DE3046241A1 - Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin - Google Patents
Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterinInfo
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Description
-A-
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin unter Verwendung von Cholesterinoxidase.
Es ist bekannt, Cholesterin, gegebenenfalls nach vorheriger
Freisetzung aus seinen Estern durch chemische oder enzymatische Verseifung, mittels Cholesterinoxidase in Gegenwart
von molekularem Sauerstoff zu Cholestenon und H3O2
umzusetzen und diese quantitativ ablaufende Reaktion zur Bestimmung des Cholesterins zu benutzen. Hierbei wird entweder
gebildetes Cholestenon bzw. H3O2 oder verbrauchter
Sauerstoff gemessen. Dieses enzymatische Cholesterin-Bestircmungsverfahren
hat zwar aufgrund seiner Spezifität gegenüber den früher gebräuchlichen chemischen Bestimmungsmethoden
einen erheblichen Fortschritt gebracht, jedoch eignet sich das Verfahren bisher nicht zur raschen und
praktikablen kinetischen Durchführung. Aufgrund des niedrigen K -Werts der Cholesterinoxidase, die den spezifischsten
Teilschritt der Reaktionsfolge katalysiert, verläuft die
Reaktion in dem für die Cholesterinbestimmung interessanten Konzentrationsbereich bis 13 mMol/1 nicht nach erster
bzw. pseudoerster Ordnung. Ein derartiger Reaktionsverlauf ist jedoch Voraussetzung für eine rasche, praktikable, keinen
Probenleerwert erfordernde kinetische Bestimmungsmethode,
die eine wesentliche Verkürzung des Zeitbedarfs pro Einzelanalyse gegenüber den bisher erforderlichen Endpunktbzw,
kinetischen Methoden ermöglichen würde. Dabei, lag der Zeitbedarf für die bisherigen photometrischen Verfahren
zwischen 1o und 6 Minuten; cmgestrebt werden bei kinetischen
Methoden Analysenzeiten von 1 bis 3 Minuten. Die Analysenautomaten der neuen Generation sind für einen hohen
Probendurchsatz konzipiert und gestatten nur kurze Inkuba-
tionszeiten, die mit den bisherigen Verfahren, im Rahmen des Cholesterinnächweises, nicht erzielt werden können. Infolgedessen
können die heute üblichen Analysenautomaten mit hoher Analysenfrequenz nicht voll ausgelastet werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein kinetisches Bestimmungsverfahren für die Cholesterinoxidase-Reaktion
zu entwickeln, bei dem diese nach pseudoerster Ordnung abläuft.
Es ist bekannt, daß es in vielen Fällen möglich ist, einen derartigen Reaktionsverlauf bei zu niedrigen K„-Werten der
beteiligten Enzyme durch künstliche K..-Werterhöhung zu erzielen.
Aus der Theorie von Michaelis und Menton folgt, daß enzymkatalysierte Einsubstrat-Reaktionen dann über
einen weiten Konzentrationsbereich nach erster Ordnung ablaufen, wenn die Michaelis-Konstante des Enzyms sehr viel
größer ist als die maximale Substratkonzentration. Da die bisher bekannten Cholesterinoxidasen aus verschiedenen Mikroorganismengattungen,
wie Nocardia, Brevibacterium oder
—4 Streptomyceten KM~Werte in der Größenordnung von 1o bis
1o~" mol/1 aufweisen, lassen sich hier nur geringe Cholesterinkonzentrationen
kinetisch messen. Versuche, durch Zusatz eines kompetitiven Inhibitors den K^-Wert der Cholesterinoxidase
in an sich bekannter Weise künstlich zu erhöhen, erwiesen sich als erfolglos.
überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß es möglich
ist, bei Auswahl einer Cholesterinoxidase bestimmter Herkunft und eines bestimmten Phenolderivats einen Reaktionsablauf nach pseudoerster Ordnung zu erzielen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
in freier oder gebundener Form mittels Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase durch Mes-
sung des SauerstoffVerbrauchs, des gebildeten Wasserstoffperoxids
oder des gebildeten Cholestenons ist daher dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung kinetisch durchgeführt
wird unter Verwendung einer Cholesterinoxidase, die aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gewonnen
wurde und unter Zusatz von 3,4-Dichlorphenol.
Weder mit den bisher für die Cholesterinbestimmung gebräuchlichen
Cholesterinoxidasen aus Nocardia oder Brevibacterium
noch mit den als kompetltiven Hemmstoffen in
erster Linie in Betracht kommenden Cholesterin ähnlichen Steroiden oder Gallensäuren konnte ein derartiger, die kinetische
Bestimmung erst ermöglichender Reaktionsverlauf
erzielt werden. Auch die anderen Isomeren des Dichlorphenols haben keinen oder nur einen ungenügenden Einfluß auf
den Reaktionsverlauf. Es wird daher angenommen, daß zwischen
dem 3,4-Dichlorphenol und dem Enzym aus Mikroorganismen
der Gattung Streptomyces eine besondere Wechselwirkung auftritt.
Die Gewinnung von Cholesterinoxidase aus Streptomyceten
wird in der DE-OS 29 24 875.7 beschrieben. Beispiele für geeignete Stämme sind Streptomyces griseofuscus DSM 4o191,
Streptomyces hygroscopicus DSM 4o771 und Streptomyces acidomyceticus
DSM 4o798.
Der angestrebte Reaktionsablauf erster Ordnung läßt sich bei weit variierenden Konzentrationen von 3,4-Dichlorphenol
und Cholesterinoxidase erzielen. Bevorzugt verwendet man o,5 bis 1o mmol/1 3,4-Dichlorphenol und o,1 bis 2o χ
1o U/l .Cholesterinoxidase aus Streptomyces.
Die Durchführung des Verfahrens der Erfindung erfolgte im übrigen in der für kinetische Bestimmungen üblichen Weise.
Vorzugsweise werden wenigstens zwei Messungen in einem
vorher bestimmten Zeitintervall durchgeführt. Die Bestimmung
kann im ganzen pH-Wertbereich, bei welchem die Cholesterinoxidase aus Streptomyces aktiv ist, vorgenommen
werden, vorausgesetzt, daß etwa verwendete Hilfsenzyme in
diesem pH-Bereich ebenfalls aktiv sind. Bevorzugt wird die Bestimmung in gepufferter Lösung bei pH-Werten von
6,5 bis 8 durchgeführt.
Wie bereits erwähnt, sind prinzipiell alle bekannten Varianten der Cholesterinbestimmung unter Verwendung von
Cholesterinoxidase im Rahmen der Erfindung anwendbar. Lediglich die Messung der Cholestenonbildung bei 23o bis
nra eignet sich bei höheren 3,4-Dichlorphenol-Konzentrationen
weniger, da 3,4-Dichlorphenol bei der Meßstrahlung des Cholestenons absorbiert. Bei dieser Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens sollte daher eine Konzentration
von 1,5 mmol/1 3,4-Dichlorphenol nicht überschritten werden.
Die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht in der Bestimmung von gebildetem Wasserstoffperoxid durch Zusatz von 4-Aminoantipyrin, Phenol, Peroxidase
und einer für dieses System geeigneten Puffersubstanz.
Bevorzugt werden hier Phosphatpuffer, Hepespuffer (HEPES:
4-(2-Hydroxyäthyl)-1-piperazinäthan-sulfonsäure) oder Trispuffer.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung erhält man die besten
Ergebnisse, wenn man außerdem ein nichtionisches Detergens und gegebenenfalls zusätzlich noch ein Detergens der
Cholsäuregruppe zusetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Peagenz zur kinetischen Bestimmung von Cholesterin, enthaltend Cholesterinoxidase
und ein System zur Bestimmung von H_02 oder
von Cholestenon sowie gegebenenfalls Cholesterinesterase,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zusätzlich 3,4-Dichlorphenol
enthält und die Cholesterinoxidase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces stammt.
Als System zur Bestimmung von H2O2 wird die Kombination
4-Aniinoantipyrin oder ein Derivat davon, Phenol oder Phenolderivat,
Puffer und Detergens, häufig als "PAP"-System
bezeichnet, bevorzugt. Das PAP-System und seine Abwandlungen sind besonders deshalb vorteilhaft, weil der gebildete
Farbstoff im UV bei anderer Wellenlänge absorbiert als das 3,4-Dichlorphenol und daher keine Beeinträchtigung der Empfindlichkeit
durch Überlappung der Extinktionen auftreten kann. Als besonders geeignet erwies sich ein nichtionisches
Detergens, welches allein oder gegebenenfalls zusammen mit einem Detergens der Cholsäuregruppe verwendet
wird.
Das erfindungsgemäße Reagenz enthält vorzugsweise eine
Puffersubstanz, wobei alle Puffer in Betracht kommen, die im Aktivitätsbereich der beteiligten Enzyme zu puffern
vermögen, vorzugsweise im pH-Bereich von 6,5 bis 8. Als besonders geeignet erwiesen sich Phosphatpuffer, Hepespuffer
und Trispuffer.
Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße Reagenz,
welches als System zur Bestimmung von H2O2 das PAP-System
enthält, folgende quantitative Zusammensetzung auf:
o,1 bis Io χ Io U/l Cholesterinoxidase,
o,1 bis 2o χ 1o U/l Cholesterinesterase, o,1 bis 5 χ Io U/l Peroxidase,
1 bis 1o mmol/1 3,4-Dichlorphenol,
o,5 bis 1o mmol/1 4-Aminoantipyrin, 5 bis 2o mmol/1 Phenol oder Phenolderivat,
1 bis Io g/l nichtionisches Detergens,
ο bis 15 iranol/1 Detergens der Choisäuregruppe und
5o bis 2oo mmol/1 Puffer, pH 6,5 bis 8.
Daneben kann das erfindungsgemäße Reagenz noch übliche Zusatzstoffe
für enzymatisch^ Reagenzien, wie Stabilisierungsmittel,
z. B. Mannit, Bakterizide, wie Azid, anorganische Salze, enthalten.
Im oben erwähnten PAP-System nach Trinder können anstelle von Phenol Phenolderivate, Anilinderivate, Naphthol, Naphtholderivate,
Naphthylamin, Naphthylaminiderivate, Aminochinoline,
Hydroxychinoline, Dihydroxyphenylessigsäure und ähnlich reagierende Substanzen eingesetzt werden. Das 4-Aminoantipyrin
kann ersetzt werden z. B. durch Phenylendiamin-sulfonsäure, Methylbenzothiazolon-hydrazon, sulfoniertes
Methylbenzothiazolon-hydrazon-Derivate und ähnlich gebaute Verbindungen.
Anstelle des PAP-Systems lassen sich jedoch im Rahmen der Erfindung auch andere bekannte H2O?-Bestimmungssysteir<e einsetzen.
Unter diesen werden die Lumineszenzmethoden, bei denen die Fluoreszenz oder Chemilumineszenz gemessen wird,
bevorzugt, beispielsweise das Peroxidase/Luminol-System.
Andere geeignete Systeme bestehen aus Katalase, ß-Diketonen, wie z. B. Acetylaceton, und einem Alkohol, wie Methanol,
Äthanol oder Methylenglykol. Ein weiteres geeignetes
System besteht aus Peroxidase und einem Chromophor, wie 2,3'-Aminobenzthiazolin-sulfonsäure.
Wenn das erfindungsgemäße Reagenz ein System zur Bestimmung
von Cholestenon enthält, so eignen sich hierfür die bekannten
Nachweissysterne. Wahlweise kann, wie oben bereits erwähnt,
auch die Cholestenonbildung bei 24o nm direkt gemessen werden, wenn ein gewisser Empfindlichkeitsverlust in
Kauf genommen wird, da bei dieser Wellenlänge auch das 3,4-
-1ο- I
ί Dichlorphenol schon absorbiert. ί
Das erfindungsgemäße Reagenz kann auch?auf einem festen
Träger imprägniert vorliegen. In diese* Fall kann man die Bestimmung durchführen, indem man entweder
a) den mit dem Reagenz imprägnierten Träger in die Probe
eintaucht, oder }
b) eine definierte Probenmenge auf den! Reagenzträger auftropft
oder |
c) mit einem definierten Probevolumen üas Reagenz vom Träger
eluiert. j
Wird die Reaktionsgeschwindigkeit direkt auf dem Träger
gemessen, so ist dies beispielsweise reflektometrisch oder
durch Lumineszenzmessung möglich. ErfctLgt die Bestimmung nach Elution des Reagenz, so erfolgt c|ie Messung wie beim
trägerfreien Reagenz. i
Als Trägermaterialien eignen sich die für analytische Nachweisreagenzien
üblichen Träger, wie Papier, Zellulose, Faservliese, poröse Kunststoffmembranen -und dergleichen. Die
Herstellung erfolgt durch Eintauchen oder Besprühen mit dem erfindungsgemäßen Reagenz. ;
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine wesentlich schnellere Erfassung der Cholesterinmenge und führt zu einer
großen Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Analysenverfahren. Für automatisierte Analysensysteme wird
in vielen Fällen hierdurch die enzymatische Cholesterinbestimmung überhaupt erst praktikabel.
Die folgenden Beispiele erläutern die. Erfindung.
ORIGINAL INSPECTED
- 11 -
Beispiel 1
Es wurde folgendes Reagenz verwendet:
5oo U/l Cholesterinoxidase aus Streptomyces,
15oo U/l Peroxidase,
8oo U/l Cholesterinesterase,
5 iratiol/1 3, 4-Dichlorphenol,
5 inmol/1 Phenol,
1 mmol/1 4-Aminophenazon,
4,8 g/l nichtionisches Detergens (Genapol OX 1oo) 9,4 mmol/1 Natriumdesoxycholat,
2oo mmol/1 Phosphatpuffer, pH 7,8.
Auf einem handelsüblichen Analysenautomaten (im Handel erhätlich unter der Bezeichnung CENTRIFICHEM 4oo) wird bei
folgender Einstellung die Cholesterinbestiitimung im Serum
durchgeführt:
Temperatur: 25 C; Filter: 5oo nmj t -time-delay: 6o Sekunden;
Δ.-Intervall: 1 Minute; Blanke, Auto; Testmode: Term;
*- ρ
Printout: Konz.; Standard Value: Sollwert Precilip ';
Testcode: oo; Reagenzvolumen: 35o/ul; Probe: 5 /Ul; Probe
und Wasser: 3o/Ul.
Die Bestimmung ergab bis mindestens 13 mmol/1 einen linearen Kurvenverlauf.
Die verwendete Cholesterinoxidase wurde aus Streptomyces griseofuscus DSM 4o191 gewonnen.
Beispiel 2
Es wurde folgendes Reagenz verwendet:
5oo U/l Cholesterinoxidase aus Streptomyces,
15oo U/l Cholesterinesterase,
15oo U/l Peroxidase,
5 nimol/1 3,4-Dichlorphönol,
5 iumol/1 Phenol,
1 mmol/1 4-Aminophen az on,
1oo ininol/1 Magnesiumsulfat,
4 g/l Isotridecylather,
1oo nunol/1 Tris-Puffer, pH 7,7.
Das Reagenz wurde wie in Beispiel 1 beschrieben an einem handelsüblichen Analysenautomaten (CENTRIFICHEM 4oo) zur
Bestimmung von Cholesterin im Serum eingesetzt. Auch hier wurde bis mindestens 13 mmol/1 ein linearer Verlauf festgestellt.
Analoge Ergebnisse wurden an einem anderen Analysenautomaten (Eppendorff ACP 5o4o) erzielt. In diesem Falle wurde
ein Startreagenz mit 5 U/ml Cholesterinoxidase verwendet.
Es wurde folgendes Reagenz verwendet:
5oo U/l Cholesterinoxidase aus Streptomyces, 15oo U/l Cholesterinesterase,
15oo U/l Peroxidase,
15oo U/l Peroxidase,
5 mmol/1 3,4-Dichlorphenol,
14 mmol/1 Salicylalkohol,
o,5 mmol/1 4-Aminophenazon,
4 g/l Isotridecyläther,
14 mmol/1 Salicylalkohol,
o,5 mmol/1 4-Aminophenazon,
4 g/l Isotridecyläther,
1o mmol/1 Natriumcholat,
5o mmol/1 Hepes-Puffer, pH 6,9.
Mit diesem Reagenz wurden analoge Ergebnisse wie in den Beispielen 1 und 2 erhalten. Die Präzision in der Serie,
die auf den beiden oben genannten Analysenautomaten erzielt wurde, zeigt nachstehende Tabelle.
CENTIiIFICHEM 4oo ACP 5o4o
η = 8 η = 8
χ = 311,3 χ= 285,6
S = 6,84 S = 2,13
VK = 2,2ο % VK = ο,8 %
Beispiel 4
Kinetische Bestimmung unter Messung des Cholestenons bei
24o nm
Reagenz: Tris-Puffer o,1 mol/1, pH 7,6
Isotridecylather 3 g/l
3,4-Dichlorphenol 1,o mmol/1
Na-Cholat 1o,o mmol/1
Cholesterinoxidase o,2 U/ml
Ansatz: 2 ml Reagenz, 1o,ul Probe (Cholesterin-Standard)
Testbedingungen: T 25°C
E1 1 Min. nach Start der Reaktion
En 2 Min. nach Start der Reaktion
Ergebnis: Cholesterinkonzentration / Extinktionsänderung
2,59 iranol/1 3o itiE
5,17 mmol/1 6o mE
1o,34 mmol/1 12o mE
* m B «
- 14 -
Beispiel 5
Messung des Sauerstoffverbrauchs
Messung des Sauerstoffverbrauchs
Reagenz: Tris-Puffer o,1 mol/1, pH 7,6
Isotridecyläther 3 g/l
3,4-Dichlorphenol 3 mmol/1
Natriumcholat 1o ircmol/l
Cholesterinoxidase 2 U/ml
Ansatz: 1,5 ml Reagenz, 1o/ul Probe
Testbedingungen: T: 250C
Testbedingungen: T: 250C
Die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs wird zwischen
der 2. und 3. Minute gemessen.
Ergebnis: Cholesterinkonzentration / relative Reaktionsgeschwindigkeit
2,59 inmol/1 25
5,17 itunol/1 5o
1o,34 mmol/1 1oo
Claims (12)
1. Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin in freier
oder gebundener Form mittels Cholesterin-Oxidase und
gegebenenfalls Cholesterin-Esterase durch Messung des
Sauerstoffverbrauches, des gebildeten Wasserstoff-Peroxyds oder des gebildeten Cholestenons, dadurch gekennzeichnet , daß die Bestiinmung kinetisch durchgeführt wird unter Verwendung einer Cholesterin-Oxidase, die aus
einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gewonnen
wurde und unter Zusatz von 3,4-Dichlorphenol.
oder gebundener Form mittels Cholesterin-Oxidase und
gegebenenfalls Cholesterin-Esterase durch Messung des
Sauerstoffverbrauches, des gebildeten Wasserstoff-Peroxyds oder des gebildeten Cholestenons, dadurch gekennzeichnet , daß die Bestiinmung kinetisch durchgeführt wird unter Verwendung einer Cholesterin-Oxidase, die aus
einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gewonnen
wurde und unter Zusatz von 3,4-Dichlorphenol.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man 0,5 - 50 mmol/1 3,4-Dichlorphenol und o,l - 50 χ
10 U/l Cholesterin-Oxidase zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η ζ
e i C'h net, daß man wenigstens zwei Messungen in
einem vorher bestimmten Zeitintervall vornimmt.
einem vorher bestimmten Zeitintervall vornimmt.
4. Vorfahren mich einem der vorhergehenden Anr.prüche ,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in gepufferter Lösung bei einem pH-Wert von 6,5-8 durchführt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung
des gebildeten Wasserstoff-Peroxyds 4-Aminoantipyrin,Phenol,
Peroxidase und Phosphat-Puffer, Hepes-Puffer oder Tris-Puffer zusetzt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nichtionisches Detergens und gegebenenfalls zusätzlich ein
Detergens der Cholsäure-Gruppe zusetzt.
7. Reagenz zur kinetischen Bestimmung von Cholesterin, enthaltend Cholesterin-Oxidase und ein System zur Bestimmung
von H-O oder von Cholestenon sowie gegebenenfalls Cholesterin-Esterase,
dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 3,4-Dichlorphenol enthält und die Cholesterin-Oxidase
aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces stammt.
8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das System zur Bestimmung von H-O0 4-Aminoantipyrin,
phenol oder ein Derivat davon, Puf-fer und Detergens
enthält.
9. Reagenz nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es ein nichtionisches Detergens
allein oder zusammen mit einem Detergens der Cholsäuregruppe enthält.
10. Reagenz nach einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet , daß es Phosphat-Puffer,
Hepes-Puffer oder Tris-Puffer enthält.
11. Reagenz nach einem der Ansprüche 8-10, dadurch gekennzeichnet , daß es
0,1 -K) χ 10 U/l Cholesterin-OxiclatJc;
0,1 - 20 x 10 U/l Cholesterin-Esterase 0,1 -5 χ 10 U/l Peroxidase
1-10 mmol/1 3,4-Dichlorphenol
0,5 - 10 mmol/1 4-Aminoantipyrin 5-20 mmol/1 Phenol oder Phenol-Derivat 1-10 g/l nichtionisches Detergens
0-15 mmol/1 Detergensder Chο!säuregruppe
50 - 200 mmol/1 Puffer-pH 6,5-8
enthält.
12. Reagenz nach einem der Ansprüche 7-11, dadurch
gekennzeichnet , daß es auf einem festen Träger imprägniert vorliegt.
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