DE3021259A1 - Mit amidopyrin verbessertes trinder-reagens und verfahren zur quantitativen bestimmung mit diesem reagens des wasserstoffperoxids zur enzymatischen oxidation von stoffwechselprodukten - Google Patents

Description

ELVI S.p.A.

Piazzale Giulio Cesare 14

1-20 100 Milano

Mit Amidopyrin verbessertes Trinder-Reagens und

quantitatxven Bestimmung Verfahren zur / mit diesem Reagens des Wasserstoffperoxids zur enzymatischen Oxidation von StoffWechselprodukten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mit Amidopyrin (4~Dimethylamino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on) mo~

BeStimmung difiziertes Trinder-Reagens und auf eine Methode zur quantitativen/ des Wasserstoffperoxids, das sich durch enzymatisehe Oxidation aus speziellen Stoffwechselprodukten durch die Verwendung dieses verbesserten Trinder-Reagenses bildet.

Die Trinder-Reaktion (Ann. Clin. Biochem. 6,24 (1969)) wird im Bereich der klinischen Chemie in großem Umfang benutzt, um das Wasserstoffperoxid quantitativ zu bestimmen, daa sich aus bestimmten Substraten unter der Einwirkung verschiedener Oxidasen (Glucoseoxidase, Cholesterinoxidase, üricase, Ct-Glycerinphosphatoxidase, Cholinoxidase) bildet. In der Praxis bildet das offenbarte System in Verbindung mit der enzymatischen Oxidationsreaktion biologische Stoffwechselprodukte von bemerkenswerter diagnostischer Bedeutung, wie Glucose, Cholesterin, Harnsäure und Triglyceride.

Im besonderen wird das nach Trinder bekannte Chromogensystem bestehend aus Phenol und 4-Aminophenazon (4-Amino-l,5-dimethyl-2-phenyl-3-pyrazolon) in Gegenwart von Peroxidasen durch Wasserstoffperoxid oxidiert und erzeugt eine rote Chinonimin-Verbindung,

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deren Farbintensität ein indirektes Maß für die Menge der Stoffwechselprodukte (Glucose, Cholesterin, Harnsäure) darstellt, die sich in der zu untersuchenden Probe befinden.

Die Trinder-Reaktion wird jedoch durch Substanzen endogenen (Bilirubin, Haemoglobin) und exogenen Ursprungs (Arzneimittel) gestört.

Vor allem bildet das Bilirubin, ein StoffWechselprodukt des "Häms" (Ferro-Protoporphyrin), eine sichere Störquelle insofern, als es ein alternatives Substrat für das Oxidationssystem Wasserstoffperoxid/Peroxidase ist (vgl. Jacobsen, J., und Wennberg, R.P., Clin.Chem. 20, 783 (1974)) und ist immer in wechselnden Konzentrationen zwischen 0,6 und 1,2 mg/100 ml in den normalen menschlichen Seren und zwischen 3,0 und 30 mg/100 ml in den menschlichen Seren bei Hyperbilirubinämie anwesend.

Derartige Störungen durch Bilirubin in den Chromogensystemen vom Trinder-Typ sind untersucht worden von Fossati - L. Prencipe Quad.Sclavo Diagn. 14, 164 (1978) und Witte, D.L., Brown, L.F. u.a. Clin.Chem. 24, 1779 (1978), die verschiedene Lösungen vorgeschlagen haben, um sie zu vermeiden.

Bestimmung Die Bilirubin-Störung ist besonders merkbar bei der quantitativen/ nach der Trinder-Methode der Serum-Harnsäure, wo die Konzentration dieses Stoffwechselprodukts besonders niedrig ist (2,5 bis 7,5 mg/100 ml), d.h. mehr als zehnmal niedriger als diejenige der Glucose, die ebenfalls nach der Trinder-Methode bestimmbar ist.

Dies bedeutet, daß für die Glucose, bei einem Verdünnungsverhältnis Serum/Reagens von 1 : 150, Absorptionsfähigkeiten bis 500 nm erhalten werden, welche ohne weiteres für die routinemäßige photometrische Ablesung geeignet sind. Um die gleichen Absorptionsfähigkeitswerte zu erhalten und damit die gleiche Empfindlichkeit bei der / der Harnsäure mit dem "Trinder-Reagens", quantitativen Bestimmung

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wäre es notwendig, Verdünnungsverhäitnisse Serum/Reagens von 1 : 15 zu verwenden. Unter diesen Bedingungen wird jedoch die Störung durch Bilirubin so bestimmend/ daß eine genaue Quantisierung der Harnsäure verhindert wird zum Unterschied von dem, was sich bei der Bestimmung der Glucose feststellen läßt, bei welcher die Bilirubinstörung wegen des hohen VerdünnungsVerhältnisses des Serums vernachlässigbar ist.

Zur Vermeidung dieses ernsten Nachteils haben Barham D. und Trlnder (P., Analyst 97, 142 (1972)) vorgeschlagen, das Phenol durch 2-4Dichlorphenolsulfonat zu ersetzen. Diese erhalten auf diese Welse ein Chromophor, das viermal intensiver ist als das normale Trinder-Reagens, was ermöglicht, auf ein Verdünnungsverhältnis Serum/Reagens von 1 : 40 überzugehen und damit auf eine Minderung, wenn auch noch nicht zu einer Beseitigung, der Bilirubinstörung überzugehen.

Nach und nach wurden verschiedene Veirfahren zur Beseitigung der Bilirubinstörung vorgeschlagen.
Wir zitieren im besonderen:

a) die Dialyse des Musters unter Beseitigung der Proteine und des Bilirubins (Klose, S., Stolz, M., Münz, E et al., Clin. Chem. 24, 250 (1978)). Dieses System hat jedoch den Nachteil, daß es nur auf Analysatoren mit kontinuierlichem Fluß anwendbar ist, die über eine geeignete Dialysegruppe verfügen;

b) die Oxidation des Bilirubins und Biliverdins oder mit Kaliumeisenzyanid (Prenzipe, L., Fossati, P. et aiii, Quad.Sclavo Diagn. 14, 383 (1978)) oder mit Äthylenperoxid/peroxidase (Peracino, A/, Zoppi, F. et alii - Uric Acid assay: methods using uricase peroxidase-chromogen and uricase-catalasealdeyde dehydrogenase-NSD ;

dieses System hat jedoch den Nachteil, daß es die Durchführung einer Blanko-Prüfung (prova in bianco) für jedes zu analysierende

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Muster wegen des niedrigen Verdünnungsverhältnisses Serum/Reagens erfordert.

Weitere Untersuchungen mit dem Ziel, das analytische Verfahren weniger mühevoll zu machen und um die vorerwähnten Nachteile zu vermeiden, waren auf die direkte Bestimmung der verschiedenen StoffWechselprodukte, insbesondere der Harnsäure, gerichtet. So wurde vorgeschlagen:

c) die Oxidation des Ferrozyanids zu Ferricyanid mit dem System Wasserstoffperoxid/Peroxidase, um auf diese Weise die Störwirkung des Bilirubins zu blockieren.

Im Verlauf der Untersuchungen in diesem Zusammenhang wurde nun entdeckt, daß erfindungsgemäß es möglich ist, in beträchtlichem Maße die Störung durch Bilirubin bei der Trinder-Reaktion auszuschalten, insbesondere bei der Anwendung auf die Analysen der Harnsäure durch Modifizieren des Trinder-Reagens durch Einverleibung von Amidopyrin in erhöhter Konzentration neben den

quantitatxve

verschiedenen Bestandteilen, welche für die enzymatische / Bestimmung , . ,

/ der Harnsäure mit dem modifizierten chromogenen Trinder-

System vorgesehen sind. Es wurde in der Tat experimentell festgestellt, daß die Gegenwart des Amidopyrins in hoher Konzentration mit bezug auf die Konzentration des 4-Aminophenazons des Bilirubins und des Wasserstoffperoxids eine grundsätzliche Rolle insofern spielt, als es die Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid, das sich bei der Oxidation der Harnsäure (als Substrat) unter der Wirkung der Ureatoxydase und dem Bilirubin (frei und und konjugiert) infolge der Massenwirkung auf das Gleichgewicht der Trinder-Reaktion bildet. Dies ist dadurch bedingt, daß das Amidopyrin direkt an der Trinder-Reaktion teilnimmt unter Bildung mit dem 2-4 Dichlorphenolsulfonat und dem Wasserstoffperoxid eines Chromophors, dessen Farbe nur leicht weniger intensiv als diejenige ist, die aus der Reaktion zwischen 4-Aminophenazon/2-4 Dichlorphenolsulfonat/Wasserstoffperoxid resultiert. In der Praxis kommt es vor, daß das ganze Wasserstoffperoxid im Augenblick

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seiner Entstehung vollständig durch das Trinder-System mit dem Amidopyrin und dem 4-Aminophen.a.:on in Anspruch genommen wird, so daß die Störwirkung des Bi irubins vollständig aufgehoben wird.

Im besonderen hat sich hinsichtlich der Konzentration des Amidopyrins experimentell ergeben, daß eine wirksame Konzentration desselben zwischen 1 und 30 g/l liegt und vorzugsweise bei etwa 15 g/l.

Es wurde ausserdem bei der experimentellen Forschung für die praktische Durchführung der Erprobung wegen der Harnsäure in den biologischen Proben (Serum od. dgl.) mit dem erfindungsgemäß modifizierten Trinder-Reagens unter Zusatz von Amidopyrin gefunden, daß es eine unerläßliche Bedingung für ihre Durchführung ist, daß die katalytischen Wirkungen der Enzyme und die Konzentrationen der verschiedenen Komponenten, die bei der Reaktion in Wirkung treten, auf den folgenden optimalen Werten gehalten werden:

Peroxidase 2000 Einh./l

2,4-Dichlorphenolsulfonat

-Natriumsalζ 1 g/l

einbasisches Kaliumphosphat (KH-PO.) 18 g/l

Natriumtetraborat (Na₂B₄O₇-IO H₂O) 13,9 g/l

4-Aminophenazon 260 mg/1

Amidopyrin 15 g/l

üricase - Aspergillus flavus 100 Einh./l

Ausserdem ist das Verhältnis von Serum zu Farbreagens 1/40, und die spektrofotometrische Dosierung des Reaktionsproduktes wird bei 500 bis 250 nm vorgenommen.

Es wurden Gegenproben mit und ohne Amidopyrin folgend der Entwicklung der chromogenen Reaktion am Spektralfotometer mit Anzeigegerät durchgeführt, was ermöglicht hat, die Störung des

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Bilirubins in Mustern zu vermeiden, die 11,6; 14,82; 15,30; 16 und 18 mg Bilirubin/100 ml enthie'lten, da bei 430 nm sich eine Spitze negativer Absorption bildet, die durch die Oxidation des Bilirubins durch das Wasserstoffperoxid bedingt ist. Es läßt sich in der Tat feststellen, daß in Gegenwart von Amidopyrin diese negative Absorptionsspitze eine wesentliche Herabsetzung (65 - 90 %) erfährt.

Zur besseren Erläuterung der Erfindung werden nachfolgend einige VergleichsbeisDiele gebracht, aus denen sich der Vorteil

, .quantitativen Bestimmung der Verwendung des Amidopyrins bei aer / der Harnsaure ergibt, ausgeübt in Hyperbilirubinämie-Mustern mit dem Trinder-Reagens zugesetzt mit Amidopyrin oder in Abwesenheit desselben, wobei die Differenz zwischen der Harnsäurekonzentration in den beiden Fällen hervorgehoben ist.

Beispiele

Differenz zwischen den beiden Harnsäurekonzentrationen

1 BILIRUBIN: 15,3 mg/dl ermittelte Harnsäure

6,7 mg/dl ohne Amidopyrin 9,3 mg/dl mit Amidopyrin

+ 3+38 %

2 BILIRUBIN: 11,6 mg/dl ermittelte Harnsäure

6,5 mg/dl ohne Amidopyrin .0,7 mg/dl mit Amidopyrin

+ 64,6 %

3 BILIRUBIN: 16 mg/dl ermittelte Harnsäure^

7.1 mg/dl ohne Amidopyrin

9.2 mg/dl mit Amidopyrin

+ 39,4 %

4 BILIRUBIN: 14,82 mg/dl ermittelte Harnsäure:

6,5 mg/dl ohne Amidopyrin 9,2 mg/dl mit Amidopyrin

+ 41,53 %

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BILIRUBIN: 18 mg/dl

Jl₁O mg/dl ohne Amidopyrin

ermittelte Harnsäure^"^ + 55 %

1 mg/dl mit Amidopyrin

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uipiom Ingenieure

D-8023 Munchen-Pullach. Wiener Str 2 Tel. (089) 7^93 30 ⁷J. Tele* P °.¹2 147 Br-/-, d; Cab'es «Patentitius·· München

ELVI S.p.Α., Pjazzale Giulio Cesare 14, 1-20 100 Milano

Ihr Zeichen: Tag: 4. Juni 198θ

Yourref Date:

1) Die mit der Anmeldung und im Laufe des Verfahrens eingereichten Patentansprüche sind Pormulierungsversuche ohne Präjudiz für die Erzielung weitergehenden Patentschutzes .

2) In Unteransprüchen verwendete Rückbeziehungen weisen auf die weitere Ausbildung des Gegenstandes des Hauptanspruches durch die Merkmale des jeweiligen Unteranspruches hin; sie sind nicht als ein Verzicht auf die Erzielung eines selbständigen,gegenständlichen Schutzes für die Merkmale der rückbezogenen Unteransprüche zu verstehen.

3) Die Anmelderin behält sich vor, noch weitere, bisher nur in der Beschreibung offenbarte Merkmale von erfindungswesentlicher Bedeutung zu beanspruchen; insbesondere beabsichtigt die Anmelderin, auf in den Unterlagen etwa offenbarteneue Stoffe Stoffansprüche zu richten.

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Claims (2)

FHTENMNH^LTE K""A BROSEDKa BROSE D-8023 Munchen-Pullach. Wiener Sir 2; Tel (039) 7 S3 30 71; Telex 3 212.147.bros ji; Qabl^: -Patentibus- München ELVI S.p.A. Piazzale Giulio Cesare 14 1-20 100 Milano Ihr Zeichen: Your ret: Tag: .4, Juni 1980 Date: Patentansprüche ;

1. Verbessertes Trinder-Reagens für klinische Analysen von Wasserstoffperoxid durch enzymatische Oxidation von StoffWechselprodukten/

dadurch gekennzeichnet, daß es neben den bekannten Komponenten Amidopyrln in einer Konzentration zwischen 1 und 30 g/l, vorzugsweise etwa 15 g/l enthält.

2. Verbessertes Trinder-Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich aus folgenden Bestandteilen zusammensetzt:
Peroxidase

2,4-Dichlorphenolsulfonat-Natriumsalz

einbasisches Kaliumphosphat

Natriumtetraborat (Na₂B₄O₇-IO H₂O)

4-Aminophenazon

Amidopyrin

üricase - Aspergillus flavus

Einh./l

1 g/l 18 g/l 13,9 g/l mg/1 15 g/l Einh./l.

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ORIGINAL INSPECTED

'J.

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei der enzymatischen Oxidation von Stoffwechselprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß das verbesserte Trinder-Reagens nach den Ansprüchen 1 und 2 angewandt wird, wobei ein Verhältnis von Serum zu Farbreagens wie 1 : 40 eingehalten wird, und daß die spektralphotometrische quantitative Bestimmung des Reaktionsprodukts bei 500 bis 520 mm vorgenommen wird.

Labordiagnostikum, das nach den Ansprüchen Λ bis 3 modifizierte Trinder-Reagens enthält.

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