DE3012368C2

DE3012368C2 - Verfahren und diagnostische Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen

Info

Publication number: DE3012368C2
Application number: DE3012368A
Authority: DE
Inventors: Laszlo Köver; Walter Dr.Rer.Nat. Rittersdorf; Wolfgang Dr.Rer.Nat. 6800 Mannheim Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1980-03-29
Filing date: 1980-03-29
Publication date: 1982-04-15
Also published as: EP0037056B1; ZA812059B; JPS56151358A; MY8600707A; AU6864981A; HK82686A; US4957872A; CA1155737A; JPH024861B2; DD157834A5; EP0037056A1; DE3160405D1; SG38686G; DE3012368A1; ATE3726T1; US4743559A; AU538332B2; CS231174B2; CS227181A2

Description

— Oxidation mit Jodlösung und Entfernung des überschüssigen Jods mit Thiosulfat,

— Oxidation mit Mangandioxid und Abfiltrieren des nicht verbrauchten Oxidationsmittels,

— Oxidation mit alkalischem H2O2,

— Behandlung der Probelösung mit Anionenaustauscher.

Alle diese Verfahren erfordern eine umständliche Behandlung der Probenlösung. Des weiteren ist insbesondere bei Schnelldiagnostica eine integrierte Problemlösung sehr aufwendig. Es sind auch Testpapiere bekannt, bei denen Urin zuerst durch eine Zone mit Anionenaustauscher (DE-AS 15 98 008) chromatographieren muß, um dann bei Weiterlaufen auf die eigentliche Reagenzzone ungestört reagieren zu können. Tests mit lonenaustauscherbezirken sind für

Glucose und Galactose handelsüblich. Sie weisen einen komplizierten Aufbau auf, und durch die erforderliche Chromatographierzeit wird die Analysenzeit im Vergleich zu herkömmlichen Schnelltesten erheblich gesteigert.

Eine weitere Möglichkeit zur Entfernung von Ascorbinsäure aus Flüssigkeiten bzw. der Entstörung von diagnostischen Mitteln beruht auf dem Zusatz von Ascorbatoxidase in optischen Tests und Schnelldiagnostica (DE-AS 26 25 834).

Obwohl dieses Verfahren besonders bei kleinen Ascorbinsäure-Konzentrationen brauchbar ist, kann das Problem als Ganzes nicht als gelöst betrachtet werden, und zwar aus folgenden Gründen:

— Ascorbatoxidase reagiert nur mit Ascorbinsäure selbst, nicht jedoch mit Metabolite·! wie dem Glucuronid und dem Sulfat so'vie anderen Reduktionsmitteln.

— Die Oxidation von Ascorbinsäure durch Ascorbatoxidase ist relativ langsam, so daß bei Testflüssigkeiten, die mehr als 100 mg Ascorbinsäure/dl enthalten können, unwirtschaftlich große Mengen Ascorbatoxidase eingesetzt werden müssen, um ein vernünftiges Ausmaß an Entstörung zu gewährleisten.

— In bestimmten Fällen wird das Enzym Ascorbatoxidase durch aggressive Reagenzien relativ schnell zerstört. So muß z. B. das in einem Harn-Blut-Test verwendete Cumolhydroperoxid in Mikrokapseln eingeschlossen werden(US 41 29 417).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren und diagnostische Mittel, insbesondere Schnelldiagnostica zu entwickeln, die nicht durch Ascorbinsäure und ihre Metaboliten gestört sind, auch wenn diese in relativ großen Mengen vorhanden sind.

Die Lösung dieser Aufgabe ist für ein Verfahren im Anspruch 1 und für ein diagnostisches Mittel im Anspruch 7 gekennzeichnet.

Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den Ansprüchen 2-6 für das Verfahren und aus den Ansprüchen 8 - 13 für das diagnostische Mittel.

Es muß als überraschend angesehen werden, daß Jodat zwar die Ascorbinsäure hinreichend schnell oxidiert, nicht jedoch die in der klinischen Chemie wichtigen Substrate, ferner viele der in der Analytik gebräuchlichen Redox-Indikatoren und ihre jeweiligen farbigen Reaktionsprodukte sowie übliche Hilfsstoffe. So werden beispielsweise unter den üblichen Analysenbedingungen (pH 5 — 9) und innerhalb der üblichen Analysenzeiten von Jodat nicht angegriffen:

— Substrate:

Kohlehydrate (Glucose, Galactose u. a.), Cholesterin, Glycerin (aus Triglyceriden), Harnsäure, NADH und NADPH etc.

- Peroxidasen:

Meerrettichperoxidase, Hämoglobin (Blut).

- Hüfsstoffe:

-, Arylsemicarbazide, die als Stabilisatoren von

Oxidationsindikatoren beschrieben sind (DE-OS 27 16 060).

Daß diese Eigenschaft des Jodats überraschend ist in und nicht etwa aus dem Oxidationspotential abgeleitet werden kann, zeigt ein Vergleich mit anderen Halogen-Verbindungen. Deren Standardpotentiale betragen laut Cotton-Wilkinson, »Anorganische Chemie«, Weinheim 1970.2. Auflage, S. 532:

Γι

- Jodat+0,."6V

- Perjodat + 0,39 V

- jod+0,54V

- Bromat f 0,61 V
:n - Chloral + 0,63 V

Während nun Perjodat und freies Jod neben Ascorbinsäure die meisten Indikatoren, vor allem die Benzidinabkömmlinge, oxidieren, sind Bromai und Chloral trot/ ihrer höheren Oxidationspotentiale nicht in der lage. Ascorbinsäure zu oxidieren und sind somit für den angestrebten Zweck völlig unbrauchbar. Auch von Joda^en wurde bisher angenommen, daß sie Ascorbinsäure nur in essigsaurer Lösung oxidieren (R.

so Indovina, D. Elia, BoIl. Soc. hai. Biol. sperm. 20,390 - 393 [1945], C. A. 40,6110 [»946]).

Erfindungsgemäße, durch Ascorbinsäure praktisch nicht gestörte Schnelldiagnostica sind einfach herzustellen, indem man den Rezepturen an sich bekannter Tests ein Jodat zumischt. Solche Tests sind z. B.:

Substratoxidasen:

Glucoseoxidase, Galactoseoxidase, Chole sterinoxidase, Glycerinoxidase, Uricase etc.

Indikatoren:

Benzidinabkömmlinge (o-Tolidin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin), heterocyclische Azine (Azino-bis-benzo-thiazolon-sulfonsäure), Formazane als Reduktionsprodukte von Tetrazoliumsalzen etc.

— Testpapiere zum Nachweis von Blut im Harn mit organischen Hydroperoxiden und o-Tolidin (DE-OS 22 35 152, DE-OS 2640211, DE-OS 12 42 905) und Tetramelhylbenzidin (DE-OS 24 60 903, DE-OS 27 16 060).

— Testpapiere zum Nachweis von Glucose im Harn mit GOD, POD und o-Tolidin (DE-OS 24 15 257, DE-AS 11 21 847, OE-PS 1 98 896), 3,3',5,5'-Tetra-

4-, methylbenzidin (DE-OS 24 60 903), substituierten Aminocarbazolen (DE-OS 22 05 733, DEOS 23 38 932) und heterocyclischen Azinen (DE-OS 16 48 840).

— Testpapiere zum Nachweis von Galactose im Harn mit Galactose-OD, POD und o-Tolidin (US 33 62 886).

— Teslpapiere diverser Substrate mit spezifischen Oxidasen, POD und o-Tolidin (US 30 99 605).

— Testfilme zur Bestimmung von Glucose im Blut mit GOD. POD, o-Tolidin (DE-OS 15 98 153) und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (DEOS 24 60 903).

— Testpapiere zur Bestimmung von NADH oder NADH-bildenden Substraten bzw. Enzymen mit Tetrazoliumsalzen und Diaphorase (z. B. DE-OS

- 60 24 52 283).

Da die meisten der eben genannten Tests in wäßrigen Lösungen durchgeführt werden, werden vorteilhaft wasserlösliche Jodate verwendet. Es kommen praktisch b5 alle wasserlöslichen Salze der Jodsäure mit anorganischen und organischen Kationen infrage, soweit diese ihrerseits die analytischen Verfahren nicht stören. Es sind dies vor allem die Alkalisalze, die bequem

zugänglich und zum Teil handelsüblich sind, ferner die Erdalkalisalze, Ammoniumsalze oder die Salze einfacher Amine wie z. B. Piperidin, Piperazin u. a.

Nur in besonderen Fällen sind gewisse Modifikationen der üblichen Rezepturen erforderlich:

— Bei der industriellen Herstelbng von Testpapieren sind mitunter relativ lange Imprägnierzeiten erforderlich. In diesen langen Zeiten kann es unter Umständen in der Imprägnierlösung schon zu einer teiiweisen Oxidation des Indikators kommen. Dies ist beispielsweise aer Fall bei substituierten Aminocarbazolen gemäß DE-OS 22 05 733. In diesen Fällen ist es zweckmäßig," eine gewisse räumliche Trennung der Reagenzien herbeizuführen, indem man zunächst das Testpapier mit allen anderen Reagenzien imprägniert und danach ein entsprechendes Jodat aus einem organischen Lösungsmittel, das die übrigen Rezepturbestandteile nicht auflöst, nachimprägnieru Organolösliche Jodale sind beispielsweise quarternäre Ammoniumjodate sowie Salze der Jodsäure mit längerkettigen Aminen.

— In Fällen, wo durch die Verwendung von Jodal Stabilitätsprobleme der Tests auftreten, können allgemein bekannte Maßnahmen der Stabilitätsverbesserung, wie aufeinanderfolgende Imprägnaiion aus verschiedenen Lösungsmitteln, gegebenenfalls unter Zugabe von geeigneten Trennmitteln wie z. B. Polymeren ergriffen werden.

Die Verwendung von Jodat in Schnelldiagnostica ist nur innerhalb folgender pH-Grenzen zweckmäßig:

— Bei pH-Werten unterhalb ca. 4,5 entsteht bei der Reduktion von Jodat durch Ascorbinsäure zunehmend freies Jod, welches, wie schon gesagt, viele Indikatoren oxidiert. Außerdem besitzt Jodat im sauren Milieu ein Oxidationspotential von + 1,20 V (Cottei-Wikinson, siehe oben) und ist daher mit den meisten Indikatoren und anderen Rezepturbestandteilen nicht mehr verträglich.

— Oberhalb von pH 7 — 8 wird die Oxidation von Ascorbinsäure durch Jodat zunehmend träger, so daß für eine wirksame Entstörung unverhältnismäßig große Mengen Jodat erforderlich sind, was zu Verarbeitungsschwierigkeiten und gegebenenfalls zu Haltbarkeitsproblemen führen kann.

Die Jodate werden zweckmäßigenveise im 2- bis 20fachen molaren Überschuß, bezogen auf die in den Untersuchungsflüssigkeiten vorkommenden Mengen an Ascorbinsäure eingesetzt. Da die Oxidation der Ascorbinsäure praktisch vor der eigentlichen Nachweisreaktion ablaufen muß, benötigt man für schnell ablaufende Nachweisreaktionen einen größeren Überschuß an Jodat als für langsamer ablaufende. Da, wie oben schon erwähnt, die Oxidation der Ascorbinsäure sich bei hohem pH verlangsamt, muß auch in diesen Fällen ein größerer Überschuß verwendet werden. Die richtige Menge Jodat ist in jedem Fall durch einfache Reihenversuche leicht zu ermitteln.

Erfindungsgemäße Schnelldiagnostica weisen gegenüber bekannten störungsfreien bzw. störungsarmen Schnelldiagnostica folgende Vorteile auf:

— Ihre Handhabung entspricht vollkommen der der bisherigen, z. T. seit langem üblichen Schnelldiagnostica.

— Ihre Herstellung ist einfach und entspricht weitgehend üblichen Fabrikat ionsmethoden.

— Verglichen mit Schnelldiagnostica, die Ascorbatoxidase enthalten, weisen sie z.T. einen höheren Entstörungsgrad auf, vor allem sind sie wesentlich preisgünstiger herzustellen.

Das Jodat kann auch direkt der zu untersuchenden Lösung zugesetzt werden und dl·? dadurch von den

ίο störenden Reaktionsmitteln befreite Lösung in bekannter Weise photometrisch oder mit üblichen Schnelitesten weiter untersucht werden. Es sei allerdings angemerkt, daß in einer solchen Lösung Tests, deren Substrate oder Reagenzien mit Jodat reagieren, nicht

r> mehr durchgeführt werden können, beispielsweise bei der Harnuntersuchung die Tests auf Nitrit und Gallenfarbstoffe (Urobilinogen und Bilirubin). Diese Stoffe werden von Jodat im sauren Milieu noch vor ihrem Nachweis oxidiert. Außerdem werden die für die

>n üblichen Nitrit-Tests verwendeten aromatischen Amine zu stark farbigen Verbindungen oxidiert.

Ob ein bestimmter Test durch den Zusatz von Jodat gestört wird, läßt sich einfach nachprüfen, indem man Standards mit und ohne Jodatzusatz vergleicht.

In gewissen Fällen, z. B. bei Analysenverfahren, die bei pH 5 — 6 arbeiten, wo Ascorbinsäure sehr schnell von Jodat oxidiert wird, kann es vorteilhaft sein, das Jodat der Reagenzienzubereitung oder Teilen derselben zuzugeben und so den Analysenablauf wesentlich zu vereinfachen. So kann z. B. bei der Analyse von Serum das Jodat den gebräuchlichen, schwach sauren Enteiweißungsmitteln, wie z. B. Uranylacetat, zugesetzt werden, wodurch man eine weitgehend entstörte Testlösiing erhält.

Die diagnostischen Mittel sind vorzugsweise Schnelltests, bei denen das Reagentiensyslem in einem saugfähigen, in dem Testsystem unlöslichen Träger imprägniert oder in einem im Tesisystem quellbaren Film incorporiert ist, der gegebenenfalls auf einem festen Träger, beispielsweise einer Kunststoff-Folie, befestigt ist. Die Reaktion wird dann nach Befeuchten mit dem Testsystem an der eintretenden Verfärbung bestimmt.

Die diagnostischen Mittel können jedoch auch in dem Testsystem löslich sein und beispielsweise als Lösung, Lyophilisat oder Reagenztablette vorliegen oder in einem im Testsystem löslichen Film incorporiert sein, der sich seinerseits auf oder in einem festen Träger befindet. Die Reagentien werden dann mit dem Testsystem sowie gegebenenfalls weiterem Lösungsmittel vermischt und die Reaktion in einer Küvette photometrisch bestimmt.

Durch die folgenden Beispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.

Beispiel 1

Testpapier zum Nachweis von Blut
(Erythrocyten) im Harn

Filterpapier (Schleicher & Schüll, Nr. 23 SL) wird nacheinander mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40⁰C getrocknet:

Lösung 1

l,2molarerCitratpuffervom pH 5,25 35,0 ml

Ethylendiamintetraessigsäure,

Dinatriumsalz 0,1 g

Dioctylnatriumsulfosuccinat

2,5-Dime thylhexan-2,5-dihydroperoxid

(ca. 70%ig)

Phosphorsäuretrimorpholid

Natriumjodai

Ethanol

Dest. Wasser, ad

Lösung 2

3,3'.5,5'-Tetramethylbenzidin

Phenanthridin

] -Phenylsemicarbazid

Toluol/Methanol (60 :40), ad

0,5 g

1.6 g

12,7 g

0.5 g

30,0 ml

100.0 ml

0,3 g
0.2 g
0,02 g
100.0 ml

Mit diesem Testpapier kann die Anwesenheit von 5 Ery/mm³ noch in Gegenwart von 150 —200 mg Ascorbinsäure/dl nachgewiesen werden. Bei einem analogen Testpapier, das anstelle des Jodats 3-10⁴U Ascorbatoxidase enthält, ist die positive Reaktion noch bis zu einer Konzentration von 30 —50 mg Ascorbinsäure/dl, bei einem Papier ohne Zusätze nur bis ca. 10 mg Ascorbinsäure/dl sichtbar. Wird das erfindiingsgemäße Testpapier 3 Tage lang auf 60°C erhitzt, so behält es seine Empfindlichkeit bei. Das Papier mit Ascorbatoxidase reagiert nach dieser Belastung nur noch wie das Papier ohne Zusätze.

Beispiel 2

festpapier zur semiquantitativen Bestimmung
von Glucose im Harn

Filterpapier (Schleicher & Schüll, 597 NF-lnd.) wird nacheinander mit Lösungen folgender Zusammensetzung getränkt und jeweils bei 50°C getrocknet:

Lösung 1	1.2 g
Glucoseoxidase(71 U/mg)	0.2 g
Peroxidase (66 U/mg)	50.0 ml
1.2 m Citratpuffer pH 5
9-(7-DimethyIaminopropyl)-6-chlor-	2.1g
3-aminocarbazol-dihydrochlorid	0.12 g
Tartrazin	i.ig
Laurolsarkosin	100,0 ml
Wasser desu ad
Lösung 2	1.4 g
Tetramethylammonium-jodat	100.0 ml
Ethanol, ad

Auf die gleiche Weise wird ein Testpapier hergestellt das nur mit Lösung 1 imprägniert ist

Es werden Urine mit 100,300 und 1000 mg Glucose/dl hergestellt, in die jeweils 0. 50, 100 und 200 mg Ascorbinsäure/dl eingewogen werden.

Die Testpapiere werden eingetaucht und auf eine saugende Unterlage gelegt- Eine Minute nach dem Eintauchen werden ihre Reaktionsfarben verglichen, wobei die des Urins ohne Ascorbinsäure als innerer Standard gewählt wurde. Aus der folgenden Tabelle ergibt sich, daß die Störung durch Ascorbinsäure durch den Zusatz von Jodat beseitigt wird.

Jotlat Anzeige	100	ausgedrückt	in mg Glucosc/dl	200 mg
0	+ 100	50	100	Ascorbin-
	300			siiure/dl
	+ 300			neg.
1000	neg.	neg.	100
+ 1000	100	100	neg.
	100	neg.	300
300	300	neg.
300	100	1000
1000	1000
Beispi	el 3	Testpapier zum Nachweis von Glucose im Harn

Filterpapier (Schleicher & Schiill, 597 NF) wird mit "" einer Lösung folgender Zusammensetzung getränkt und bei 50° C getrocknet:

Glucoseoxidase(71 U/ml)
Peroxidase (66 U/ml)
"' Kaliumjodat
Tartrazin
o-lolidin
Ethanol
Wasser dest., ad

0,38 g

0,02 g

2,00 g

0,08 g

0,42 g

33,0 ml

100,0 ml

Mit diesem Testpapier geben Urine mit 50 mg Glucose/dl, denen 0, 50, 100 und 200 mg Ascorbinsäure/dl zugewogen wurde, praktisch die gleiche grüne Reaktionsfarbe.

Ein analoges Testpapier ohne Jodat gibt nur im ascorbinsäurefreien Urin eine positive Reaktion.

Beispiel 4

Testfilm zur Bestimmung geringer Glucosegehalte in Blut oder Serum

Bestandteile

Polyvinylacetatpropionatdispersion 45,0 g (Propiofan 70 D)

l,85%ige Lösung von Natriumalginat

in 0,5 m Phosphatpuffer vom pH 5,5 35,0 g

Natriumnonylsulfat in 5,0 ml Wasser gelöst 0,75 g

Glucoseoxidase (71 U/mg) 1 in 10 ml Was- 0,2 g

Peroxidase (66 U/mg) J sergelöst · 0,25 g

3.3'.5.5'-Tetramethylbenzidin in 5 ml 1 0,68 g

Aceton gelöst

Natriumjodat 1,0 g

Die Bestandteile werden gut durchgemischt, in einer Schichtdicke von 200 μ auf einer Unterlage aus Kunststoff-Folie ausgestrichen und 35 Minuten bei 60⁰C getrocknet

Auf gleiche Weise wurde ein Film ohne Jodat hergestellt

Seren mit 20 mg Glucose/dl und 0, 23 bzw. 5,0 mg Ascorbinsäure/dl werden aufgetropft nach 1 Minute wird abgewischt und nach weiteren 2 Minuten wird die Färbung an einem handelsüblichen Remissionsphotometer unter Verwendung einer linearen 0—100-Skala gemessen:

TestRlm Scrum mil

0 2,5 5,0 mg Ascorbinsüure/dl

Ohne Jodat Mit Jodat

47 43 35 46 45 45

Beispiel 5
Testpapier zum Nachweis von NADH

Filterpapier (Schleicher & Schüll, 23 SL) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert π und bei 50⁰C getrocknet:

Jod-nitiO-triphenyltetrazoliumchlorid 0,2 g

Natriumjodat 0,5 g

Nonylphenolpolyglykolether 0,2 g io

Diaphorase (32 U/mg) 0,05 g

0,15m Phosphatpuffer pH 7 40,0 ml

Wasser dest., ad 100,0 ml

In gleicher Weise wurde ein Testpapier ohne Jodat :5 hergestellt

Mit wäßrigen Lösungen von NADH reagieren beide Papiere mit der gleichen roten Färbung. Fügt man den NADH-Lösungen Ascorbinsäure zu, so reagieren die Papiere ohne Jodat stärken 30

Beispiel 6

Bestimmung von Glucose in Serum Lösungen

Enteiweißungslösungl:

0,16% Uranylacetat in 0,9%iger Kochsalzlösung.

Enteiweißungslösung 2:

0,16% Uranylacetat und 0,05% Nalriumjodat in

0,9%iger Kochsalzlösung.
Reagenzlösung:

POD 0,8 U/ml, GOD 10 U/ml, Azino-bis-benzthiazolonsulfonsäure, NHrSaIz 1,0 mg/ml in Phosphat-

pufferpH7(100mmol/l).
Probe 1:

Serum mit 100 mgGlucose/dl. Probe 2:

Serum mit 100 mg Glucose/dl und 20 mg Ascorbin-

säure/dl.
Standard:

9,1 mg Glucose/100 ml Wasser.

Enteiweißung

Gemäß folgendem Schema (ml) pipettieren und zentrifugieren:

Enteiweißungslösung 1

Enteiweißungslösung 2

Probe Probe 2

ergibt Überstand Nr.

Analyse

1.00 1,00 -

1,00 1,00

0,10 - 0,10 -

0,10 - 0,10

1.1 1.2 2.1 2.2

Gemäß folgendem Schema pipettieren (ml), 30 Minuten bei 25°C inkubieren, Extinktion bei 436 nm messen (rf = lern).

Leerwert Überstand

Standard 1.2

2.1

2.2

Dest. Wasser	0,1	—	—	—	—
Standard	-	0,1	-	-	-
übersiand	-	-	r\ 1 υ, 1	0,1	η ι
Reagenzlösung	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
E	0,115	0,425	0,424	0,366	0,426
E-E (Leerwert)	—	0,310	0,309	0,251	0,311

0,1

5,0

0,423

0,308

Ergebnis

Berechnet nach C = 100 -E (Piobe)/E (Standard)

Überstand 1.1 1.2 2.1 U.

Ascorbinsäure in Probe — + — +

Jodat in Enteiweißungs- — — + + lösung

Ergebnis (mg/dl) 99,7 89,0 100,3 99,4

II

Die durch Ascorbinsäure bewirkte Störung in der Probe 2 wird also durch Jodat völlig aufgehoben.

Beispiel 7

Bestimmung von L-Glutaminsäurc
Lösungen

Reagenzlösung 1:

1,2 ml Triton X 100,

30 U Diaphorase,

10 mg NAD,

60 mg ]od-nitro-triphenyltetrazoliumchlorid in 100 ml 0,1m Kaliumphosphat/Triethanolaniin-Puf-

ferpH8,6.
Reagenzlösung 2:

90 000 U Glutamatdehydrogenase in 100 ml Wasser.
Probe 1:

100 mg L-Glutaminsäurein 100 ml Wasser.
Probe 2:

100 mg L-Glutaminsäure und 40 mg Ascorbinsäure in 100 ml Wasser.
Jodat-Lösung:

200 mg Natriumjodat in 100 ml Wasser.

Probenvorbereitung

Gemäß folgendem Schema pipettieren (ml) und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen:

II)

ι > 1,0 1,0

1.0 1,0

1,0 - 1.0

1.0 - 1.0 -

1.1 1.2 2.1 2.2

Probe 1
Probe 2
NaJCVLösung

Dest. Wasser
ergibt Mischung Nr.

Analyse

Gemäß folgendem Schema pipottiercn im!), nach 2 Minuten Anljngso\iinktioii /Tl bei 4^l>2 um (</= 1 cm) messen, mil Reagenzlösung 2 starten, n.ich 15 Minuten Endextinktion £2 messen

	Leer	Mischung	1.:	2.1	1.0
	wert	1.1	1,0	1.0	1.8
Reagenzlösung 1	1,0	1,0	1.8	1.8	0.2
Dest. Wasser	2,0	1,8	0,2	0,2	0.041
Mischung	-	0,2	0,053	Schleich	0.03
£1	0,058	0,058	0,03	0,03	0.503
Reagenzlösung 2	0,03	0,03	0,499	Schleich	0,454
El	0,062	0,490	0,446	-	0.452
E2-EX (AE)	0,004	0,432	0.442	-
AE-AE (Leerwert)	-	0,428

Ergebnis

Berechnet nach C = 224. (AE-AE [Leerwert])

Mischung Nr. 1.1 1.2 2.1 2.2

Ascorbinsäure in Probe - - + +

Jodat-Behandlung - + - +

Ergebnis (mg/dl) 95,9 99,0 nicht ablesbar 101,2

Der durch Ascorbinsäure verursachte Schleich der Extinktion (langsame Reduktion des Tetrazoliumsalzes), der eine exakte Messung verhindert, kann durch Vorinkubation der Probenlösung mit Jodat verhindert werden, ohne daß das überschüssige Jodat die Analyse stört.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis von Redox-Reaktionen durch Einbringpn eines Redox-Reagentiensystems in ein Testsystem, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein im Testsystem lösliches ]odat in einer Menge zugegeben wird, die einem Oberschuß, bezogen auf die höchste im Restsystem vorkommende Menge von störenden Reduktionsmitteln, entspricht

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Redox-Reagentiensystem und das Jodat getrennt in das Testsystem gegeben werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Jodat vor dem Redox-Reagentiensystem zugegeben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß das Redox-Reagentiensystem und das Jodat gemeinsam in das Testsystem gegeben werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Testsystems durch die Zugabe des Redox-Reagentiensystems erhöht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert von 5 - 6 auf 7 - 9 erhöht wird.

7. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen, enthaltend ein Redox-Reagentiensystem, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein im Testsystem lösliches ]odat in einer Menge enthalten ist, die einem Überschuß, bezogen auf die höchste im Testsystem vorkommende Menge von störenden Reduktionsmitteln entspricht.

8. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 7,dadurch gekennzeichnet, daß 0,5-2 g Jodat pro 100 ml Testsystem enthalten ist.

9. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es einen derartigen pH-Wert hat, daß zusammen mit dem Testsystem ein pH-Wen von 5-9 eingestellt wird.

10. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß das Redox-Reagentiensystem aus einem Oxidationsindikator, einem Hydroperoxid, einer Peroxidase und üblichen Hilfsstoffen besteht.

11. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 7-9, dadurch gekennzeichnet, daß das Redox-Reagentiensystem aus einem Reduktionsindikator, einem Reduktionsmittel sowie gegebenenfalls einem Elektronenüberträger besteht.

12. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 7-11, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem saugfähigen, in dem Testsystem unlöslichen Träger vorliegt oder in einem im Testsystem quellbaren Film, der gegebenenfalls auf einen festen Träger aufgebracht ist, enthalten ist.

13. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 7 — 11, dadurch gekennzeichnet, daß es als Lösung, Lyophilisat oder lösliche Reagenztablette vorliegt oder in einem im Testsystem löslichen Film enthalten ist, der sich auf oder in einem festen Träger befindet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis

von Redox-Reaktionen durch Einbringen eines Redox-Reagentiensystems in ein Testsystem sowie ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Redox-Reak-

■, tionen, enthaltend ein Redox-Reagentiensystem.

In der klinischen und pharmazeutischen Chemie, der Biochemie und Lebensmittelchemie sind für Bestimmungsmethoden von Substraten und Enzymen Redox-Systeme von großer Bedeutung. Für solche Bestim-Ui mungsmethoden existieren die verschiedensten photometrischen Verfahren. Von besonderer Bedeutung sind sogenannte Schnelldiagnostica. Das sind Mittel, bei denen alle Reagenzien in saugfähigen Trägern oder in Filmen in trockener Form vorliegen. Die Mittel werden i) mit der IJntersuchungsflüssigkeit in Berührung gebracht, die entstehende Farbe kann visuell oder mit Reflexionsphotometern beurteilt werden.

Die zu untersuchenden Materialien auf den obengenannten Gebieten der chemischen Analytik, wie z. B. 2» Urin, Blut, Lebensmittel. Arzneiir.ittel/ubereitungen u. a. sind vielfach gekennzeichnet durch einen mehr oder weniger großen Gehalt an Reduktionsmitteln, von denen das häufigste die Ascorbinsäure ist. Es ist klar, daß Redox-Reaktionen durch starke Reduktionsmittel 2i wie Ascorbinsäure empfindlich gestört werden können. So ist bekannt, daß beim Nachweis von Glucose mit Schnelldiagnostica, die auf der Basis der Reaktion GOD-POD-Redox-lndikator beruhen, durch Ascorbinsäure falsch negative Befunde hervorgerufen werden, Das aus Glucose mit Hilfe von GOD (Glucoseoxidase) entstandene H2O2 wirkt nämlich mit POD (Peroxidase) auf die Ascorbinsäure anstatt auf den Indikator unter Oxidation ein und wird so der Bestimmung entzogen.

Weiter ist bekannt, daß Schnelldiagnostica zum

j5 Nachweis von Blut im Harn ebenfalls in Anwesenheit von Ascorbinsäure falsch negativ reagieren Vermutlich reduziert hier die Ascorbinsäure den durch die hämoglobinkatalysierte Oxidation gebildeten Farbstoff.

Als Beispiel für falsch positive Befunde durch Ascorbinsäure soll die Bestimmung von NADH oder NADPH mit Hilfe der Reduktion von Tetrazoliumsalzen zu farbigen Formazanen angeführt werden. Ascorbinsäure wirkt hier gleichsinnig und erhöht das Meßsignal.

Wegen der besonderen Bedeutung und des Umfanges der Störungen durch Reduktionsmittel, insbesondere Ascorbinsäure, hat es daher nicht an Versuchen gefehlt, diese aus den Untersuchungsflüssigkeiten zu entfernen, bzw. nicht gestörte Verfahren und Mittel zu entwickeln.

Folgen Verfahren sind bekanntgeworden: