DE3009154A1 - Verbesserung der auf spezifischer bindung basierenden bestimmungsmethoden - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen gekennzeichnete Verfahren und ermöglicht eine einfache, genaue und wirkungsvolle Abtrennung des freien Liganden vom Antikörpergebundenen Liganden in auf spezifischer Bindung basierenden Bestimmungstechniken.

Auf spezifischer Bindung basierende Bestimmungsmethoden machen bekanntlich vom Prinzip der Messung spezifischer Bindung sreaktionen, in denen das Ausmaß der Bindung eine Funktion des vorhandenen unbekannten Liganden darstellt, Gabrauch unter Verwendung einer markierten Komponente. Als Beispiele für bekannte derartige Methoden können die folgenden fünf auf spezifischer Bindung basierenden Bestimmungstechniken genannt werden: Radioimmunoassay (RIA), MetalIoimmunoassay (MIA), freies Radikal-Assaytechnik (FRAT), Hämaglutinationshemmung (HI) und Enzymmultiplied -Immunoassaytechnik (MIT) In den beiden erstgenannten Techniken wird das den unmarkierten Liganden, den markierten Liganden und den Antikörper enthaltende Gemisch zu einem Gleichgewicht kommen gelassen, worauf der Antikörper-gebundene Ligand vom freien Liganden abgetrennt wird. Im Radioimmunoassay ist der Ligand mit einem radioaktiven Isotop markiert, und im Metalloimmunoassy ist der Ligand mit einem metallhaltigen Reagens markiert, das gleichzeitig eine geeignete funktioneile Gruppe enthält, mit deren Hilfe das Metallreagens an das zu bestimmende Hapten gebunden werden kann. Eine ausführliche Beschreibung der letztgenannten Methode ist in der GB-PS 1 550 540 zu finden.

Die Trennoperation der freien Fraktion von der gebundenen ist von großer Wichtigkeit und deren Genauigkeit bestimmt die Enpfindlichkeit und Präzision der gesam^-ten auf spezifischer Bindung beruhenden Bestimmungstechnik. Bei der Wahl und Beurteilung einer Trennoperation empfiehlt es sich, die Kriterien

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in Betracht zu ziehen, die zur Erzielung des gewünschten Resultats erfüllt sein sollten. Als Haupterfordernisse einer idealen Trennung können die folgenden genannt werden:

a) eine vollständige Trennung zwischen der gebundenen und freien Fraktion sollte mit einer weiten Fehlerbreite der zur Trennung verwendeten Bedingungen erfolgen, woraus sich ergibt, daß die Trennmethode die primäre Bindungsreaktion nicht beeinträchtigen sollte,

b) die Trennoperation sollte einfach, schnell und billig und unter Verwendung bekannter Reagentien und üblicher Weise zur Verfügung stehender Apparaturen durchführbar sein, und

c) die Trennoperation sollte vom verwendeten Liganden nicht beeinflußt werden, da andernfalls Schwierigkeiten bei der Standardisierung auftreten.

Die wichtigsten der üblichen bekannten Methoden sollen im folgenden kurz dargelegt werden:

- Adsorptionsmethoden. Dabei wird in der Regel die freie Fraktion adsorbiert; die Adsorbentien werden gewöhnlich für kleine Peptide, Steroide und Thyroidhormone verwendet. Die Adsorption wird durch viele Faktoren bestimmt, einschließlich der relativen Oberfläche des Adsorbens, der Größe und Ladung des Antigens, der Natur und Konzentration der konkurrierenden Proteine, der Temperatur, der Ionenstärke und des pH-Werts. Es ist wesentlich, daß die Bedingungen für die Durchführung der Adsorptionsmethoden für jedes Antigen experimentell erarbeitet und optimal festgelegt werden. Beispiele für"Üblicher Weise verwendete Adsorbentien sind Holz- und Knochenkohle sowie Silikate. Das Hauptproblem ist dabei, daß Holz- und Knochenkohle immer etwas nicht-aktiviertes Material enthält, das eine hohe unspezifische Avidität für eine große Vielzahl von

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Substanzen hat, so daß sowohl die gebundene als auch die freie Fraktion adsorbiert werden kann. Außerdem kann Holz- und Knochenkohle das gebundene Antigen entfernen, insbesondere dann, wenn ein Bindemittel mit niedriger Avidität verwendet wird. Die Verwendung von Silikaten hat den Nachteil, daß die Adsorption vom vorhandenen Protein abhängt, so daß die optimalen relativen Verhältnisse von Adsorbens und Serum für jedes Antigen experimentell bestimmt werden müssen.

Fraktionierte Ausfällung mit Neutralsalzen oder organischen Lösungsmitteln, wobei die freie Fraktion in Lösung belassen wird. Die diesen Effekt bestimmenden Kräfte sind hochgradig elektrostatischer Natur und können von zahlreichen Faktoren beeinflußt werden, z. B. von Temperatur, pH, Protein-Konzentration und Dielektrischer Konstante des Mediums. Optimale Bedingungen müssen experimentell bestimmt werden unter Beachtung der Parameter pH, Puffer, Protein und Salz-Konzentrationen. Die Anwendbarkeit dieser einfachen Ausfällungen hängt hauptsächlich von den Eigenschaften des freien Antigens ab.

Ammoniumsulfat wurde zur Untersuchung von Plasma- und Urinextrakten auf viele kleine Peptide bereits erfolgreich eingesetzt. Äthanol dürfte vielseitiger sein, da es sich für ein weites Bereich von Peptiden als geeignet erweist. Polyäthylenglycol hat sich zur Bestimmung von Insulin als zufriedenstellend erwiesen und ist zur Ausfällung von Peptidhormonen verwendbar, die sich an Standardadsorbentien nicht binden. Alle Methoden dieses Typs haben den Nachteil, daß sie mindestens einen Zentrifugationsschritt erfordern.

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Gelfiltration. Da gebundene Komplexe wesentlich größer in ihrem Molekularvolumen sind als die freien Antigene, können sie unter Verwendung eines Gels geeigneter Porengröße, z. B. mit Hilfe von Sephadex,einwandfrei getrennt werden. Das Gel ist zur Phasentrennung in zweierlei Weise verwendbar.,So kann das Inkubat durch eine Säule unter solchen Bedingungen geleitet werden, daß die gebundene Komponente eluiert wird unter Zurücklassung der freien Komponente innerhalb des Gels. Eine zweite, bei der konkurrierenden Protein-Bindungstechnik weit verbreiteten Methode ist diejenige des Gel-Gleichgewichts. Das Gel liegt während der gesamten Inkubation vor und kann vorab ins Gleichgewicht gesetzt werden mit der Tracer-Binder-Lösung. Die freie Komponente innerhalb der Poren des Gels befindet sich daher im Gleichgewicht mit derjenigen ohne dasselbe . Wenn die Testprobe zu der Gelsuspension zugegeben wird, stellt sich das Gleichgewicht rasch erneut ein, da die Bindung von Tracer an das Gel reversibel ist. Nach^-dem man die Gelpartikel absetzen gelassen hat, kann eine Probe des überstände, der die gebundene Fraktion enthält, entfernt und gemessen werden.

Papier-chromatoelektrophorese. Dabei wird ein geeignetes Papier verwendet, das das freie Hapten an dessen Angriffsstellen adsorbiert, während die gebundene Fraktion von der Auftragsstelle wegwandert unter dem Einfluß eines elektrischen Stroms und des durch Verdampfen verursachten Fließens einer Pufferlösung. Der Nachteil dieser Methode liegt darin begründet, daß sie zu kompliziert, zu zeitaufwendig und zu teuer ist, um als Routineverfahren verwendbar zu sein und außerdem bietet sich diese Methode nicht

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ohne weiteres für eine Automatisierung an. Hinzu kommt, daß Papiere und Antigene in ihren Affinitätseigenschaften variieren, was die Reproduzierbarkeit erschwert.

Die aufgezeigten Nachteile des Standes der Technik werden erfindungsgemäß in besonders vorteilhafter Weise behoben durch Verbesserung der Methode zur Trennung der freien Fraktion von der gebundenen Fraktion in auf der spezifischen Bindung beruhenden Bestimmungstechniken.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf alle Immunoassaytechniken anwendbar (z. B. auf Radioimmunoassay, freies Radikalassay und Metalloimmunoassay, wie sie in der angegebenen GB-PS 1 550 540 beschrieben werden), die eine Trennoperation zwischen der gebundenen und freien Fraktion erfordern. Obwohl die generellen Prinzipien der Lösungsmittelextraktion seit langem bekannt sind, wurde die Lösungsmittelextraktion für diese Trennung in der Immunoassaytechnik noch nicht eingesetzt. Der Hauptgrund hierfür liegt darin begründet, daß ein störendes Eingreifen des Lösungsmittels in die mmunologische Reaktion zu erwarten war, entweder durch eine Schädigung des spezifischen Bindungsproteins durch das Lösungsmittel oder durch drastische, durch das Lösungsmittel hervorgerufene Änderungen in der Antikörper-Antigen-Gleichgewichtsreaktion zum Zeitpunkt der Trennung der gebundenen und freien Fraktionen durch die Lösungsmittel extraktionsoperation. Dies erklärt die Tatsache, daß in der umfangreichen Literatur über Immonoassaytechniken keinerlei Hinweis auf eine erfolgreiche Anwendung der Lösungsmittelextraktion zur Trennung von gebundenen und freien Fraktionen in Routine-Immunoassaytechniken zu finden ist. Die Verwendung einer Scintillationsflüssigkeit, die Toluol enthält, wurde vorgeschlagen zur Extraktion von mit Tritium-markiertem Aldosteron durch wiederholte Anwendungen für die nachfolgende

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Messung im Scintillationszähler (vgl. J.P. Jewett et.al. Clinical Science an^d Molecular Medicine, 1973, Seiten 607-623), doch sind in der Beschreibung dieses mühseligen Verfahrens keinerlei Hinweise zu finden auf die Möglichkeit einer allgemeinen Anwendbarkeit.

Es war daher nicht vorhersehbar, daß es erfindungsgemäß möglich ist durch Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels und entsprechender Verfahrensbedingungen eine vorteilhafte Trennung von gebundenen und freien Liganden in Iitimunoassaytechniken durchzuführen ohne entweder die Bindefähigkeit des Bindungsproteins oder das Bindungsprotein-Ligand-Gleichgewicht nachteilig zu beeinflussen. Außerdem zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch eine breite und allgemeine Anwendbarkeit aus, die sich sowohl auf Radioimmunoassay-Systeme als auch auf andere Iitimunoassaytechniken, bei denen keine mit Isotopen markierte Mittel zur Markierung der zu analysierenden Haptene zur Anwendung gelangen, erstreckt. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist seine Vielseitigkeit und die Vielfalt von Ausgestaltungen des Flüssig-Flüssig-Systems, das zur Erzielung der gewünschten Trennung des freien vom gebundenen Liganden anwendbar ist. Zusätzlich zum üblichen Flüssig-Flüssig-System sind verschiedene Ausgestaltungen anwendbar, bei denen das System Flüssigkeit-Lösungsmittel und/oder das wässrige Medium der immonulogischen Reaktion immobilisiert werden in einer festen Matrix. Auf diese Weise ist das erfindungsgemäße Verfahren in einem Flüssig-Flüssig-System, einem Fest-Flüssig-System und sogar in einem Fest-Fest-System durchführbar.

In einem Flüssig-Flüssig-System kann die immunologische Reaktion in üblicher Weise in dem wässrigen Medium vor sich

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gehen. Nach Erreichen des Gleichgewichts in der Reaktion wird eine entsprechende Menge eines geeigneten Lösungsmittels zugegeben und nach innigem Vermischen läßt man eine Phasentrennung erfolgen, wobei der freie Ligand in das Extraktionslösungsmittel überführt ist. Wenn ein ^-Strahlung aussendendes Radioisotop zur Hapten-Markierung verwendet wurde, erfolgt die Trennung in Zonen spontan und die gebundene und/oder die freie Fraktion wird bestimmt ohne tatsächliche Trennung der wässrigen und Lösungsmittelphase in verschiedene Gefäße. Dies stellt von Haus aus einen wichtigen Vorteil dar, insbesondere für markierte radioaktive Elemente, da die Zahl der Verfahrensschritte dadurch erniedrigt wird. Wird die Trennung der wässrigen und Lösungsmittelphase für wünschenswert erachtet, so kann dies nach üblichen bekannten Verfahren erfolgen einschließlich der Verwendung von Membransystemen.

Eine andere Ausgestaltung der Trennung der freien von der gebundenen Fraktion ist ein Fest-Flüssig-System, in dem die Flüssigkeit in einer festen Martix gehalten wird. Nach^dem die iitimonulogische Reaktion in üblicher Weise in einer wässrigen Lösung durchgeführt und die erforderliche Inkubationszeit zur Erzielung des Gleichgewichts beendet ist, wird ein entsprechendes Lösungsmittel zugegeben und in innigen Kontakt mit der wässrigen Phase gebracht. Nach sorgfältigem Vermischen läßt man die bei^-den Phasen (die wässrige und die Lösungsmittelphase) trennen und ein entsprechendes hydrophobes, jedoch Lösungsmittel-adsorbierendes Material in Form eines Streifens oder in anderer geeigneter Form wird in das Reaktionsgemisch eingebracht. Die Adsorption des Lösungsmittels auf das Feststoffmaterial schleppt den freien Liganden mit sich. Der gebundene Ligand in der wässrigen

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Phase und/oder freie Ligand, die mit dem Lösungsmittel auf die feste Phase adsorbiert ist » können gemessen werden mit Hilfe einer geeigneten analytischen Methode, die sich nach dem Typ des zur Markierung des Haptens verwendeten Markierungsmittels richtet.

Gemäß einer Abwandlung der obigen Ausführungsform wird die wässrige Phase der immunologischen Reaktion nach der erforderlichen Inkubationszeit durch eine poröse Zelle geleitet, z. B. durch eine poröse Rohrschlange, die vom Lösungsmittel umgeben ist. Durch Wahl der geeigneten Länge der Rohrschlange und des geeigneten Lösungsmittels wird beim Durchfluß von einem Ende des Spiralrohrs zum anderen Ende der gesamte freie Ligand in das Lösungsmittel extrahiert, so daß die wässrige Phase nur den gebundenen Ligand mit sich führt. Der in die Lösungsmittelzelle extrahierte freie Ligand und/oder der in die wässrige Phase gebrachte gebundene Ligand kann sodann bestimmt werden nach einer geeigneten analytischen Methode, die sich nach dem zur Markierung des Haptens verwendeten Markierungsmittel richtet. Die soeben beschriebene Ausführungsform eignet sich ganz hervorragend zur Automatisierung der gesamten Prozedur.

Eine weitere Ausgestaltung ist die Verwendung von Fest-Fest-Trennsystemen, was einen weiteren Beitrag zur Vielseitigkeit und zur hochgradigen Vereinfachung darstellt, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Lösungsmittel-Extraktion bei der Trennung von gebundenen und feien Liganden in immonulogischen Reaktionen erzielt werden. In diesem Falle werden die beiden Flüssigkeiten (Lösungsmittel und immonulogisches System) in zwei festen Matrices gehalten, die gleich oder verschieden sein können. So wird z. B. ein Streifen eines geeigneten hydrophilen Materials mit dem wässrigem Medium der immonulogischen Reaktion imprägniert und die Bindungskom-

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ponenten und Liganden werden in dieses Medium adsorbiert und bis zur Gleichgewichtseinstellung inkubieren gelassen. Ein zweiter Streifen eines geeigneten hydrophoben Materials, der mit einem geeigneten Lösungsmittel imprägniert ist, wird in innigen Kontakt mit dem ersten hydrophilen Streifen gebracht. Aufgrund der Verteilung der Reagentien über die sehr großen Oberflächen der beiden Streifen erfolgt die Extraktion des freien Liganden von dem hydrophilen Streifen in das Lösungsmittel im hydrophoben Streifen extrem rasch und vollständig. Die Trennung der beiden Streifen ermöglicht sodann die Bestimmung des markierten Haptens in sowohl der gebundenen als auch der freien Fraktion. Diese Ausgestaltung ist ebenfalls für eine Automatisierung gut geeignet ohne das Erfordernis einer komplizierten Zusatzausstattung.

Eine weitere einfache Ausgestaltung des Fest-Fest-Extraktionssystems im Rahmen der Erfindung besteht in der Herstellung von zwei ineinander verschlungenen Streifen, von denen der eine aus hydrophilem und der andere hydrophobem Material besteht. Die wässrigen immonulogisehen Reagentien werden zum hydrophilen Teil der verschlungenen Streifen zugegeben. Nach der erforderlichen Inkubationszeit wird das Extraktionslösungsmittel zum hydrophilen Teil zugegeben. Dieses Lösungsmittel wandert sodann rasch auf den hydrophoben Teil. Während diese Wanderung stattfindet,übt das Lösungsmittel seine Extraktionswirkung aus und führt dabei den freien Liganden mit sich auf den hydrophoben Teil. Die Trennung der beiden miteinander verschlungenen Streifen ermöglicht sodann die Analyse des gebundenen und/oder des freien markierten Liganden.

Diese Methode ist auch im Enzym-Immunoassay verwendbar und insbesondere in dem Falle geeignet, wenn das Markierungsmittel ein floureszierendes Markierungsmaterial ist, wobei die Messungen mit einem geeigneten Spektrometer durchgeführt werden.

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Ist das bei der Bestimmungsmethode verwendete Markierungsmittel ein y-Strahlung aussendendes Radioisotop, z. B. Jod-125, und die obere Phase ein organisches Lösungsmittel, so enthält nach der Lösungsmittelextraktion die wässrige Phase den Antikörper-Antigen-Komplex. Die untere Phase wird daher mit Hilfe des Gammazählers gemessen.

Das Verfahren kann auch in den verschiedenen auf dem Markt befindlichen Fertigpacks für Immunoassay verwendet werden, wie Versuche, die in einigen der unten angegebenen Beispielen beschrieben werden, ergeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für die Trennung von freiem Antigen von gebundenem Antigen-Antikörper-^Komplex geeignet im Falle von Proteinen, Zellen und anderen hochmolekularen Verbindungen, wenn man zwei wasserlösliche, jedoch gegenseitig miteinander unverträgliche Polymere zur Induzierung des Entmischens verwendet. Dies führt zur Bildung von zwei wässrigen Phasen, zwischen denen verschiedene Typen von Verbindungen sich verteilen können. Ein derartiges Phänomen wird z. B. von P.A. Albertson et.al. Nature, 184, 1465, 1959 und G. Johanson et.al., Eur.J. Biochem., 2K3, 379, 1973 beschrieben. Es gibt zahlreiche unverträgliche Paare von Polymeren (vgl. z. B. A.Dobry et.al., J. Polym.Sci. 2, 90, 1947).

Das erfindungsgemäße Verfahren ist technisch einfach, rasch durchführbar und billig und muß als eine Idealmethode in der Immunoassaytechnik angesehen werden. Um das lange bestehende Bedürfnis nach einem Verfahren dieses Typs deutlich zu machen kann auf das bekannte Handbuch des Fachmannes "Principles of competitive protein-binding assays,", Herausgeber W.D.Odell und W.H.Daughaday, Verlag J.B. Lippincott Co., Philadelphia und Toronto, 1971, verwiesen werden, wo es in Kapitel XI, Seite

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303 heißt, daß die Tatsache, daß so zahlreiche verschiedene Trenntechniken vorgeschlagen wurden, ein Anzeichen für eine bestimmte Unzufriedenheit mit den bestehenden Methoden ist.

Offensichtlich kommt das erfindungsgemäße Verfahren den Erfordernissen einer Idealmethode näher als irgendeines der bisher bekannten Verfahren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in der auf spezifischer Bindung beruhenden Bestimmungstechnik brauchbar zur Messung winziger Konzentrationen an chemischen Substanzen in biologischen Flüssigkeiten. Von der bekannten Nomenclatur dieser chemischen Substanzen bieten sich folgende für eine erfindungsgemäß durchgeführte Analyse an:
Alkaloide, z. B. Morphin, Codein, Dihydro-codein, Heroin,

Oxymorphon , Met-Όροη, Pholcodine, und dergleichen,
Barbiturate, z. B. Veronal, Luminal, Seconal, Phenobarbital,

Barbital und dergleichen, Steroide und östrogene, z. B. a-östradiol, östron, östriol,

17a-fithinylöstradiol und dergleichen, und Rogene, Progestogene, Adrenocorticalhormone und dergleichen, Cannabinoide und deren Metabolite,

Vitamine, z. B. Carotin, Riboflavin, Thiamin, Niacin, Ascorbinsäure, Tocopherol, Phytyl-1,4-naphtochinon und dergleichen,
Aminosäuren und Polypeptide,

Zucker, einschließlich Saccharide und Polysaccharide Tranquilizer, z. B. Meprobamat, Valium, Oxazepam, Phenothiazine

und dergleichen.

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Zusätzlich zu obigen Haptenen können mit Hilfe des erfindungs-⁴ gemäßen Verfahrens auch andere Verbindungen des verschiedensten Typs bestimmt werden, z. B. Cocain, Prostaglandin, Anticiotika, z. B. Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin und Nucleinsäuren und Nucleotide; Insektizide, Fungizide, Bakerio^u zide und Nematizide, z. B. Malathion, Carbamate und dergleichen. Generell können Antigene,Haptene und deren Antikörper, Hormone, Vitamine, Arzneimittel, Metaboliten und deren Receptoren und Bindungsmaterialen erfindungsgemäß bestimmt werden.

Von den zu bestimmenden speziellen Verbindungen können insbesondere die folgenden genannt werden:

Kompensiertes T₄; Tg-Aufnähme

Cortisol; Insulin;

Digoxin; Trijodthyronin

Folat; Thyroxin (Gesamt-T.);

h G H; TSH;

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten organischen Lösungsmittel müssen die folgenden Erfordernisse erfüllen:

(a) Sie müssen mit Wasser wenig mischbar oder mit Wasser vollkommen unmischbar sein,

(b) sie müssen eine ausgeprägte selektive Extraktionskraft für das Antigen besitzen, und

(c) sie dürfen mit keiner Komponente des Systems eine spezifische Wechselwirkung haben.

Organische Lösungsmittel, die Antigen als solches extrahieren, gibt es sehr viele und die meisten davon sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ungeeignet. So können z. B. alle organischen Lösungsmittel, die mit Wasser vollständig oder sehr ausgeprägt mischbar sind, z. B. Äthanol, Aceton und der-

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gleichen, nicht verwendet werden. Glücklicher Weise ist eine Großzahl von organischen Lösungsmitteln literaturbekannt, die das oben angegebene Kriterium in Bezug auf Wassermischbarkeit besitzen. In der Regel werden organische Lösungsmiitel verwendet, die bestehen aus Kohlenwasserstoffen, Halogenkohlenwasserstoffen, Sauerstoffderivaten von Kohlenwasserstoffen, Stickstoffderivaten von Kohlenwasserstoffen und Phosphorderivaten von Kohlenwasserstoffen, in denen die Wasserstoff komponente von C₃ bis C₃₀ variieren kann.

Typische geeignete derartige organische Lösungsmittel sind z. B. Methylisobutylketon, Chloroform, Dichloromethan, Kohlenstofftetrachlorid, t-Amylalkohol, Benzylalkohol, Äthylacetat, tert-Butylmethylather, Hexan, Heptan, Isooctan und dergleichen. Die Wahl des bevorzugten Lösungsmittels für das jeweilige System wird von Fall zu Fall aufgrund von einfachen Vorversuchen getroffen, wie sie weiter unten beschrieben werden.

In der folgenden Tabelle I,sind die Eigenschaften einiger der geeigneten Lösungsmittel in bezug auf die oben angegebenen Kriterien in einem Versuch zur Auswahl eines brauchbaren Lösungs-

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mittels für östriol aufgeführt. J-Östriol wurde als Ligand gewählt und in bezug auf seine Extraktion getestet in Gegenwart von 250 ng/ml unmarkiertem östriol und ohne dasselbe.

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Tabelle I

Lösungsmittel

% östriol extrahiert nur . mit

Tracer 250 ng/mlunmark.

% Löslichkeit in Wasser

Methyl- isobutylketone	91-94
Äthylacetat	90-94
Toluol	85-91.5
Triäthylamin	86-91
Benzylchlorid	78-80
tert-Amyl- alkohol	78-82
Chloroform	52-53
Dichloromethan	45-47
Kohlenstoff tetrachlorid	35-38

90-94 90-92 90.5

86-90 76-78 80-85

53-54 52-51 38-40

1.9

3.3

0.05

1.5

0,05

12.5 % getrennt nur nach Zentrifugation

1.01

0.08

Die erfindungsgemäß durchgeführte Trennoperation wird im folgenden mit östriol, Digoxin und T-4 erläutert, die als Liganden dienen, und die erhaltenen Ergebnisse werden mit denjenigen ver^k glichen, die bei Verwendung der bekannten chromatographischen Säulenmethode oder Ausfällmethode erhalten werden.

Beispiel 1:

Lösungsmittelextraktionsmethode für Digoxin-RIA.

Nach beendeter Inkubationszeit wurde die geeignete Menge Lösungsmittel jedem Teströhrchen (Polypropylen) zugesetzt, die Teströhrchen wurden verschlossen und 30 Sekunden lang einer Wirbel¹-behandlung ausge- 030039/0698

setzt (oder alle Teströhrchen zusammen wurden kräftig geschüttelt durch 2 Minuten langes U-mkippen) . Alle Teströhrchen wurden sodann einige Minuten lang ( 5 bis 10 Minuten) stehen gelassen und die halbe Menge an Lösungsmittel (oder der wässrigen Lösung) wurde in neue Teströhrchen zum Zählen überführt.

Weitere Versuche wurden durchgeführt, um die "physikalische" Trennung zu vermeiden (das überführen eines bestimmten Volumens nach der Phasentrennung). Ein kupfergeschütztes Bohrungseinsatzstück wurde zur Abdeckung der oberen Phase (üblicher Weise des Lösungsmittels) verwendet und jedes Teströhrchen wurde in den Gammazähler so eingesetzt, daß nur der untere Teil des Teströhrchens (der die wässrige Phase mit der gebundenen Fraktion enthält) gezählt werden konnte. Digoxin-Fertigpackkomponente wurden nach den Gebrauchsrichtlinien zusammengestellt.

Das Reaktionsgemisch enthielt 200μ1 Antiserum (Komponente Nr. 9002), 400 μΐ ¹²⁵J-Digoxinderivat (Komponente Nr. 9007), 100 μΐ Standardlösung (Komponente Nr. 9902) oder Kontrollserum (DADE-3 Standard-Kontrollserum), wobei alle Fertigpackkomponenten EDTA-Phosphatpuffer (pH 7,4 + 0,1).enthielten. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt und dann wurde jedes Teströhrchen mit Methylisobutylketon versetzt und 30 Sekunden lang in einer Wirbelvorrichtung geschüttelt. Eine Trennung wurde innerhalb von 5 bis 10 Minuten erreicht und die wässrige Phase wurde in einer Gamacord II-Vorrichtung gezählt unter Verwendung eines geschützten Bohrungseinsatzes (15 mm Abstandhalter).

In der beigefügten Figur 1 ist die Eichkurve wieder gegeben, wobei aufgetragen sind logit gebunden/gesamt (B/T) gegen log Digoxin-Konzentration. Die Gesamfedelta %Retention (Abfall

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zwischen 0,54 und 4,6 ng/ml) beträgt 50%. Der Digoxin-RIA-

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Test ( J) wurde unter Verwendung handelsüblicher Fertigpackkomponenten (AX.) durchgeführt, wobei 2 ml Methyliso butylketon (MIBKl zur Extraktion von freiem Digoxin aus jedem Teströhrchen'(0,7 ml) nach 30 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur verwendet wurden.

In der beigefügten Figur 1A sind Kontrollserum-Werte,die erfindungsgemäß erhalten wurden, denjenigen, die mit Hilfe handelsüblicher Fertigpacks zur Digoxin-Bestimmung erhaltbar sind, einander gegenübergestellt. Die Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung. Zur Durchführung der Versuche wurden die unter dem Handelsnamen "DADE" bekannten Kontrollseren I, II und III eingesetzt.

In der beigefügten Figur 2 sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen wieder gegeben, die unter Verwendung der erfindungsgemäß durchgeführten Lösungsmittelextraktion bzw. mit Hilfe der bekannten Chromatographie-teströhrenmethode gewonnen wurden. Es wurde ein Ames-Digoxin-RIA-Test nach den Gebrauchsanweisungen durchgeführt und nach beendeter Inkubationszeit wurde die Trennung von freier und gebundener Fraktion bewirkt unter Verwendung der Chromatographie-Teströhrenmethode (Fertigpacksystem, Ergebnisse wiedergegeben als kreisförmige Punkte} bzw. mit Hilfe der erfindungsgemäßen Lösungsmittelextraktion unter Verwendung von Methyl-i sobutyl-k'eton (MIBK) , Ergebnisse wiedergegeben als Kreise.

Beispiel 2;

Lösungsmittelextraktionsmethode für T-4-RIA (T=Thyroxin).

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Ein J-T-4-Ansatz mit Komponenten Nr. 0047 wurde hergestellt, der 3 mg/ml 8-Anilino-naphtalin-sulfonsäure (ANS) in Tris-Maleat-Puffer pH 7,3 + 0,1 (Tris 1,47 g, Maleinsäure 0,62 g, Dinatrium-EDTA 0,22g) in 150 ml doppelt-destilliertem Wasser enthielt.

Antiserum Komponente Nr. 0007 wurde unter Verwendung des gleichen Puffers hergestellt. Τ-4-Standardproben wurden in Pufferlösung hergestellt, wobei das Raktionsgemisch 200 μΐ herge-

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stelltes J-T-4 enthielt. 50 μΐ Standardproben oder Serumproben und 400 μΐ Antiserum wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Drei Kontrollseren (TRI-Rac - Komp. Nr. RCS-16) Standard I, II und III wurden ebenfalls mit der Eichkurve bestimmt.

Nach der Inkubation wurden 200 μΐ gesättigte Lösung von (NHN)₂SO₄ und 1 ml tert-amyl-Alkohol zu jedem Teströhrchen zugesetzt. Alle Teströhrchen wurden verschlossen und mit der Oberseite nach unten 2 Minuten lang rotiert. Die wässrige Phase wurde im Gammacord II ( £-Zähler) gezählt unter Verwendung eines abgeschirmten Bohreinsatzes (keine physikalische Trennung war erforderlich).

Die Ergebnisse wurden berechnet als % gebunden über gebunden Null (B/Bo) und sie sind in der beigefügten Figur 3 wieder-^gegeben. Zur Durchführung der Versuche wurde die T-4-RIA-Methode unter Verwendung handelsüblicher Fertigpackkomponenten (A.Y.) durchgeführt und die Trennung zwischen der gebundenen und freien Fraktion wurde unter Verwendung von 1 ml tert-amyl-Alkohol bewirkt. Die Ergebnisse zeigen, daß der Abfall zwischen den 1-5 mcg/dl-Standartwerten und dem 24 mcg/dl-Standartwert 43% beträgt.

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Kontrollserum-Werte wurden ebenfalls berechnet und sie sind in Figur 3A wiedergegeben und mit den Werten verglichen, die mit Hilfe der Arnes T-4-Fertigpacks (Tetralute und Seralute T-4-RIA) erhalten wurden. Die Ergebnisse zeigen/ daß eine gute Übereinstimmung zwischen den erfindungsgemäße erhaltenen und den mit der bekannten Methode gefundenen Werte besteht. Daraus ergibt sich, daß das System zu unterscheiden vermag zwischen normalen und hyperthyroiden und hypothyroiden Werten.

Beispiel 3:

Lösungsmittelextraktionmethode für Östriol-RIA.

Als Puffer wurde im östriol RIA-System EDTA-Phosphatpuffer (0,01 M, pH 7,4) verwendet.

Als Antisera wurden solche aus zwei verschiedenen Quellen verwendet, nämlich

(1) Antiserum, das erzeugt worden war durch Kaninchen, die injiziert wurden mit östriol 6-0-Carboxymethyl-BSA (R-68, von Arnes Yissum Research Laboratories und verwendet als rohes Antiserum),

(2) Antiserum, das erzeugt worden war von Kaninchen, die injiziert wurden mit östriol 3-0 BSA (R-63, R-64, R-65, hergestellt von Technion, Haifa, und verwendet als gereinigte Immunoglobuline), 36 % Ammoniumsulfat-Ausfällung.

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Als Östrogen-Tiacers wurden verwendet J-Östriol, hergestellt von Arnes Yissum Laboratories; H-Östriol, gehandelt von New England Nuclear (N.E.N.), H-Östron und H-Östradiol, ebenfalls gehandelt von N.E.N.

Als östrogen und östrogenderivate dienten östriol (Merck), östrä* diol (Sigma), östron (Signa) und östriol-3-O-Carboxymethyl (her-

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gestellt von Technion).

Zur Eichkurvenbestiimnung wurden 100 μΐ Tracer in EDTA-Phosphatpuffer (der 0,2 % Polyvinylalkohol PVA enthielt), 200 μΐ östriol-Standard (im gleichen Puffer) und 100 μΐ Antiseruin (unter Verwendung der entsprechenden Verdünnung) 60-90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach beendeter Inkubationszeit wurde das gebundene vom freien östriol getrennt unter Verwendung verschiedener Trennmethoden und die Radioaktivität der freien Fraktion wurde bestimmt. Die Standardkurve wurde aufgetragen als freies östriol gegen log Östriol-Konzentration (ng/ml).

Als Trennmethoden wurden angewandt

(1) Sephadex-Säulen: Das Reaktionsgemisch (200 μΐ) wurde am oberen Ende einer G-10-Sephadex-Säule aufgetragen und in die Säule eindringen gelassen. Die Säule wurde sodann gewaschen mit 3 ml EDTA-Phosphatpuffer zur Entfernung der gebundenen Fraktion;

(2) Lösungsmittelextraktion: Nach beendeter Inkubation 'wurden 200 μΐ des Reaktionsgemisches mit 400 μΐ Lösungsmittel (vgl. die Ergebnisse ) extrahiert durch 30 Sekunden lange Wirbel-Behandlung (unter Verwendung von zugestöpselten Polypropylen-Teströhrchen). Nach der Phasentrennung wurden 200 μΐ des Lösungsmittels in Teströhrchen überführt und gezählt.

1 25 In der beigefügten Figur 4 sind die Ergebnisse der J-Östriol-RIA gemäß Lösungsmittelextraktion mit Methyl-isobutyl-keton (MIBK), Ab R=65 (1:2), Inkubationszeit 60 Minuten, wiedergegeben, berechnet als %freies östriol über log Östriol-Konzentration. Die Messpunkte sind als Kreise dargestellt.

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Zu Vergleichszwecken sind in Figur 4 auch die Ergebnisse wieder gegeben, die durch bekannte Trennung der gebundenen und freien Fraktion auf Sephadex-Säulen erhalten wurden (Messpunkte dargestellt als volle Punkte).

Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Lösungsmittelextraktion in der RIA-Methode zur Bestimmung von östriol in biologischen Flüssigkeiten mit Erfolg angewandt werden kann.

Beispiel 4:

Lösungsmittelextraktionsmethode für Diyoxin-RIA.

Ein analoger Versuch wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt unter Verwendung von handelsüblichem Digoxin RIA-Fertigpack von Becton Dickinson. Alle Fertigpack-Komponenten wurden unver-

1 25 ändert verwendet mit Ausnahme von J-Digoxin-Tracer, der VOIi Becton Dickinson Research Laboratory speziell für diesen Versuch hergestellt worden war, so daß die entsprechende Menge Radioaktivität in 0,1 ml/Portionen statt in 1 ml/Portionen, wie sie im Original-Fertigpack vorgesehen sind, enthalten war.

DADE-Kontrollseren (I, II und IV) wurden hergestellt und bestimmt mit den Fertigpack-Komponenten gemäß den Fertigpack-Gebrauchsvorschriften. Nach der vorgeschriebenen Inkubationszeit wurde 1 ml t-Amyl-alkohol zu jedem Teströhrchen zugegeben und es wurde Wirbel-behandelt zur Extraktion des freien Digoxins, worauf nach erfolgter Phasentrennung 150 μΐ der wässrigen Phase überführt wurden zur Zählung der Radioaktivität. Die erhaltenen Ergebnisse für die Standardkurve (ausgedrückt als % B/Bo) und für die Kontrollseren (ausgedrückt als % B/Bo und mg Digoxin/ml) sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt:

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Tabelle II

Digoxin
(ng/ml)

B/Bo

DADE-KONTEOLLSEKEN %B/Bo

ng/ml Digoxin
gef. erwartet

0.5	74.0
1.0	49.0
1.5	35.0
2.0	27.5
3.0	20.0
5.0	12.0

Stand. I 61.1

Stand. II 32.3

Stand. Ill 20.2

0.72 0.71-1.06 1.78

1.55-2.17

2.90 2.64-3.49

Beispiel 5:

Lösungsmittelextraktionsmethode für RIA-17ß-östradiol.

Ein handelsüblicher ( H) RIA-Fertigpack für östradiol von Isopac wurde auf erfindungsgemäße Lösungsmittelextraktion wie folgt getestet:

Alle Fertigpack-Komponenten wurden gemäß den Fertigpack-Gebrauchsrichtlinien angewandt und hergestellt. Ein Versuch (A) wurde genau nach den Fertigpack-Instruktionen durchgeführt. Ein zweiter paralleler Versuch (B) wurde gemäß den Fertigpack-Instruktionen bis zur und einschließlich der Inkubations-

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stufe durchgeführt. Nach der Inkubationszeit wurden in Versuch B 1,6 ml Lösungmittel (ein 1:1-Gemisch aus tert-Amylalkohol und tert-Butylmethylather, vorgesättigt mit dem zur Bestimmung verwendeten Puffer) zu allen Teströhrchen zugegeben, worauf 20 Sekunden lang Wirbel-behandelt wurde. Nach der Phasentrennung (nach etwa 10 Minuten) wurde die obere Lösungsmittelphase, welche das freie östradiol enthielt, in Scintillationsgefäße überführt, in die 5 ml Scintillationsflüssigkeit (Instagel II, Packard) eingeführt worden waren, und die Radioaktivität wurde bestimmt. In der unten angegebenen Tabelle III, sind die erhaltenen Ergebnisse aufgeführt, berechnet als ;%B/Bo für die beiden parallel durchgeführten Versuche. Beim Auftragen der Messpunkte auf ein logit-log-Papier nach den Fertigpack-Richtlinien wird für beide Versuche eine lineare Kurve erhalten, doch ergeben die Ergebnisse des Versuchs B (unter Verwendung der Losungsmittelextrationsmethode) eine steilere Standartkurve, was anzeigt, daß es sich um eine empfindlichere Bestimmungsmethode handelt.

	Tabelle III	% B/Bo Versuch B (erfindungsgemäß)
östradiol- standards pg/ml	% B/Bo Versuch A (bek. Methode)	98.0
12.5	96.0	89.0
25.0	89.0	76.0
50.0	85.0	40.0
100.0	59.0	23.0
200.0	40.0	14.0
400.0	21.0

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Beispiel 6:

Lösungsmittelextraktionsmethode für RIA-Phenobarbiton.

Die zur Durchführung der Phenobarbiton-RIA-Methode verwendeten Komponenten waren ( H)-Phenobarbitontracer (N.E.N.. = , ein Phenobarbiton-Antiserum R-66X (Technion) und Tris-Maleatpuffer (pH 7,3, 0,078 M-Tris, 0,035 M Maleinsäure), mit einem Gehalt an 0,1 % PVP (Polyvinylpyrrolidon).

Der Tracer wurde in einer Menge von 100 μΐ (etwa 10 nano Ci/Teströhrchen) zu den Teströhrchen zugegeben, worauf 50 μΐ Penhobarbiton-Standardlösung und 100 μΐ verdünntes Antiserum zugegeben wurden. Alle Teströhrchen wurden über Nacht bei 4 C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,5 ml Lösungsmittel (tert-Butylmethylather, (TBME) in einem Versuch und Methylisobutylketon (MIBK) in einem Parallel-Versuch) zu jedem Teströhrchen zugegeben und 20 bis 30 Sekunden lang wurde in einer Wirbel-Vorrichtung behandelt. Nach erfolgter Phasentrennung beim Stehen wurde die wässrige Phase in Scintillationsgefäße überführt zur Bestimmung der Radioaktivität. In der folgenden Tabelle IV sind die erhaltenen Ergebnisse (Mittelwerte aus Doppelbestimmungen), ausgedrückt als % B/Bo, wiedergegeben.

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Tabelle IV

% B/Bo

Phenobarbiton- Standardlösung ng/ml	TBME (tert-Butylmethyläther)	MIBK (Methyl-isdbutylketon)
5	96.5	73.0
10	79.0	63.0
25	52.0	45.0
50	30.0	30.0
100	23.0	19.0
Beispiel 7:

Lösungimittelextraktionsmethode für RIA-THC.

Eine Bestimmungsmethode unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lösungsmittelextraktion wurde fürTetrahydrocannabinol (THC)-Methabolite entwickelt unter Verwendung eines H-THC-Tracers (Amersham). Alle zur Bestimmung verwendeten Komponenten wurden in Tris-Maleat-Puffer (ph 7,3), der 0,2% PVP und 0,1% Triton X450 enthielt, hergestellt. Der H-THC-Tracer wurde in einer Menge von 100 μΐ mit 50 μΐ THC-Standardlösungen und 100 μΐ verdünntem Anti-THC-Antiserum R-41Va (hergestellt bei Technion) vermischt und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Drei Versuche wurden parallel durchgeführt, wobei in einem Versuch die Trennung der freien und gebundenen Fraktion nach der bekannten Dextran-beschichteten Adsorptionskohle-Methode und

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die anderen beiden Versuche unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lösungsmittelextraktion unter Einsatz von tert-Amylalkohol bzw. MIBK durchgeführt wurden. Das Lösungsmittel wurde in einer Menge von 500 μΐ zu den Teströhrchen zugegeben, die sodann 20 bis 30 Sekunden lang Wirbel -behandelt wurden. Nach der Phasentrennung (nach 10 bis 20 Minuten) wurden 150 μΐ der wässrigen Phase in Scintillationsgefäße zur Bestimmung der Radioaktivität überführt. In der folgenden Tabelle V sind die erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt als % B/Bo für die drei Versuchsansätze wiedergegeben.

	Tabelle V	% B/Bo	Adsorpt. Kohle
			98
IHC Standardlösg.			-
ng/ml		MIBK	86
1	t-Amylalkohol	98	55
2	90	84	32
4	86	68	21
10	77	30
20	36	18
40	15	8
6

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Claims (1)

1. MÜLLKH-HOHis · I)KUFEL ^;;.S|;II

   PATENTANWÄLTE

   DR. WOLFGANG MULLER-BORfe (PATENTANWALTVON 1827-1B75) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN, DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL₁ DIPL.-PHYS.

   ZUGILJkMENE VCRTRETCR ICIM EUROPÄISCHEN PATENTAKtT REPRESENTATIVES BEFORC THC EUROPEAN PATENT OPFICC MANDATAIRES AGREES PRES L¹OFrICC EUROPEEN DES InKVKTS

   D/R/sb - T 1461

   10.mi.1980

   TECHNION RESEARCH AND DEVELOPMENT FOUNDATION LTD.
   Technion City, Haifa, Israel

   Verbesserung der auf spezifischer Bindung basierenden

   Bestiitunungsmethoden

   Patentansprüche

   1.) Verfahren zur Verbesserung der auf spezifischer Bindung

   basierenden Bestiitunungsmethoden einschließlich Immunoassaytechnik zur Bestimmung eines Mediums für einen Liganden, bei dem

   - das Medium mit einem Reagens in Kontakt gebracht wird,
   das einen markierten Bestandteil aus einem Konjugat einer markierenden Substanz und einer Bindungskomponente aufweist und mit dem zu bestimmenden Liganden ein Bindungs-Reaktionssystem bildet unter Erzeugung einer gebundenen und einer freien Fraktion des markierten Bestandteils, wo-

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   MÜNCHEN 66, SIEBERTSTR. 4 ■ POB 860720 · KABEL: MUEBOPAT · TEL. (089) 47400S ■ TELECOPIER XEROX 400 · TKLEX 5-24

   bei die Menge der in der gebundenen Fraktion befindlichen markierenden Substanz eine Funktion der Menge des in dem Ligandenmedium vorhandenen Liganden ist,

   - die gebundene Fraktion von der freien Fraktion getrennt wird, und

   - die Menge an markierender Substanz entweder in der gebundenen oder in der freien Fraktion bestimmt wird,

   dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung der gebundenen von der freien Fraktion durch eine Lösungsmittelextraktion bewirkt unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, das mit Wasser wenig mischbar oder vollständig unmischbar ist, eine ausgeprägte selektive Extraktionskraft für das Antigen hat und zur Einfrierung des Gleichgewichts zwischen der freien und gebundenen Fraktion befähigt ist.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

   aus
   Immunoassay-Methoden/Radioimmunoassay-, freies Radikal-Assay-, Enzymassay-, Fluoreszenzassay- oder Metalloimmunoassay-Techniken anwendet.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man freies Antigen vom gebundenen Antigen-Antikörperkomplex, der in Proteinen, Zellen oder hochmolekularen Verbindungen vorliegt, abtrennt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebundene und/oder freie Fraktion ohne tatsächliche Trennung zwischen den Phasen in verschiedene Gefäße analysiert.

   5. Verfahren nach Anspruch1, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß einer von mehreren Ausführungsformen der Trennung die Flüssigkeit in einer festen Matrix immobilisiert und da-

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   durch in ein Fest-Flüssig-System oder Fest-Fest-System
   bringt.

   6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Erreichen des Gleichgewichts zwischen den beiden
   flüssigen Phasen ein hydrophobes und Lösungsmittefc-adsorbierendes festes Material zugibt zur Adsorption des den
   freien Liganden enthaltenden Lösungsmittels an dem festen
   Material.

   7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Kohlenwasserstoffe, Halogenkohlenwasserstoffe, Sauerstoffderivate von Kohlenwasserstoffen, Stickstoffderivate von Kohlenwasserstoffen oder
   Phosphorderivate von Kohlenwasserstoffen mit einer Kohlenwasser stoff komponente zwischen C, und C₂₀ verwendet.

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Methyl isobutylketom verwen¹-det.

   9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Chloroform verwendet.

   10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Dichioromethan verwendet.

   11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Kohlenstofftetrachlorid verwendet .

   12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel t-Amy!alkohol verwendet.

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   13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Benzylalkohol verwendet.

   14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Äthylacetat verwendet.

   15. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Hexan verwendet.

   16. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Isooctan verwendet.

   17. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel tert-Butylmethyläther verwendet.

   18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine automatisierte Verfahrensdurchführung anwendet.

   19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus Antigenen, Hormonen, Barbituraten, Steroiden, Vitaminen, Tranquilizern, Arzneimitteln oder Alkaloiden besteht.

   20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus Digoxin besteht.

   21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus Östriol besteht.

   22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus Thyroxin (T-4) besteht.

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   23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus 17 ß-östradiol besteht.

   24. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus Phenobarbiton besteht.

   25. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus Tetrahydrocannabinol besteht.

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