DE3042535A1 - Solid-phase immunoassay - using substrate with metal surface - Google Patents
Solid-phase immunoassay - using substrate with metal surfaceInfo
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Abstract
Description
Beschreibung description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Feststellung induzierter Signale.The invention relates to a device for determining induced Signals.
Es kann erforderlich sein, induzierte Signale festzustellen, um hieraus Rückschlüsse auf die Substanz zu ziehen, die die induzierten Signale abgibt.It may be necessary to determine induced signals in order to get from this To draw conclusions about the substance that emits the induced signals.
Durch die Erfindung soll nun eine Vorrichtung geschaffen werden, mit der in sicherer und einfacher Weise diese induzierten Signale gemessen werden können.The invention now aims to create a device with which these induced signals can be measured in a safe and simple manner.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Oberfläche zur Aufnahme einer Probe vorgesehen ist, Einrichtungen zur Erzeugung von Erregungssignalen und Einrichtungen, mit denen diese Erregungssignale auf die Probe errichtet werden1 Einrichtungen, die diese Oberfläche beeinflussen, um die Erregungssignale, die die Erregung bewirkt haben, von der Mengenmeßeinrichtung fortzulenken und Einrichtungen zur Messung der Menge der von der Probe abgegebenen induzierten Signale.According to the invention this object is achieved in that a surface is provided for receiving a sample, means for generating excitation signals and means by which these excitation signals are applied to the sample1 Bodies that affect this surface to the excitation signals that the Have caused excitement to divert from the quantity measuring device and facilities to measure the amount of induced signals emitted by the sample.
Mit besonderem Vorteil wird hierdurch sichergestellt, daß die Erregungssignale das Meßergebnis nicht verfälschen können.This ensures with particular advantage that the excitation signals cannot falsify the measurement result.
Mit besonderem Vorteil kann die Oberfläche durch ein hochreflektierendes Substrat gebildet werden, sowie die Erregungssignale Photone aufweisen und die induzierten Signale Photone aufweisen. Dabei kann insbesondere mit Vorteil das hochreflektierende Substrat ein metallbeschichtetes Substrat sein, die Einrichtungen zur Erzeugung der Erregungssignale eine Lichtquelle und Wellenlängenauswahleinrichtungen aufweisen, die Einrichtung zur Ablenkung des Erregungssignals von der Mengenmeßeinrichtung das metallbedeckte Substrat und eine Photonenzelle aufweisen und die Einrichtungen zur Messung der Menge der induzierten Signale eine Wellenlängenauswahleinrichtung und ein Photonenzählsystem aufweisen.With particular advantage, the surface can be provided with a highly reflective Substrate are formed, and the excitation signals have photons and the induced Signals have photons. The highly reflective Substrate be a metal-coated substrate, the means for generating the excitation signals have a light source and wavelength selection devices, the device for deflecting the excitation signal from the quantity measuring device the metal covered substrate and have a photon cell and the means for measuring the amount of induced signals are wavelength selection means and a photon counting system.
Mit dieser Vorrichtung soll in vorteilhafter Weise beispielsweise wie folgt gearbeitet werden.With this device, for example, in an advantageous manner can be worked as follows.
An ein eine metallische Oberflächenschicht aufweisendes Substrat wird zunächst eine Schicht aus bekannten biologischen Teilchen absorbiert. Dieses aktive Substrat wird dann in eine Lösung eingetaucht, die eine unbekannte Menge an zweiten biologischen Teilchen, die die erste Art von Teilchen, die in ungeordneter Verteilung in der Schicht anwesend sind, binden, enthalten. Auf dieses Substrat wird dann eine dritte Art biologischer Teilchen, gebunden an ein anregbares Mittel, von dem ein induziertes Signal erzeugt werden kann, aufgebracht, und dieses Substrat wird dann in eine Vorrichtung eingebracht, die eine Quelle für induzierte Signale anregende Teilchen sowie ein Photonenzählsystem zum Messen der Menge an induziertem Signal aufweist. Das die Metallschicht aufweisende Substrat lenkt die anregenden Teilchen auf eine Falle, so daß weniger anregende Teilchen auf das Photonenzählsystem gelangen, während das induzierte Signal auf das Photonenzählsystem gelenkt wird und eine größere Menge an induziertem Signal gemessen wird.To a substrate having a metallic surface layer first a layer of known biological particles is absorbed. This active The substrate is then immersed in a solution containing an unknown amount of the second biological particles, which are the first type of particles that are in disorderly distribution are present in the layer, bind, contain. On this substrate is then a third type of biological particle bound to a stimulable agent, one of which induced signal generated can be applied, and this substrate is then placed in a device that provides a source of induced signals excitation Particles as well as a photon counting system for measuring the amount of induced signal having. The substrate having the metal layer directs the stimulating particles on a trap, so that less exciting particles reach the photon counting system, while the induced signal is directed to the photon counting system and a larger one Amount of induced signal is measured.
Insbesondere kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine immunologische Untersuchung vorgenommen werden.In particular, with the device according to the invention, an immunological Investigation to be made.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, daß das Erregungssignal nach dem Auftreffen auf das Substrat zur Photonen zelle reflektiert wird.It has proven advantageous that the excitation signal after the impact on the substrate to the photon cell is reflected.
Dabei kann die Wellenlängenauswahlvorrichtung der Einrichtung zur Messung der induzierten Signale zwei Schmalband-Interferenzfilter mit ähnlicher Spitzenwellenlänge aufweisen.The wavelength selection device of the device can be used for Measurement of the induced signals using two narrowband interference filters with similar Have peak wavelength.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Oberfläche eine leitende Oberfläche ist, das Erregungssignal Elektronen aufweist, das induzierte Signal Photonen aufweist und die Oberfläche zum Einfangen der Elektronen positiv aufgeladen ist.It is particularly advantageous if the surface has a conductive surface is, the excitation signal comprises electrons, the induced signal comprises photons and the surface for trapping the electrons is positively charged.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sollen in der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Figuren der Zeichnung erläutert werden. In den Zeichnungen ist Fig. 1 ein Schnitt durch ein in der Vorrichtung verwendetes Präparat mit einem Substrat mit einer in der monomolekularen Proteinschicht gebundenen zweiten Art biologischer Teilchen, Fig. 2 ein Schnitt durch ein Präparat mit an die zweiten biologischen Teilchen gebundenen dritten biologischen Teilchen, Fig.3A eine Ansicht einer Ausführungsform der Vorrichtung zur Uberprüfung des fertigen Substrats, ein Photonenzählsystem befindet sich in einem Abstand von dem Substrat, damit die anregenden Teilchen von der Metalloberfläche gegen das dunkle Gehäuse reflektiert werden, so daß alle darauf auftreffenden Photonen absorbiert werden, während zufolge dieser Reflexion ein verstärktes induziertes Signal vom Substrat zum Photonenzählsystem laufen kann, Fig. 3B eine perspektivische Ansicht eines Teiles der Vorrichtung von Fig. 3A. Hier ist eine Elektronenkanone 31 gezeigt. Das Substrat 30 wird mittels einer Metallbürste 33 positiv aufgeladen und auf konstanter Spannung gehalten. In Fig. 3B sind nur die Kontaktteile von Bürste 33 und Oberfläche 30 im Detail gezeigt. Die Rückwand des dunklen Aufnahmekastens 35 weist ein Loch 34 auf, durch das Licht auf die Metalloberfläche 30' gerichtet werden kann.Embodiments of the invention are intended in the following description will be explained with reference to the figures of the drawing. In the drawings Fig. 1 is a section through a preparation used in the device with a Substrate with a second type bound in the monomolecular protein layer biological particles, FIG. 2 a section through one preparation with the second biological particles bound third biological particles, Fig.3A a view an embodiment of the device for checking the finished substrate Photon counting system is located at a distance from the substrate so that the stimulating Particles from the metal surface are reflected against the dark housing, so that all photons hitting it are absorbed, while according to this Reflecting an amplified induced signal from the substrate to the photon counting system can walk 3B is a perspective view of part of FIG Apparatus of Figure 3A. Here an electron gun 31 is shown. The substrate 30 is positively charged by means of a metal brush 33 and at constant voltage held. In Fig. 3B only the contact parts of brush 33 and surface 30 are im Detail shown. The rear wall of the dark receiving box 35 has a hole 34, through which light can be directed onto the metal surface 30 '.
Fig. 4 ist ein Schnitt durch das Präparat von Fig. 2, der eine vierte Art biologischer Teilchen an die zweite Art, die wiederum an die erste Art gebunden ist, gebunden zeigt.Fig. 4 is a section through the preparation of Fig. 2, the fourth Kind of biological particles bound to the second kind, which in turn is bound to the first kind is bound shows.
Fig. 5 ist ein Schnitt durch das Präparat von Fig. 1, das die dritte Art biologischer Teilchen an die erste Art gebunden zeigt.Fig. 5 is a section through the preparation of Fig. 1, the third Shows kind of biological particles bound to the first kind.
Nachdem einige biologische Teilchen von Interesse (2. biologisches Teilchen) an die erste Schicht aus Protein gebunden sind, hat das Substrat den in Fig. 1 gezeigten Aufbau aus dem eigentlichen Substrat 10, der Metalloberflächenschicht 11, den ersten biologischen Teilchen 12 und den zweiten biologischen Teilchen 13. Ein biologisches Teilchen, wahrscheinlich der Antikörper des zweiten biologischen Teilchens, wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff verbunden.After some biological particles of interest (2nd biological Particles) are bound to the first layer of protein, the substrate has the in 1 from the actual substrate 10, the metal surface layer 11, the first biological particle 12 and the second biological particle 13. A biological particle, probably the antibody of the second biological Particle, is attached to a fluorescent dye.
Ein Tropfen einer Lösung dieses fluoreszierenden Antikörpers (drittes biologisches Teilchen) wird auf das Substrat, das bereits das zweite biologische Teilchen aufweist, wie in Fig. 1 gezeigt, aufgebracht. Dann wird das Substrat vorzugsweise so lange in einer Feuchtigkeitskammer gehalten, daß der fluoreszierende Antikörper mit dem zweiten biologischen Teilchen reagiert. Nach der Reaktion hat das Substrat den in Fig. 2 gezeigten Aufbau. Die Menge an gebundenem fluoreszierenden Antikörper 14 ist proportional der Menge an dem auf dem Substrat 30 anwesenden zweiten biologischen Teilchen. Das Präparat mit dem in Fig. 3 gezeigten Aufbau wird in ein geschlossenes Gehäuse mit einer Lichtquelle 31, die dem Induzieren einer Fluoreszenzemission von dem Substrat 30 dient, eingebracht. Das Photon von der Lichtquelle 31 wird nach Auftreffen auf dem Substrat 30, das eine reflektierende metallische Oberfläche hat, gegen die Wand des Gehäuses reflektiert und von ihr eingefangen, während das induzierte Signal von dem Photonenzählsystem 32, das der Messung der Quantität dieser Fluoreszenzemission dient, angezeigt wird. Da eine konstante Lichtquelle verwendet wird, ist das am Photonenzählsystem 32 angezeigte Signal proportional der Menge an fluoreszierendem Antikörper 14 an dem Substrat. Daher ist es bei Anwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung nicht notwendig, daß die biologischen Teilchen, damit sie bestimmt werden können, eine Schicht bilden. Die zweiten biologischen Teilchen werden an die erste oder Proteinschicht gebunden. Da die zweiten biologischen Teilchen keine Schicht bilden müssen, müssen diese ersten biologischen Teilchen nicht die ganze Schicht einnehmen. Daher braucht die erste Schicht aus Protein nicht von hoher Reinheit zu sein. Alles dies sind beträchtliche Vorteile gegenüber den US-Patentschriften 3 926 564 und 4 011 308.A drop of a solution of this fluorescent antibody (third biological particle) is on the substrate, which is already the second biological Has particles, as shown in Fig. 1, applied. Then the substrate is preferred kept in a humidity chamber for so long that the fluorescent antibody with the second biological Particle reacts. After the reaction the substrate has the structure shown in FIG. The amount of bound fluorescent Antibody 14 is proportional to the amount of the second present on substrate 30 biological particles. The preparation with the structure shown in Fig. 3 is in a closed housing with a light source 31, which induces a fluorescence emission from the substrate 30 is introduced. The photon from the light source 31 is after Striking the substrate 30, which has a reflective metallic surface, reflected against the wall of the enclosure and captured by it while the induced Signal from photon counting system 32 that measures the quantity of this fluorescence emission is used. Since a constant light source is used, this is am Photon counting system 32 displayed signal proportional to the amount of fluorescent Antibody 14 on the substrate. Therefore, when the device is used, it is in accordance with The invention does not require the biological particles to be determined in order for them can form a layer. The second biological particles are on the first or protein layer bound. Since the second biological particles do not have any Must form a layer, these first biological particles do not have to be the whole Take shift. Therefore, the first layer of protein does not need to be of high purity to be. All of these are considerable advantages over the US patents 3 926 564 and 4 011 308.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung aufgefangene Signal nicht von der Größe des biologischen Teilchens abhängt.Another advantage is that when the method is carried out signal collected according to the invention does not depend on the size of the biological particle depends.
Mit der Vorrichtung können beispielsweise sowohl große biologische Teilchen (vergleichbar den in der US-PS 3 853 467 genannten) als auch kleine biologische Teilchen (vergleichbar den in der US-PS 3 926 564 genannten) bestimmt werden.With the device, for example, both large biological Particles (comparable to those mentioned in US Pat. No. 3,853,467) as well as small biological ones Particles (comparable to those mentioned in US Pat. No. 3,926,564) can be determined.
Auch kleinere Teilchen, wie Steroidhormon und Polypeptide, können bestimmt werden. Der gebundene fluoreszierende Farbstoff kann (a) ein Fluorescein-derivat, üblicherweise Fluorescein-isocyanat (FIC) oder -isothiocyanat (FITC), (B) ein Rhodamin-derivat, üblicherweise Rhodamin-isocyanat oder -isothiocyanat, Lissamin-rhodamin-B 200-sulfonylchlorid (RB200XC) oder (C) 1-Dimethylaminonaphtalin-5-sulfonylchlorid (DANSC) sein. Diese Farbstoffe sind im Handel erhältlich (beispielsweise von der Baltimore Biological Lab), und auch einige Antikörper mit daran gebundenem fluoreszierendem Farbstoff sind im Handel erhältlich. Für verschiedene Farbstoffe werden zweckmäßig verschiedene Lichtquellen und verschiedene Photonenbestimmungsvorrichtungen verwendet. Die am stärksten intensivierte Lichtquelle ist der Laser. Es können aber auch Bogenlampen mit einer Wellenlängenselektiereinrichtung oder Wolframlampen mit einer Wellenlängenselektiereinrichtung zum Auswählen einer günstigen Wellenlänge verwendet werden. Die stark reflektierende Oberfläche des Substrats lenkt die anregenden Photonen von dem Photonenzählsystem 32 ab, so daß das induzierte Signal nicht von anregenden Photonen gestört wird. Je stärker die Vermischung von induziertem Signal und anregenden Photonen ist, desto größer ist die Störung. Je höher das Verhältnis Signal zu Störung ist, desto zuverlässiger sind die Testergebnisse. Unabhängig davon, was für eine Lichtquelle verwendet wird, ist für die Photonenbestimmungsvorrichtungeine Wellenlängenselektiereinrichtung erforderlich, um die Fluoreszenzemissionen weiter zu selektieren, da sie mit einer geringen Menge an anregenden Photonen gemischt sein kann, obwohl wegen der Verwendung der Reflektiereinrichtung das Verhältnis Signal zu Störung sehr groß ist. Die Wellenlängenselektiereinrichtung kann ein Monochromator oder ein Filter sein.Smaller particles, such as steroid hormones and polypeptides, can also to be determined. The bound fluorescent dye can (a) a fluorescein derivative, usually fluorescein isocyanate (FIC) or isothiocyanate (FITC), (B) a rhodamine derivative, usually rhodamine isocyanate or isothiocyanate, lissamine-rhodamine-B 200-sulfonyl chloride (RB200XC) or (C) 1-dimethylaminonaphthalene-5-sulfonyl chloride (DANSC). These Dyes are commercially available (for example from Baltimore Biological Lab), and also some antibodies with a fluorescent dye attached to them are commercially available. Different dyes are conveniently used for different dyes Light sources and various photon detection devices are used. The on the most powerful intensified light source is the laser. But it can also use arc lamps with a wavelength selection device or tungsten lamps with a wavelength selection device can be used to select a favorable wavelength. The highly reflective The surface of the substrate directs the stimulating photons from the photon counting system 32 so that the induced signal is not disturbed by stimulating photons. The stronger the mixing of the induced signal and stimulating photons, the more greater is the disturbance. The higher the signal-to-interference ratio, the more reliable it is are the test results. Regardless of what kind of light source is used, is a wavelength selector for the photon determination device required to reduce the fluorescence emissions to select further, since it can be mixed with a small amount of stimulating photons, though because of the use of the reflecting device, the signal-to-interference ratio is very big. The wavelength selector can be a monochromator or be a filter.
Das anregende Signal muß kein Photon sein. Es kann ein Neutronensignal sein, und das induzierte Signal kann Strahlung (bekannt als Neutronenaktivierungsanalyse) oder andere Strahlung sein.The stimulating signal need not be a photon. It can be a neutron signal and the induced signal can be radiation (known as neutron activation analysis) or other radiation.
Es können Elektronen oder andere geladene Teilchen sein, und das induzierte Signal kann die charakteristische Röntgenstrahlung sein, wenn das dritte biologische Teilchen mit spezifischen Elementen etikettiert ist. Beispielsweise kann eine Metalletikettierung durch Ferritin, das im Handel erhältlich ist, erfolgen, und das wirtschaftlichste geladene Teilchen kann ein Elektron sein. In diesem Fall wird die Metalloberfläche positiv aufgeladen und mit einer konstanten Spannung verbunden, wie in Fig. 3B gezeigt. Diese Metalloberfläche dient dann als die Elektronenfalle. Ein entsprechendes Photonenzählsystem kann verwendet werden, um das induzierte Signal von dem Eisenelement zu bestimmen.It can be electrons or other charged particles, and that induced Signal can be the characteristic X-ray radiation, if the third biological Particle labeled with specific elements. For example, metal labeling made by ferritin, which is commercially available, and the most economical charged particles can be an electron. In this case, the metal surface becomes positively charged and connected to a constant voltage as shown in Fig. 3B. This metal surface then serves as the electron trap. A corresponding photon counting system can be used to determine the induced signal from the iron element.
Die zu messende Menge an induziertem Signal kann durch Ändern der Menge an erregendem Signal manipuliert werden. Gemäß der Erfindung werden die anregenden Teilchen von dem Signalbestimmungssystem fortgelenkt, so daß das Signal verstärkt wird, ohne daß die Störung beträchtlich erhöht wird. In der Vorrichtung gemäß der Erfindung ergibt ein mit einer Metallschicht überzogenes Substrat ohne biologische Teilchen sehr wenige Störungsgeräuschzählungen. Das ist eine Verbesserung gegenüber den bekannten Vorrichtungen, die eine Emanation eines Signals von einer Quelle von konstantem Wert, der von der spezifischen Aktivität abhängt, verwenden. Auch wird die Emanation mit der Zeit geringer, manchmal bei sehr kurzer Halbwertszeit, und es ist daher schwieriger, damit zu arbeiten. Die Verwendung eines induzierten Signals ist ein beträchtlicher Vorteil gegenüber der US-PS 4 011 308.The amount of induced signal to be measured can be changed by changing the Amount of exciting signal can be manipulated. According to the invention, the stimulating Particles deflected away from the signal determination system so that the signal is amplified without increasing the disturbance significantly. In the device according to Invention results in a substrate coated with a metal layer without biological Particles very few interfering noise counts. That's an improvement over the known devices that emanate a signal from a source of constant value derived from depends on the specific activity. The emanation also decreases over time, sometimes with a very short half-life, and it is therefore more difficult to work with. The use of an induced Signal is a significant advantage over U.S. Patent 4,011,308.
Bei Verwendung eines induzierten Signals kann der natrliche Hintergrund gemessen werden, indem man das anregende Signal dafür abschaltet, d. h. die Abscheidung eines biologischen Teilchens zur Bildung eines speziellen Musters, wie es gemäß US-PS 4 011 308 erforderlich ist, ist nicht notwendig. Die Zählung außerhalb des Musters ist das, was unter dem natürlichen Hintergrund zu verstehen ist.When using an induced signal, the natural background be measured by switching off the stimulating signal for it, d. H. the deposition of a biological particle to form a special pattern, as in accordance with U.S. Patent 4,011,308 is not required. The count outside of the Pattern is what is meant by the natural background.
Durch die Verwendung der Vorrichtung wird es möglich, eine Spurenmenge an dem dritten biologischen Teilchen auf der Metalloberfläche zu bestimmen, d. h., es hat sich gezeigt, daß das dritte biologische Teilchen, um bestimmt zu werden, keine Schicht bilden muß. Auch das zweite biologische Teilchen oder das erste biologische Teilchen müssen keine Schicht bilden. Als die erste Schicht wurden teilweise gereinigte erste biologische Teilchen (beispielsweise nach Fällung mit Ammoniumsulfat) verwendet. Die geringe Menge an zweiten biologischen Teilchen ragen ebenso wie die dritten biologischen Teilchen aus der Metalloberfläche heraus. Das ist gegenüber der Verwendung von Schichten ein Vorteil, weil die Teilchen von Interesse in die Lösung hineinragen und dadurch die spezifische Reaktion erleichtern und die nicht spezifische Bindung verringern. Sowohl die Zeit zur Durchführung eines solchen Tests als auch die Menge an nicht spezifischer Bindung wird stark verringert. Weitere Vorteile des Verfahrens gemäß der Erfindung gegenüber den Verfahren der US-Patentschriften 4 011 308 und 3 926 564, bei denen die ersten, die zweiten oder die dritten biologischen Teilchen Schichten bilden, damit sie bestimmt werden können (Giaever Slides), sind: 1) Es ist nur eine sehr geringe Menge an ersten biologischen und zweiten biologischen Teilchen (etwa 1/1000 der von Giaever verwendeten) erforderlich, um einen Test durchzuführen. Die ersten biologischen Teilchen müssen nur teilweise gereinigt sein und können daher leichter erhalten werden und sind billiger.By using the device, it becomes possible to detect a trace amount to determine on the third biological particle on the metal surface, d. H., it has been shown that the third biological particle to be determined does not have to form a layer. Also the second biological particle or the first biological Particles do not have to form a layer. As the first layer were partially cleaned first biological particles (for example after precipitation with ammonium sulfate) are used. The small amount of second biological particles protrude just like the third biological particles out of the metal surface. That's opposite of using layers an advantage because the particles of interest protrude into the solution and thereby facilitate the specific response and non-specific binding to decrease. Both the time to conduct such a test and the amount of non-specific binding is greatly reduced. Other advantages of the process according to the invention over the methods of U.S. Patents 4,011,308 and 3,926,564 where the first, the second or the third biological Particles form layers so that they can be determined (Giaever Slides) are: 1) There is only a very small amount of first biological and second biological Particles (about 1/1000 of that used by Giaever) are required to run a test. The first biological particles only have to be and can be partially purified therefore are easier to obtain and are cheaper.
2) Einfluß der Gleichgewichtskonstante: Wenn die ersten biologischen Teilchen eine Schicht bilden, ist eine Bindung mit dem Metall erforderlich, damit diese Teilchen nicht in Lösung gehen, und um dies zu erreichen, ist eine große Menge an ersten biologischen Teilchen erforderlich. Wenn auch die zweiten biologischen Teilchen eine Schicht bilden, ist es die Bindung zwischen dem ersten und dem zweiten biologischen Teilchen, die verhindert, daß das zweite biologische Teilchen in Lösung geht. Für die Bildung einer Schicht aus dem zweiten biologischen Teilchen gibt es jedoch eine Mindestkonzentration an dem zweiten biologischen Teilchen in der Lösung, unter der dieses zweite biologische Teilchen keine Schicht bilden kann. Dadurch wird die Genauigkeit des Testergebnisses stark vermindert. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung gibt es keine Schicht aus den zweitenbiologischen Teilchen. Auch die Menge an ersten biologischen Teilchen in der Proteinschicht kann mit dem Grad der Reinigung oder des Zusatzes verschiedener Mengen an inertem Protein wie BSA variieren. Die beste Auflösung ist sehr viel empfindlicher, und ihre Grenzen hängen von der Menge an dritten biologischen Teilchen, die noch genau gemessen werden kann, ab.2) Influence of the equilibrium constant: When the first biological Particles forming a layer require a bond with the metal in order for it these particles do not go into solution, and to achieve this is a large amount of the first biological particles required. Even if the second biological one Particles form a layer, it is the bond between the first and the second biological particle, which prevents the second biological particle from being in solution goes. For the formation of a layer from the second biological particle there is however, a minimum concentration of the second biological particle in the solution, under which this second biological particle cannot form a layer. Through this the accuracy of the test result is greatly reduced. In the procedure according to According to the invention there is no layer of the second biological particles. Also the Amount of first biological particles in the protein layer can vary with the degree of Purification or the addition of different amounts of inert protein such as BSA will vary. The best resolution is much more sensitive, and its limits depend on the Amount of third biological particles that can still be measured accurately.
Die in Fig. 3A gezeigte Vorrichtung, die im folgenden besprochen wird, ist der Schlüssel für die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung. Das wesentlichste Merkmal der in Fig. 3A gezeigten Vorrichtung ist das metallische Substrat. Im Weg des anregenden Photons, das von der Lichtquelle 32 ausgeht und an der Wand des dunklen Gehäuses endet, darf sich nichts befinden als die stark reflektierende metallische Oberfläche und die biologischen Teilchen darauf. Wenn der Einfallswinkel gleich dem Reflexionswinkel ist und das Signalbestimmungssystem senkrecht zu dem Substrat und in einigem Abstand davon angeordnet ist, wird das anregende Teilchen nicht auf das Bestimmungssystem zu gestreut. Auch kann die Form des Gehäuses so gewählt werden, daß sein Einfangvermögen erhöht wird, so daß fast alle anregenden Teilchen, die gegen die entsprechend ausgebildete Falle reflektiert werden, dort abgebremst werden und nicht zu dem Signalzählsystem gelangen. Das induzierte Signal, das von dem dritten biologischen Teilchen ausgeht, nachdem das anregende Teilchen absorbiert ist, kann in jeder Richtung ausstrahlen, und ein Teil davon, der von der Sammelöffnung des Photonenzählsystems abhängt, gelangt zu dem Photonenzählsystem. Wegen der stark reflektierenden metallischen Oberfläche werden auch diejenigen induzierten Photonen, die direkt in eine Richtung entgegengesetzt von dem Photonenzählsystem abgestrahlt werden, zurückreflektiert und treten in das Photonenzählsystem ein.The device shown in Fig. 3A, which will be discussed below, is the key to the application of the method according to the invention. The most essential characteristic of the device shown in Fig. 3A is the metallic one Substrate. In the path of the stimulating photon emanating from the light source 32 and ends on the wall of the dark case, there must be nothing but the strong reflective metallic surface and the biological particles on it. if the angle of incidence is equal to the angle of reflection and the signal determination system is arranged perpendicular to the substrate and some distance therefrom, the stimulating particles are not scattered towards the determination system. Also can the shape of the housing can be chosen so that its capture capacity is increased, so that almost all stimulating particles that are reflected against the appropriately designed trap are slowed down there and not reach the signal counting system. That induced Signal emanating from the third biological particle after the exciting one Particle is absorbed, can radiate in any direction, and part of it, which depends on the collection opening of the photon counting system, arrives at the photon counting system. Because of the highly reflective metallic surface, those are also induced Photons traveling directly in a direction opposite from the photon counting system are emitted, reflected back and enter the photon counting system.
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist speziell für ein stark reflektierendes Substrat ausgebildet, und es ist nicht wesentlich, daß es ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat ist. Jedoch ist ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat eines der zweckmäßigsten.The device according to the invention is especially for a highly reflective Substrate and it is not essential that it be coated with a metal coating provided substrate is. However, it is a metal coated substrate one of the most functional.
Aber auch beispielsweise ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat, das noch eine dünne Schicht aus einem Gel aufweist, ist ein gutes Substrat. Auch ist es nicht von entscheidender Bedeutung, daß die daran gebundenen Moleküle Proteinmoleküle sind. Vielmehr kann die Vorrichtung auch für andere Moleküle oder dünne Gewebeschnitte und andere Dinge, die durch Trocknen, chemische Umsetzung, Adhäsion, Bindung oder andere Maßnahmen zur Bindung an ein solches stark reflektierendes Substrat gebracht sind, verwendet werden.But also, for example, a substrate provided with a metal coating, that still has a thin layer of gel is a good substrate. Even is not it vital that those tied to it Molecules are protein molecules. Rather, the device can also be used for other molecules or thin tissue sections and other things that can be caused by drying, chemical conversion, Adhesion, bonding, or other means of bonding to such a highly reflective one Substrate are brought to be used.
In der Vorrichtung gemäß der Erfindung kann auch für eine trockene Probe, wie im vorliegenden Fall, eine Lichtquelle sehr hoher Intensität verwendet werden. Die stark reflektierende Metalloberfläche bewirkt, daß es zu einer nur sehr geringfügigen Photonenabsorption (die in Wärme umgewandelt wird) kommt, so daß auch die Wahrscheinlichkeit eines Ausbleichens oder einer Beschädigung der Probe sehr gering ist. Daher kann sogar ein Laser als Lichtquelle verwendet werden. Dies sind beträchtliche Vorteile gegenüber den US-Patentschriften 4 056 724 und 4 036 946.In the device according to the invention can also be used for dry Sample, as in the present case, uses a very high intensity light source will. The highly reflective metal surface causes it to be just a very minor photon absorption (which is converted into heat) comes so that too the likelihood of fading or damage to the specimen is very high is low. Therefore, even a laser can be used as a light source. these are significant advantages over U.S. Patents 4,056,724 and 4,036,946.
Es gibt verschiedene Wege zur Bindung der ersten biologischen Teilchen an das Substrat. Für ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat kann die erste Stufe in einem Eintauchen bestehen, und auch für die Bindung der zweiten biologischen Teilchen an die ersten biologischen Teilchen und für die Bindung der dritten biologischen Teilchen an die zweiten biologischen Teilchen (die ersten biologischen Teilchen in Fig. 5) kann in gleicher Weise vorgegangen werden. Um den Test zu beschleunigen, kann die Probe auf dem Substrat getrocknet werden. Um die nichtspezifische Bindung zu senken, kann ein Eintrocknen der Lösung dadurch verhindert werden, daß man das Substrat in einer Feuchtigkeitskammer hält. Die Vorrichtung und das Verfahren gemäß der Erfindung können jedoch in vielfacher Weise modifiziert werden. Beispielsweise kann die Probe in ein kleines Rohr eingebracht werden, um den Kontakt mit dem Substrat auf ein kleines Gebiet zu begrenzen; oder das Volumen der Lösung der Probe kann dadurch vergrößert werden, daß ein Becher verwendet wird. In jedem Fall ist es wesentlich, daß das fertige Substrat gewaschen wird. Da die Metalloberfläche die erste biologischen Teilchen bindet, die ersten biologischen Teilchen die zweiten biologischen Teilchen binden usw., wird durch Waschen die nichtspezifische Bindung, nicht jedoch die durch die spezifische Reaktion erfolgte Bindung gelöst. Bei Substraten aus Glas, Plastik oder vielen anderen Materialien, erfolgt dagegen keine Bindung zwischen ersten biologischen Teilchen und Substrat, und durch Waschen kann daher die durch die spezifische Reaktion erfolgte Bindung gelöst werden, während andererseits bei Unterlassung des Waschens die durch nichtspezifische Reaktion erfolgte Bindung an das Substrat erhalten bleibt und daher eine quantitative Messung unmöglich wird.There are different ways of binding the first biological particles to the substrate. For a metal coated substrate, the first Stage consist in an immersion, and also for the binding of the second biological Particles to the first biological particle and for the binding of the third biological Particle to the second biological particle (the first biological particle in Fig. 5) can be proceeded in the same way. To speed up the test, the sample can be dried on the substrate. To the non-specific binding the solution can be prevented from drying out by using the Keeps substrate in a humidity chamber. The device and the method according to However, the invention can be modified in many ways will. For example, the sample can be placed in a small tube to make contact with the substrate confined to a small area; or the volume of the solution the sample can be enlarged by using a beaker. In each In this case, it is essential that the finished substrate is washed. As the metal surface the first biological particle binds, the first biological particle binds the second bind biological particles, etc., the non-specific binding, however, the binding effected by the specific reaction was not released. With substrates made of glass, plastic or many other materials, on the other hand, there is no binding between first biological particles and substrate, and by washing can therefore the binding effected by the specific reaction can be broken, while on the other hand if washing is omitted, the binding caused by non-specific reaction remains on the substrate and therefore a quantitative measurement becomes impossible.
Außerdem sind solche Substrate nicht stark reflektierend und ergeben daher in der Vorrichtung gemäß der Erfindung keine gute Auflösung.In addition, such substrates are not highly reflective and made therefore not a good resolution in the device according to the invention.
Um die quantitative Bestimmung bei einem Test zu verbessern und die Umsetzung klar erkennbar zu machen, werden zweckmäßig in einer Serie von Tests Substrate mit gleicher Fläche und gleicher Menge an Lösung der Probe verwendet.To improve the quantitative determination in a test and the To make implementation clearly recognizable, substrates are expedient in a series of tests used with the same area and the same amount of solution of the sample.
Die Absorptions- und Emissionsspektren der meisten fluoreszierenden Verbindungen, die zur Einfärbung von Protein verwendet werden, sind von Hansen PA (1964) (Publikation der University of Maryland, College Park, Maryland) zusammengestellt.The absorption and emission spectra of most fluorescent Compounds used to stain protein are from Hansen PA (1964) (publication of the University of Maryland, College Park, Maryland).
Die Peakwellenlänge des zu verwendenden Filters oder Monochromators wird zweckmäßig unter Verwendung dieser Angaben ausgewählt. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung eines im Handel erhältlichen (Oriel Corporation) Engbandinterferenzfilters mit einer Transmission außerhalb eines Durchlässigkeitsbereiches von 0,01 % nicht genügt, um eine Spurenmenge an dritten biologischen Teilchen auf dem Substrat zu bestimmen, weil das Störgeräusch des Instruments (zur Ablesung einer blanken Metalloberfläche) noch hoch ist.The peak wavelength of the filter or monochromator to be used is appropriately selected using this information. However, it was found that the use of a commercially available (Oriel Corporation) narrow band interference filter with a transmission outside a transmission range of 0.01% not sufficient to leave a trace amount of third biological particles on the substrate because the background noise of the instrument (for reading a bare metal surface) is still high.
Bei Verwendung von zwei solchen Engbandfiltern als Gruppe als Filter sowohl für das anregende als auch für das induzierte Signal wird die Auflösung sehr gut und das Störgeräusch des Instruments nicht wahrnehmbar.When using two such narrow band filters as a group as a filter for both the exciting and induced signals, the resolution becomes great good and the noise of the instrument imperceptible.
Nach Hansen sind sowohl die Absorptions- als auch die Emissionsbande sehr breit und werden noch breiter, wenn eine Bindung an eine Metalloberfläche gemäß der Erfindung erfolgt ist. Die genaue Peakwellenlänge dieser Engbandinterferenzfilter ist nicht wesentlich. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung von zwei Filtern als Gruppe besser geeignet ist, um die gleiche Peakwellenlänge und Bandbreite zu haben.According to Hansen, both the absorption and emission bands are very wide and become even wider when bonded to a metal surface according to the invention has occurred. The exact peak wavelength of these narrow band interference filters is not essential. However, it has been found that the use of two filters as a group is better suited to the same peak wavelength and bandwidth to have.
Wenn als Lichtquelle ein Laser verwendet wird, muß kein Filter für das anregende Signal verwendet werden. Monochromatoren eignen sich ausgezeichnet zur Wahl des anregenden Signals, insbesondere wenn Lichtquellen hoher Intensität verwendet werden.If a laser is used as the light source, there is no need for a filter for the stimulating signal can be used. Monochromators are excellent to choose the stimulating signal, especially when light sources are high intensity be used.
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