesiumsilicatgel (Florisil) und dgl. zum Einsatz gelangen, haben den Nachteil/ daß der gebundene Antigen-Antikörperkomplex auch an das feste Absorbens gebunden werden kann. Eine in jüngster Zeit bekanntgewordene elegante Methode der Festphasenabsorption von Antikörpern besteht in der Absorption von Antikörpern an Kunststoffröhrchen. Demzufolge wird eine größere Zahl von beschichteten Röhrchen im voraus hergestellt. Die Herstellung und Lagerung einer großen Menge derartiger Röhrchen bedeutet jedoch einen ernsthaften Nachteil zusätzlich zu der Tatsache, daß diese Röhrchen gegen Veränderungen im Serumproteingehalt empfindlich sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist demgegenüber sehr einfach durchzuführen und ergibt sehr genaue Ergebnisse. Als weiterer Vorteil kommt hinzu, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung aufgrund ihres geringen Preises zum einmaligen Gebrauch bestimmt sein kann.

Zur Erläuterung der Erfindung sei z.B. angenommen, daß eine wässrige Lösung vorliegt, die einen gelösten Stoff enthält, der in irgendeinem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, löslich ist. Diese wässrige Lösung wird in den Mischbehälter A in solcher Weise eingebracht, daß sie etwa ein Viertel des Volumens des Mischbehälters A einnimmt. Ein geeignetes organisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, wird sodann in den Mischbehälter A eingeführt. Die Menge an zugesetztem organischem Lösungsmittel kann je nach Volumkapazität des Mischbehälters variieren. Das spezifische Gewicht des Lösungsmittels kann größer oder kleiner sein als dasjenige der wässrigen Lösung.

Die beiden Phasen werden sodann sorgfältig gemischt durch Bewegen des Mischer-Separators B in den Mischbehälter A oder aus diesem heraus. Gewünschtenfalls kann dieses Vermischen auch mit Hilfe eines Vibrationsmischers oder Magnetrührers oder irgendeiner anderen geeigneten Mischvorrichtung während

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einer kurzen Zeitspanne erfolgen. Nach dem Vermischen wird das System während einer angemessenen Zeitspanne stehen gelassen, wobei die zwei nicht-mischbaren Phasen (obere Phase und untere Phase) erhalten werden. Der Mischer-Separator B wird nach unten gedrückt, wobei die obere flüssige Phase durch den Kanal C in den Sammelbehälter E eintritt. Der Mischer-Separator D wird so weit eingedrückt, bis er die Grenzfläche erreicht, so daß die obere Phase, welche den zuvor in der wässrigen Phase vorliegenden gelösten Stoff enthält, vollständig entfernt wird.

Die auf diese Weise abgetrennte obere Phase kann sodann in ein geeignetes Meßgefäß überführt werden, um die Menge an gelöstem Stoff aus der unteren Phase, welche in die obere Phase überführt wurde, zu bestimmen. Die gleiche Meßoperation kann mit der unteren Phase (welche im Mischbehälter A zurückbleibt) durchgeführt werden.

Handelt es sich bei dem ursprünglich in der wässrigen Phase vorliegenden gelösten Stoff um ein Gammastrahlung-emittierendes Radioisotop, so wird die Operation wie angegeben ausgeführt und das ganze System in den Schacht eines Gammazählerinstruments in solcher Weise eingesetzt, daß nur die Strahlung, welche von der im Mischbehälter A verbleibenden Phase emittiert wird, gezählt wird. Da die Gesamtstrahlungsmenge schon vorher bekannt ist, ergibt der Zählwert, welcher in der unteren Phase des Mischbehälters A verbleibt, den Verteilungsgrad des im gelösten Stoff vorliegenden Gamma-emittierenden Radioisotops zwischen den beiden Phasen.

Dieses Analyseverfahren erweist sich als besonders vorteilhaft zur Entwicklung von Immunoassay-Techniken, die winzige Konzentrationen chemischer Substanzen in biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen gestatten. Als Beispiele für chemische Substanzen, die sich für eine derartige Analysen-

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methode anbieten, können genannt werden:

Alkaloide, wie Morphin, Codein, Dihydrocodein, Heroin, Oxymorphon, Metopon und Pholcodin

Barbiturate, wie Veronal, Luminal, Seconal, Phenobarbital und Barbital

Steroide und östrogene, wie ß-östradiol, östron, östriol, 17a-Ä'thyinyl-östradiol und dgl., Androgene, Progestogene und adrenocorticoide Hormone

Cannabinoide und deren Metabolite.

Vitamine, wie Carotin, Riboflavin, Thiamin, Niacin, Ascorbinsäure, Tocopherol und Phytyl-1,4-naphtochinon

Aminosäuren und Polypeptide

Zucker einschließliehe Saccharide und Polysaccharide

Tranquilizer, wie Meprobamat, Valium, Oxazepam und Phenothiazine

Zusätzlich zu den obigen Haptenen können verschiedene andere Verbindungen, z.B. Cocain, Prostaglandin, Antibiotica wie Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin und Nucleinsäure und Nucleotide, Insecticide, Fungicide, Bacteriocide und Nematocide wie Malathion, Carbamate und dgl., mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls bestimmt werden. In der Regel bieten sich Antigene, Haptene und deren Antikörper, Hormone, Vitamine, Arzneimittel, Metabolite und deren Receptoren und Bindematerialien für die erfindungsgemäße Bestimmung an.

Von den erfindungsgemäß bestimmbaren speziellen Verbindungen seien z.B. genannt:

kompensiertes T.: T .,-Auf nähme

Cortisol; Insulin;

Digoxin; Trijodthyronin;

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Folat; Thyroxin(Gesamt-T₄);

h G H; T S H;

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner besonders geeignet in den Fällen, wo das Markierungsmittel ein fluoreszierendes Markierungsraaterial ist, wobei die Messung mit einem geeigneten Spektrometer durchgeführt wird. Handelt es sich beim verwendeten Markierungsmittel um ein Gammastrahlungemittierendes Radioisotop wie Jod-125 und besteht die obere Phase aus einem organischen Lösungsmittel, so enthält die wässrige Phase, welche im Mischbehälter A nach der Trennung durch den Mischer-Separator B vorliegt, den Antikörper-Antigen-Komplex und die gesamte Vorrichtung kann in den Schacht des Gammazählers in solcher Weise eingesetzt werden, daß nur die untere Phase vom Instrument gezählt wird. Das gleiche gilt auch dann, wenn die untere Phase aus einem organischen Lösungsmittel besteht und beim Einsetzen der gesamten Vorrichtung in den Schacht des Gammazählers wird der in das organische Lösungsmittel überführte freie ungebundene Ligand gezählt.

Das Verfahren ist für jede Immunoassay-Technik anwendbar, z.B. für Radioimmunoassay-, freie Radikalassay-, Fluoreszenzimmunoassay-, Enzymimmunoassay- oder Metallimmunoassay-Techniken (wie sie z.B. in der US-PS 4 205 952 beschrieben werden). Ganz besonders geeignet ist die erfindungsgemäße Vorrichtung für die verschiedenen auf dem Markt befindlichen Kits und Verpackungseinheiten zur Durchführung dieser Techniken.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäße Vorrichtung ist die Trennung von freiem Antigen von gebundenem Antigen-Antikörper-Komplex im Falle von Proteinen, Zellen und anderen hochmolekularen Verbindungen, wenn zwei wasserlösliche, jedoch miteinander unverträgliche Polymere zur Induzierung des Entmischens dienen. Dies erzeugt zwei wässrige Phasen, zwischen denen verschiedene Spezien verteilt sein

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können. Bezüglich dieses Phänomens vgl. z.B. P.A.Albertson et al., Nature 184, 1465, 1959 und G. Johnson et al. Hur. J. Biochem. 3J3, 379, 1973). Miteinander unverträgliche Paare von Polymeren gibt es viele (vgl. z.B. A. Dobry et al. J. Polym. Sei. 2y 90, 1947). Erfindungsgemäß können sodann die beiden entmischten wässrigen Phasen in der angegebenen Weise getrennt werden.

Verfahren und Vorrichtung nach der Erfindung erweisen sich ferner hochgradig geeignet in der Atomabsorptionsspektrometrie zur Analyse von Spurenmetallen. Dabei ist es oftmals notwendig, eine Extraktion durchzuführen, bei der das organische Lösungsmittel ein chelatbildendes Mittel enthält zur Extraktion des Metallions aus dem wässrigen Medium. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung stellt eine sehr einfache und wirksame Extraktionsmethode dar und nach der Abtrennung der organischen Phase im Sammelbehälter E der Vorrichtung ist es möglich, diese organische Phase direkt für die Atomabsorptionsmessungen zu verwenden. Diese Vorrichtung kann auch leicht in automatische Systeme zum Einspritzen von Proben in Atomabsorptionsspektrometer eingebaut werden.

Verfahren und Vorrichtung nach der Erfindung zeichnen sich somit durch technische Einfachheit, Geschwindigkeit und Billigkeit aus und bieten eine ideale Methode in der Flüssig-Flüssigextraktion im allgemeinen und in der Immunoassay-Technik im besonderen. Das seit langem bestehende Bedürfnis nach einer derartigen Vorrichtung und einem derartigen Verfahren wird auch durch das bekannte Fachbuch W.D. Odell und W.H. Daughaday "Principles of competitive protein-binding assays", Verlag J.P. Lippincott Co. Philadelphia und Toronto 1971, bestätigt, wo es in Kapitel XI auf Seite 303 heißt, daß die Tatsache, daß so viele verschiedene Trenntechniken vorgeschlagen wurden, für eine gewisse Unbefriedigung mit den bestehenden Methoden spricht. Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das er-

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findungsgemäße Verfahren kommen den Erfordernissen für ideale Mittel und Wege auf diesem Spezialgebiet der Technik offensichtlich am nächsten.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnung mit den Figuren 1 bis 6 näher veranschaulicht.

In Fig. 1 wird eine vorteilhafte Ausführungsform der Vorrichtung schematisch dargestellt. Die Vorrichtung besteht aus den vier Hauptkomponenten, Mischbehälter A, Mischer-Separator B, Sammelbehälter E und Verschluß S. Der Verschluß S kann sich entweder in geschlossener oder offener Stellung befinden.

In Fig. 1a wird die Vorrichtung mit den beiden flüssigen Phasen, nämlich der oberen Phase U und der unteren Phase L, gezeigt, wie sie vor der Massentransferoperation vorliegen.

In Fig. 1b ist dargestellt, wie der Mischer-Separator B vollständig in den Mischbehälter A eingedrückt ist, wobei die beiden Phasen innig miteinander vermischt werden. Während der Ab- und Aufbewegungen des Mischer-Separators B ist der Stopper S geschlossen. Dies führt zur Bildung eines Vakuums im Mischbehälter A und zu einem erhöhten Druck im Sammelbehälter E. Die Kombination dieser beiden Effekte bewirkt ein besonders wirksames Mischen und eine entsprechend hochwirksame Massentransferoperation. Nach beendetem Mischen wird der Mischer-Separator B in der oberen Stellung (wie in Fig. 1a gezeigt) belassen, der Verschluß S geöffnet zur Aufhebung des Luftdruckes und die vermischten Flüssigkeiten spontan in eine obere und untere Phase trennen gelassen.

Figur 1c zeigt die Vorrichtung bei eingedrücktem Mischer-Separator B in den Mischbehälter A nach Trennung der beiden flüssigen Phasen in eine obere Phase U und eine untere Phase L. Der Mischer-Separator B kann bis zu einem gewünschten Niveau

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herabgedrückt werden, so daß nur wenig oder überhaupt keine obere Phase im Kanal C verbleibt. Bei geöffnetem Verschluß S in der oberen Stellung kann die obere flüssige Phase U gewünschtenfalls in ein anderes Gefäß geschüttet werden. Keine der im Kanal C verbliebenen Phasen wird während dieser Entfernung der oberen Phase U mit ausgeschüttet aufgrund des Vakuums, das im Mischbehälter A erzeugt wurde.

Figur 2 zeigt eine weitere Ausgestaltung der in Figur 1 dargestellten Vorrichtung, bei der sich der Kanal C nicht längs der gesamten Länge des Mischer-Separators B erstreckt. Die Figuren 2a, 2b und 2c erläutern die Wirkungsweise der in Fig. 1 beschriebenen Vorrichtung. Die in diesen Figuren veranschaulichte Ausführungsform der Vorrichtung zeigt ferner einen unterschiedlichen Typ des Verschlusses S.

Figur 3 stellt eine andere vorteilhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung dar, wonach nur der untere Teil Bb des Mischer-Separators B in den Mischbehälter A eingepaßt ist. Außerdem ist der Mischbehälter A mit einer kalibrierten Skala G für Volummessungen versehen. Selbstverständlich kann eine derartige Kalibrierung auch bei den in den anderen Figuren gezeigten Ausführungsformen vorliegen. Der eng eingepaßte Teil Bb, bei dem es sich um einen integralen Teil des Mischer-Separators B handelt, kann auch in solcher Weise vorliegen, daß er durch eine Schraubverbindung oder ein anderes geeignetes Mittel austauschbar ist. Die Wirkungsweise der in den Fig. 3a und 3c dargestellten Vorrichtung entspricht derjenigen, wie sie in den Fig. 1a, 2a bzw. 1c und 2c gezeigt ist.

In Figur 4 wird eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Es handelt sich dabei um eine Konstruktion, die das glatte Gleiten des Mischer-Separators B in den Mischbehälter A noch -weiter erleichtern soll. Diese Ausführungsform erweist sich insbesondere in den Fällen als vorteilhaft, ·η cü-evw* cM& Vorr\ cihtung aus einem

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Material besteht, bei dem der Gleiteffekt nicht leicht erzielt wird. Wie aus Figur 4b ersichtlich,* weist der Mischbehälter Ac mindestens zwei sich in Längsrichtung erstreckende Führungsvertiefungen auf, die in den Wänden des Mischbehälters Ac vorgesehen sind. Figur 4c zeigt einen Querschnitt des Mischbehälters Ac, in dem vier derartige sich in Längsrichtung erstreckende Vertiefungen vorliegen. Der in Fig. 4a dargestellte Mischer-Separator Bc hat natürlich eine entsprechende Zahl von Erhebungen, wobei ein Querschnitt desselben in Figur 4d gezeigt ist. Die Zahl der Erhebungen am Mischer-Separator (vgl. Figur 4a) muß im Einklang stehen mit der Zahl der Längsvertiefungen oder -aussparungen im Mischbehälter Ac. Beim Eindrücken des Mischer-Separators Bc in den Mischbehälter Ac wird der gleiche enge Einpassungseffekt erzielt wie bei der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung.

Figur 5 zeigt eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, gemäß welcher wiederum die vier Hauptkomponenten vorliegen, nämlich Mischbehälter A, Mischer-Separator B, Sammelbehälter E und Verschluß S. Für den Mischer-Separator B sind zwei Modifikationen gezeigt. Gemäß einer dieser Modifikationen ist der Sammelbehälter E Teil des Mischer-Separators B und gemäß der zweiten Modifikation kann der Sammelbehälter E vom Mischer-Separator B abgenommen werden. Der Mischer-Separator B bzw. B' weist an seinem Bodenteil ein Abdichtungselement auf, das zum Gleiten längs der Innenwände des Mischbehälters A ausgestaltet ist. Das Abdichtungselement besitzt mindestens eine Öffnungsbohrung, die dessen Dickenabmessung durchdringt und mit dem Kanal C in Verbindung steht. Verschiedene Modifikationen sind in bezug auf Lage und Ausgestaltung des Abdichtungselements im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich. So kann z.B. das Abdichtungselement aus einem Kautschuk-O-Ring mit einer Öffnungsdurchbohrung bestehen, der längs der Innenwände des Mischbehälters A zu gleiten vermag. Durch Eindrücken des Mischer-Se-

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parators B wird die obere Flüssigkeitsschicht durch die Öffnungsbohrung und den Kanal C gesaugt -und speichert sich im Sammelbehälter E. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Kautschuk-O-Ring etwas oberhalb des Fußpunkts des Mischer-Separators B angeordnet, so daß der Kautschuk nicht in Kontakt mit der unteren flüssigen Phase aus dem Mischbehälter A gelangt. In diesem Falle bestehen in bezug auf den Kautschuktyp keine Beschränkungen. Der Verschluß S, der das Abschließen des Sammelbehälters E bzw. E' ermöglicht, weist einen inneren perforierten Deckel auf, der es ermöglicht, daß die eingeschlossenen Flüssigkeitstropfen in den Sammelbehälter E durch die Löcher dieses Deckels zurückkehren. Selbstverständlich können diese Löcher jede beliebige Gestalt und Größe aufweisen, ohne die Wirkungsweise der Vorrichtung zu beeinträchtigen. Die Wirkungsweise und Handhabung dieser Vorrichtung ist ähnlich derjenigen, wie sie in Fig. 1 beschrieben ist.

Wie bereits erwähnt, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung erfolgreich auf dem allgemeinen Gebiet der Flüssig-Flüssigextraktion anwendbar, und zwar sowohl in kleinem als auch großem Maßstab. In kleinem Maßstab kann sie in der Grundlagenforschung zur Lösungsmittelauswahl verwendet werden oder zur Bestimmung der Grenzbedingungen der Verteilungskoeffizienten eines bestimmten Lösungsmittels. In großem Maßstab konkurriert sie sehr vorteilhaft mit den Standard-Misch-Absitzapparaturen oder den bekannten Typen von Säulen aufgrund der Effizienz des mit ihr erzielbaren Massentransfers.

Als einer der Hauptvorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die vollständige Abwesenheit von hydraulischen Verbindungsstücken und die Trennung der Mischoperation von der Ansaugfunktion gelten, so daß jede dieser Operationen unabhängig von der anderen nach jeweils den eigenen Erfordernissen erfolgen kann unter Ausschaltung der Gefahr eines Rückvermischens.

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Mit anderen Worten, die erfindungsgemäße Vorrichtung ergibt die hohe Effizienz des Massentransfers, die in der Regel bei Verwendung eines Mischers erzielt wird, ist aber gleichzeitig frei von den Nachteilen, die bei Verwendung einer Mischvorrichtung auftreten. Die Ausgestaltung der einzelnen Elemente der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann je nach speziellem Verwendungszweck variiert werden. Auch das Volumen des Mischbehälters A und des Sammelbehälters E kann je nach Erfordernis, das sich aus den Volumina der beiden im jeweiligen Trennprozeß beteiligten flüssigen Phasen ergibt, variiert werden. Beim Sammelbehälter E kann es sich um ein Aufnahmegefäß in jeder gewünschten geometrischen Form und Größe handeln, sofern dafür gesorgt wird, daß es ab einer bestimmten geeigneten Höhe vom oberen Ende des Mischer-Separators B breiter ist als der Außendurchmesser des Mischbehälters A/ um gewünschtenfalls eine vorbestimmte quantitative Aufnahme des Flüssigkeitsvolumens zu erzielen.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist ein Ring D zwischen dem oberen Ende des Mischbehälters A und dem Sammelbehälter E vorgesehen, der auf dem Mischer-Separator B gleiten kann und damit das Niveau des Eindrückens des Mischer-Separators B bestimmt und entsprechend auch die Grenzfläche zwischen den beiden flüssigen Phasen, so daß eine vollständige Entfernung der oberen Phase aus dem Mischbehälter A sichergestellt wird. Auf dem gleichen Prinzip beruhend können auch zwei oder mehrere Ringe für unterschiedliche Stellungen der Zwischenschichtlagen vorgesehen sein. Ein derartiger, mit dem Bezugszeichen D versehener Ring ist z.B. in den Fig. 1, 2 und 4 dargestellt.

Ein weiterer Vorteil der zur Verfahrensdurchführung verwendbaren erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt darin begründet, daß sic mit einer Reihe von Apparaturen betrieben werden kann, die sich hervorragend zur Automatisierung eignen, ohne daß sich

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komplizierte Hilfseinrichtungen als notwendig erweisen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann aus einem beliebigen inerten Material bestehen, z.B. aus Glas, Polyäthylen oder einem anderen geeigneten Kunststoffmaterial und selbst Metall kann für spezielle Zwecke ins Auge gefaßt werden.

Die erfindungsgomäße Trennung zweier flüssigen Phasen wird im folgenden durch Beispiele aus der Immunoassay-Technik erläutert, bei der eine klare Trennung absolut erforderlich ist.

Der Einfachheit halber wird im folgenden die erfindungsgemäße Vorrichtung als "Lidex"-Separator bezeichnet und mit "Rohr A" des Lidex-Separators ist der oben im Zusammenhang mit den Figuren erläuterte Mischbehälter A gemeint, und "Mischer B" des Lidex-Separators bedeutet den gesamten Bauteil B gemäß obiger Beschreibung und den Figuren.

Beispiel 1 - Extraktionseffizienzstudien unter Verwendung eines Radioisotop-Tracers

Um festzustellen, wie geeignet ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch für die Extraktion einer Verbindung aus einer wässrigen Lösung ist, wurde das folgende Verfahren entwickelt, das sehr rasche und genaue Ergebnisse liefert. 12 "Rohre A" des Lidex-Separators wurden mit 1 bis 12 durchnumeriert. In jedes "Rohr A" wurden 500 μΐ EDTA-Phosphatpufferlösung eingebracht und anschließend 200 μΐ einer Lösung, die ein Digoxinderivat enthielt, das mit dem Radioisotop Jod-125 markiert war (diese Lösung wurde hergestellt durch Neuansatz eines handelsüblichen Digoxin-J 125-Derivats (Arnes) mit 12 ml des EDTA-Phosphatpuffers, pH 7,4, der 1,2 g Dinatriumphosphat und 0,6 g Dinatrium-EDTA in 100 ml deionisiertem Wasser enthielt). Die Radioaktivität der "Rohre A"

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1 bis 12 wurde gemessen in einem Gammazähler, wobei diese Zählung zweimal durchgeführt wurde, und zwar jedesmal 30 B lang. Zu jedem "Rohr A" wurden sodann 1,4 ml der folgenden Lösungsmittel zugesetzt:

a) Rohre 1 und 2: tert-Amylalkohol,

b) Rohre 3 und 4: ein Gemisch aus tert-Amylalkohol/Methyl-

isobutylketon (MIBK) in einem Volumenverhältnis von 9:1

c) Rohre 5 und 6: tert-Amylalkohol/MIBK im Volumenverhältnis

3:1

d) Rohre 7 und 8: tert-Amylalkohol/MIBK im Volumenverhältnis

von 1:1

e) Rohre 9 und 10: MIBK und

f) Rohren und 12 : tert-Butyl me thy lather

Alle angegebenen Lösungsmittel und Lösungsmittelgemische wurden zuvor mit dem gleichen EDTA-Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt.

Nach Zugabe der Lösungsmittel wurde ein Mischer-Separator B des Lidex-Separators wie ein Stöpsel in den Oberteil jedes "Rohrs A" 1 bis 12 eingesetzt und jeder dieser zusammengesetzten Lidex-Separatoren wurde 30 s lang in einer Vortex-Apparatur behandelt. (Durch Verwendung eines geeigneten Trogs konnten sämtliche Lidex-Separatoren gleichzeitig mit der Vortex-Apparatur behandelt werden.) Nach dem Vermischen mit der Vortex-Apparatur wurden die Lidex-Separatoren 10 min lang stehen gelassen, worauf sich eine obere und eine untere flüssige Phase gebildet hatte. Sodann wurde der Mischer-Separator B jedes Lidex-Separators 1 bis 12 vorsichtig in das "Rohr A" so weit wie es ging gedrückt (die zur Durchführung dieser Versuche verwendeten Lidex-Separatoren waren so konstruiert, daß beim maximalen Niederdrücken des Mischer-Separators B 0,5 ml der unteren flüssigen Phase im "Rohr A" verblieben, o,2 ml im Kanal C waren und die gesamte obere

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Phase (1,4 ml) sich im Sammelbehälter E befand). Jeder der Lidex-Separatoren 1 bis 12 wurde sodann in den Hohlraum des Gammazählers eingesetzt und die Radioaktivität der unteren Phase (welche im "Rohr A" verblieb) wurde wie zuvor gezählt, d.h. zweimal für jedes Rohr und jeweils 30 s lang.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt und sie zeigen, daß die Genauigkeit der Messungen hochgradig befriedigt. Versuche, die zur Bestimmung der Meßgenauigkeit durchgeführt wurden, zeigten, daß aufgrund der instrumenteilen Schwankungen in der Hohlraumgeometrie des Gammazählers Abweichungen von bis zu 1 % in der Genauigkeit der Bestimmung der Extraktionseffizienz eintreten können.

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Lösungs- Rohr mittel Nr.

- 26 -

Tabelle 1

Extraktionseffizienz Zählwert in der % der ver-

Gesamt- Zählwert in der % der ver- % Ex- Mittelzähl- flüssigen Phase bleibenden Radio- trak- wert wert nach der aktivität in der tions-Trennung v/äs sr igen Phase effi-

zienz

tert-Ainyl-	1	26264	1299
alkohol	1	26131	1360
	2	26770	1403
	1	26442	1540
tert-Amyl-	S	26165	1670
alkohol/	S	26219	1626
wiat	4	26171	154S
	4	263S0	1580
tert-Amyl-	S	26597	1426
alkohol/	S	26651	1461
MIBE	6	2 04 74	1402
(i 1)	ft	26075	13Ci
tert-Amyl-	7	26104	IMI
alkohol/	7	26291	1891
MIBK	•	2621S	14St
(1:1)	t	26797	1528
KIBC	9	2612S	5352
	9	26290	3501
	10	26491	J347
	10	26399	5512
tert-3utyl-	11	26191	2332
ino thyl-	11	26S92	2201
äther	12	26032	2455
	12	26311	2360

4.9 (.2 5.S

5.1

6.3 6.2 5.1

5.2

5.4 5.5 5.3 5.3

7.0 7.2 5.5 5.S

12.7 12.6 12.7 12.6

8.9 8.4 ».2

10.0

95.1	94. U 02	1
94.8 94.7
94.9
93.7	*94.30.6**	9
93.8 04.9
94.8
94.6	94.6+0.	OS
94.5 94.7
94.7
93.0	93.6+0.	,7
92.8 94.5
94.2
S7.J	87.5+0.
87.4 87.S
87.4
91.1	90.9+0,
91.6 90.8
90.0

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Beispiel 2 - Extraktionseffizienzstudien unter Verwendung von Fluoreszenz-Tracers

Dieser ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführte Versuch zeigte, daß die obere Phase, welche im Sammelbehälter E des Lidex-Separators abgetrennt ist, für die Messungen verwendbar ist. Die Ergebnisse beziehen sich auf die Bestimmung der Extraktionseffizienz von Lösungsmitteln unter Verwendung von Fluoreszenz-Tracern, doch ist diese Arbeitsweise auch für andere Bestimmungen geeignet, z.B. für Nichtisotopen-Immunoassay-Techniken unter Verwendung von fluoreszierenden Markierungsmitteln oder anderen Nichtisotopen-Markierungsmitteln sowie Radioisotop-Markierungsmitteln, wenn die freie, nicht gebundene Fraktion bestimmt werden soll.

-4 Es wurden zwei Standard-Stammlösungen von 5x10 M Rhodamin B hergestellt, die eine in doppelt destilliertem Wasser und die andere in tert-Amylalkohol. Diese Lösungen wurden zur Verdünnung unter Erzielung von Arbeitslösungen der gewünschten Kon-

-5 -5 -5

zentrationen von 5 χ 10 M, 4,5 χ 10 M, 4,0 χ 10 M,

2,5 χ 10~⁵Μ, 2,25 χ 1θ"⁵Μ, 2,0 χ 1θ"⁵Μ, 1,0 χ 1θ"⁵Μ und 0,5 χ 10~ M verwendet. Kalibrierkurven wurden mit :Hilfe dieser Lösungen erhalten unter Verwendung eines handelsüblichen Fluoreszenz-Spektrophotometers (Perkin-Elmer Modell MPF-44B) mit einer Anregungswellenlänge von 430 nm und einer Emissionswellenlänge von 615 nm.

16 "Rohre A" des Lidex-Separators wurden mit 1 bis 16 durchnumeriert. In die Rohre 1 und 2 wurdenzum Vergleich 0,7 ml Wasser eingebracht. Dann wurden in die Rohre 3 bis 16 0,7 ml der angegebenen Arbeitslösungen von Rhodamin B in Wasser eingebracht und jede der oben angegebenen sieben Konzentrationen als Doppelbestimmung. Danach erfolgte die Zugabe von 1,4 ml tert-Amylalkohol (vorgesättigt mit Wasser) zu jedem "Rohr A" 1 bis 16.

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Ein "Mischer B" des Lidex-Separators wurde wie ein Stöpsel im Oberteil jedes "Rohrs A" eingesetzt, worauf alle 16 Anordnungen der Lidex-Separatoren 20 s lang mit einem Vortex-Mischer behandelt wurden. Nach 10 min langem Stehen wurde der "Mischer B" jeder Anordnung 1 bis 16 vorsichtig in das "Rohr A" geschoben, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die obere Phase, welche in den Sammelbehälter E jedes Lidex-Separators floß, wurde in eine Spektrophotometerzelle geschüttet und das Fluoreszenzsignal wurde gemessen. Die Konzentration an Rhodamin B in jedem Röhrchen wurde aus der Eichkurve bestimmt durch Interpolation des wie angegeben erhaltenen Fluoreszenzsignals und unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (2:1), der bei diesen Versuchen zur Anwendung gelangte. Die Ergebnisse zeigen, daß die Extraktion von Rhodamin B in das tert-Amylalkohol-Lösungsmittel in einem Ausmaß von 90 - 93 % Effizienz erfolgte.

In Abänderung der beschriebenen Versuche ist es auch möglich, einen Lidex-Separator in der Weise auszugestalten, daß der Sammelbehälter E des "Mischers B" einen separaten Bauteil darstellt, der z.B. aus Quarz oder Pyrex oder einem anderen für Fluoreszenzmessungen geeigneten Material besteht und am Mischer-Separator B vor der Phasentrennung befestigt wird. Sobald sich nach der Phasentrennung die obere Phase in dem Sammelbehälter E befindet, kann die gesamte Lidex-Anordnung in einen modifizierten Zellhalter des Fluoreszenz-Spektrophotometers eingesetzt werden. Auf diese Weise braucht audh die obere Phase nicht in eine eigene Meßzelle geschüttet zu werden und die gesamte Operation kann leicht automatisiert werden. Wie zu Beginn dieses Beispiels bereits erwähnt, kann die gleiche Arbeitsweise auch dann angewandt werden, wenn z.B. ein Tritium-markiertes Material als Tracer verwendet wird. Nachdem sich nach der Phasentrennung die obere Phase, in welche der Tritium-markierte Tracer extrahiert wurde, im Sammelbe-

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hälter E befindet, kann diese Phase in die Szintillationsflüssigkeit geschüttet und in einem Szintillationszähler auf Radioaktivität getestet werden.

Beispiel 3 - Digoxin-Radioimmunoassay

Um das vorteilhafte Verhalten, die Zuverlässigkeit, Einfachheit und andere Vorteile der Verwendung des Lidex-Separators in Immunoassay-Techniken zu zeigen, wurden zwei Parallelversuche wie folgt ausgeführt:

1. Ein handelsüblicher Kit oder Fertigpack für Digoxin-Radioimmunoassay (Handelsname RIALYZE von Arnes) wurde verwendet, bei dem Chromatographieröhrchen als Trennsystem zur Trennung der freien und gebundenen Fraktionen diente;

2. die gleichen Fertigpack-Reagentien wurde verwendet, wobei jedoch die Bestimmung mit Hilfe des Lidex-Separators erfolgte.

Alle Fertigpack-Komponenten wurden nach den Gebrauchsanweisungen frisch hergestellt. Doppel-Fertigpack-Proberöhrchen wurden markiert für die Gesamtzählung, nämlich Standardproben A, B, C, D und E. Ferner wurden Doppe1-Proberöhrchen I, II und III markiert für jedes DADE-Kontrollserum (Handelsbezeichnung TRI-YAC, Trilevel Radioimmunoassay Kontrollen, Level I, Level II und Level III).

Für die Parallelversuche mit dem Lidex-Separator wurden jeweils für Doppelbestimmungen "Rohre A" des Lidex-Separators markiert für die Gesamtzählungen, Null-Standard und Standard-Proben A, B, C, D und E. Ferner wurden für Dreifachbestimmungen "Rohre A" des Lidex-Separators für jedes DADE-Kontrollserum I, II und III markiert.

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Jeweils 100 μΐ des frisch bereiteten J 125-Digoxin-Reagens wurde zu jedem Proberöhrchen zugegeben. Pufferlösung (50 μΐ) wurde zu den Proberöhrchen für Gesamtzählungen und Null-Standard zugesetzt. Zu den entsprechend markierten Standardröhrchen wurden 50 μΐ jedes Standards und 50 μΐ jedes Kontrollserums wurden zu den mit I, II und III bezeichneten Röhrchen zugegeben.

Ein Volumen von 100 μΐ frisch bereitetem Antiserum wurde zu allen Röhrchen zugesetzt außer zu dem Gesamtzählungsröhrchen, welche mit 100 μΐ der für die Bestimmung verwendeten Pufferlösung versetzt wurden. Alle Röhrchen wurden 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde jeder Versuchsansatz unterschiedlich weiterverarbeitet, nämlich:

1. Auf jedes Teströhrchen des handelsüblichen Fertigpacks wurde ein Chromatographierohr aufgesetzt und nach 10 min langem Stehenlassen wurden 0,8 ml Pufferlösung auf jedes Teströhrchen aufgebracht, worauf weitere 10 min lang stehengelassen wurde. Die Röhrchen wurden sodann in einem Gammazählrohrinstrument auf Radioaktivität getestet.

2. Zu jedem "Rohr A" des Lidex-Fertigpacks wurden 350 μΐ Pufferlösung (zur Volumeneinstellung) und anschließend 1,4 ml des Extraktionslösungsmittelgemischs (tert-Amylalkohol/MIBK im Verhältnis 3:1), das zuvor mit dem zur Bestimmung verwendeten Puffer gesättigt worden war, zugegeben. Ein "Mischer B" des Lidex-Separators wurde wie ein Stöpsel auf den Kopfteil jedes der "Rohre A" aufgesetzt und alle Lidex-Separatoranordnungen wurden 30 s lang mit einem Vortex-Mischer behandelt.

Die Testanordnungen wurden 10 min lang stehen gelassen (zur Trennung der Flüssigphasen) und der "Mischer B" jedes Lidex-Separators wurde vorsichtig so weit es ging in das "Rohr A" eingedrückt. Die Lidex-Anordnungen wurden in den Schacht des

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Gammazählrohrs eingesetzt zur Messung der Radioaktivität der wässrigen Phase, welche am Boden des "Rohres A" verblieben war. Die Ergebnisse der Radioaktivitätszählung
wurden berechnet als frei/gesamt für den handelsüblichen Fertigpack (wie in den Gebrauchsanweisungen beschrieben) und als gebunden/gebunden-null für das Lidex-System.

In Fig. 6 sind die Ergebnisse aus beiden Versuchsansätzen graphisch ausgewertet auf dem im Fertigpack mitgelieferten Koordinatenpapier als log Meßwert gegen log
Digoxin-Konzentration. Aus diesen Kurven wurden die Digoxinwerte (ng/ml) der Kontrollseren bestimmt. Die Mittelwerte aller Ergebnisse und eine Zusammenfassung der gefundenen Werte für die Kontrollsera im Vergleich zu anderen handelsüblichen Fertigpacks sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 zusammengefaßt. Wie die in Fig. 6 wiedergegebene Kurve und die für die Kontrollseren bestimmten Werte der Digoxin-Konzentration zeigen, erweist sich das erfindungsgemäße Lidex-Separatorsystem als voll befriedigend für den Digoxin-Radioimmunoassay.

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Tabelle 2 - Jod 125 Digoxin-Radioinununoassay mit bekanntem

	Kit bzw.	Lidex-Separator	77,0
Standards	Digoxin Konz. (ng/ml)	bekannter Kit erfindungsgemäß Mittelwert % Lidex-Separator frei Mittelwert % (F/T) B/Bo	67,0
A	0,6	33,6	46,3
B	1,0	48,1	39,3
C	2,0	65,8	27,9
D	2,8	75,7	67,8
E	4,6	83,8	47,6
Kontroll-	Level I	40,5	37,6
Sera	Level II	61,5	(ng/ml) berechnet aus
	Level III 72,7
Tabelle 3	- Bezugskontrollwerte

Ergebnissen in Tabelle 2 und Figur 6 und Vergleich mit bekannten DADE-Werten

DADE-	I	bekann	Kit	erfin-	DADE-	06	Bereich bekannter Werte	Corning	Kalesta D
	II	ter		dungs-	Werte	17	für	(J-125)	(5H)
Kontroll-	III			gem.		49	Immunophase	Quantitop
Sera			Lidex-		0,64-1,04	0,77-1,37
		78	Separator		1,40-2,10	1,48-2,4
	o.	65	0,92	0,71-1,	2,3-3,5	2,33-3,52
Level	1,	6	2,05	1,55-2,
Level	2,	3,0	2,64-3,
Level

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Claims

μΓμ.ΚΙΜ»)ΚΑ · I)KlFKL · S(IION · II 1-,HTLL !'AT K N TΛ .N VV Λ 1.Ύ K UR. WOUFC-ANG Mt(LI EH-OORE (PATENTANWALT VON 1927-1975) DR. PAUL DEIJFEL. DIFM..-CH EM. DR. AI-FHED SCHÖN. D1PL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.- PHYS. ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATCNTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUHOPEAN PATENT OFFICE MANDATAIRES ACRECS PRES !.'OFFICE EUROPEEN DES BREViCTS C 3088

1. Prof. Michael CAIS, 4 Harofe St., Haifa, Israel

2. Moshe SHIMONI, 2 Victor Hugo St.-, Haifa, Israel

3. Technion Research & Development Foundation Ltd.,
Technion City, Haifa 32000, Israel

Verfahren und Vorrichtung für Massentransferoperationen auf Immunoassay- und anderen Anwendungsgebieten

Patentansprüche

1. Vorrichtung zur Durchführung von Massentransferoperationen einer oder mehrerer Komponenten aus einer
flüssigen Phase in eine andere flüssige Phase und Bewirkung einer physikalischen Trennung der beiden Phasen,
gekennzeichnet durch eine sowohl den Massentransfer als auch die Phasentrennung bewirkende Anordnung
aus einem Mischbehälter (A), in den ein vertikal verschiebbarer Mischer-Separator (B) eng eingepaßt ist, der mindestens einen längs der Vertikalachse des Mischer-Separators (B) sicherstreckenden Kanal (C) aufweist, welcher an seinem

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β MÜNCHEN 86. SIHBERTbTR. 4 · POB 860 720 · KABFL: MUEBOPAT · TEL. (0B9) 47 40 05 · TELECOPIER XfcROX 400 · TELEX Ϊ.-242Β:

oberen Ende mit einem am Kopfteil durch einen Verschluß (5) absperrbaren Sammelbehälter (E) versehen ist zur Aufnahme und physikalischen überführung der beim Eindrücken des Mischer-Separators (B) in den Mischbehälter (A) durch den Kanal (C) gesaugten oberen flüssigen Phase aus dem Mischbehälter (A).

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischer-Separator (B) an seinem Bodenteil mit einem Abdichtelement versehen ist, das mindestens eine durch dessen Dicke reichende Öffnungsbohrung aufweist, die mit dem Kanal (C) in Verbindung steht.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdichtelement zum Gleiten längs der Innenwände des Mischbehälters (A) ausgestaltet ist und mit den Innenwänden des Mischbehälters (A) in gutem Kontakt steht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Abdichtelement aus einem Kautschuk-O-Ring besteht, der eine mit dem Kanal (C) in Verbindung stehende Öffnungsbohrung aufweist und zum Gleiten längs der Innenwände des Mischbehälters (A) ausgestaltet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß nur der untere Abschnitt des Mischer-Separators (B) in den Mischbehälter (A) eng eingepaßt ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sich der Kanal (C) nur längs des unteren Abschnitts der Vertikalachse des Mischer-Separators (B) erstreckt.

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7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischbehälter (A) mindestens zwei in Längsrichtung verlaufende Vertiefungen in seinen Wänden aufweist, die mit der gleichen Zahl von am Mischer-Separator (B) vorgesehenen Vorsprüngen im Eingriff stehen zur Erleichterung des Gleitens des Mischer-Separators (B) in den Mischbehälter (A).

8. Vorrichtung nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß der Mischbehälter (A) eine zylindrische Form aufweist.

9. Vorrichtung nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischbehälter (A) mit einer kalibrierten Skala zur Volumenmessung versehen ist.

10. Vorrichtung nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß zwischen dem oberen Ende des Mischbehälters (A) und dem mit dem Mischer-Separator (B) gleitenden Sammelbehälter (E) ein Ring (D) vorgesehen ist, ist zur Begrenzung des Eindrückniveaus des Mischer-Separators (B) in den Mischbehälter (A).

11. Vorrichtung nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß der Sammelbehälter (E) ab einer bestimmten Höhe vom oberen Ende des Mischer-Separators (B) einen größeren Außendurchmesser aufweist als der Mischbehälter (A).

12. Vorrichtung nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß sie aus einem inerten Material besteht.

13. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch g e k e η η zeichnet , daß das inerte Material aus Glas, Poly-

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äthylen oder einem anderen Kunststoff oder aus Metall besteht.

14. Verfahren zur Durchführung von Massentransferoperationen einer oder mehrerer Komponenten aus einer flüssigen Phase in eine andere flüssige Phase und Bewirkung einer physikalischen Trennung der beiden Phasen, dadurch gekennzeichnet , daß man den Massentransfer und die physikalische Trennung in der gleichen Vorrichtung nach Ansprüchen 1 bis 13 vornimmt durch Einbringen der beiden in Kontakt zu bringenden Flüssigkeiten in den Mischbehälter (A), Mischen der Komponenten, Bildenlassen der Grenzschicht zwischen den beiden Flüssigkeiten, Eindrücken des Mischer-Separators

(B) bis zum gewünschten Niveau und Ansaugen der oberen Flüssigphase durch den Kanal (C) in den Sammelbehälter (E).

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß es für Immunoassaytechniken eingesetzt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß als Immunoassaytechniken Radioimmunoassay-, freie Radikalassay-, Fluorcszenzimmunoassay-. Enzymimmunoassay- oder Metallimmunoassay-Techniken durchgeführt werden.

17. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß es unter Verwendung einer Immunoassay-Verpackungseinheit durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß es automatisiert wird.

19. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß as auf Digoxin angewandt

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20. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es auf östradiol, Progesteron oder Testosteron angewandt wird.

21. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß es auf T₄ angewandt wird.

22. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es auf T₃ angewandt wird.

23. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß es auf Barbiturate angewandt wird.

24. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es auf Cannabinoide angewandt wird.

25. Verfahren nach Ansprüchen 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß es auf Morphin angewandt wird.

26. Verpackungseinheit für Radioimmunoassay-, freie Radikalassay-, Fluoreszenzimmunoassay-, Enzymimmunoassay- oder Metallimmunoassay-Techniken, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Vorrichtung nach Ansprüchen 1 bis 13 zur Durchführung von Massentransferoperationen.

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