DE29925020U1 - Zusammengesetzte Arrays mit Mikrokügelchen - Google Patents

Zusammengesetzte Arrays mit Mikrokügelchen Download PDF

Info

Publication number
DE29925020U1
DE29925020U1 DE29925020U DE29925020U DE29925020U1 DE 29925020 U1 DE29925020 U1 DE 29925020U1 DE 29925020 U DE29925020 U DE 29925020U DE 29925020 U DE29925020 U DE 29925020U DE 29925020 U1 DE29925020 U1 DE 29925020U1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
array
beads
decoding
preferred
bead
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE29925020U
Other languages
English (en)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Illumina Inc
Original Assignee
Illumina Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26811698&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE29925020(U1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Illumina Inc filed Critical Illumina Inc
Publication of DE29925020U1 publication Critical patent/DE29925020U1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00279—Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00306—Reactor vessels in a multiple arrangement
    • B01J2219/00313—Reactor vessels in a multiple arrangement the reactor vessels being formed by arrays of wells in blocks
    • B01J2219/00315—Microtiter plates
    • B01J2219/00317—Microwell devices, i.e. having large numbers of wells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00382—Stamping
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/005—Beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00646—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports
    • B01J2219/00648—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports by the use of solid beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis

Abstract

Eine zusammengesetzte Array-Anordnung, umfassend:
(a) ein erstes Substrat (40), umfassend eine Vielzahl von Assay-Positionen (45);
(b) ein zweites Substrat, umfassend eine Vielzahl von Array-Positionen (20), wobei jede Array-Position eine Vielzahl von diskreten Stellen (25, 21, 22, 23) umfasst, worin besagte Array-Positionen (20) so konfiguriert sind, dass sie relativ zueinander bewegbar sind und
(c) mindestens ein erstes und ein zweites bioaktives Mittel, die an jede Array-Position gebunden sind, worin jede der besagten diskreten Stellen in besagten Array-Positionen nur eine einzige Art von bioaktivem Mittel enthält.

Description

  • Diese Anmeldung ist eine weiterführende Anmeldung von U.S.S.N.s 60/113,968, angemeldet am 28. Dezember 1998, und von 09/256,943, angemeldet am 24. Februar 1999.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf Sensor-Anordnungen, die aus einem zusammengesetzten Array einzelner Arrays zur gleichzeitigen Bearbeitung einer Anzahl von Proben bestehen. Die Erfindung umfasst auch Methoden zur Herstellung und Verwendung der zusammengesetzten Arrays.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es gibt eine Anzahl von Assays (Tests) und Sensoren zur Detektion der Anwesenheit und/oder Konzentration von spezifischen Substanzen in Flüssigkeiten und Gasen. Viele von diesen beruhen auf spezifischen Liganden-/Antiliganden-Reaktionen als Nachweismechanismus. Das bedeutet, dass sich Substanzpaare (d. h. die Bindungspaare oder Liganden/Antiliganden) zwar bekanntermaßen aneinander binden, aber nur wenig oder gar nicht an andere Substanzen. Dies war der Schwerpunkt einer Anzahl von Techniken, in denen diese Bindungspaare zur Detektion der komplexen Verbindungen eingesetzt werden. Diese werden im Allgemeinen so behandelt, dass eine Komponente der komplexen Verbindung in irgendeiner Weise markiert wird, um so den gesamten Komplex nachweisen zu können, z. B. unter Verwendung von Radioisotopen, fluores zierenden und anderen optisch aktiven Molekülen, Enzymen, usw.
  • Von besonderem Nutzen bei diesen Sensoren sind Nachweismechanismen unter Einsatz von Lumineszenz. In jüngster Zeit, besonders in den letzten 10 Jahren, hat der Einsatz von optischen Fasern und optischen Fasersträngen in Kombination mit lichtabsorbierenden Farbstoffen für chemisch-analytische Bestimmungen eine schnelle Entwicklung durchgemacht. Die Verwendung von optischen Fasern für solche Zwecke und Techniken wurde von folgenden Autoren beschrieben: Milanovich et al., "Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application", Proceedings of the SPIE 28th Annual International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics, Band 494, 1980; Seitz, W. R., "Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics" in C. R. C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Band 19, 1988, S. 135–173; Wolfbeis, O. S., "Fiber Optical Fluorosensors In Analytical Chemistry" in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications (S. G. Schulman, editor), Wiley & Sons, New York (1988); Angel, S. M., Spectroscopy 2 (4): 38 (1987); Walt, et al., "Chemical Sensors and Microinstrumentation", ACS Symposium Series, Band 403, 1989, S. 252, und Wolfbeis, O. S., Fiber Optic Chemical Sensors, Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2. Band.
  • In jüngerer Zeit wurden optische Fasersensoren konstruiert, die eine Verwendung von vielen Farbstoffen mit einem einzelnen, diskreten optischen Faserbündel ermöglichen. In den U.S. Pat.-Nummern 5,244,636 and 5,250,264 , erteilt an Walt, et al., werden Systeme zur Befestigung von vielen verschiedenen Farbstoffen auf dem distalen Bündelende offenbart, wobei die Aussagen jeder dieser Patente durch diese Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind. Durch die offenbarten Konfigurationen können einzelne optische Fasern des Bündels auf einzelne Farbstoffe optisch zugreifen. Dadurch wird das Problem der Entfaltung der einzelnen Signale im Licht, das von jedem Farbstoff zurückgeworfen wird, vermieden. Dieses Problem entsteht, wenn die Signale von zwei oder mehr Farbstoffen kombiniert werden, wobei jeder Farbstoff gegenüber einem anderen Analyten sensitiv ist und eine starke Überlappung in den Emissionsspektren der Farbstoffe besteht.
  • Im U.S.S.N.s 08/818,199 und 09/151,877 werden zusammengesetzte Arrays beschrieben, in denen Mikrokügelchen oder Kügelchen auf einer Substratoberfläche verwendet werden, beispielsweise am terminalen Ende eines optischen Faserbündels, wobei jede einzelne Faser aus einem Kügelchen mit einer optischen Signatur besteht. Weil sich die Kügelchen wahllos nach unten bewegen, ist eine einmalige optische Signatur erforderlich, um den Array zu „dekodieren”, d. h. nach der Herstellung des Arrays kann eine Korrelation der Position einer einzelnen Stelle auf dem Array mithilfe des Kügelchens oder des bioaktiven Mittels an dieser bestimmten Stelle hergestellt werden. Das bedeutet, dass die Kügelchen wahllos auf dem Array verteilt werden können, ein schneller und billiger Prozess im Vergleich mit entweder der in-situ-Synthese oder den Spotting-Techniken des Stands der Technik. Sobald der Array mit Kügelchen beladen ist, kann der Array dekodiert oder verwendet werden, wobei eine vollständige oder teilweise Dekodierung nach dem Testen erfolgt, wie es untenstehend vollständig beschrieben ist.
  • Weiterhin sind im U.S. Patent Nr. 5,545,531 Anordnungen beschrieben, die Silikon-Mikroplättchen beinhalten, die eine Vielzahl von Messsonden-Arrays in Mikrotiterplatten umfassen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In Übereinstimmung mit den obigen Aufgaben beinhaltet die vorliegende Erfindung zusammengesetzte Array-Anordnungen, die einen ersten Substrat mit einer Oberfläche umfassen, die eine Vielzahl von Assay-Positionen umfasst, wobei jede Assay-Position eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst. Das Substrat enthält weiterhin eine Population von Mikrokügelchen, die zumindest eine ersten und eine zweiten Subpopulation umfasst, wobei jede Subpopulation einen bioaktiven Mittel umfasst. Die Mikrokügelchen sind auf jeder der Assay-Positionen verteilt.
  • Als weiteren Aspekt enthält die Erfindung zusammengesetzte Array-Anordnungen, die aus einem ersten Substrat mit einer Oberfläche bestehen, die aus einer Vielzahl von Assay-Positionen besteht, und ein zweites Substrat, das aus einer Vielzahl von Array-Positionen besteht, wobei jede Array-Position diskrete Stellen umfasst. Die Anordnungen bestehen ferner aus einer Population von Mikrokügelchen, die mindestens aus einer ersten und einer zweiten Subpopulation bestehen, wobei jede Subpopulation aus einem bioaktiven Mittel besteht. Die Mikrokügelchen sind auf jeder der Array-Positionen verteilt.
  • Als zusätzlichen Aspekt enthält die vorliegende Erfindung Methoden zur Dekodierung von Array-Anordnungen, die aus dem Bereitstellen einer Array-Anordnung besteht, wie sie oben beschrieben ist, sowie den Zusatz einer Vielfalt von dekodierenden Bindungsliganden zur zusammengesetzten Array-Anordnung, um die Position mit mindestens einer Vielzahl der bioaktiven Mittel zu bestimmen.
  • Als weiteren Aspekt enthält die vorliegende Erfindung Methoden zur Bestimmung der Anwesenheit eines oder mehrerer Zielanalyten in einer oder mehreren Proben, welche aus der Verbindung der Probe mit einer Zusammensetzung, wie sie hier beschrieben ist, bestehen, sowie die Bestimmung der An- oder Abwesenheit des besagten Zielanalyts.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • Die 1A, 1B, 1C, 1D und 1E zeigen mehrere verschiedene „Zwei-Komponenten”-System-Ausführungen der Erfindung. In 1A ist ein Kügelchen-Array abgebildet. Das erste Substrat 10 besitzt Array-Positionen 20 mit Vertiefungen 25 und Kügelchen 30. Das zweite Substrat 40 besitzt Assay-Positionen 45. Eine optionale Linse oder ein Filter 60 ist auch abgebildet; wie Fachleute erkennen, kann dies auch substratintern sein. 1B ist ähnlich, außer dass keine Kügelchen verwendet werden; stattdessen haben die Array-Positionen 20 diskrete Stellen 21, 22, 23, usw., die beim Spotting, Aufdrucken, bei der Anwendung photolithographischer Techniken, usw. gebildet werden können. Die 1C–F zeigen die Anwendung einer Vielzahl von ersten Substraten. 1C zeigt ein „Kügelchen aus Kügelchen”, das bei Vermischungsfunktionen zusätzlichen Nutzen haben kann. 1D zeigt eine Vielzahl von Kügelchen-Arrays und 1E zeigt eine Vielzahl von Nicht-Kügelchen-Arrays. 1F zeigt die Nutzung von Bindungsfunktionalitäten an erste „Ziel”-Substrate 10 an Positionen auf dem zweiten Substrat 40; wie Fachleute erkennen, kann dies auf flachen zweiten Substraten oder auf kompartmentalisierten zweiten Substraten gemacht werden. In 1F werden Bindungsligandenpaare 70/70', 71/71', 72/72' usw. verwendet. Diese können entweder von chemischer oder biologischer Funktionalität sein, wie sie für IBL/DBL-Paare, wie z. B. Oligonukleotide, usw. beschrieben sind.
  • Die 2A und 2B zeigen zwei verschiedene „Ein-Komponenten”-Systeme. 2A zeigt ein Kügelchen-Array, wobei das Substrat 50 Assay-Positionen 45 mit Vertiefungen 25 enthält, die aus Kügelchen 30 bestehen. 2B zeigt einen Nicht-Kügelchen-Array; jede Assay-Position 45 hat diskrete Stellen 21, 22, 23, usw.
  • 3 zeigt Anhäufungen (Cluster) im hyperspektralen Alpha-Raum (α1 = I1/ΣIl, α2 = I2/Σj;, α3 = I3/Σj, usw.). Ein Satz von 128 verschiedenen Kügelchen-Typen auf einem Faserbündel wurde durch Hybridisierung einer Gruppe aus komplementären Oligonukleotiden dekodiert, die mit vier Farbstoffen markiert wurden: Bodipy-493, Bodipy-R6G, Bodipy-TXR und Bod-564 (nur ein Farbstoff pro Oligonukleotid). Abgebildet ist das zweite Stadium eines Vier-Stadium-Dekoders, in dem 4013 Kügelchen dekodiert wurden. Die Farbton-Cluster wurden mit Eilinien umrandet.
  • 4 zeigt einen Zweifarben-Dekodierungsprozess, bei dem entweder FAM-markierte oder Cy3-markierte Oligo-Komplemente zum „Anmalen” (Markierung) der verschiedenen Kügelchen-Typen auf dem Array verwendet werden.
  • 5 zeigt die Dekodierung 128 verschiedener Kügelchen-Typen mit vier Farben und vier Dekodierungsstadien. (Das eingefügte Bild zeigt ein einziges Dekodierungsstadium unter Verwendung von vier verschiedenen Farbstoffen zur Dekodierung von 16 Kügelchen-Typen.)
  • 6 zeigt die Grauskalen-Dekodierung von 16 verschiedenen Kügelchen-Typen. (A) Kombinatorisches Vereinigungsschema für komplementäre Dekodierungs-Oligos. (B) Es wurden zwei unabhängige, normierte Bilder angefertigt und die resultierenden Kügelchen-Intensitäten verglichen. (C) Die Alpha-Werte (Verhältnis von Kügelchen-Intensität im angezeigten Dekodierungsstadium zur Intensität im normierten Bild) sind für drei Dekodierungsstadien angegeben, wie sie in (A) beschrieben ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Bildung von Arrays sehr hoher Dichte, mit denen Simultananalysen durchgeführt werden können, d. h. eine Parallel- statt Serienverarbeitung einer Anzahl von Proben. Dies wird durch die Bildung eines „Arrays aus Arrays” erreicht, d. h. ein zusammengesetztes Array, das aus einer Vielzahl von einzelnen Arrays besteht, das zur Verarbeitung vieler Proben konfiguriert ist. Beispielsweise ist jedes einzelne Array in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte vorhanden. Daher kann, je nach Größe der Mikrotiterplatte und der Größe des einzelnen Arrays, eine sehr große Anzahl von Assays gleichzeitig durchgeführt werden; beispielsweise können bei Verwendung von einzelnen Arrays aus 2.000 distinkten Arten (mit hohem eingebauten Redundanzgrad) und einer 96-Loch-Mikrotiterplatte 192.000 Experimente gleichzeitig durchgeführt werden; die gleichen Arrays in einer 384-Mikrotiterplatte ergeben 768.000 simultane Experimente, und eine 1536-Mikcrotiterplatte ermöglicht 3.072.000 Experi mente.
  • Im Allgemeinen können die Array-Anordnungen in dieser Erfindung auf verschiedene Weise konfiguriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, wird ein ”Ein-Komponenten”-System verwendet. Das bedeutet, ein erstes Substrat, das aus einer Vielzahl von Assay-Positionen besteht, (vorliegend auch manchmal als „Assay-Vertiefungen” bezeichnet), wie z. B. eine Mikrotiterplatte, wird so konfiguriert, dass jede Assay-Position ein einzelnes Array enthält. Das bedeutet, dass Assay- und Array-Position identisch sind. Beispielsweise kann das Plastikmaterial der Mikrotiterplatte so ausgestaltet werden, dass es eine Vielzahl von „Kügelchen-Vertiefungen” im unteren Teil einer jeden Assay-Vertiefung aufweist. Die Kügelchen, die bioaktive Mittel enthalten, können dann in die Kügelchen-Vertiefungen in jeder Assay-Position gefüllt werden, wie es unten ausführlicher beschrieben wird. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass, obwohl in der vorliegenden Offenlegung die Verwendung von Kügelchen betont wird, die Kügelchen in keiner der Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden müssen; die bioaktiven Mittel können auch direkt an die Array-Positionen gebunden werden. Beispielsweise sind andere Typen von Arrays gut bekannt und können in dieser Ausführung verwendet werden; „spotted” (bepunktete), bedruckte oder photolithographische Arrays sind gut bekannt; siehe beispielsweise WO 95/25116 ; WO 95/35505 ; PCT US98/09163 : U.S. Patent Nummern 5,700,637 ; 5,807,522 und 5,445,934 ; und U.S.S.N.s 08/851,203 09/187,289 ; und dort zitierte Quellenangaben, die alle durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind. In den Ein-Komponenten-Systemen werden, falls keine Kügelchen verwendet werden, in den bevorzugten Ausführungsformen Nicht-Silikon-Mikroplättchen-Substrate verwendet.
  • Alternativ kann ein „Zwei-Komponenten”-System verwendet werden. In dieser Ausführungsform werden die einzelnen Arrays auf einem zweiten Substrat gebildet, das dann in das erste Mikrotiterplatten-Substrat eingepasst oder „einge taucht” wird. Wie Fachleute erkennen, kann eine Vielzahl von Array-Ausführungen und Konfigurationen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können optische Faserbündel als einzelne Arrays verwendet werden, im Allgemeinen mit einer „Kügelchen-Vertiefung”, die in eine Oberfläche einer jeden Einzelfaser geätzt wird, und zwar so, dass die Kügelchen mit dem bioaktiven Mittel auf das Ende des optischen Faserbündels aufgeladen werden. Der zusammengesetzte Array umfasst daher eine Anzahl von einzelnen Arrays, die so konfiguriert sind, dass sie in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte passen. Alternativ können in einem Zwei-Komponenten-System auch andere Typen von Array-Ausführungen verwendet werden. So können beispielsweise Angeordnete Arrays, wie z. B. solche, die durch Spotting-, Aufdruck- oder photolithographische Techniken hergestellt wurden, auf das zweite Substrat platziert werden, wie oben dargestellt. Darüber hinaus können „Teile” von Arrays, entweder willkürlich oder sortiert, als erstes Substrat verwendet werden, wie in den 1C–F gezeigt.
  • Die vorliegende Erfindung beruht im Allgemeinen auf früheren Arbeiten, die aus einem Kügelchen-basierten System der analytischen Chemie bestehen, in dem Kügelchen, auch Mikrokügelchen genannt, mit verschiedenen chemischen Funktionalitäten auf einem Substrat verteilt werden, das aus einer gemusterten Oberfläche diskreter Stellen besteht, welche die einzelnen Mikrokügelchen binden können. Die Kügelchen werden im Allgemeinen wahllos auf das Substrat gebracht, und daher können mehrere verschiedene Methoden angewandt werden, um die Arrays zu „dekodieren”. In einer Ausführungsform werden einmalige optische Signaturen in die Kügelchen eingebracht, im Allgemeinen Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Identifizierung der chemischen Funktionalität auf jedem einzelnen Kügelchen verwendet werden könnten. Dadurch können die Wirkstoff-Kandidaten (d. h. Verbindungen wie z. B. Nukleinsäuren und Antikörper) getrennt von ihrer Platzierung auf einem Array synthetisiert werden, d. h. die Wirkstoff-Kandidaten können auf den Kügelchen synthetisiert werden, und dann werden die Kügelchen wahllos auf einer gemusterten Oberfläche verteilt. Weil die Kügel chen zuerst mit einer optischen Signatur kodiert werden, bedeutet dies, dass der Array später „dekodiert” werden kann, d. h. nach der Herstellung des Arrays kann die Position einer einzelnen Stelle auf dem Array mit dem Kügelchen oder Wirkstoff-Kandidaten an dieser bestimmten Stelle korreliert werden. Das bedeutet, dass die Kügelchen auf dem Array wahllos verteilt werden können, ein schneller und billiger Prozess im Vergleich zu entweder der in-situ-Synthese oder den Spotting-Techniken des Stands der Technik. Diese Methoden werden allgemein im PCT US98/05025 ; PCT US98/21193 ; PCT US99/20914 ; PCT US99/14387 und U.S.S.N.s 08/818,199 ; 09/315,584 und 09/151,877 beschrieben, die alle durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind. Obwohl die hier geführte Diskussion im Allgemeinen auf die Anwendung von Kügelchen gerichtet ist, können darüber hinaus dieselben Anordnungen auf Zellen und andere Partikel angewandt werden; siehe beispielsweise PCT US99/04473 .
  • Bei diesen Systemen erfolgt die Platzierung der bioaktiven Mittel im Allgemeinen wahllos, und daher ist ein Kodierungs-/Dekodierungs-System erforderlich, um das bioaktive Mittel an jeder Position im Array zu identifizieren. Das kann auf verschiedenem Wege geschehen, wie es unten ausführlicher beschrieben wird, und beinhaltet im Allgemeinen: a) die Anwendung eines dekodierenden Bindungsliganden (DBL), im Allgemeinen direkt markiert, der entweder an das bioaktive Mittel oder an Identifikator-Bindungsliganden (IBLs) bindet, die an den Kügelchen befestigt sind; b) positionale Dekodierung, beispielsweise entweder durch Vorherbestimmung der Kügelchen-Platzierung (beispielsweise durch Anwendung von photoaktivierbaren oder photospaltbaren Komponenten, damit Kügelchen selektiv zu bestimmten Positionen hinzugefügt werden können) oder durch die Anwendung von entweder Unterbündeln oder selektiver Beladung der Stellen, wie es unten ausführlicher beschrieben ist; c) selektive Dekodierung, wobei nur solche Kügelchen, die an ein Ziel binden, dekodiert werden; oder d) beliebige Kombinationen dieser. In einigen Fällen, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, kann diese Dekodierung für alle Kügelchen erfolgen oder nur für diejenigen, die ein bestimmtes Zielanalyt binden. Ebenso kann dies entweder vor der nach der Hinzugabe eines Zielanalyten erfolgen.
  • Sobald die Identität (d. h. das tatsächliche Mittel) und die Position eines jeden Mikrokügelchens im Array bestimmt wurde, wird der Array mit den Proben zusammengebracht, welche die Zielanalyte enthalten, obwohl dies, wie es unten beschrieben ist, vor oder auch während der Analyse geschehen kann. Die Zielanalyten binden die bioaktiven Mittel, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, und führt zu einer Veränderung im optischen Signal des bestimmten Kügelchens.
  • In der vorliegenden Erfindung können für die „Dekodierung” optische Signaturen verwendet werden, dekodierende Bindungsliganden, die während eines Dekodierungsschrittes zugesetzt werden oder eine Kombination dieser Methoden. Die dekodierenden Bindungsliganden binden entweder an einen distinkten Identifikator-Bindungsligandenpartner, der auf die Kügelchen gegeben wurde, oder an das bioaktive Mittel selber, beispielsweise wenn die Kügelchen aus einsträngigen Nukleinsäuren als bioaktive Mittel bestehen. Die dekodierenden Bindungsliganden sind entweder direkt oder indirekt markiert, und daher erfolgt die Dekodierung durch den Nachweis der Anwesenheit der Markierung. Durch die sequenzielle Verwendung von Pools mit dekodierenden Bindungsliganden ist es möglich, die Anzahl der erforderlichen Dekodierungsschritte stark zu minimieren.
  • Entsprechend liefert die vorliegende Erfindung zusammengesetzte Array-Anordnungen, die aus mindestens einem ersten Substrat mit einer Oberfläche bestehen, die aus einer Vielzahl von Assay-Positionen besteht. Mit „Array” ist vorliegend eine Vielzahl von Wirkstoff-Kandidaten in einer Array-Ausführung gemeint; die Größe des Arrays hängt dabei von der Anordnung und dem Verwendungszweck des Arrays ab. Es können Arrays hergestellt werden, die ungefähr 2 bis viele Millionen verschiedene bioaktive Mittel (d. h. unterschiedliche Kügelchen) enthalten, wobei sehr große optische Faser-Arrays möglich sind. Im Allgemeinen wird der Array zwei bis mindestens eine Milliarde umfassen, je nach Grö ße der Kügelchen und des Substrats sowie dem Verwendungszweck des Arrays. Daher können Arrays sehr hoher Dichte, hoher Dichte, mittlerer Dichte, geringer Dichte und sehr geringer Dichte hergestellt werden. Die bevorzugten Spannbreiten für Arrays sehr hoher Dichte reichen von ungefähr 10.000.000 bis ungefähr 2.000.000.000, (wobei alle Zahlen pro Quadratzentimeter gelten), wobei ein Bereich von ungefähr 100.000.000 bis ungefähr 1.000.000.000 bevorzugt wird. Arrays hoher Dichte liegen zwischen 100.000 und ungefähr 10.000.000, wobei der Bereich von ungefähr 1.000.000 bis ungefähr 5.000.000 besonders bevorzugt wird. Die besonders bevorzugten Arrays von mittlerer Dichte liegen zwischen ungefähr 10.000 bis ungefähr 100.000, wobei der Bereich zwischen ungefähr 20.000 und ungefähr 50.000 speziell bevorzugt wird. Arrays geringer Dichte liegen im Allgemeinen bei weniger als 10.000, wobei der Bereich zwischen ungefähr 1.000 bis ungefähr 5.000 bevorzugt wird. Arrays von sehr geringer Dichte liegen bei weniger als 1.000, wobei der Bereich zwischen ungefähr 10 und ungefähr 1000 bevorzugt wird, wobei der Bereich zwischen ungefähr 100 bis ungefähr 500 besonders bevorzugt wird. Bei einigen Ausführungsformen liegen die Anordnungen der Erfindung möglicherweise nicht in einer Array-Ausführung vor, das heißt, bei einigen Ausführungsformen können auch Ausführungen hergestellt werden, die nur aus einem einzigen bioaktiven Mittel bestehen. Weiterhin können bei einigen Arrays auch mehrere Substrate verwendet werden, und zwar entweder identischer oder verschiedener Zusammensetzungen. Daher können große Arrays beispielsweise aus einer Vielzahl kleinerer Substrate bestehen.
  • Weiterhin ist ein Vorteil der vorliegenden Ausführungen, dass besonders durch die Anwendung der Faseroptik-Technologie Arrays extrem hoher Dichte hergestellt werden können. Daher ist es beispielsweise möglich – weil Kügelchen einer Größe von 200 μm oder kleiner (wobei Kügelchen von 200 nm möglich sind) verwendet werden können und sehr kleine Fasern bekannt sind – in einem optischen Faserbündel von 1 mm2 mindestens 40.000 bis 50.000 oder mehr (in einigen Fällen 1 Million) verschiedene Fasern und Kügelchen unterzubringen, mit Dichten von mehr als 15.000.000 einzelnen Kügelchen und Fasern (wie ge sagt, in einigen Fällen mindestens 25–50 Millionen) pro 0,5 cm2, die erreichbar sind.
  • Mit „zusammengesetztem Array” oder „Kombinations-Array” oder vorliegend enthaltenen grammatikalischen Äquivalenten ist eine Vielzahl von einzelnen Arrays gemeint, wie oben dargestellt. Im Allgemeinen ist die Anzahl einzelner Arrays durch die Größe der verwendeten Mikrotiterplatte vorgegeben. Daher werden bei 96-Loch-, 384-Loch- und 1536-Loch-Mikrotiterplatten zusammengesetzte Arrays verwendet, die aus 96, 384 und 1536 einzelnen Arrays bestehen, obwohl, wie Fachleute erkennen, nicht jeder Mikrotiter ein einzelnes Array enthalten muss. Es sollte angemerkt werden, dass die zusammengesetzten Arrays aus einzelnen Arrays bestehen können, die identisch, ähnlich oder verschieden sind. Das heißt, bei einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, dieselben 2000 Assays bei 96 verschiedenen Proben laufen zu lassen. Alternativ könnte die Durchführung von 192.000 Experimenten bei der gleichen Probe (d. h. die gleiche Probe in jeder der 96 Vertiefungen) wünschenswert sein. Alternativ könnten alle Reihen oder Kolonnen des zusammengesetzten Arrays identisch sein, und zwar aus Gründen der Redundanz-/Qualitätskontrolle. Wie Fachleute erkennen, gibt es eine Vielzahl von Möglichkeiten, das System zu konfigurieren. Weiterhin könnte die zufällige Natur der Arrays bedeuten, dass dieselbe Population Kügelchen auf zwei verschiedene Oberflächen zugesetzt werden kann, was zu im Wesentlichen ähnlichen, aber vielleicht nicht zu identischen Arrays führt.
  • Mit „Substrat” oder „fester Träger” oder anderen vorliegend enthaltenen grammatikalischen Äquivalenten ist jedes Material gemeint, das so verändert werden kann, dass es diskrete, einzelne Stellen enthält, die zur Anlagerung oder Verbindung der Kügelchen geeignet sind, und das für mindestens eine Nachweismethode geeignet ist. Wie Fachleute erkennen, ist die Anzahl möglicher Substrate sehr groß. Mögliche Substrate sind z. B. Glas und modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe (u. a. Acryle, Polystyrol und Copolymere von Styren und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyu rethane, TeflonJ, usw), Polysaccharide, Nylon oder Nitrocellulose, Harze, Kieselsäure oder auf Kieselsäure basierende Materialien, z. B. Silikon und modifiziertes Silikon, Kohlenstoff, Metalle, anorganische Gläser, Kunststoffe, optische Faserbündel und eine Vielzahl von sonstigen Polymeren, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist. Im Allgemeinen ist mit den Substraten ein optischer Nachweis möglich und sie selber fluoreszieren nicht merklich.
  • Im Allgemeinen ist das Substrat flach (planar), obwohl Fachleute erkennen, dass auch andere Substratkonfigurationen verwendet werden können. Es können beispielsweise dreidimensionale Konfigurationen verwendet werden, beispielsweise durch Einbettung der Kügelchen in einen porösen Kunststoffblock, der einen Probenzugang zu den Kügelchen und die Verwendung eines konfokalen Mikroskops zur Detektion ermöglicht. Ebenso können die Kügelchen zur Minimierung des Probenvolumens auf die Innenoberfläche eines Reagenzglases platziert werden, um eine Durchfluss-Probenanalyse durchzuführen. Bevorzugte Substrate sind z. B. optische Faserbündel, wie sie unten diskutiert werden, und flache (planare) Substrate, z. B. Glas, Polystyren und andere Kunststoffe und Acryle. Bei einigen Ausführungsformen werden Silikon-Mikroplättchen-Substrate nicht bevorzugt.
  • Das erste Substrat besteht aus einer Oberfläche, die aus einer Vielzahl von Assay-Positionen besteht, d. h. die Position, wo der Assay zur Detektion des Zielanalyten durchgeführt wird. Die Assay-Positionen sind im Allgemeinen physisch voneinander getrennt, beispielsweise als Assay-Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte, obwohl auch andere Konfigurationen (Hydrophobizität/Hydrophilizität, usw.) zur Trennung der Assay-Positionen verwendet werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Substrat ein optisches Faserbündel oder -Array, wie er allgemein im U.S.S.N.s 08/944,850 und 08/519,062 , PCT US98/05025 und PCT US98/09163 beschrieben wurde, die alle durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden vorgeformte, einheitliche optische Faser-Arrays verwendet. Mit „vorgeformtem, einheitlichen optischen Faser-Array” ist hier ein Array aus diskreten einzelnen optischen Fasersträngen gemeint, die koaxial angeordnet werden und längsseits verbunden sind. Die Fasterstränge sind im Allgemeinen einzeln verkleidet. Eine Sache jedoch, die einen vorgeformten, einheitlichen Array von anderen optischen Faser-Ausführungen unterscheidet ist, dass die Fasern nicht einzeln physisch zu manipulieren sind, das heißt, ein Strang kann im Allgemeinen an keiner Stelle längsseits von einem anderen Fasterstrang physisch getrennt werden.
  • In einigen „Zwei-Komponenten”-Ausführungsformen ist das zweite Substrat jedoch kein optischer Faser-Array.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Assay-Positionen (des „Ein-Komponenten-Systems”) oder die Array-Positionen (des „Zwei-Komponenten-Systems”) aus einer Vielzahl von diskreten Stellen. Daher ist im ersteren Fall die Assay-Position mit der Array-Stelle identisch, wie es vorliegend beschrieben ist. Im letzteren Fall ist die Array-Position getrennt in die Assay-Stelle eingepasst. Bei diesen Ausführungsformen wurde mindestens eine Oberfläche des Substrates so modifiziert, dass sie diskrete, einzelne Stellen zur späteren Verbindung von Mikrokügelchen enthält (oder, wenn keine Mikrokügelchen verwendet werden, zur Anlagerung des bioaktiven Mittels). Diese Stellen können aus physisch veränderten Stellen bestehen, d. h. physische Konfigurationen, wie z. B. Vertiefungen oder kleine Einsenkungen im Substrat, welche die Kügelchen zurückhalten, und zwar so, dass ein Mikrokügelchen in der Vertiefung ruhen kann oder es wurden andere Kräfte (magnetisch oder kompressiv) eingesetzt oder chemisch veränderte oder aktive Stellen, wie z. B. chemisch funktionalisierte Stellen, elektrostatisch veränderte Stellen, hydrophobisch funktionalisierte Stellen, Klebestellen, usw.
  • Die Stellen können ein Muster darstellen, d. h. ein regelmäßiges Design oder eine Konfiguration, oder wahllos verteilt sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein regelmäßiges Muster der Stellen verwendet, und zwar so, dass die Stellen in der X-Y-Koordinatenebene zugänglich sind. „Muster” in diesem Sinne beinhaltet eine sich wiederholende Einheitszelle, bevorzugterweise eine, mit der eine hohe Kügelchendichte auf dem Substrat erreicht werden kann. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass diese Stellen möglicherweise keine diskreten Stellen sind. Das heißt, es ist beispielsweise möglich, eine einheitliche Oberfläche mit adhäsiven oder chemischen Funktionalitäten zu verwenden, mit der die Anlagerung von Kügelchen an jede Stelle erzielt werden kann. Das heißt, die Oberfläche des Substrats wurde modifiziert, damit eine Anlagerung der Mikrokügelchen an einzelne Stellen erzielt wird, unabhängig davon, ob diese Stellen mit anderen Stellen benachbart sind oder nicht. Daher kann die Oberfläche des Substrats so verändert werden, dass diskrete Stellen gebildet werden, die nur ein einziges zugehöriges Kügelchen enthalten oder, alternativ, die Oberfläche des Substrats wird modifiziert und die Kügelchen können sich überall nach unten bewegen, aber sie gelangen an diskrete Stellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche des Substrats durch die Herstellung von Vertiefungen, d. h. Einsenkungen auf der Oberfläche des Substrats, verändert. Dies kann, wie dem Allgemeinen Stand der Technik bekannt, durch eine Vielzahl von Techniken geschehen, z. B. Photolitographie, Stempeltechniken, Pressformtechniken und Mikroätztechniken, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist. Wie Fachleute erkennen, hängt die Art der angewandten Technik von der Anordnung und Form des Substrats ab. Wenn das erste Substrat sowohl aus der Assay-Positionen als auch der einzelnen Arrays besteht, wird in einer bevorzugten Ausführungsform die Pressformtechnik angewandt, mit der die Kügelchen-Vertiefungen im Boden der Assay-Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte hergestellt werden. Ebenso wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein ausgeformtes zweites Substrat verwendet, das aus „Fingern” oder Verlängerungen in einer Array-Ausführung besteht, und jeder Finger besteht aus Kügelchen-Vertiefungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden physische Veränderungen in einer Oberfläche des Substrats vorgenommen, um die Stellen herzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Substrats beispielsweise ein terminales Ende des Faserbündels, wenn das zweite Substrat ein optisches Faserbündel ist, wie es allgemein in 08/818,199 und 091151,877 beschrieben ist, die beide durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind. Bei dieser Ausführungsform werden Vertiefungen in einem terminalen oder distalen Ende eines optischen Faserbündels hergestellt, das aus einzelnen Fasern besteht. Bei dieser Ausführungsform wird das Innerste der einzelnen Fasern geätzt, hinsichtlich der Verkleidung, sodass kleine Vertiefungen oder Einsenkungen am einen Ende der Fasern gebildet werden. Die erforderliche Tiefe der Vertiefungen hängt von der Größe der Kügelchen ab, die in die Vertiefungen gegeben werden sollen.
  • In dieser Ausführungsform binden sich die Mikrokügelchen im Allgemeinen in den Vertiefungen nicht kovalent aneinander, und – obwohl die Vertiefungen zusätzlich chemisch funktionalisiert wurden, wie es allgemein unten beschrieben wurde – können Vernetzungsmittel oder eine physische Barriere angewandt werden, d. h. eine Beschichtung oder Membrane über den Kügelchen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche des Substrats so verändert, dass sie modifizierte Stellen enthält, besonders chemisch modifizierte Stellen, die zur Anlagerung (entweder kovalent oder nicht kovalent) der Mikrokügelchen der Erfindung an die diskreten Stellen oder Positionen auf dem Substrat genutzt werden können. „Chemisch modifizierte Stellen” beinhalten in diesem Zusammenhang z. B. die Hinzufügung eines Musters aus chemisch funktionalen Gruppen, u. a. Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen zur kovalenten Anlagerung von Mikrokügelchen, die im Allgemeinen auch korrespondierende, reaktive funktionale Gruppen enthalten, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist; die Hinzufügung eines Musters aus Klebemitteln zur Bindung der Mikrokügelchen (entweder durch vorhergehende chemische Funktionalisierung für das Hinzufügen der Klebestoffe oder direkte Hinzufügung des Klebemittels); die Hinzufügung eines Musters aus geladenen Gruppen (ähnlich den chemischen Funktionalitäten) zur elektrostatischen Anlagerung der Mikrokügelchen, d. h. wenn die Mikrokügelchen aus geladenen Gruppen bestehen, die den Stellen entgegengesetzt sind; die Hinzufügung eines Musters aus chemisch-funktionalen Gruppen, das die Stellen unterschiedlich hydrophob oder hydrophil macht, so dass die Hinzufügung von ähnlich hydrophoben oder hydrophilen Mikrokügelchen unter passenden experimentellen Bedingungen auf Grundlage der Hydroaffinität zur einer Verbindung der Mikrokügelchen mit den Stellen führt. Beispielsweise treibt der Einsatz von hydrophoben Stellen mit hydrophoben Kügelchen in einem wässrigen System die Verbindung der Kügelchen bevorzugt auf die Stellen.
  • Weiterhin können biologisch modifizierte Stellen zur Anlagerung der Kügelchen an das Substrat verwendet werden. Beispielsweise können die Bindungsligandenpaare, wie sie vorliegend im Allgemeinen beschrieben werden, verwendet werden; ein Partner befindet sich auf dem Kügelchen und der andere auf dem Substrat. Besonders bevorzugt in dieser Ausführungsform sind komplementäre Nukleinsäurestränge und Antigen/Antikörper-Paare.
  • Darüber hinaus können durch die Verwendung von biologischen Komponenten auf diese Weise auch zusammengesetzten Arrays gebildet werden. Dies ist analog zu dem System in 1F, außer, dass das Substrat 10 fehlt. Bei dieser Ausführungsform umfassen die Populationen von Kügelchen einen einzigen Bindungspartner, und die Subpopulationen dieser Population besitzen verschiedene bioaktive Mittel. Durch die Verwendung von verschiedenen Populationen mit verschiedenen Bindungspartnern und eines Substrates, das aus verschiedenen Assay- oder Array-Positionen mit räumlich getrennten Bindungspartnern besteht, kann ein zusammengesetzter Array gebildet werden. Diese Ausführungsform auch eine Wiederverwendung von Codes, wie es allgemein unten beschrie ben ist, weil jeder einzelne Array des zusammengesetzten Arrays die gleichen Codes verwenden kann.
  • Wie es oben beschrieben wurde, bedeutet „Muster” in diesem Sinne die Anwendung einer einheitlichen Behandlung der Oberfläche, damit die Kügelchen an die diskreten Stellen anlagern können, ebenso wie eine Behandlung der Oberfläche, die zu diskreten Stellen führt. Wie Fachleute erkennen, kann dies mit einer Vielzahl von Methoden erreicht werden.
  • Wie Fachleute erkennen, gibt es eine Vielzahl von möglichen Systemkonfigurationen, wie es allgemein in den Abbildungen dargestellt ist. Außer den hierin beschriebenen Standardformaten, kann auch eine Vielzahl anderer Formate verwendet werden. Beispielsweise, wie in den 1C–1F dargestellt, können „Teile” der Substrate verwendet werden, die nicht miteinander verbunden sind. Wie gesagt, diese können die gleichen oder verschiedene Arrays sein. Diese Teile können einzeln oder als große Einheit auf einem einzigen Substrat hergestellt werden, und dann wird das Substrat in verschiedene einzelne Substrate geschnitten oder getrennt. Daher zeigen die 1C und 1D beispielsweise eine Vielzahl von Kügelchen-Arrays, die in die Vertiefungen des zweiten Substrats gegeben werden. 1C zeigt ein „Kügelchen aus Kügelchen”, das zur Maximierung des Gemisches konfiguriert wurde. In 1D ist die Vielzahl von planaren ersten Substraten abgebildet. Wie Fachleute erkennen, können diese zur Bindung an das zweite Substrat verwendet werden oder auch nicht. Bei einer Ausführungsform werden keine besonderen Anlagerungsmethoden verwendet. Alternativ wird eine Vielzahl von Bindungstechniken angewandt. Es können beispielsweise, wie es für die Anlagerung von Kügelchen an Substrate beschrieben wurde, kovalente oder nicht kovalente Kräfte eingesetzt werden, u. a. die Verwendung von Klebemittel, chemische Substanzen, hydrophoben/hydrophilen Interaktionen, usw. Weiterhin kann das Substrat magnetisch sein und auch durch magnetische Kräfte festgehalten (und optional vermischt) werden. Daher können beispielsweise, wie in 1F dargestellt, Bindungskompo nenten verwendet werden. Diese können kovalente oder nicht kovalente Bindungen sein. Sie können einfach nur für die Anlagerung oder zur Hinführung des ersten Substrat-Arrays zu bestimmten Positionen im oder auf dem zweiten Substrat verwendet werden. Daher können beispielsweise verschiedene Oligonukleotide zur Hinführung und Anlagerung des ersten Substrats an das zweite Substrat verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind optische Eigenschaften in das Substrat zur Nutzung bei bildgebenden Verfahren eingebaut. Daher können beispielsweise „Linsen”-Fähigkeiten in das Substrat eingebaut werden, entweder in das Ein-Komponenten- oder das Zwei-Komponenten-System. Bei einem Ein-Komponenten-System können sich beispielsweise auf dem Boden einer oder mehrerer der Assay-Positionen einmalige oder spezielle optische Komponenten, wie z. B. Linsen oder Filter, befinden.
  • Weiterhin können bei bevorzugten Ausführungsformen Konfigurationen verwendet werden, welche die Vermischung bei der Assay-Reaktion fördern.
  • Bei bevorzugten Ausführungsformen werden beispielsweise Zwei-Komponenten-Systeme verwendet, die eine Vermischung ermöglichen. Das heißt, dass bei einigen Ausführungsformen die Arrays aus dem Block herausragen und als „Stöckchen” verwendet werden können, das die Reaktionskomponenten umrührt, um eine gute Vermischung der Assay-Komponenten zu fördern, die Kinetik der Reaktion zu verbessern, usw. Wie Fachleute erkennen, kann dies mit einer Vielzahl von Methoden erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erste und zweite Substrat so konfiguriert, dass es gegeneinander bewegt werden kann, und zwar entweder in der X-Y-Koordinatenebene, der X-Z-Koordinatenebene, der Y-Z-Koordinatenebene oder in drei Richtungen (X-Y-Z). Bei bevorzugten Ausführungsformen wird eine Block-Vorrichtung verwendet, mit welcher der Block entweder in Richtung der Plattenebene oder orthogonal zu dieser frei bewegt werden kann. Dies ist besonders nützlich, wenn die Reaktionsvo lumina klein sind, weil die Standard-Vermischungsbedingungen unter diesen Umständen oft nicht gut funktionieren.
  • In Ergänzung dazu, oder stattdessen, können zusätzliche Mischungskomponenten als Teil des Systems vorhanden sein. Es können beispielsweise exogene Mischpartikel zugesetzt werden; bei einer Ausführungsform werden beispielsweise Magnetpartikel verwendet, wobei ein Magnet bewegt wird, um die Vermischung zu fördern; es können beispielsweise kleine magnetische Mischungsstäbe und magnetische Rührplatten verwendet werden.
  • Alternativ kann die Vermischung in entweder Ein- oder Zwei-Komponenten-Systemen durch Verschluss und Schütteln des Systems mithilfe von Standardtechniken erreicht werden, optional durch die Verwendung von Mischpartikeln.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Anordnungen der Erfindung ferner aus einer Population von Mikrokügelchen. Mit „Population” ist vorliegend eine Vielzahl von Kügelchen gemeint, wie es oben für Arrays beschrieben ist. Innerhalb der Population bestehen einzelne Subpopulationen, die ein einziges Mikrokügelchen oder viele identische Mikrokügelchen sein können. Das heißt, dass bei einigen Ausführungsformen, wie es unten vollständig beschrieben ist, der Array nur ein einziges Mikrokügelchen für jedes bioaktive Mittel enthalten kann; bei bevorzugten Ausführungsformen wird eine Vielzahl von Kügelchen einer jeden Art verwendet.
  • Mit „Mikrokügelchen” oder „Kügelchen” oder „Partikel” oder vorliegend enthaltenen grammatikalischen Äquivalenten sind kleine diskrete Partikel gemeint. Die Zusammensetzung der Kügelchen variiert, je nach der Klasse des bioaktiven Mittels und der Synthesemethode. Geeignete Kügelchen-Zusammensetzungen beinhalten beispielsweise solche, die bei Peptiden, Nukleinsäuren und der organischen Komponentensynthese verwendet werden, z. B. Kunststoffe, Keramiken, Glas, Polystyren, Methylstyren, Acrylipolymere, paramagnetische Materialien, Thorerdelösung, Kohlegraphit, Titandioxid, Latex oder vernetzte Dextrane wie z. B. Sepharose, Cellulose, Nylon, vernetzte Mizellen und Teflon können alle verwendet werden, wobei diese Aufzahlung nicht abschließend ist. „Microsphere Detection Guide” (Anleitung zur Detektion von Mikrokügelchen) von Bangs Laboratories, Fishers IN, ist eine nützliche Anleitung.)
  • Die Kügelchen müssen nicht späherisch sein; es können auch unrunde Partikel verwendet werden. Weiterhin können die Kügelchen porös sein, wodurch die Oberfläche der Kügelchen, die entweder zur Anlagerung des bioaktiven Mittels oder zur IBL-Anlagerung zur Verfügung steht, vergrößert wird. Die Kügelchen-Größen fangen im Nanometerbereich an, d. h. 100 nm, und reichen bis in den Millimeterbereich, d. h. 1 mm, wobei Kügelchen zwischen ungefähr 0,2 Mikron bis ungefähr 200 Mikrons bevorzugt werden, und wobei ungefähr 0,5 bis ungefähr 5 Mikron besonders bevorzugt werden, obwohl bei einigen Ausführungsformen kleinere Kügelchen verwendet werden können.
  • Es sollte erwähnt werden, dass eine Hauptkomponente der Erfindung die Verwendung eines Substrat/Kügelchen-Paares ist, das die Verbindung oder Anlagerung der Kügelchen an diskrete Stellen auf der Oberfläche des Substrats ermöglicht, und zwar so, dass sich die Kügelchen während des Assays nicht bewegen.
  • Jedes Mikrokügelchen besteht aus einem bioaktiven Mittel, obwohl, wie Fachleute erkennen, es einige Kügelchen geben kann, die kein bioaktives Mittel enthalten, je nach der Synthesemethode. Mit einem „bioaktiven Wirkstoff-Kandidaten” oder „bioaktiven Mittel” oder „chemischer Funktionalität” oder „Bindungsligand” ist vorliegend die Beschreibung irgendeines Moleküls gemeint, z. B. Protein, Oligopeptid, kleines organisches Molekül, Koordinationskomplex, Polysaccharid, Polynucleotid, usw., das an die Mikrokügelchen in dieser Erfindung angelagert werden kann. Es versteht sich, dass die Anordnungen in dieser Erfindung zwei wichtige Hauptverwendungszwecke aufweisen. In einer bevor zugten Ausführungsform, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, werden die Anordnungen zur Detektion der Anwesenheit eines bestimmten Zielanalyten verwendet; beispielsweise die An- oder Abwesenheit einer bestimmten Nukleotidsequenz oder eines bestimmten Proteins, wie z. B. eines Enzyms, Antikörpers oder Antigens. Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform werden die Anordnungen zum Screenen von bioaktiven Mitteln, d. h. Arzneimittelkandidaten, zur Bindung an ein besonderes Zielanalyt verwendet.
  • Bioaktive Mittel umfassen zahlreiche chemische Klassen, obwohl sie typischerweise organische Moleküle sind, bevorzugterweise kleine organische Verbindungen, die ein Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als ungefähr 2.500 Dalton aufweisen. Bioaktive Mittel umfassen funktionale Gruppen, die für die strukturelle Interaktion mit Proteinen, besonders Wasserstoffbindungen, erforderlich sind und normalerweise mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxyl-Gruppe beinhalten, bevorzugterweise mindestens zwei der funktionalen chemischen Gruppen. Die bioaktiven Mittel umfassen oft zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die durch eine oder mehrere der obigen funktionalen Gruppen substituiert werden. Bioaktive Mittel befinden sich auch unter den Biomolekülen, z. B. Peptiden, Nukleinsäuren, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanaloga oder Kombinationen aus diesen. Besonders bevorzugt werden Nukleinsäuren und Proteine.
  • Bioaktive Mittel können aus einer großen Vielzahl von Quellen gewonnen werden, z. B. Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen. Beispielsweise stehen zahlreiche Möglichkeiten für die zufällige oder gerichtete Synthese einer großen Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen zur Verfügung, z. B. die Exprimierung von randomisierten Oligonukleotiden. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, fungalen, pflanzlichen oder tierischen Extrakten verfügbar oder können leicht produziert werden. Weiterhin können natürlich oder synthetisch produzierte Bib liotheken und Verbindungen leicht mithilfe konventioneller chemischer, physikalischer oder biochemischer Methoden modifiziert werden. Bekannte pharmakologische Mittel können gerichtet oder wahllos chemisch modifiziert werden, z. B. durch Acylierung, Alkylierung, Veresterung, und/oder Amidifikation, um Strukturanaloga herzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Proteine. Unter „Protein” ist vorliegend die kovalente Anlagerung von mindestens zwei Aminosäuren gemeint, das Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide beinhaltet. Das Protein kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Peptidbindungen hergestellt sein oder aus synthetischen, peptidomimetischen Strukturen bestehen. Daher bedeutet „Aminosäure” oder „Peptidrest”, wie vorliegend bezeichnet, sowohl natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren. Beispielsweise werden Homophenylalanin, Citrullin und Norleucin für die Zwecke der Erfindung als Aminosäuren erachtet. Die Seitenketten können entweder in der (R)- oder (S)-Konfiguration vorkommen. Bei der bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration vor. Wenn nicht natürlich vorkommende Seitenketten verwendet werden, können Nicht-Aminosäuren-Substituenten verwendet werden, um beispielsweise einen in-vivo-Abbau zu verhindern oder zu verzögern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel natürlich vorkommende Proteine oder Fragmente von natürlich vorkommenden Proteinen. Daher können beispielsweise Zellextrakte mit Proteinen oder zufällige oder gerichtete Aufschlüsse von proteinösen Zellextrakten verwendet werden. Auf diese Weise können Bibliotheken von prokaryotischen oder eukaryotischen Proteinen zum Screenen in den vorliegend beschriebenen Systemen hergestellt werden. Besonders bevorzugt in dieser Ausführungsform sind Bibliotheken von Bakterien-, Pilz-, Virus- und Säugetierproteinen, wobei die letzteren bevorzugt werden und menschliche Proteine speziell bevorzugt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Peptide aus ungefähr 5 bis ungefähr 30 Aminosäuren, wobei ungefähr 5 bis ungefähr 20 Aminosäuren bevorzugt werden und eine Zusammensetzung aus ungefähr 7 bis ungefähr 15 Aminosäuren besonders bevorzugt wird. Die Peptide können Aufschlüsse von natürlich vorkommenden Proteinen sein, wie es oben ausführlich beschrieben ist, willkürlichen Peptiden oder „verzerrt” willkürlichen Peptiden. Unter „randomisiert” oder vorliegend enthaltenen grammatikalischen Äquivalenten ist gemeint, dass jede Nukleinsäure und jedes Peptid im Wesentlichen aus jeweils zufälligen Nukleotiden und Aminosäuren bestehen. Weil im Allgemeinen diese zufälligen Peptide (oder Nukleinsäuren, unten diskutiert) chemisch synthetisiert werden, kann jedes Nukleotid bzw. jede Aminosäure an irgendeiner Stelle eingebaut werden. Der synthetische Prozess kann so konzipiert werden, dass randomisierte Proteine oder Nukleinsäure generiert werden, wobei alle oder die meist möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz gebildet werden und so eine Bibliothek aus randomisierten, bioaktiven, proteinösen Mitteln hergestellt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek bioaktiver Mittel verwendet. Die Bibliothek sollte aus einer ausreichend strukturell diversen Population bioaktiver Mittel bestehen, damit die Wahrscheinlichkeit groß genug wird, dass diese Mittel an Zielanalyte binden. Dementsprechend muss eine Bibliothek für Interaktionen groß genug sein, damit mindestens ein Mitglied die Affinitätsstruktur für das Zielanalyt aufweist. Obwohl es schwierig ist, die erforderliche absolute Größe einer Bibliothek für Interaktionen zu bestimmen, gibt die Natur mit der Immunantwort einen Hinweis darauf: Eine Vielfalt von 107–108 verschiedenen Antikörpern liefert mindestens eine Kombination mit einer ausreichend großen Affinität für eine Interaktion mit den meisten potentiellen Antigenen, der ein Organismus ausgesetzt ist. Veröffentlichte in-vitro-Selektionstechniken haben auch gezeigt, dass eine Bibliothekgröße von 107 to 108 groß genug ist, um Strukturen mit Affinität zum Zielanalyt zu finden. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform mindestens 106, bevorzugterweise mindestens 107, noch stärker bevorzugt mindestens 108 und am stärksten bevorzugt mindestens 109 verschiedene bioaktive Mittel gleichzeitig mit den Methoden des Fachgebietes analysiert. Mit den bevorzugten Methoden werden die Größe und die Vielfalt der Bibliothek maximiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek vollständig randomisiert, ohne Präferenzen für bestimmte Sequenzen oder feste Größen an irgendeiner Stelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek „verzerrt”. Das heißt, einige Positionen innerhalb der Sequenz sind entweder konstant oder wurden aus einer begrenzten Anzahl von Möglichkeiten ausgewählt. Beispielsweise werden in einer bevorzugten Ausführungsform die Nukleotide oder Aminosäurereste aus einer definierten Klasse wahllos selektiert, beispielsweise aus hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen Resten, sterisch „verzerrten” (entweder kleinen oder großen) Resten, um Cysteine herzustellen, zur Vernetzung, Proline für SH-3-Domänen, Serine, Threonine, Tyrosine oder Histidine für die Phosphorylierungsstellen, usw. oder um Purine herzustellen, usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Nukleinsäuren (vorliegend allgemein „Nukleinsäure-Sonden” oder „Sonden-Kandidaten” genannt). Mit „Nukleinsäure” oder „Oligonukleotid” oder vorliegend enthaltenen grammatikalischen Äquivalenten sind mindestens zwei Nukleotide gemeint, die kovalent verbunden sind. Eine Nukleinsäure in der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen, obwohl in einigen Fällen, wie es unten beschrieben ist, Nukleinsäureanaloga enthalten sind, die alternative Hauptketten haben können, die beispielsweise aus Phosphoramid (Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10): 1925 (1993) und dort enthaltene Quellenangaben bestehen; Letsinger, J. Org. Chem., 35: 3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81: 579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14: 3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988); und Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26: 141 (1986)), Phosphorothioat (Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19: 1437 (1991); und U.S. Patent- Nr. 5,644,048 ), Phosphorodithioat (Briu, etal., J. Am. Chem. Soc., 111: 2321 (1989)), O-Methylphosphoroamidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptid-Nukleinsäurehauptketten und -Bindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114: 1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380: 207 (1996), die alle durch Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind)). Andere Nukleinsäureanaloga bestehen aus solchen mit positiven Hauptketten (Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995)); nicht ionischen Hauptketten ( U.S. Patent-Nummern 5,386,023 ; 5,637,684 ; 5,602,240 ; 5,216,141 und 4,469,863 ; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30: 423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleosides & Nucleotides, 13: 1597 (1994); Kaptitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4: 395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett., 37: 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Hauptketten, z. B. solche, wie sie in den U.S. Patenten Nummer 5,235,033 und 5,034,506 und den Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook beschrieben sind. Nukleinsäuren, die ein oder mehrere carbozyklischen Zucker enthalten, entsprechen auch der Definition von Nukleinsäuren (siehe Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) S. 169–176). Verschiedene Nukleinsäureanaloga sind beschrieben in Ravels, C & E Neves, 2. Juni 1997, Seite 35. Alle diese Quellenangaben sind hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme Teil dieser Beschreibung. Diese Modifikationen der Ribose-Phosphat-Hauptkette können durchgeführt werden, um den Zusatz von weiteren Komponenten, z. B. Markierungen, zu fördern oder um die Stabilität und Halbwertzeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu verbessern. Beispielsweise ist PNA besonders bevorzugt. Weiterhin können Gemische aus natürlich vorkommenden Nukleinsäuren und Analoga hergestellt werden.
  • Alternativ können Gemische aus verschiedenen Nukleinsäureanaloga und Gemische aus natürlich vorkommenden Nukleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Die Nukleinsäuren können einzelsträngig oder doppelsträngig sein, wie spezifiziert, oder Anteile von sowohl doppelsträngigen als auch einzelsträngigen Sequenzen enthalten. Die Nukleinsäure kann eine DNA sein, sowohl genomisch als auch cDNA, eine RNA oder ein Hybrid, wobei die Nukleinsäure eine beliebige Kombination aus Desoxyribo- und Ribonukleotiden sein kann und eine beliebige Kombination aus Basen, z. B. Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xanthanin, Hypoxanthanin, Isocytosin, Isoguanin und Basen-Analoga, z. B. Nitropyrrol und Nitroindol, usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Bibliotheken aus klonalen Nukleinsäuren, z. B. DNA und RNA. Bei dieser Ausführungsform werden einzelne Nukleinsäuren hergestellt, im Allgemeinen mit konventionellen Methoden (z. B. Übertragung durch Plasmid- oder Phagen-Vektoren, Amplifikationstechniken, wie z. B. PCR, usw., wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist). Die Nukleinsäuren werden bevorzugt in einer bestimmten Ausführung angeordnet, z. B. als Mikrotiterplatten-Ausführung unter Zugabe von Kügelchen zur Bindung von Bibliotheken.
  • Eine Bindung der klonalen Bibliotheken (oder irgendeiner der hierin beschriebenen Nukleinsäuren) kann auf vielfältige Art und Weise erreicht werden, wie Fachleute erkennen, beispielsweise durch chemisches oder Affinitätsfangen, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist (beispielsweise u. a. Einbau von Nukleotid-Derivaten, wie z. B. AminoLink oder biotinylierten Nukleotiden, die dann zur Bindung der Nukleinsäure an eine Oberfläche verwendet werden können, ebenso wie Affinitätsfangen durch Hybridisierung), Vernetzung und elektrostatische Anlagerung, usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Affinitätsfangen zur Bindung der klonalen Nukleinsäuren an die Kügelchen angewendet. Beispielsweise können klonierte Nukleinsäuren derivatisiert werden, beispielsweise mit einem Mitglied des Bindungspaares, und die Kügelchen können mit dem anderen Mitglied des Bindungspaares derivatisiert werden. Passende Bindungspaare sind diejenigen, welche vorliegend für IBL/DBL-Paare beschrieben sind. Beispielsweise können die klonierten Nukleinsäuren biotyniliert werden (beispielsweise durch enzymatischen Einbau von biotynilierten Nukleotiden durch photoaktivierte Vernetzung von Biotin). Biotynilierte Nukleinsäuren können dann auf Streptavidinbeschichteten Kügelchen gefangen werden, wie dem Stand der Technik bekannt. Ebenso können auch andere Hapten-Rezeptorkombinationen verwendet werden, wie z. B. Digoxigenin und Anti-Digoxigenin-Antikörper. Alternativ können chemische Gruppen in Form von derivatisierten Nukleotiden zugesetzt werden, die dann zur Zugabe von Nukleinsäuren auf die Oberfläche verwendet werden können.
  • Die bevorzugten Anlagerungen sind kovalent, obwohl selbst relativ schwache Interaktionen (d. h. nicht kovalent) ausreichend sein können, um eine Nukleinsäure an eine Oberfläche anzulagern, wenn viele Anlagerungsstellen pro Nukleinsäure vorhanden sind. Daher können beispielsweise elektrostatische Interaktionen für die Bindung verwendet werden, beispielsweise, indem die Kügelchen die entgegen gesetzte Ladung zum dem bioaktiven Mittel tragen.
  • Ebenso kann eine Affinitätsbindung mittles Hybridisierung zur Bindung von klonierten Nukleinsäuren an die Kügelchen verwendet werden. Beispielsweise wird PolyA+RNA routinemäßig mittels Hybridisierung an Oligo-dT-Kügelchen gefangen, wie dem Stand der Technik bekannt. Dies kann ein Oligo-dT-Fangen mit anschließendem Vernetzungsschritt beinhalten, z. B. Psoralen-Vernetzung). Wenn die Nukleinsäuren von Interesse kein PolyA–Teil enthalten, kann eines durch Polymerisation mit der terminalen Transferase angelagert werden oder via Ligation eines OligoA-Verbindungsgliedes, wie dem Stand der Technik bekannt.
  • Alternativ kann eine chemische Vernetzung durchgeführt werden, beispielsweise durch photoaktivierte Vernetzung von Thymidin an reaktive Gruppen, wie dem Stand der Technik bekannt.
  • Im Allgemeinen sind spezielle Methoden erforderlich, um klonale Arrays zu dekodieren, wie es unten ausführlicher beschrieben ist.
  • Wie es oben allgemein für Proteine beschrieben wurde, können bioaktive Nukleinsäure-Mittel natürlich vorkommende Nukleinsäuren sein, zufällige Nukleinsäuren oder „verzerrte” zufällige Nukleinsäuren. Beispielsweise können prokaryotische oder eukaryotische Genomaufschlüsse verwendet werden, wie es oben für Proteine beschrieben wurde.
  • Im Allgemeinen sind die Sonden der vorliegenden Erfindung so konzipiert, dass sie eine Zielsequenz ergänzen (entweder die Sequenz des Zielanalyten der Probe oder andere Sondensequenzen, wie es vorliegend beschrieben ist), und zwar so, dass eine Hybridisierung der Zielsequenz mit den Sonden der vorliegenden Erfindung stattfindet. Dieses Komplementärprinzip muss nicht perfekt sein. Es gibt möglicherweise eine Reihe von nicht passenden Basenpaaren, die mit der Hybridisierung zwischen der Zielsequenz und den einsträngigen Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung interferieren. Wenn jedoch die Anzahl Mutationen so groß ist, dass selbst unter den lockersten Hybridisierungsbedingungen keine Hybridisierung stattfinden kann, dann ist die Sequenz keine komplementäre Zielsequenz. Daher ist mit „stark komplementär” vorliegend gemeint, dass die Sonden für die Zielsequenzen ausreichend komplementär sind, um unter den ausgewählten Reaktionsbedingungen zu hybridisieren. Dem Stand der Technik sind sehr strenge Bedingungen bekannt; siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, und Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., die beide hiermit durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind. Strenge Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umständen unterschiedlich. Längere Sequenzen hybridisieren speziell bei höheren Temperaturen. Eine ausführliche Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren ist zu finden bei Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Allgemein bedeuten strenge Bedingungen, wenn die Temperatur ungefähr 5–10°C unter dem Wärmeschmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Innenstärke/pH liegt. Tm ist die Temperatur (bei einer definierten Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der für die Zielsequenz komplementären Sonden mit der Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren (weil die Zielsequenzen im Überfluss vorhanden sind, sind bei Tm, 50% der Sonden im Gleichgewicht belegt). Strenge Bedingungen sind solche, bei denen die Salzkonzentration geringer ist als ungefähr 1,0 M Natriumionen, normalerweise ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) bei einem pH von 7,0 bis 8,3 und die Temperatur liegt um mindestens 30°C bei kurzen Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide) und bei mindestens 60°C für lange Sonden (z. B. mehr als 50 Nukleotide). Strenge Bedingungen können auch durch Zusatz von destabilisierenden Mitteln wie z. B. Formamid erreicht werden. Bei einer anderen Ausführungsform werden weniger strenge Hybridisierungsbedinungen eingesetzt; es können beispielsweise, wie dem Stand der Technik bekannt, auch mittelstrenge oder gering strenge Bedingungen eingesetzt werden (siehe Maniatis und Ausubel, supra, und Tijssen, supra).
  • Der Begriff „Zielsequenz” oder vorliegend enthaltene grammatikalische Äquivalente bedeuten eine Nukleinsäuresequenz an einem einzigen Nukleinsäurestrang. Die Zielsequenz kann Teil eines Genes, einer angeordneten Sequenz, der genomischen DNA, cDNA, RNA, z. B. mRNA und rRNA, und Sonstiges sein. Sie kann beliebig lang sein, wobei längere Sequenzen spezifischer sind. Wie Fachleute erkennen, kann die komplementäre Zielsequenz in vielerlei Formen vorliegen. Sie kann, beispielsweise innerhalb einer größeren Nukleinsäuresequenz liegen, d. h. unter anderem ein vollständiges oder teilweises Gen oder mRNA darstellen, ein Restriktionsfragment eines Plasmids oder einer genomischen DNA. Wie es unten ausführlicher beschrieben ist, werden die Sonden zur Hybridisierung an die Zielsequenzen zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit der Zielsequenz in einer Probe hergestellt. Allgemein ist der Begriff unter Fachleuten bekannt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel chemisch-organische Komponenten, von denen eine große Vielzahl in der Literatur bekannt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jedes Kügelchen eine einzige Art von bioaktivem Mittel, obwohl eine Vielzahl von einzelnen bioaktiven Mitteln bevorzugt an jedes Kügelchen angelagert ist. Ebenso werden in bevorzugten Ausführungsformen mehr als ein Mikrokügelchen mit einem einmaligen bioaktiven Mittel verwendet; das heißt, dass in das System durch die Verwendung von Subpopulationen von Mikrokügelchen eine Redundanz eingebaut ist, wobei jedes Mikrokügelchen in der Subpopulation das gleiche bioaktive Mittel enthält.
  • Wie Fachleute erkennen, können die bioaktiven Mittel entweder direkt auf den Kügelchen synthetisiert werden oder sie werden hergestellt und dann nach der Synthese angelagert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Gewährleistung einer guten Anlagerung und einer ausreichenden Flexibilität für eine gute Interaktion mit dem Zielmolekül Bindungslinker zur Anlagerung der bioaktiven Mittel an die Kügelchen verwendet, und auch, um unerwünschte Bindungsreaktionen zu verhindern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Mittel direkt auf den Kügelchen synthetisiert. Wie dem Stand der Technik bekannt, werden gegenwärtig viele Klassen chemischer Verbindungen auf festen Trägern synthetisiert, u. a. Kügelchen, wie z. B. Peptide, organische Komponenten und Nukleinsäuren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Mittel erst synthetisiert und dann kovalent an die Kügelchen angelagert. Wie Fachleute erkennen, hängt dieser Vorgang von der Anordnung der bioaktiven Mittel und der Kügelchen ab. Die Funktionalisierung der Oberflächen der festen Träger wie z. B. bestimmte Polymere mit chemisch reaktiven Gruppen wie z. B. Thiole, Amine, Carboxyle usw. ist dem allgemeinen Stand der Technik bekannt. Dementsprechend können „leere” Kügelchen mit einer Oberflächenchemie verwendet werden, welche die Anlagerung der gewünschten Funktionalität durch den Anwender erleichtern. Einige Beispiele dieser Oberflächenchemie bei leeren Mikrokügelchen sind u. a. Aminogruppen, z. B. alipathische und aromatische Amine, Carboxylsäuren, Aldehyde, Amide, Chlormethylgruppen, Hydrazide, Hydroxylgruppen, Sulfonate und Sulfate, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist.
  • Diese funktionalen Gruppen können verwendet werden, um eine beliebige Anzahl verschiedener Mittel-Kandidaten den Kügelchen beizufügen, im Allgemeinen unter Ausnutzung bekannter chemischer Eigenschaften. Beispielsweise können Mittel-Kandidaten, die Kohlenhydrate enthalten, an einen Träger mit Aminofunktionalität angelagert werden. Das Aldehyd des Kohlenhydrates wird mit Standardtechniken hergestellt, und dann reagiert das Aldehyd mit einer Aminogruppe auf der Oberfläche. In einer alternativen Ausführungsform kann ein Sulfhydryl-Verbindungsglied verwendet werden. Es gibt eine Anzahl von dem Stand der Technik bekannnten reaktiven Sulfhydryl-Bindungslinkern, z. B. SPDP, Maleimide, α-Haloacetyle und Pyridyldisulfide (siehe beispielsweise den Katalog der Pierce Chemical Company von 1994, technischer Abschnitt über Bindungslinker, Seite 155–200, der hiermit durch Bezugnahme Teil dieser Beschreibung ist), die zur Anlagerung von Cystein-haltigen proteinösen Mitteln an den Träger verwendet werden können. Alternativ kann eine Aminogruppe am Mittel-Kandidaten zur Anlagerung an eine Aminogruppe auf der Oberfläche verwendet werden. Beispielsweise ist eine große Anzahl von stabilen bifunktionalen Gruppen dem Stand der Technik gut bekannt, u. a. homobifunktionale und Bindungslinker (siehe Katalog und Handbuch von Pierce, Seite 155–200). In einer zusätzlichen Ausführungsform können Carboxylgruppen (entweder von der Oberfläche oder dem Mittel-Kandidaten stammend) mithilfe von gut bekannten Bindungslinkern derivatisiert werden (siehe Katalog von Pierce). Carbodiimide aktivierten beispielsweise Carboxylgruppen für einen Angriff durch gute Nukleophile wie z. B. Amine (siehe Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4):275–308 (1991), vorliegend ausdrücklich Teil dieser Beschreibung). Proteinöse Mittel-Kandidaten können auch durch Verwendung anderer dem Stand der Technik bekannter Techniken angelagert werden, beispielsweise bei der Anlagerung von Antikörpern an Polymere; siehe Slinkin et al., Bioconi. Chem. 2: 342– 348 (1991); Torchilin et al., supra; Trubetskoy et al., Bioconi. Chem. 3: 323–327 (1992); King et al., Cancer Res. 54: 6176–6185 (1994) und Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5: 220–235 (1994), die alle durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind). Offenbar können die Mittel-Kandidaten auf vielerlei Art und Weise, u. a. wie oben dargestellt, angelagert werden. Bevorzugterweise wird die Funktionalität des Mittel-Kandidaten durch die Art der Anlagerung nicht erheblich verändert, das heißt, der Mittel-Kandidat sollte auf so anpassungsfähige Weise angelagert werden, dass eine Interaktion mit dem Zielmolekül möglich ist. Weiterhin können diese Arten der chemischen oder biologischen Funktionalitäten zur Anlagerung von Arrays an Assay-Positionen verwendet werden, wie es in 1F dargestellt ist, oder einzelne Kügelchen-Gruppen.
  • Spezifische Techniken zur Immobilisierung von Enzymen auf Mikrokügelchen sind dem Stand der Technik bekannt. In einem Fall werden Mikrokügelchen mit chemischen NH2-Oberflächeneigenschaften verwendet. Eine Oberflächenaktivierung wird mit 2,5%igem Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (10 mM) erzielt, die einen pH von 6,9. (138 mM NaCl, 2,7 mM, KCl) gewährleistet. Diese wird auf einem Rührer über ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden die Mikrokügelchen mit ultrareinem Wasser plus 0,01%igem Tween 20 gespült (Netzmittel) –0,02% und erneut mit PBS (pH 7,7) plus 0,01%igem Tween 20 gespült. Letztendlich wird das Enzym der Lösung zugefügt, bevorzugterweise nach Vorfilterung mit einem Amicon Mikropur-Filter (0.45 μm).
  • In einigen Ausführungsformen können die Mikrokügelchen weiterhin Identifikator-Bindungsliganden zur Anwendung bei bestimmten Dekodierungssystemen umfassen. Unter „Identifikator-Bindungsliganden” oder „IBLs” wird vorliegend eine Verbindung verstanden, die spezifisch an einen entsprechenden Decoder-Bindungsliganden (DBL) bindet, um die Aufklärung der Identität des an das Kügelchen gebundenen bioaktiven Mittels zu erleichtern. Das heißt, dass der IBL und der entsprechende DBL ein Bindungspartnerpaar bilden. Mit „spezifisch gebunden” ist vorliegend gemeint, dass der IBL seinen DBL bindet, und zwar so spezifisch, dass zwischen dem korrespondierenden DBL und anderen DBLs (d. h. DBLs für andere IBLs) oder anderen Komponenten oder Kontaminanten des Systems unterschieden werden kann. Die Bindung sollte ausreichend stark sein, um unter den Bedingungen des Dekodierungsschritts, z. B. Waschschritte zur Aufhebung einer nicht spezifischen Bindung, erhalten zu bleiben. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise, wenn die IBLs und die korrespondierenden DBLs Proteine oder Nukleinsäuren sind, liegen die Dissoziationskonstanten des IBL zu seinem DBL bei weniger als ungefähr 10–4–10–6 M–1, wobei weniger als ungefähr 10–5 bis 10–9 M–1 bevorzugt wird und weniger als ungefähr 10–7–10–9 M–1 besonders bevorzugt wird.
  • IBL-DBL-Bindungspaare sind bekannt oder können leicht mit den bekannten Techniken gefunden werden. Wenn beispielsweise der IBL ein Protein ist, können die DBLs Proteine sein (besonders z. B. Antikörper oder Fragmente davon (Fabs, usw.)) oder kleine Moleküle oder umgekehrt (der IBL ist ein Antikörper und der DBL ein Protein). Metallionen-Metallionen-Liganden oder Chelat-Paare sind auch nützlich. Antigen-Antikörper-Paare, Enzyme und Substrate oder Inhibitoren, andere Protein-Protein-Wechselwirkungspaare, Rezeptor-Liganden, komplementäre Nukleinsäuren (z. B. Nukleinsäuremoleküle, die dreigängige Helices bilden) und Kohlenhydrate und ihre Bindungspartner sind auch passende Bindungspaare. Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindungsproteinpaare sind auch nützlich, u. a. einsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäurebindungsprote ine und Kleinmolekül-Nukleinsäurebindungsmittel. Ebenso können Nukleinsäure-„Aptamere”, wie allgemein in den US- Patenten 5,270,163 , 5,475,096 , 5,567,588 , 5,595,877 , 5,637,459 , 5,683,867 , 5,705,337 und verwandten Patenten beschrieben, hiermit durch Bezugnahme Teil dieser Beschreibung, zur Bindung an fast jedes Zielmolekül entwickelt werden, z. B. kann ein Aptamer-Zielpaar als das IBL-DBL-Paar verwendet werden. Ebenso wird in umfangreicher Literatur über die Entwicklung von Bindungspaaren berichtet, die auf kombinatorisch-chemischen Methoden beruht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist IBL ein Molekül, dessen Farbe oder Lumineszenz-Eigenschaften sich bei Anwesenheit eines selektiv bindenden DBL ändert.
  • In einer Ausführungsform kann der DBL an ein Kügelchen gebunden sein, d. h. ein „Decoder-Kügelchen”, das mit einer Markierung wie z. B. einem Fluorophor markiert sein kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das IBL-DBL-Paar stark komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuren in dieser Ausführungsform, wobei die Bindungsliganden als „Identifikator-Sonden” und „Dekodierungssonden” bezeichnet werden können. [0057] Im Allgemeinen reicht die Länge der Identifikator- und Dekodierungssonden von ungefähr 4 Basenpaaren bis ungefähr 1000, wobei eine Länge von ungefähr 6 bis ungefähr 100 bevorzugt wird und von ungefähr 8 bis ungefähr 40 besonders bevorzugt wird. Wichtig ist, dass die Sonden lang genug sind, um spezifisch zu sein, d. h. um zwischen verschiedenen IBL-DBL-Paaren zu unterscheiden, aber auch kurz genug, um sowohl a) eine Dissoziation, falls notwendig, unter geeigneten experimentellen Bedingungen und b) eine effiziente Hybridisierung zu ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, binden IBLs nicht an DBLs. Stattdessen werden IBLs als Identifika tor-Komponenten („IMs”) eingesetzt, die direkt identifiziert werden, beispielsweise mithilfe der Massenspektroskopie.
  • Alternativ sind in einer bevorzugten Ausführungsform der IBL und das bioaktive Mittel dieselben Komponenten. Daher kann das bioaktive Mittel, beispielsweise, wie hierin beschrieben, besonders wenn keine optische Signatur verwendet wird, sowohl als Identifikator als auch das Mittel dienen. Im Fall von Nukleinsäuren beispielsweise, kann die an ein Kügelchen gebundene Sonde (die als bioaktives Mittel dient) auch Dekodierungssonden binden, um die Sondensequenz auf dem Kügelchen zu identifizieren. Daher binden in dieser Ausführungsform die DBLs an die bioaktiven Mittel. Dies ist besonders nützlich, weil diese Ausführungsform nicht nur als Decoder dienen kann, sondern auch Informationen über den Array oder Assay geben kann. Beispielsweise, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, ist durch die Anwendung von DBLs eine Array-Kalibrierung und Assay-Entwicklung möglich. Dies kann durchgeführt werden, selbst wenn die DBLs nicht als solche verwendet werden; beispielsweise kann bei nicht zufälligen Arrays durch die Verwendung dieser Sondengruppen eine Array-Kalibrierung und Assay-Entwicklung ermöglicht werden, selbst wenn eine Dekodierung nicht erforderlich ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Mikrokügelchen keine optische Signatur. Das heißt, wie es in U.S.S.N.s 08/818,199 und 09/151,877 beschrieben wurde, besteht in früheren Arbeiten jede Subpopulation von Mikrokügelchen aus einer einmaligen optischen Signatur oder optischen Markierung, die zur Identifikation des einmaligen bioaktiven Mittels dieser Subpopulation von Mikrokügelchen verwendet wird. Das heißt, dass bei der Dekodierung die optischen Eigenschaften der Kügelchen auf die Weise genutzt werden, dass ein Kügelchen, das aus einer einmaligen Signatur besteht, von den Kügelchen an anderen Stellen mit verschiedenen optischen Signaturen unterschieden werden kann. Daher wurde in früheren Arbeiten jedem bioaktiven Mittel eine einmalige optische Signatur auf die Weise zugeordnet, dass alle Mikrokügelchen, die aus diesem bioaktiven Mittel bestehen, auf Grundlage der Signatur identifizierbar sind. Diese optischen Signaturen bestanden aus Farbstoffen, normalerweise Chromophore oder Fluorophore, die in den Kügelchen selber enthalten oder an diese angelagert waren. Die Diversität optischer Signaturen bestand aus verschiedenen Fluorochromen, verschiedenen Verhältnissen von Fluorochrom-Gemischen und verschiedenen Konzentrationen (Intensitäten) von Fluorochromen.
  • Daher hängt bei der vorliegenden Erfindung die Dekodierung der Arrays nicht ausschließlich von der Nutzung optischer Eigenschaften ab, obwohl es in einigen Fällen der Fall sein kann. Wie Fachleute jedoch erkennen, ist es in einigen Ausführungsformen möglich, optische Signaturen in Verbindung mit dem vorliegenden System als zusätzliche Kodierungsmethode zu verwenden. Daher kann beispielsweise, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, die Größe des Arrays unter Verwendung eines einzigen Satzes von Decoder-Komponenten auf verschiedene Weisen effektiv vergrößert werden, von denen eine die Anwendung in Kombination mit den optischen Signaturen auf den Kügelchen darstellt. Daher kann beispielsweise unter Verwendung eines „Satzes” von Decoder-Molekülen die Verwendung von zwei Populationen Kügelchen, eine mit optischer Signatur und die andere ohne, die effektive Verdoppelung der Array-Größe ermöglichen. Durch die Verwendung von vielen optischen Signaturen wird die mögliche Größe des Arrays auf ähnliche Weise vergrößert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede Subpopulation von Kügelchen eine Vielzahl von verschiedenen IBLs. Durch Anwendung einer Vielzahl verschiedener IBLs zur Verschlüsselung eines jeden bioaktiven Mittels wird die Anzahl möglicher einmaliger Codes erheblich vergrößert. Das heißt, dass durch Anwendung eines einmaligen IBL pro bioaktivem Mittel die Größe des Arrays der Anzahl einmaliger IBLs entspricht (vorausgesetzt, es findet keine „Wiederanwendung” satt, wie es unten beschrieben wurde). Durch die Anwendung einer Vielzahl verschiedener IBLs pro Kügelchen (n) kann die Größe des Arrays auf 2n vergrößert werden, wenn die An- oder Abwesenheit eines jeden IBL als Indikator verwendet wird. Beispielsweise wird durch die Zuordnung von 10 IBLs pro Kügelchen ein binärer 10-Bit-Code generiert, bei dem jedes Bit als „1” (IBL ist anwesend) oder „0” (IBL ist abwesend) bezeichnet werden kann. Ein binärer 10-Bit-Code hat 210 mögliche Varianten. Die Größe des Arrays kann jedoch, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, weiter vergrößert werden, wenn ein anderer Parameter aufgenommen wird, z. B. Konzentration oder Intensität. Daher vergrößert sich beispielsweise die Array-Größe auf 3n, wenn zwei verschiedene IBL-Konzentrationen eingesetzt werden. Daher wird in dieser Ausführungsform jedes einzelne aktive Mittel im Array einer Kombination aus IBLs zugeordnet, die den Kügelchen vor Zugabe des bioaktiven Mittels zugesetzt werden kann – oder nach oder während der Synthese des bioaktiven Mittels, d. h. es handelt sich um eine simultane Zugabe von IBLs und der Komponenten des bioaktiven Mittels.
  • Alternativ kann die Kombination verschiedener IBLs zur Aufklärung der Protein- oder Nukleinsäuresequenz verwendet werden, wenn das bioaktive Mittel ein Polymer verschiedener Residuen ist, d. h. wenn das bioaktive Mittel ein Protein oder eine Nukleinsäure ist.
  • Daher kann beispielsweise bei Anwendung von zwei verschiedenen IBLs (IBL1 und IBL2) die erste Position einer Nukleinsäure aufgeklärt werden: Beispielsweise kann Adenosin durch die Anwesenheit von sowohl IBL1 als auch IBL2 verkörpert werden. Thymidin kann durch die Anwesenheit von IBL1, aber nicht IBL2 verkörpert werden. Cytosin kann durch die Anwesenheit von IBL2 aber nicht IBL1 verkörpert werden, und Guanosin kann durch die Abwesenheit von beiden verkörpert werden. Die zweite Position der Nukleinsäure kann ebenso unter Einsatz von IBL3 und IBL4 aufgeklärt werden. Daher ergibt die Anwesenheit von IBL1, IBL2, IBL3 und IBL4 eine Sequenz von AA; IBL1, IBL2 und IBL3 zeigen die Sequenz AT; IBL1, IBL3 und IBL4 ergeben die Sequenz TA, usw. Für die dritte Position wird IBL5 und IBL6 verwendet, usw. Auf diese Weise kann die Anwendung von 20 verschiedenen Identifikatoren einen einmaligen Co de für jedes mögliche 10-mer ergeben.
  • Das System ist für Proteine ähnlich, erfordert aber eine größere Anzahl verschiedener IBLs, um jede Position zu identifizieren, je nach gestatteter Diversität in jeder Position. Daher sind beispielsweise, wenn jede Aminosäure in jeder Position gestattet ist, fünf verschiedene IBLs für jede Position erforderlich. Es kann sich jedoch, wie es oben beschrieben wurde, beispielsweise bei Anwendung von zufälligen Peptiden als bioaktive Mittel, ein systematischer Fehler („Bias”) im System befinden. Möglicherweise sind nicht alle Aminosäuren in allen Positionen vorhanden, und einige Positionen können entsprechend vorgegeben sein. Dementsprechend kann es möglich sein, vier verschiedene IBLs für jede Aminosäure zu verwenden.
  • Auf diese Weise kann eine Art „Barcode” für jede Sequenz konstruiert werden. Durch die An- oder Abwesenheit eines jeden distinkten IBL kann jedes bioaktive Mittel identifiziert werden.
  • Weiterhin ist durch die Anwendung von verschiedenen Konzentrationen oder Dichten der IBLs eine Art „Wiederanwendung” möglich. Wenn beispielsweise das Kügelchen, das aus einem ersten Mittel besteht, der einfachen Konzentration von IBL entspricht, und ein zweites Kügelchen, das aus einem zweiten Mittel besteht, der 10fachen IBL-Konzentration entspricht, dann ist es dem Anwender möglich, bei Anwendung von gesättigten Konzentrationen der korrespondierend markierten DBL beide Kügelchen zu unterscheiden.
  • Sobald die Kügelchen, aus denen die Wirkstoff-Kandidaten bestehen und die einmaligen IBLs hergestellt sind, werden sie dem Substrat zur Bildung eines Arrays hinzugefügt. Erwähnenswert ist, dass obwohl bei den meisten vorliegend beschriebenen Methoden die Kügelchen vor dem Assay dem Substrat zugesetzt werden, die Reihenfolge der Herstellung, Anwendung und Dekodierung des Arrays variieren kann. Beispielsweise kann der Array hergestellt und dekodiert und dann der Assay durchgeführt werden. Alternativ kann der Array hergestellt, in einem Assay verwendet und dann dekodiert werden. Dies findet besonders dann Anwendung, wenn nur wenige Kügelchen dekodiert werden müssen. Alternativ können die Kügelchen vor Zugabe der Kügelchen zum Substrat dem Assay-Gemisch zugegeben werden, d. h. der Probe mit den Zielanalyten. Nach Zugabe und Assay-Durchführung kann der Array dann dekodiert werden. Dies wird besonders bevorzugt, wenn die Probe mit den Kügelchen bewegt oder vermischt wird. Dies kann die Menge des an die Kügelchen gebundenen Zielanalyten pro Zeiteinheit erhöhen und daher (bei Nukleinsäure-Assays) die Hybridisierungskinetik steigern. Dies kann besonders in den Fällen Anwendung finden, in denen die Konzentration des Zielanalyten in der Probe gering ist; im Allgemeinen müssen bei geringen Konzentrationen lange Bindungszeiten eingesetzt werden.
  • Weiterhin kann durch Zugabe der Kügelchen zum Assay-Gemisch eine Sortierung oder Selektion stattfinden. Beispielsweise kann eine große Bibliothek von Kügelchen der Probe zugegeben werden, und nur diejenigen Kügelchen, die an die Probe binden, können dem Substrat zugesetzt werden. Wenn der Zielanalyt beispielsweise eine Fluoreszenz-Markierung erhalten hat (entweder direkt (beispielsweise durch Aufnahme von Markierungen in Reaktionen der Nukleinsäure-Amplifikation) oder indirekt (beispielsweise mit der Durchführung von Sandwich-Assays)) können die Kügelchen, die Fluoreszenz als Folge der Zielanalytbindung aufweisen, durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) sortiert werden und nur diese Kügelchen einem Array zugesetzt und anschließend dekodiert werden. Ebenso kann die Sortierung durch Affinitätstechniken erzielt werden. Es können Affinitätssäulen hergestellt werden, welche aus den Zielanalyten bestehen, und nur diejenigen Kügelchen, die binden, werden auf dem Array verwendet. Ebenso können zwei Kügelchensysteme verwendet werden, zum Beispiel können magnetische Kügelchen verwendet werden, die aus den Zielanalyten bestehen, um diejenigen Kügelchen „herauszuziehen”, die an die Zielmoleküle binden, wobei die magnetischen Kügelchen (beispielsweise durch Temperaturerhöhung) anschließend freigegeben und einem Array zugesetzt werden.
  • Im Allgemeinen werden die Methoden zur Herstellung und Dekodierung der Arrays angewendet, um die Anzahl der verschiedenen Mittel-Kandidaten zu maximieren, die einzeln kodiert werden können. Die Anordnungen der Erfindung können auf verschiedene Weisen hergestellt werden. Im Allgemeinen werden die Arrays durch Zusatz einer aus den Kügelchen bestehenden Lösung oder wässrigen Masse zu einer Oberfläche hergestellt, welche die Stellen zur Verbindung der Kügelchen enthält. Dies kann in einer Vielzahl von Puffer, z. B. wässrige oder organische Lösungsmittel und Gemischen geschehen. Das Lösungsmittel kann verdunsten und überzählige Kügelchen entfernt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn nicht kovalente Methoden zur Verbindung der Kügelchen an den Array eingesetzt werden, wird eine neuartige Methode zum Aufladen der Kügelchen auf den Array angewendet. Diese Methode besteht aus der Exposition des Arrays gegenüber einer Partikellösung (u. a. Mikrokügelchen und Zellen) und dann der Applikation von Energie, z. B. Bewegung oder Schütteln des Gemisches. Dieses führt zu einem Array, der aus fester gebundenen Partikeln besteht, weil die Bewegung mit genügend starker Energie durchgeführt wird, dass schwach verbundene Kügelchen abfallen (oder herausfallen, im Fall von Vertiefungen). Diese Stellen stehen dann für die Bindung eines anderen Kügelchens zur Verfügung. Auf diese Weise werden die Kügelchen ausgewählt, die eine starke Affinität zu den Stellen zeigen. Die auf diese Weise hergestellten Arrays haben zwei wichtige Vorteile gegenüber denjenigen, bei denen die Beladung bewegungsloser abläuft: Erstens kann ein höherer Prozentsatz Stellen leicht gefallt werden und zweitens zeigen die Arrays, die auf diese Weise beladen werden, eine erhebliche Verminderung von Kügelchen-Verlusten während der Assays. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform diese Methoden angewendet, um Arrays herzustellen, bei denen mindestens ungefähr 50% der Stellen gefüllt sind, wobei mindestens ungefähr 75% bevorzugt werden und mindestens ungefähr 90% besonders bevorzugt werden. Ebenso verlieren auf diese Art hergestellte Arrays bevorzugterweise weniger als ungefähr 20% der Kügelchen während eines Assays, wobei weniger als ungefähr 10% bevorzugt werden und weniger als ungefähr 5% besonders bevorzugt werden.
  • In dieser Ausführungsform wird das Substrat, das aus der Oberfläche mit den diskreten Stellen besteht, in eine aus den Partikeln (Kügelchen, Zellen, usw.) bestehende Lösung getaucht. Die Oberfläche kann Vertiefungen umfassen, wie sie hierin beschrieben sind, oder andere Arten von Stellen auf einer gemusterten Oberflächen, sodass eine unterschiedliche Affinität für diese Stellen besteht. Diese unterschiedliche Affinität führt zu einem kompetitiven Prozess, sodass die Partikel, die fester verbinden, selektiert werden. Bevorzugterweise befindet sich die gesamte, mit Kügelchen zu „beladende” Oberfläche in Flüssigkeitskontakt mit der Lösung. Diese Lösung ist im Allgemeinen eine wässrige Masse, die von ungefähr 10.000: 1 Kügelchen: Lösung (vol:vol) bis 1:1 reicht. Im Allgemeinen kann die Lösung eine beliebige Anzahl von Reagenzien umfassen, u. a. wässrige Puffer, organisch Lösungsmittel, Salze und andere Reagenzien-Bestandteile, usw. Weiterhin umfasst die Lösung bevorzugterweise ein Übermaß an Kügelchen, das heißt, es gibt mehr Kügelchen als Stellen auf dem Array. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein zwei- bis milliardenfacher Überschuss an Kügelchen verwendet.
  • Die Immersion kann die Assay-Bedingungen imitieren; beispielsweise, wenn der Array von oben in eine aus Proben bestehende Mikrotiterplatte „getaucht” werden soll, kann diese Konfiguration zum Beladen wiederholt werden und so die Kügelchen minimieren, die aufgrund der Schwerkraft herausfallen.
  • Sobald die Oberfläche eingetaucht wurde, werden das Substrat, die Lösung oder beide einem kompetitiven Prozess ausgesetzt, bei dem die Partikel mit einer geringeren Affinität vom Substrat abgelöst werden können und dann durch Partikel mit einer höheren Affinität gegenüber der Stelle ersetzt werden. Dieser kompetitive Prozess erfolgt durch die Einführung von Energie in Form von Wärme, Beschallung, Rühren oder Mischen, Schütteln oder Bewegen der Lösung oder des Substrats oder beider.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird Bewegung oder Vibration angewendet. Im Allgemeinen wird die Menge der am Substrat vorgenommenen Handlungen minimiert, um den Array nicht zu beschädigen. Daher wird in bevorzugten Ausführungsformen eher die Lösung als der Array bewegt, obwohl beides möglich ist. Wie Fachleute erkennen, kann diese Bewegung auf vielerlei Weise erfolgen, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform Mikrotiterplatten verwendet werden, die aus Kügelchenlösungen bestehen, die mittels Mikrotiterplatten-Schüttler bewegt werden.
  • Die Bewegung wird so lange fortgeführt, bis der Array mit der gewünschten Menge aufgeladen ist. Je nach Größe und Konzentration der Kügelchen und Größe des Arrays kann diese Zeitspanne von ungefähr 1 Sekunde bis zu Tagen reichen, wobei die Zeitspanne von ungefähr 1 Minute bis ungefähr 24 Stunden bevorzugt wird.
  • Es sollte erwähnt werden, dass möglicherweise nicht alle Stellen eines Arrays aus einem Kügelchen bestehen. Das heißt, dass einige Stellen auf der Substratoberfläche leer sein können. Weiterhin können einige Stellen mehr als ein Kügelchen enthalten, obwohl dies nicht bevorzugt wird.
  • In einigen Ausführungsformen, beispielsweise, wenn eine chemische Anlagerung durchgeführt wird, ist es möglich, die Kügelchen auf eine nicht zufällige oder geordnete Weise zu verbinden. Mithilfe von photoaktivierbaren Bindungslinkern oder photoaktivierbaren Klebestoffen oder Abdeckungen können beispielsweise ausgewählte Stellen auf dem Array nacheinander für die Anlagerung vorbereitet werden, sodass definierte Populationen von Kügelchen aufgelegt werden.
  • Die Arrays der vorliegenden Erfindung sind so konstruiert, dass Informati onen über die Identität des Mittel-Kandidaten in den Array eingebaut sind, sodass die zufällige Ablage von Kügelchen in die Faservertiefungen „dekodiert” werden kann, um eine Identifikation des Mittel-Kandidaten in allen Positionen zu ermöglichen. Dies kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden und zwar entweder vor, während oder nach der Verwendung des Arrays zur Detektion von Zielmolekülen.
  • Daher wird der Array nach Herstellung „dekodiert”, um die Position von einem oder mehreren bioaktiven Mitteln, d. h. jede Subpopulation von Kügelchen, auf der Substratoberfläche zu identifizieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein selektives Dekodierungssystem angewendet. In diesem Fall werden nur diejenigen Mikrokügelchen dekodiert, die eine Veränderung im optischen Signal als Folge der Bindung eines Zielanalyten zeigen. Dies geschieht überlicherweise dann, wenn die Anzahl von „Treffern”, d. h. die Anzahl der zu dekodierenden Stellen, allgemein gering ist. Das heißt, der Array wird zuerst unter experimentellen Bedingungen in Abwesenheit der Zielanalyten gescannt. Die Zielanalyten enthaltende Probe wird zugegeben, und es werden nur solche Positionen dekodiert, die eine Veränderung im optischen Signal zeigen. Beispielsweise können die Kügelchen entweder an den positiven oder negativen Signal-Positionen entweder selektiv markiert oder aus dem Array freigesetzt werden (beispielsweise durch die Verwendung von photospaltbaren Bindungsgliedern) und anschließend sortiert oder in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) angereichert werden. Das heißt, entweder werden alle negativen Kügelchen freigesetzt, und dann werden die positiven Kügelchen entweder in situ freigesetzt oder analysiert, oder es werden alternativ alle positiven Kügelchen freigesetzt und analysiert. Alternativ können die Markierungen halogenierte aromatische Verbindungen umfassen, und die Detektion der Markierung wird beispielsweise mit Gaschromatographie, chemischen Markern, Isotopenmarkern oder Massenspektometrie-Markern durchgeführt.
  • Wie Fachleute erkennen, kann dies auch in Systemen durchgeführt werden, bei denen der Array nicht dekodiert wird, d. h. es muss keine Korrelation der Kügelchen-Anordnung mit der Position vorhanden sein. In dieser Ausführungsform werden die Kügelchen auf den Array geladen und der Assay wird durchgeführt. Die „positiven”, d. h. solche Kügelchen, die eine Veränderung im optischen Signal zeigen, wie es unten ausführlicher beschrieben ist, werden dann „markiert”, um sie von den „negativen” Kügelchen zu unterscheiden oder zu trennen. Die kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden, bevorzugt mit optischen Faser-Arrays. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jedes Kügelchen einen Fluoreszenzfarbstoff. Nach dem Assay und der Identifizierung der „positiven” und „negativen” Kügelchen, scheint Licht nur auf die positiven oder nur auf den negativen Fasern, im Allgemeinen in Anwesenheit eines lichtaktivierten Reagens' (normalerweise Gelöstsauerstoff). In dem ersteren Fall werden alle aktiven Kügelchen lichtgebleicht. Daher können bei der nicht selektiven Freisetzung aller Kügelchen mit anschließender Sortierung, beispielsweise unter Verwendung einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortiervorrichtung (FACS-Vorrichtung), die nicht fluoreszierenden aktiven Kügelchen von den fluoreszierenden negativen Kügelchen sortiert werden. Alternativ, wenn Licht auf die negativen Fasern fällt, werden alle negativen nicht fluoreszierend und die positiven fluoreszierend sein, und die Sortierung kann durchgeführt werden. Die Charakterisierung des gebundenen bioaktiven Mittels kann direkt durchgeführt werden, beispielsweise mithilfe der Massenspektroskopie.
  • Alternativ kann die Identifikation durch die Verwendung von Identifikationskomponenten („IMs”) auftreten, die ähnlich IBLs sind, aber nicht notwendigerweise an DBLs binden. Das heißt, anstatt einer direkten Ermittlung der Struktur des bioaktiven Mittels kann die Zusammensetzung der IMs als Identifikation dienen. Daher kann beispielsweise eine spezifische Kombination von IMs dazu dienen, das Kügelchen zu kodieren, und wird verwendet, um das Mittel auf dem Kügelchen bei der Freisetzung aus dem Kügelchen zu identifizieren, gefolgt von anschließender Analyse, beispielsweise unter Verwendung eines Gaschromatographen oder Massenspektroskopen.
  • Alternativ besteht jedes Kügelchen anstatt aus einem fluoreszierenden Farbstoff aus einem nicht fluoreszierenden Präkursor für einen fluoreszierenden Farbstoff. Beispielsweise kann unter Verwendung von photospaltbaren Schutzgruppen, wie bestimmten ortho-Nitrobenzylgruppen, auf einem fluoreszierenden Molekül die Photoaktivierung des Fluorochroms durchgeführt werden. Nach dem Assay werden entweder die „positiven” oder „negativen” Fasern erneut bestrahlt, um diese Populationen zu unterscheiden. Die beleuchteten Präkursoren werden dann chemisch zu einem fluoreszierenden Farbstoff umgewandelt. Alle Kügelchen werden dann aus der Anordnung unter Sortierung freigesetzt, um Populationen von fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Kügelchen zu bilden (entweder den positiven oder den negativen oder umgekehrt).
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verbindungsstellen der Kügelchen (beispielsweise die Vertiefungen) ein photopolymerisierbares Reagens, oder das photopolymerisierbare Mittel wird zu dem vereinigten Array zugegeben. Nach der Durchführung des Testassays werden entweder die „positiven” oder die „negativen” Fasern erneut bestrahlt, um diese Populationen zu unterscheiden. Infolge der Bestrahlung werden entweder alle positiven oder alle negativen polymerisiert und eingefangen oder an die Stellen gebunden, während die andere Population von Kügelchen aus dem Array freigesetzt werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Position jedes bioaktiven Mittels unter Verwendung von Dekodierungsbindungsliganden (DBLs) bestimmt. Wie oben dargestellt, sind DBLs Bindungsliganden, die entweder an Identifikationsbindungsliganden, wenn vorhanden, oder an die bioaktiven Mittel selbst binden, bevorzugt wenn das bioaktive Mittel eine Nukleinsäure oder ein Protein ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bindet, wie oben dargestellt, der DBL an den IBL.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel einzelsträngige Nukleinsäuren, und der DBL ist eine im wesentlichen komplementäre einzelsträngige Nukleinsäure, die an das bioaktive Mittel bindet (hybridisiert), vorliegend als eine Dekodierungssonde bezeichnet. Eine Dekodierungssonde, die im Wesentlichen komplementär zu jeder möglichen Sonde ist, wird hergestellt und verwendet, um den Array zu dekodieren. In dieser Ausführungsform sollten die Kandidaten-Sonden und die Dekodierungssonden von ausreichender Länge sein (und der Dekodierschritt unter geeigneten Bedingungen verlaufen), um die Spezifität zu erlauben; d. h. jede Kandidaten-Sonde bindet an ihre entsprechende Dekodierungssonde mit ausreichender Spezifität, um die Unterscheidung von jeder Kandidaten-Sonde zu ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die DBLs entweder direkt oder indirekt markiert. Mit „markiert” ist vorliegend gemeint, dass bei einer Verbindung mindestens ein Element, Isotop oder chemische Verbindung angelagert ist, um die Detektion der Verbindung zu gewährleisten. Im Allgemeinen lassen sich die Markierungen in drei Klassen unterteilen: a) Isotopenmarkierungen, die radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) magnetisch, elektrisch, thermal und c) farbige oder Lumineszenzfarbstoffe, obwohl Markierungen auch Enzyme und Partikel, wie z. B. magnetische Partikel, beinhalten. Bevorzugte Markierungen beinhalten Lumineszenzmarkierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DBL direkt markiert, das heißt, der DBL umfasst eine Markierung. In einer anderen Ausführungsform ist der DBL indirekt markiert; das heißt, ein markierender Bindungsligand (LBL), der an DBL bindet, wird verwendet. In dieser Ausführungsform kann das markierende Bindungsliganden-DBL-Paar wie oben für IBL-DBL-Paare beschrieben sein. Passende Markierungen beinhalten u. a. fluores zierende Lanthanidkomplexe, z. B. solche aus Europium und Terbium, Fluorescein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Eosin, Erythrosin, Kumarin, Methylkumarine, Pyren, Malachitgrün, Stilben, Luzifer-Gelb, Cascade BlueTM, Texas-Rot, FITC, PE, cy3, cy5 und weitere in der 6. Ausgabe des „Molecular Probes Handbook" von Richard P. Haugland beschriebene, die durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist.
  • In einer Ausführungsform ist die Markierung ein Molekül, dessen Farb- oder Lumineszenzeigenschaften sich in Anwesenheit des IBL aufgrund einer Änderung in der lokalen Umgebung verändern. Beispielsweise kann die Markierung Folgendes sein: (1) ein fluoreszierender pH–Indikator, dessen Emissionsintensität sich mit dem pH ändert; (2) ein fluoreszierender Ionenindikator, dessen Emissionseigenschaften sich mit der Ionenkonzentration ändern oder (3) ein fluoreszierendes Molekül, z. B. ein Ethidium-Salz, dessen Fluoreszenz-Intensität sich in hydrophoben Umgebungen erhöht.
  • Folglich wird die Identifikation der Position der einzelnen Kügelchen (oder Subpopulationen von Kügelchen) unter Verwendung von ein oder mehreren Dekodierungsschritten durchgeführt, die aus einer Bindung zwischen dem markierten DBL und entweder dem IBL oder dem bioaktiven Mittel bestehen (d. h. eine Hybridisierung zwischen der möglichen Sonde und der Dekodierungssonde, wenn das bioaktive Mittel eine Nukleinsäure ist). Nach dem Dekodieren können die DBLs entfernt werden, und der Array kann verwendet werden; unter einigen Umständen, beispielsweise wenn der DBL an einen IBL und nicht an das bioaktive Mittel bindet, ist jedoch die Entfernung des DBLs nicht erforderlich (obwohl es unter einigen Umständen wünschenswert sein kann). Außerdem kann, wie vorliegend dargestellt, das Dekodieren durchgeführt werden, entweder bevor der Array in einem Assay, während des Assays oder nach dem Assay verwendet wird.
  • In einer Ausführungsform wird ein einzelner Dekodierungsschritt durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird jeder DBL mit einer einmaligen Markierung markiert, so dass die Anzahl an einmaligen Markierungen gleich oder größer als die Anzahl der bioaktiven Mittel ist (obwohl in einigen Fällen die „Wiederverwendung” der einmaligen Markierungen wie vorliegend beschrieben durchgeführt werden kann; ebenso können kleinere Varianten von möglichen Sonden denselben Dekodierer teilen, wenn die Varianten in einer anderen Dimension kodiert werden, d. h. in der Kügelchengröße oder -markierung). Für jedes bioaktive Mittel oder IBL wird ein DBL hergestellt, der spezifisch daran binden wird und eine einmalige Markierung enthält, beispielsweise einen oder mehrere Fluorochrome. Daher ist die Identität von jedem DBL, sowohl seine Zusammensetzung (d. h. seine Sequenz, wenn es eine Nukleinsäure ist) als auch seine Markierung, bekannt. Dann kann durch die Zugabe der DBLs zu dem Array, enthaltend die bioaktiven Mittel, unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen (als Hybridisierungskomplexe bezeichnet, wenn die Komponenten Nukleinsäuren sind) zwischen den DBLs und entweder den bioaktiven Mitteln oder der IBLs erlauben, die Position von jedem DBL ermittelt werden. Dies ermöglicht die Identifikation der Position von jedem bioaktiven Mittel; der zufällige Array wurde dekodiert. Die DBLs können, wenn notwendig, entfernt und die Zielprobe angebracht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anzahl an einmaligen Markierungen geringer als die Anzahl einmaliger bioaktiver Mittel, und daher werden aufeinander folgende Reihen von Dekodierungsschritten verwendet. Um die Diskussion zu erleichtern, wird diese Ausführungsform für Nukleinsäuren erklärt, obwohl andere Arten von bioaktiven Mitteln und DBLs auch nützlich sind. In dieser Ausführungsform werden Dekodierungssonden in n Gruppen zum Dekodieren unterteilt. Die Anzahl von Gruppen entspricht der Anzahl von einmaligen Markierungen. Jede Dekodierungssonde wird in n separaten Reaktionen mit n unterschiedlichen Markierungen markiert. Alle Dekodierungssonden teilen dieselben n Markierungen. Die Dekodierungssonden werden vereinigt, so daß jeder Pool nur eine der n Markierungsversionen von jedem Dekodierer enthält und kei ne zwei Dekodierungssonden dieselbe Sequenz an Markierungen über die gesamten Pools aufweisen. Die Anzahl an Pools, die erforderlich ist, damit dies zutrifft wird durch die Anzahl an Dekodierungssonden und n bestimmt. Die Hybridisierung von jedem Pool mit der Anordnung erzeugt ein Signal an jeder Adresse, die aus einem IBL besteht. Die aufeinander folgende Hybridisierung von jedem Pool erzeugt wiederum einen einmaligen, sequenzspezifischen Code für jede Kandidaten-Sonde. Dies identifiziert die mögliche Sonde an jeder Adresse in dem Array. Beispielsweise kann, wenn vier Markierungen verwendet werden, dann 4 X n aufeinander folgende Hybridisierungen idealerweise 4n Sequenzen unterscheiden, obwohl in einigen Fällen mehr Schritte erforderlich sein können. Nach der Hybridisierung von jedem Pool werden die Hybride denaturiert, und die Dekodierungssonden entfernt, so dass die Sonden für die nächste Hybridisierung einzelsträngig gemacht werden; (obwohl es ebenso möglich ist, begrenzte Mengen an Markierung zu hybridisieren, so dass die erhältliche Sonde nicht gesättigt ist. Aufeinanderfolgende Hybridisierungen können durchgeführt und durch Subtrahieren des vorher existierenden Signals von der vorherigen Hybridisierung analysiert werden).
  • Ein Beispiel ist illustrativ. Unter der Voraussetzung einer Anordnung mit 16 Sondennukleinsäuren (Zahlen 1 bis 16) und vier einmaligen Markierungen (vier unterschiedlichen Fluorophoren, beispielsweise; Markierungen A-D), werden die Dekodierungssonden 1 bis 16 hergestellt, die den Sonden auf den Kügelchen entsprechen. Der erste Schritt ist die Markierung der Dekodierungssonden 1 bis 4 mit Markierung A, der Dekodierungssonden 5 bis 8 mit Markierung B, der Dekodierungssonden 9 bis 12 mit Markierung C und der Dekodierungssonden 13 bis 16 mit Markierung D. Die Sonden werden gemischt, und der Pool mit dem Array kontaktiert, der die Kügelchen mit den gebundenen Kandidaten-Sonden enthält. Die Position von jeder Markierung (und daher jedem Dekodierer und Kandidaten-Sondenpaar) wird dann bestimmt. Die erste Gruppe Dekodierungssonden wird dann entfernt. Eine zweite Gruppe wird zugegeben, aber jetzt werden die Dekodierungssonden 1, 5, 9 und 13 mit Markierung A markiert, die Dekodie rungssonden 2, 6, 10 und 14 mit Markierung B markiert, die Dekodierungssonden 3, 7, 11 und 15 mit Markierung C markiert und die Dekodierungssonden 4, 8, 12 und 16 mit Markierung D markiert. Daher enthalten die Kügelchen, die Markierung A in beiden Dekodierungsschritten enthielten, die Kandidaten-Sonde 1; die, die die Markierung A in dem ersten Dekodierungsschritt und Markierung B in dem zweiten Dekodierungsschritt enthielten, enthalten die Kandidaten-Sonde 2; die, die die Markierung A in dem ersten Dekodierungsschritt und Markierung C in dem zweiten Schritt enthielten, enthalten die Kandidaten-Sonde 3, usw. Wie Fachleute erkennen, können die Dekodierungssonden in jeder Reihenfolge hergestellt und zugefügt werden.
  • In einer Ausführungsform werden die Dekodierungssonden in situ markiert; das heißt, sie müssen vor der Dekodierungsreaktion nicht markiert werden. In dieser Ausführungsform ist die eingehende Dekodierungssonde kürzer als die Kandidaten-Sonde, was einen 5'-„Überhang” an der Dekodierungssonde erzeugt. Die Zugabe von markierten ddNTPs (jeweils markiert mit einer einmaligen Markierung) und einer Polymerase wird die Zugabe der Markierungen in einer sequenzspezifischen Weise erlauben, wodurch ein sequenzspezifisches Muster von Signalen erzeugt wird. Ebenso können andere Modifikationen durchgeführt werden, u. a. Ligation, usw.
  • Außerdem ist es möglich, da die Größe der Anordnung durch die Anzahl an einmaligen dekodierenden Bindungsliganden eingestellt wird, eine Gruppe von einmaligen DBLs „wiederzuverwenden”, um eine größere Anzahl an Teststellen zu ermöglichen. Dies kann auf mehreren Wegen durchgeführt werden; beispielsweise unter Verwendung von einigen Subpopulationen, die aus optischen Signaturen bestehen. Ebenso können bei der Verwendung eines Positionskodierungsschemas innerhalb einer Anordnung unterschiedliche Subbündel die Gruppe von DBLs wiederverwenden. Ebenso nutzt eine Ausführungsform die Kügelchengröße als eine Kodierungsmodalität, wodurch die Wiederverwendung der Gruppe von einmaligen DBLs für jede Kügelchengröße ermöglicht wird. Alternativ kann die aufeinander folgende Teilladung von Arrays mit Kügelchen ebenso die Wiederverwendung von DBLs ermöglichen. Außerdem kann „Codesharing” ebenso auftreten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die DBLs wiederverwendet werden, indem einige Subpopulationen von Kügelchen aus optischen Signaturen bestehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die optische Signatur im Allgemeinen ein Gemisch aus Reporterfarbstoffen, bevorzugt fluoreszierend. Durch Verändern von sowohl der Zusammensetzung des Gemisches (d. h. dem Verhältnis von einem Farbstoff zum anderen) als auch der Konzentration des Farbstoffes (was zu Unterschieden in der Signalintensität führt) können Matrizes von einmaligen optischen Signaturen erzeugt werden. Dies kann durch kovalente Anlagerung der Farbstoffe an die Oberfläche der Kügelchen oder alternativ durch Einschließen des Farbstoffes innerhalb der Kügelchen erfolgen.
  • Die Farbstoffe können Chromophore oder Luminophore sein, aber sind bevorzugterweise fluoreszierende Farbstoffe, die aufgrund ihrer starken Signale ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für die Dekodierung aufweisen. Passende Farbstoffe zur Anwendung in der Erfindung sind u. a. diejenigen, die für die Markierung der DBLs oben aufgeführt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Kodierung in einem Verhältnis von mindestens zwei Farbstoffen erreicht werden, obwohl beispielsweise weitere kodierende Dimensionen in der Größe der Kügelchen hinzugefügt werden können. Außerdem sind die Markierungen voneinander zu unterscheiden; daher können zwei unterschiedliche Markierungen aus unterschiedliche Molekülen bestehen (d. h. zwei unterschiedliche Fluorophore) oder alternativ eine Markierung bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen oder Intensitäten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe kovalent an die Oberfläche der Kügelchen angelagert. Dies kann, wie im Allgemeinen für die Anlagerung der bioaktiven Mittel dargestellt, unter Verwendung funktioneller Gruppen auf der Oberfläche der Kügelchen durchgeführt werden. Fachleute erkennen, dass diese Anlagerungen durchgeführt werden, um die Wirkung auf den Farbstoff zu verringern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe nicht-kovalent mit den Kügelchen verbunden, im Allgemeinen durch Einschließen der Farbstoffe in die Poren der Kügelchen.
  • Außerdem ist das Kodieren in den Verhältnissen der zwei oder mehreren Farbstoffe, anstatt einzelner Farbstoffkonzentrationen, bevorzugt, da es Unempfindlichkeit für die Intensität von Licht bereitstellt, das verwendet wird, um die Signatur des Reporterfarbstoffs und Detektorempfindlichkeit abzufragen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein räumliches oder Positionskodierungssystem durchgeführt. In dieser Ausführungsform gibt es Subbündel oder Sub-Arrays (d. h. Teile des Gesamt-Arrays), die verwendet werden. Analog zu dem Telefonsystem ist jedes Sub-Array eine „Vorwahl”, die dieselben Markierungen (d. h. Telefonnummern) von anderen Sub-Arrays aufweisen, die aufgrund der Position des Sub-Arrays getrennt werden. Daher können beispielsweise dieselben einmaligen Markierungen von Bündel zu Bündel wiederverwendet werden. Daher kann die Verwendung von 50 einmaligen Markierungen in Kombination mit 100 unterschiedlichen Sub-Arrays eine Anordnung von 5000 unterschiedlichen bioaktiven Mitteln bilden. In dieser Ausführungsform ist es wichtig, ein Bündel aus anderen identifizieren zu können; im Allgemeinen wird dies entweder manuell oder durch die Verwendung von Markerkügelchen, d. h. Kügelchen, die einmalige Markierungen für jedes Sub-Array enthalten können, durchgeführt, oder durch die Verwendung des gleichen Markerkügelchens in verschiedenen Mengen oder durch die Anwendung von zwei oder mehreren Markerkügelchen in verschiedenen Verhältnissen.
  • In alternativen Ausführungsformen können zusätzliche Kodierungsparameter zugegeben werden, wie z. B. die Mikrokügelchengröße. Beispielsweise kann die Verwendung von Kügelchen mit unterschiedlicher Größe ebenso die Wiederverwendung von DBL-Gruppen erlauben; das heißt, es ist möglich, Mikrokügelchen von unterschiedlichen Größen zu verwenden, um die kodierenden Dimensionen der Mikrokügelchen zu erweitern. Optische Faser-Arrays können hergestellt werden, die Pixel mit unterschiedlichen Faserdurchmessern oder Querschnitten enthalten; alternativ können zwei oder mehrere optische Faserbündel, jeweils mit unterschiedlichen Querschnitten der einzelnen Fasern, zusammen zugegeben werden, um ein größeres Bündel zu bilden; oder es können optische Faserbündel aus Fasern mit Querschnitten derselben Größe, aber nur mit unterschiedlich großen Kügelchen verwendet werden. Mit unterschiedlichen Durchmessern können die größten Vertiefungen mit den größten Mikrokügelchen gefüllt werden, und dann bewegen sich zunehmend kleinere Mikrokügelchen in kleinere Vertiefungen, bis alle großen Vertiefungen gefüllt sind. In dieser Weise konnte dasselbe Farbstoffverhältnis verwendet werden, um Mikrokügelchen mit unterschiedlichen Größen zu kodieren, wodurch die Zahl an unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen oder chemischen Funktionalitäten, die in dem Array vorliegen, erhöht wird. Obwohl für die optischen Fasersubstrate dargestellt, kann dies sowie andere vorliegend dargestellte Verfahren mit anderen Substraten und mit anderen Anlagerungsmodalitäten ebenso verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kodieren und Dekodieren durch aufeinander folgendes Laden der Mikrokügelchen in den Array erreicht. Wie oben für räumliches Kodieren dargestellt, können in dieser Ausführungsform die optischen Signaturen „wiederverwendet” werden. In dieser Ausführungsform wird die Bibliothek von Mikrokügelchen, jeweils bestehend aus einem anderen bioaktiven Mittel (oder die Subpopulationen bestehen jeweils aus einem anderen bioaktiven Mittel), in eine Vielzahl von Unterbibliotheken unterteilt; beispielsweise können in Abhängigkeit von der Größe des gewünschten Arrays und der Anzahl an einmaligen Markierungen 10 Unterbibliotheken, jeweils bestehend aus ungefähr 10% der Gesamtbibliothek, hergestellt werden, wobei jede Unterbibliothek aus ungefähr den selben einmaligen Markierungen besteht. Dann wird die erste Unterbibliothek zu dem optischen Faserbündel, das aus den Vertiefungenen besteht, zugegeben, und die Position von jedem bioaktiven Mittel wird im Allgemeinen durch die Verwendung von DBLs bestimmt. Die zweite Unterbibliothek wird dann zugegeben, und die Position von jedem bioaktiven Mittel wird erneut bestimmt. Das Signal besteht in diesem Fall aus dem Signal von dem „ersten” DBL und dem „zweiten” DBL; durch Vergleichen der zwei Matrizes kann die Position von jedem Kügelchen in jeder Unterbibliothek bestimmt werden. Ebenso wird durch Zugabe der dritten, vierten, usw. Unterbibliotheken nacheinander das Befüllen der Arrays ermöglicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Codes auf mehreren Wegen „geteilt” werden. In einer ersten Ausführungsform kann ein einzelner Code (d. h. IBL/DBL-Paar) zwei oder mehreren Mitteln zugewiesen werden, wenn sich die Zielsequenzen in ihren Bindungsstärken ausreichend unterscheiden. Beispielsweise können zwei Nukleinsäuresonden, die in einem mRNA-Quantifizierungsassay verwendet werden, denselben Code teilen, wenn die Bereiche ihrer Hybridisierungssignalintensitäten nicht überlappen. Dies kann beispielsweise auftreten, wenn eine der Zielsequenzen stets bei einer viel höheren Konzentration als die andere vorliegt. Alternativ können die zwei Zielsequenzen stets bei einer ähnlichen Konzentration vorliegen, unterscheiden sich aber in der Hybridisierungswirksamkeit.
  • Alternativ kann ein einzelner Code mehreren Mitteln zugewiesen werden, wenn die Mittel funktionell äquivalent sind. Wenn beispielsweise eine Gruppe von Oligonukleotidsonden mit dem üblichen Zweck der Detektion der Gegenwart eines speziellen Gens konstruiert ist, dann sind die Sonden funktionell äquivalent, selbst wenn sie sich in der Sequenz unterscheiden können. Ebenso könnten sich alle Sonden für verschiedene Mitglieder einer Klasse, wie z. B. Kinasen oder G-Protein-verbundene Rezeptoren, einen Code teilen, wenn Klassen von „Familien” von Analyten erwünscht sind. Ebenso konnte ein Array von diesem Typ verwendet werden, um Homologa von bekannten Genen nachzuweisen. In dieser Ausführungsform wird jedes Gen durch eine heterologe Gruppe von Sonden dargestellt, die mit unterschiedlichen Bereichen des Gens hybridisieren (und sich daher in der Sequenz unterscheiden). Die Gruppe von Sonden teilt sich einen gemeinsamen Code. Wenn ein Homologon vorliegt, kann es mit einigen, aber nicht allen Sonden hybridisieren. Der Grad der Homologie kann durch den Anteil von hybridisierenden Sonden sowie die durchschnittliche Hybridisierungsintensität angegeben werden. Ebenso könnten sich mehrere Antikörper für dasselbe Protein denselben Code teilen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Dekodierung von selbst organisierten zufälligen Arrays auf der Basis der pH-Titration durchgeführt. In dieser Ausführungsform umfassen die Kügelchen zusätzlich zu den bioaktiven Mitteln optische Signaturen, wobei die optischen Signaturen durch die Verwendung von pH-reaktionsfähigen Farbstoffen (vorliegend manchmal als „PH-Farbstoffe” bezeichnet), wie Fluorophore, erzeugt werden. Diese Ausführungsform ist ähnlich der in PCT US98/05025 und U.S.S.N. 09/151,877 dargestellten, die beide durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind, außer, dass die Farbstoffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Veränderungen in der Fluoreszenzintensität (oder anderen Eigenschaften) zeigen, wenn der Lösungs-pH von unter dem pKa-Wert bis über dem pKa-Wert (oder umgekehrt) eingestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Gruppe von pH-Farbstoffen verwendet, jeweils mit einem unterschiedlichen pKa-Wert, bevorzugt getrennt durch mindestens 0,5 pH-Einheiten. Bevorzugte Ausführungsformen nutzen eine pH-Farbstoffgruppe mit pKa's von 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11 und 11,5. Jedes Kügelchen kann eine Untergruppe der pH-Farbstoffe enthalten, und in dieser Weise wird ein einmaliger Code für das bioaktive Mittel erzeugt. Daher wird die Dekodierung eines Arrays durch Titrieren der Anordnung von pH 1 bis pH 13 und Messen des Fluoreszenzsignals aus jedem Kügelchen als eine Funktion des Lösungs-pHs erreicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen zusätzliche Möglichkeiten, die Anzahl einmaliger oder distinkter Markierungen zu erhöhen. Das heißt, dass die Anwendung von distinkten Eigenschaften bei jedem Kügelchen zur Erhöhung der Code-Anzahl eingesetzt werden kann. Weiterhin ermöglicht eine sequenzielle Dekodierung die Wiederverwendung der Codes auf andere Arten. Diese Eigenschaften sind voneinander unabhängig, wodurch die Code-Anzahl als Funktion einer Reihe von Dekodierungsschritten und einer Anzahl von Eigenschaften (z. B. distinkte Codes) exponentiell wachsen kann. Durch die Zunahme der bei einem einzigen Dekodierungsschritt gewonnenen Dekodierungsinformationen wird die Anzahl der Dekodierungsschritte jedoch erheblich reduziert. Alternativ erhöht sich die Anzahl distinkter Codes erheblich. Durch die Erhöhung der Anzahl Eigenschaften pro Dekodierungsschritt sind weniger Dekodierungsschritte bei einer gegebenen Anzahl Codes erforderlich. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Vielzahl von Methoden eingesetzt, um etliche Codes zur Anwendung im Dekodierungsverfahren der Arrays zu generieren, während die notwendigen Dekodierungsschritte minimiert werden. Beispielsweise kann eine Vielzahl von verschiedenen Codierungsstrategien kombiniert werden: Daher können beispielsweise verschiedene „Farben”, Farbkombinationen („Farbtöne”), verschiedene Farbintensitäten oder -töne oder beide, usw. alle miteinander kombiniert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hängen die DBLs von der Bindung oder Einbettung eines quantitativen oder diskreten Satzes von physikalischen Eigenschaften an das Kügelchen, d. h. Markierung des Kügelchens, ab. Bevorzugte physikalische Eigenschaften des Kügelchens sind u. a.: Oberflächen-„Weichheit” oder -„Rauhheit”, Farbe (Fluoreszenz oder sonstige), Farbintensität, Größe, nachweisbare chemische Komponenten, chemische Reaktivität, Magnetisierung, pH-Sensitivität, Effizienz des Energie-Transfers zwischen vorhandenen Farbstoffen, Hydrophobizität, Hydrophilizität, Absorptionsfähigkeit, Ladung, pH-Sensitivität, usw., wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist.
  • Ein Kügelchen-dekodierendes Schema beinhaltet die Zuordnung oder Durchdringung jeder Kügelchen-Art mit einem einzigen quantifizierbaren Merkmal, wobei jede Kügelchen-Art sich in dem quantifizierbaren Wert dieses Merkmals unterscheidet. Beispielsweise kann eine gegebene Anzahl von Fluorophoren an ein Kügelchen angegliedert und die Anzahl der angegliederten Fluorophore im Dekodierungsprozess bestimmt werden. In der Praxis kann jedoch die Angliederung einer „gegebenen Menge” einer Eigenschaft an ein Kügelchen und die akkurate Messung dieser Eigenschaft problematisch sein. Im Allgemeinen ist es das Ziel, den Variationskoeffizienten (CV) zu reduzieren. Mit Variationskoeffizient ist die Variabilität der Markierung eines Kügelchens bei sukzessiven Markierungen gemeint. Dieser CV kann durch die Markierung der Kügelchen mit einer definierten, gegebenen Anzahl von Markierungen (beispielsweise Fluorophor) in vielen Tests und durch Messung des resultierenden, vom Kügelchen emittierten Signals bestimmt werden. Ein großer CV limitiert die Anzahl von brauchbaren und zerlegbaren „Niveaus” für alle gegebenen Merkmale.
  • Bei einem stabileren Dekodierungsschema werden statt absoluten Messungen ratiometrische Messungen zur Segmentierung eines quantitativen Merkmals in Codes durchgeführt. Unter ratiometrischer Dekodierung ist die Markierung eines Kügelchens mit einem bestimmten Markierungsquotienten gemeint (d. h. 1:10, 1:1 und 10:1). Theoretisch kann jegliche Anzahl Quotienten verwendet werden, solange der Unterschied der Signale zwischen den Quotienten nachweisbar ist. Mit diesem Verfahren werden kleinere CVs produziert, was eine stärkere Merkmal-Segmentierung innerhalb eines gegebenen dynamischen Bereiches ermöglicht. Daher reduziert in einer bevorzugten Ausführungsform die Anwendung von ratiometrischer Dekodierung den Variationskoeffizienten.
  • Weiterhin, wie Fachleute erkennen, kann die ratiometrische Dekodierung auf eine andere Art erreicht werden. In dieser Ausführungsform kann diese ratiometrische Analyse-statt durch Zugabe einer gegebenen Anzahl von DBLs mit einer ersten Farbstoff- (oder Farbstoffkombination) Intensität bei der ersten Dekodierungsreaktion und einer zweiten Anzahl mit einer zweiten Farbstoffintensität bei der sequenziellen zweiten Dekodierungsreaktion – durch die Anwendung eines Quotienten aus markierten zu unmarkierten DBLs durchgeführt werden. Das heißt, unter der Voraussetzung einer vorbestimmten Sättigungskonzentration aus dekodierenden Kügelchen, beispielsweise 100.000 DBLs/Reaktion, kann der erste Intensitäts-Dekodierungsschritt durch die Zugabe von 100.000 markierten DBLs und der zweite Dekodierungsschritt durch Zugabe von 10.000 markierten DBLs und 90.000 unmarkierten DBLs durchgeführt werden. Das Gleichgewicht schreibt vor, dass der zweite Schritt ein Zehntel der Signalintensität abgibt.
  • Wegen der Bandbreite der Werte eines quantitativ gemessenen Merkmalwertes ist die Anzahl distinkter Codes praktisch auf weniger als schätzungsweise ein Duzend limitiert. Wegen der seriellen „Bemalung” (d. h. vorübergehenden Anlagerung eines Eigenschaftsniveaus an ein Kügelchen) und „Ablösung” (Entfernung des Eigenschaftsniveaus) eines Kügelchens mit verschiedenen Eigenschaftswerten wächst jedoch die Anzahl möglicher Codes exponentiell mit der Anzahl der seriellen Stadien beim Dekodierungsprozess.
  • Ein Beispiel ist illustrativ. Beispielsweise 9 verschiedene Kügelchen-Arten und drei unterscheidbare Eigenschaftsverteilungen (Tabelle 1). Eine „Bemalung” (Markierung) der Kügelchen mit verschiedenen Eigenschaftswerten in einem kombinatorisch distinkten Muster in den beiden verschiedenen Stadien generiert einen einmaligen Code für jede Kügelchen-Art, d. h. es werden neun distinkte Codes generiert. Daher werden die Kügelchen in einer bevorzugten Ausführungsform mit verschiedenen Eigenschaften in einem kombinatorisch distinkten Muster in einer Vielzahl von Stufen markiert. Dadurch werden einmalige Codes für jede Kügelchen-Art generiert. Beispiele von verschiedenen Eigenschaften sind oben beschrieben. Die Markierung der Kügelchen mit verschiedenen Eigenschaften wird mithilfe dem Stand der Technik bekannter Methoden durchgeführt.
    Stadium 1 Stadium 2 Anzahl einmaliger Codes = Anzahl Eigenschaftens Anzahl Stadien
    Kügelchen-Typ Eigenschaftswert Eigenschaftswert Code
    1 L L (L, L)
    2 L M (L, M)
    3 L H (L, H)
    4 M L (M, L)
    5 M M (M, M)
    6 M H (M, H)
    7 H L (H, L)
    8 H M (H, M)
    9 H H (H, H)
    Tabelle 1 Durch serielle Dekodierung werden einmalige Codes durch Anwendung einer kleinen Anzahl von Eigenschaften-„Niveaus” generiert
  • Fluoreszenzfarben sind eine besonders passende Eigenschaft für die Anwendung in einem Dekodierungsschema. Fluoreszenzfarben können an jedes Mittel angelagert werden, das ein IBL zur Bildung eines markierten DBL erkennt. Die Diskussion ist auf Oligonukleotide (u. a. Nukleinsäure-Analoga) als den DBLs gerichtet. Ein mit Fluoreszenz markiertes Oligonukleotid ist ein besonders nützliches DBL, weil es spezifisch und reversibel jede gewünschte Untergruppe von Kügelchen mit einer bestimmten Farbe „anmalt” (markiert), und zwar einfach durch den Vorgang der Hybridisierung und Dehybridisierung (d. h. an den DBL mit einer komplementären Sequenz). Darüber hinaus kann Fluoreszenz leicht mit einer optischen Standard-Hardware und -Software abgebildet und quantifiziert werden. Um eine gegebene Kügelchen-Art mit einer bestimmten Farbe „anzumalen”, muss die Kügelchen-Art mit einer einmaligen hybridisierbaren DNA-Sequenz (IBL) markiert werden, und die Dekodierungslösung muss ein farbmarkiertes Komplement dieser Sequenz enthalten.
  • Ein Gesichtspunkt bei der Implementierung eines Dekodierungsschemas ist die Minimierung der Anzahl gewonnener Bilder. Bei einem farbbasierten Schema ist die Anzahl der gewonnenen Bilder das Produkt der Anzahl Farben und der Anzahl Stadien. Die Anzahl der Bilder kann durch „Anmalen” eines Kügelchens mit vielen Farben für jedes gegebene Stadium reduziert werden. Durch die Zuordnung von vielen Farben für ein Kügelchen erhöht sich die Anzahl wirksamer Codes. Beispielsweise können in einem von Computer verwendeten 24-Bit-Dreifarben- (z. B. rot, grün, blau) Färbungsprozess-Schema insgesamt 256·256·256 = 16,7 Millionen verschiedene „Farbtöne” aus nur drei Farben (rot, grün, blau) generiert werden.
  • Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform die DBLs mit einer Kombination aus farbigen Fluorophoren markiert. Als solche findet diese Methode Anwendung bei der Erhöhung der Anzahl erhältlicher Codes zur DBL-Markierung durch Einsatz einer nur Handvoll großen Menge verschiedener Farbstoffe (Farben). Die Erhöhung der Anzahl erhältlicher Codes bei jedem Dekodierungsschritt vermindert die Anzahl der in einem gegebenen Dekodierungsprozess erforderlichen Dekodierungsschritte stark.
  • In einer Ausführungsform ist eine Population von Oligonukleotiden, welche ein einziges DBL kodieren, mit einem definierten Farben-Quotienten so markiert, dass jedes Kügelchen, an das der DBL bindet, auf Grundlage eines charakteristischen Farbtons, erhalten aus der Kombination der farbigen Fluorophore, identifiziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei distinkte Farben verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform sind drei oder mehr distinkte Farbstoffe (Farben) zur Anwendung verfügbar. In diesem Beispiel ist die Anzahl differenzierbarer Codes, die durch Markierung einer Population von Oligonukleotiden generiert werden, die ein einziges DBL mit irgendeinem gegebenen Farbstoff kodieren, Drei. Durch Zulassung von Kombinationen von Farben und Farbstufen bei der Markierung werden jedoch viel mehr Codes generiert.
  • Bei einer Dekodierung durch Hybridisierung reicht die bevorzugte Anzahl von unterscheidbaren Farbnuancen von 2 bis 2000; eine stärker bevorzugte Anzahl von unterscheidbaren Farbnuancen reicht von 2 bis 200 und die am meisten bevorzugte Anzahl unterscheidbarer Farbnuancen reicht von 2 bis 20. Durch Anwendung von drei verschiedenen Farbnuancen (Intensitäten) und drei Farben beträgt die Anzahl verschiedener Farbtöne 34 = 81. Durch Kombination eines Farbtons mit einer sequenziellen Dekodierung kann eine fast unbegrenzte Anzahl Codes generiert werden.
  • Wie es zuvor beschrieben wurde, kann der DBL irgendein Mittel sein, das an den IBL bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein einziger DBL mit einem vorbestimmten Farbenverhältnis markiert. Dieses Verhältnis variiert für jedes DBL, wodurch die Markierung eines jeden DBL mit einem als einmalig gekennzeichneten „Farbton” ermöglicht wird. Nach der Behandlung der Kügelchen mit dem DBL wird das Kügelchen analysiert, um den mit jedem Kügelchen assoziierten „Farbton” zu bestimmen, wodurch das Kügelchen mit seinem assoziierten bioaktiven Mittel identifiziert wird.
  • Beispielsweise sind mit vier Primärfarben und zwei Intensitätsstufen (Farbe ist an- oder abwesend) fünfzehn verschiedene Farbtöne/Stadien möglich. Wenn vier Farbtöne und drei verschiedene Intensitätsstufen verwendet werden (abwesend, halb anwesend, voll anwesend), dann sind 73 verschiedene Farbtöne/Stadien möglich. In diesem Fall reicht die Anfertigung von nur 4 Farbbildern aus, um Informationen über 73 verschiedene Kodierfarbtöne zu erlangen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bietet die vorliegende Erfindung Array-Anordnungen, die aus einem ersten Substrat mit einer Oberfläche bestehen, die aus diskreten Stellen besteht. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Population von Mikrokügelchen verwendet, die auf den Stellen verteilt sind, und die Population besteht aus mindestens einer ersten und einer zweiten Subpopulation. Jede Subpopulation umfasst ein bioaktives Mittel und zusätzlich mindestens einen optischen Farbstoff mit einem gegebenen pKa. Die pKas der verschiedenen optischen Farbstoffe sind unterschiedlich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn beispielsweise der Array klonierte Nukleinsäuren umfasst, gibt es verschiedene Methoden zur Dekodierung der Arrays. In einer bevorzugten Ausführungsführungsform, wenn einige Sequenzinformationen über die klonierten Nukleinsäuren bekannt sind, können spezifische Dekodierungssonden hergestellt werden, wie allgemein vorliegend dargestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können „zufällige” Dekodierungs sonden hergestellt werden. Durch sequenzielle Hybridisierungen oder Anwendung vieler Markierungen, wie oben dargestellt, kann ein einmaliges Hybridisierungsmuster für jedes Sensorelement generiert werden. Dadurch können alle Kügelchen, die einen gegebenen Klon darstellen, als Mitglieder derselben Gruppe identifiziert werden. Im Allgemeinen wird dies durch Anwendung von zufälligen oder teilweise degenerierten Dekodierungssonden bewirkt, die sequenzabhängig, aber nicht stark sequenzspezifisch binden. Das Verfahren kann viele Male wiederholt werden, wobei jedes Mal eine verschiedene Markierungseinheit verwendet wird, um ein verschiedenes Signalmuster auf Grundlage von quasi-spezifischen Interaktionen zu generieren. Auf diese Weise wird für jedes Sensorelement eine einmalige optische Signatur entwickelt. Durch Applikation der Mustererkennung oder Clustering-Algorithmen bei optischen Signaturen können die Kügelchen in Gruppen mit der gleichen Signatur unterteilt werden (d. h. sie tragen die gleichen Sonden).
  • Um die tatsächliche Sequenz des Klons selber zu identifizieren, sind weitere Verfahren erforderlich; beispielsweise kann eine direkte Sequenzierung durchgeführt werden. Durch Anwendung eines angeordneten Arrays, der die Klone enthält, wie z. B. einen cDNA-Array (spotted array), kann ein „Schlüssel” generiert werden, der das Hybridisierungsmuster mit einem spezifischen Klon verbindet, dessen Position in dem Satz bekannt ist. Auf diese Weise kann der Klon rückgewonnen und weiter charakterisiert werden.
  • Alternativ können Klon-Arrays durch binäre Dekodierung mit Vektor-Markern dekodiert werden. Beispielsweise werden teilweise randomisierte Oligonukleotide in einen Nukleinsäurevektor kloniert (z. B. Plasmid, Phage, usw.). Jede Oligonukleotidsequenz besteht aus einer Untergruppe einer limitierten Sequenzgruppe. Beispielsweise kann, wenn die limitierte Gruppe 10 Sequenzen umfasst, jedes Oligonukleotid einige Untergruppen (oder alle der 10)-Sequenzen aufweisen. Daher kann jede der 10 Sequenzen im Oligonukleotid an- oder abwesend sein. Daher gibt es 210 oder 1.024 mögliche Kombinationen. Die Sequenzen können überlappen, und kleinere Varianten können auch vertreten sein (z. B. A, C, T und G-Substitutionen), um die Anzahl möglicher Kombinationen zu erhöhen. Eine Nukleinsäure-Bibliothek wird in einen Vektor kloniert, der alle möglichen (randomisierten) Code-Sequenzen enthält. Alternativ können anderen Methoden, wie z. B. PCR für die Zufügung der Marker verwendet werden. Auf diese Weise ist die Anwendung einer kleinen Anzahl von Oligo-Dekodierungssonden zur Dekodierung eines Arrays mit Klonen möglich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Diskriminantenanalyse, Cluster-Algorithmen und eine Computerausrüstung zur Analyse der Dekodierungsdaten der Array-Erfindung angewendet. Die potentiell große Anzahl von den in der Erfindung verwendeten Codes, verbunden mit der Anwendung von verschiedenen Intensitäten und „Farbtönen” der Fluorophore bei den Multi-Step-Dekodierungsverfahren, erfordert eine gute Klassifikation der Daten. Die Daten, besonders die Daten zur Intensität, werden in einem Multi-Steg-Verfahren gesammelt, in dem Kügelchen reversibel markiert werden (beispielsweise durch Hybridisierung von farbstoffmarkierten, komplementären Dekodierungsoligonukleotiden mit den IBL-Sonden auf den Kügelchen oder durch Bildung von Bindungsligandenpaaren für Nicht-Nukleinsäure-IBL-DBL-Paare), und zwar mit verschiedenen Farben oder Farbmischungen („Farbtönen”) in jedem Stadium. Die Herausforderung dabei ist es, ein Kügelchen hinsichtlich der in jedem Schritt verwendeten Farbe für die „Bemalung” genau zu klassifizieren. Je ähnlicher die Markierungen sind (wie durch optische bildgebende Verfahren bestimmt), umso schwieriger ist die Klassifizierung.
  • Die Ähnlichkeit der Farbstoffe, wie sie durch bildgebende Systeme bestimmt werden, werden durch die Spektraleigenschaften der Dekodierungsfarbstoffe und die Trennung durch die Spektralkanäle des bildgebenden Systems bestimmt. Eine bessere Farbtrennung wird durch die Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen mit engen Emissionsspektren und durch die Anwendung eines optischen Systems mit einer engen Bandpass-Exzitation und Emissionsfiltern erreicht, die den Farbstoff „on peak” anregen und seine Emission „on peak” messen. Das Verfahren der optischen Abbildung der Farbstoffe auf den Kügelchen ist ähnlich dem menschlichen Sehprozess, bei dem unser Gehirn Farben sieht, indem es die Rate der Anregung in den drei verschiedenen Zapfenarten innerhalb unseres Auges misst. Bei einem bildgebenden optischen System ist die Anzahl der geeigneten Farbkanäle jedoch viel größer als es die drei im menschlichen Auge vorhandenen sind. CCD-basierte bildgebende Systeme können Farben zwischen 350 nm und 850 nm „sehen”, während die Zapfen im Auge ein Spektrum zwischen 500 bis 600 nm erkennen können.
  • Das Problem der Dekodierung von Kügelchen-Arrays ist im Wesentlichen ein Klassifikationsproblem der Diskriminantenanalyse. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Varianzanalyse im hyperspektralen Alpha-Raum bei einer bekannten Farben- oder Farbton-Gruppe der Kügelchen durchgeführt. Das Zentrum der Kügelchen-Cluster im Alpha-Raum wird Schwerpunkt-Cluster genannt, und die Streuung der Punkte innerhalb eines Clusters bestimmt die Ausbreitung des Clusters. Ein stabiles Klassifikationsschema erfordert, dass die Entfernung zwischen den Schwerpunkten der verschiedenen Kügelchenklassen (Farbtöne) viel größer ist als die Ausbreitung einer beliebigen Cluster-Klasse. Darüber hinaus sollte die Position des Schwerpunktes von Faser zu Faser und Experiment zu Experiment unverändert bleiben.
  • Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Farbton-„Zone” als eine Region im Alpha-Raum definiert, die den Farbton-Schwerpunkt umgibt und bis zum Ausbreitungsradius des Clusters reicht. Angesichts einer Referenzgruppe von Farbton-Schwerpunkten und Ausbreitungsradien, wie sie empirisch bestimmt wurden, kann die Klassifikation eines neuen Datensatzes mit der Frage erzielt werden, ob ein gegebener Kügelchenpunkt so nah wie möglich oder innerhalb der „Zone” eines Farbton-Clusters fällt. Dies wird durch die Berechnung der Mahalanobis-Entfernung (in diesem Fall ist es einfach eine euklidische Abstandsmetrik) des Kügelchen-Punktes von den Schwerpunkten der verschiedenen Farbton-Klassen erzielt. Für die in 3 gezeigten Daten sind die Position der Schwerpunkte und ihre Abstände voneinander in Tabelle 2 dargestellt.
    Tabelle 2 Schwerpunktposition Schwerpunktabstände
    Farbstoff/Kanal Blau Grün Gelb Rot Bod-493 Bod-R6G Bod-564 Bod-TXR
    Bod-493 0.63 0.22 0.11 0.03 0.00
    Bod-R6G 0.03 0.51 0.37 0.09 0.72 0.00
    Bod-564 0.06 0.04 0.57 0.32 0.81 0.55 0.00
    Bod-TXR 0.09 0.05 0.04 0.82 0.99 0.93 0.73 0.00
  • Für die Klassifizierung der verschiedenen Kügelchen in eine bestimmte Farbtonklasse wurde ein euklidischer Abstands-Cutoff von 0,3 festgelegt. Die zwei Schwerpunkte mit dem geringsten Abstand, Bod-R6G und Bod-564 (Abstand = 0,55), zeigen eine leichte Überlappung ihrer Dekodierungszonen bei Anwendung eines euklidischen oder Mahalanobis-Abstands von 0,3. Eine Klassifikationsverbesserung kann durch eine Verkleinerung dieses Abstands erfolgen und durch eine entsprechende Gewichtung der verschiedenen Koordinatenachsen.
  • Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung Computermethoden zur Analyse und Klassifizierung der Farbe eines Kügelchens.
    Die Farbklassifizierung des Kügelchens wird durch die Betrachtung des Kügelchens im hyperspektralen „Alpha”-Raum durchgeführt (a1 = l1/Sll, a2 = l2/Sli, a3 = l3/Sli, usw.), in dem jede Koordinatenachse den Anteil der Kügelchenintensität innerhalb eines gegebenen Bildgebungskanals darstellt. Beispielsweise kann die Farbe oder der Farbton eines Kügelchens durch einen Punkt im dreidimensionalen Alpha-Raum (die vierte Dimension ist nicht notwendig, weil Sai = 1) dargestellt werden, wenn zur Abbildung der Kügelchen vier Bildgebungskanäle eingesetzt werden. Angesichts einer Gruppe von verschiedenen primären Farbstoffen, mit denen die Kügelchen markiert werden, ist die Anzahl der Farbtöne, die aus diesen Farbstoffen generiert werden können, unbegrenzt, weil die Farbstoffe im wechselnden Verhältnis und wechselnden kombinatorischen Muster kombiniert werden können. Die Anzahl der brauchbaren Farbtöne wird experimentell durch die Trennung der verschiedenen Farbton-Cluster im hyperspektralen Alpha-Raum bestimmt.
  • 3 zeigt einen hyperspektralen Alpha-Plot von Kügelchen, die mit vier verschiedenen Farbtönen markiert sind, die in vier einzelnen Bildgebungskanälen abgebildet sind. Es ist zu beachten, dass die Kügelchen vier distinkte Cluster bilden. Wegen der sauberen Trennung der vier Cluster kann ein solides Dekodierungsklassifikationsschema implementiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird für den Dekodierungsprozess eine Qualitätskontrollanalyse durchgeführt. Dies wird durch eine Cluster-Analyse des Alpha-Raums für jedes Dekodierungsstadium erreicht. Die Anzahl der bestimmten Cluster wird durch die erwartete Anzahl der Farbtöne festgelegt. Die Positionen der Cluster-Schwerpunkte werden überwacht und alle Abweichungen von der erwarteten Position dokumentiert.
  • Daher liefert die Erfindung einen Apparat zur Dekodierung der Arrays im Rahmen der Erfindung. Als Ergänzung zu den vorliegend dargestellten Anordnungen beinhaltet der Apparat eine zentrale Prozesseinheit, die mit einem Speicher und einer Gruppe von Input- und Output-Geräten über einen Bus kommuniziert (z. B. Keyboard, Maus, Monitor, Drucker). Die allgemeine Interaktion zwischen einer zentralen Prozesseinheit, einem Speicher, Input- und Output-Geräten und einem Bus ist dem Stand der Technik bekannt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung zielt auf das Klassifikationssystem des hyperspektralen „Alpha”-Raums, das im Speicher gespeichert ist.
  • Das Klassifikationssystemprogramm beinhaltet ein Datenerhebungsmo dul, das Daten von einem optischen Lesegerät oder konfokalen Mikroskop empfängt (oder anderen bildgebenden Systemen). Im Allgemeinen beinhaltet das Klassifikationsprogramm auch ein Analysenmodul, das die Varianz im hyperspektralen Alpha-Raum analysieren, die Schwerpunkte und Streuung der Cluster berechnen, sowie die Farbton-Zone und den Abstands-Cutoff definieren kann. Im Allgemeinen kann das Analysenmodul ferner bestimmen, ob ein Datenpunkt innerhalb der Farbton-Zone fällt, und zwar durch Berechnung des Mahalanobis-Abstands.
  • Schlussendlich analysiert das Analysenmodul die unterschiedlichen sequenziellen Dekodierungsdaten, um letztlich der Kügelchen-Position ein bioaktives Mittel zuzuordnen.
  • Auf diese Weise werden die sequentiellen Dekodierungsschritte durchgeführt, wobei bei jedem Schritt die Ergebnisse der Diskriminantenanalyse verwendet werden, um jedem Kügelchen im Array bei jedem Schritt ein Farbtoncluster zuzuordnen. Durch die Anhäufung der Daten der sequentiellen Dekodierung können die Position des Kügelchens und die darauf vorhandene chemische Substanz korreliert werden.
  • Nach der Herstellung können die Anordnungen der Erfindung bei vielen Applikationen eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Anordnungen zur Untersuchung einer Probenlösung auf die An- oder Abwesenheit eines Zielanalyten, u. a. zur Quantifizierung der Menge des vorhandenen Zielanalyten verwendet. Unter „Zielanalyt” oder „Analyt” oder vorliegend enthaltenen grammatikalischen Äquivalenten ist jedes Atom, Molekül, Ion, molekulares Ion, jede Verbindung oder jeder Partikel entweder zur Detektion oder zur Evaluation für Bindungspartner gemeint. Wie Fachleute erkennen, kann eine große Anzahl von Analyten in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Praktisch kann jeder Analyt verwendet werden, der ein bioaktives Mittel bindet oder für den ein Bindungspartner (d. h. ein Arzneimittelkandidat) gesucht wird.
  • Passende Analyten sind z. B. organische und anorganische Moleküle, z. B. Biomoleküle. Nach der Detektion eines Zielanalyten werden die folgenden Zielanalyte als geeignet erachtet, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist: ein Umweltschadstoff (z. B. Pestizide, Insektizide, Toxine); eine chemische Substanz (z. B. Lösungsmittel, Polymere, organische Materialien); therapeutische Moleküle (z. B. therapeutische und missbrauchte Drogen, Antibiotika, usw.); Biomoleküle (z. B. Hormone, Cytokine, Proteine, Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate, Zellmembranantigene und Rezeptoren (neutrale, hormonale, Nährstoff- und Zelloberflächen-Rezeptoren) oder ihre Liganden, usw.); ganze Zellen (z. B. prokaryotische (wie z. B. pathogene Bakterien) und eukaryotische Zellen, z. B. Säugetier-Tumorzellen); Viren (z. B. Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Lentiviren) und Sporen, usw. Besonders bevorzugte Analyte sind Nukleinsäuren und Proteine.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt ein Protein. Wie Fachleute erkennen, gibt es eine große Anzahl von möglichen proteinösen Zielanalyten, die mithilfe der vorliegenden Erfindung entdeckt oder als Bindungspartner untersucht werden können. Geeignete Protein-Zielanalyte sind u. a. (1) Immunoglobuline, (2) Enzyme (und andere Proteine), (3) Hormone und Cytokine (von denen viele Liganden für Zellrezeptoren sind) und (4) andere Proteine, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nukleinsäure. Diese Assays finden in einer großen Vielfalt von Applikationen Anwendung, wie es allgemein in U.S.S.N.s 60/160,027 ; 60/161,148 ; 09/425,633 und 60/160,917 dargestellt ist, die alle durch ausdrückliche Bezugnahme Teil dieser Beschreibung sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden bei der genetischen Diagnose verwendet. Beispielsweise können Sonden mit den vorliegend offenbarten Techniken hergestellt werden, um Zielsequenzen wie z. B. das Gen für das nicht polypöse Kolonkarzinom, das BRCA1-Brustkrebsgen, das mit einer Vielzahl von Krebsarten verbundene P53-Gen, das ApoE4-Gen, das ein größeres Risiko der Alzheimer-Erkrankung anzeigt, zu detektieren, wodurch ein leichtes, präsymptomatisches Screening der Patienten möglich ist, Mutation des Gens für die zystische Fibrose, Cyochrom P450s oder beliebige andere, dem Stand der Technik bekannte Zielsequenzen nachgewiesen werden.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform wird die virale und bakterielle Detektion mit den Komplexverbindungen der Erfindung durchgeführt. In dieser Ausführungsform werden Sonden für die Detektion von Zielsequenzen aus einer Vielzahl Bakterien und Viren konzipiert. Beispielsweise hängen die aktuellen Blut-Screening-Techniken von der Detektion von Anti-HIV-Antikörpern ab. Mit den vorliegend offenbarten Methoden ist ein direktes Screening von klinischen Proben möglich, um HIV-Nukleinsäuresequenzen, insbesondere stark konservierte HIV-Sequenzen, nachzuweisen. Weiterhin können zirkulierende Viren innerhalb eines Patienten direkt überwacht werden, wobei diese Technik eine verbesserte Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit antiviraler Therapien darstellt. Ebenso können auf diese Weise Viren, die mit Leukämie, HTLV-I und HTLV-II assoziiert sind, nachgewiesen werden. Ebenfalls können bakterielle Infektionen, wie z. B. Tuberkulose, Durant-Nicolas-Favre-Krankheit und andere sexuell übertragenen Krankheiten nachgewiesen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform finden die Nukleinsäuren der Erfindung Anwendung als Sonden für toxische Bakterien beim Screening von Wasser- und Nahrungsmittelproben. Beispielsweise können Proben behandelt werden, damit sie die Bakterien zur Freigabe ihrer Nukleinsäuren lysieren, und dann werden Sonden zur Erkennung von Bakterienstämmen konzipiert, z. B. pathogene Stämme wie Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania, enterotoxische Stämme von E. coli und Bakterien der Legionärskrankheit, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist. Ebenso können mit den Ausführungen der Erfindung Biosanierungsstrategien untersucht werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden für ein forensisches „DNA-Fingerprinting” verwendet, um am Tatort eines Verbrechens gesammelte DNA-Proben mit den Proben von Opfern und Verdächtigen abzugleichen.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform werden die Sonden in einem Array zur Sequenzierung durch Hybridisierung verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung findet auch Anwendung als eine Methodologie zur Detektion von Mutationen oder Fehlübereinstimmungen von Ziel-Nukleinsäuresequenzen. Beispielsweise wurde jüngstens der Schwerpunkt auf die Analyse der Beziehung zwischen genetischer Variation und Phänotyp durch Einsatz von polymorphen DNA-Markern gelegt. In früheren Arbeiten wurden kurze Tandemwiederholungen (STRs) als polymorphe positionale Marker verwendet. Der jüngste Schwerpunkt liegt jedoch in der Anwendung von Einzel-Nukleotidpolymorphismen (SNPs), die mit einer mittleren Häufigkeit von mehr als 1 pro Kilobase in der humanen Genom-DNA vorkommen. Einige SNPs, besonders solche in und um die Kodierungssequenzen, sind wahrscheinlich die direkte Folge von therapeutisch relevanten phänotypischen Varianten. Es gibt eine Anzahl von gut bekannten Polymorphismen, die zu klinisch wichtigen Phänotypen führen, z. B. die ApoE2/3/4-Varianten sind mit verschiedenen relativen Risiken der Alzheimer-Erkrankung und anderen Erkrankungen assoziiert (siehe Cordor et al., Science 261 (1993). Die Multiplex-PCR-Amplifikation von SNP-Loci mit nachfolgender Hybridisierung mit Oligonukleotid-Arrays hat sich als akkurate und zuverlässige Methode von simultaner Gentypisierung von mindestens Hunderten von SNPs herausgestellt; siehe Wang et al., Science, 280: 1077 (1998); siehe auch Schafer et al., Nature Biotechnology 16: 33–39 (1998). Die Anordnungen der vorliegenden Erfindung können leicht mit den Arrays des Stands der Technik substituiert werden, besonders die Einzelbasenextension (SBE), und Pyrosequenziertechniken sind zusammen mit den Anordnungen der Erfindung besonders nützlich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Anordnungen der Erfindung zum Screening von bioaktiven Mitteln verwendet, um ein Mittel zu finden, das an ein Zielmolekül bindet und bevorzugterweise seine Funktion modifiziert. Wie oben dargestellt, kann eine große Vielfalt verschiedener Assay-Formate durchgeführt werden, wie Fachleute erkennen. Im Allgemeinen wird der Zielanalyt, für den ein Bindungspartner gewünscht wird, markiert. Die Bindung des Zielanalyten durch das bioaktive Mittel führt zur Rekrutierung der Markierung an das Kügelchen, mit nachfolgender Detektion.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung des bioaktiven Mittels und des Zielanalyten spezifisch. Das heißt, das bioaktive Mittel bindet spezifisch an den Zielanalyten. Mit „spezifisch gebunden” ist vorliegend gemeint, dass das Mittel einen Analyten bindet, und zwar so spezifisch, dass zwischen dem Analyten und anderen Komponenten oder Kontaminanten der Testprobe unterschieden werden kann. Wie Fachleute erkennen, ist es jedoch möglich, Analyte durch Bindungen zu detektieren, die nicht hoch spezifisch sind. Beispielsweise können in den Systemen verschiedene Bindungsliganden verwendet werden, z. B. ein Array verschiedener Liganden, und die Detektion von jeglichen speziellen Analyten erfolgt über ihre Bindungs-„Signatur” an eine Gruppe von Bindungsliganden, ähnlich der Art, wie „elektronische Nasen” funktionieren. Die ist besonders bei der Detektion von chemischen Analyten nützlich. Die Bindung sollte ausreichend sein, um unter den Bedingungen des Assays, z. B. Waschschritte zur Aufhebung einer nicht spezifischen Bindung, bestehen zu bleiben, obwohl in einigen Ausführungsschritten keine Waschschritte erforderlich sind, d. h. zur Detektion von Bindungspartnern mit geringer Affinität. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise bei der Detektion von bestimmten Biomolekülen, werden die Dissoziationskonstanten des Analysten zum Bindungsliganden bei weniger als ungefähr 10–4–10–6 M–1 liegen, wobei weniger als ungefähr 10–5 bis 10–9 M–1 bevorzugt werden und weniger als ungefähr 10–7–10–9 M–1 besonders bevorzugt werden.
  • Im Allgemeinen wird eine Probe, die ein Zielanalyt enthält (ob für die Detektion des Zielanalyten oder zum Screenen von Bindungspartnern des Zielanalyten), dem Array zugefügt, und zwar unter Bedingungen, die für die Bindung des Zielanalyten an mindestens eines der bioaktiven Mittel geeignet sind, d. h. im Allgemeinen unter physiologischen Bedingungen. Dann wird die An- oder Abwesenheit des Zielanalyten nachgewiesen. Wie Fachleute erkennen, kann dies auf vielfältige Weise geschehen, im Allgemeinen durch Ausnutzung einer Veränderung im optischen Signal. Diese Veränderung kann über viele verschiedene Mechanismen erfolgen. Einige Beispiele sind die Bindung eines farbstoffmarkierten Analyten an das Kügelchen, die Herstellung einer Farbstoffart auf oder nahe eines Kügelchens, die Vernichtung einer existierenden Farbstoffart, eine Veränderung in der optischen Signatur bei der Analyteninteraktion mit einem Farbstoff auf dem Kügelchen oder irgendein anderes optisches, messbares Ereignis.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform findet die Veränderung in der optischen Signatur als Folge der Bindung eines Zielanalyten, der entweder direkt oder indirekt markiert wurde, mit einem nachweisbaren Marker, bevorzugterweise einem optischen Marker, wie z. B. einem Fluorochrom, statt. Wenn daher beispielsweise ein proteinöser Zielanalyt verwendet wird, kann er entweder direkt mit einem Fluor markiert werden oder indirekt, beispielsweise durch Anwendung eines markierten Antikörpers. Ebenso können Nukleinsäuren leicht mit Fluorochromen markiert werden, beispielsweise bei der PCR-Amplifikation, wie dem Stand der Technik bekannt. Alternativ kann bei Bindung der Zielsequenzen ein Hybridisierungsindikator als Markierung verwendet werden. Hybridisierungsindikatoren verbinden sich, normalerweise reversibel, bevorzugt mit doppelsträngiger Nukleinsäure. Hybridisierungsindikatoren sind z. B. Interkalatoren und kleine und/oder große Rinnenbinderkomponenten. In einer bevorzugten Ausführungsform können Interkalatoren verwendet werden; da eine Interkalation im Allgemeinen bei Anwesenheit einer doppelsträngigen Nukleinsäure stattfindet, leuchtet die Markierung nur bei Anwesenheit einer Ziel-Hybridisierung auf. Daher wird bei Bindung des Zielanalyten an das bioaktive Mittel an dieser Stelle eine neue optische Signatur generiert, die dann nachgewiesen werden kann.
  • Alternativ generiert in einigen Fällen, wie oben diskutiert, der Zielanalyt, wie z. B. ein Enzym, eine Art, die entweder direkt oder indirekt optisch nachweisbar ist.
  • Darüber hinaus kann in einigen Ausführungsformen die optische Signatur die Grundlage des optischen Signals sein. Beispielsweise kann durch die Interaktion von einigen chemischen Zielanalyten mit einigen Fluoreszenzfarbstoffen auf den Kügelchen die optische Signatur verändert werden, wodurch ein anderes optische Signal generiert wird.
  • Wie Fachleute erkennen, kann die An- oder Abwesenheit in einigen Ausführungsformen durch Veränderungen in anderen optischen oder nicht optischen Signalen erkannt werden, z. B. durch oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie, Oberflächen-Plasmon-Resonanz, Radioaktivität, usw., wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist.
  • Die Assays können unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen durchgeführt werden, wie Fachleute erkennen. Es kann eine Vielzahl von weiteren Reagenzien in die Screening-Assays aufgenommen werden. Diese sind u. a. Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, z. B. Albumine, Detergenzien, usw., welche die beste Protein-Protein-Bindung fördern und/oder nicht spezifische oder Hintergrund-Interaktionen reduzieren können. Es können auch Reagenzien verwendet werden, die andererseits die Effizienz des Assays verbessern, wie z. B. Protease-Hemmer, Nuklease-Hemmer, antimikrobielle Mittel. Das Komponentengemisch kann in beliebiger Reihenfolge hinzugefügt werden, die die notwendige Bindung bereitstellt. Wie in Fachkreisen bekannt, können verschiedene Blockierungs- und Waschschritte angewendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden kompetitive Zweifarben-Hybridisierungsassays durchgeführt. Diese Assays können auf den traditionellen Sandwich-Assays beruhen. Die Kügelchen enthalten eine Fangsequenz, die auf einer Seite (vor- oder nachgeschaltet) des SNP lokalisiert ist, um die Zielsequenz zu fangen. Zwei allelspezifische SNP-Sonden, jede mit einem anderen Fluorophor markiert, werden mit der Zielsequenz hybridisiert. Der Genotyp kann aus dem Verhältnis beider Signale gewonnen werden, wobei die richtige Sequenz im Allgemeinen die bessere Bindung zeigt. Dies hat den Vorteil, dass die Zielsequenz selber nicht markiert werden muss. Weiterhin bedeutet dies, dass die Bedingungen für eine Bindung nicht optimiert werden müssen, weil die Sonden miteinander konkurrieren. Unter Bedingungen, bei denen eine fehlgepaarte Sonde stabil gebunden wäre, kann sie immer noch durch eine passende Sonde ersetzt werden. Daher kann unter solchen Bedingungen mit dem kompetitiven Assay eine bessere Unterscheidung erreicht werden. Weil viele Assays parallel durchgeführt werden, können die Bedingungen für jede Sonde nicht simultan optimiert werden. Daher kann ein kompetitives Assay-System zur Kompensation von nicht optimalen Bedingungen zur Unterscheidung von Fehlpaarungen verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Dideoxynukleotid-Kettenabbruchsequenzierung mit den Anordnungen der Erfindung durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird eine DNA-Polymerase zur Extension eines Primers mit fluoreszenzmarkierten ddNTPs verwendet. Das 3'-Ende des Primers befindet sich neben der SNP-Stelle. Auf diese Weise ist die Einzelbasenextension komplementär zur Sequenz an der SNP-Stelle. Durch die Anwendung von vier verschiedenen Fluorophoren, eines für jede Base, kann die SNP-Sequenz durch den Vergleich der vier basenspezifischen Signale hergeleitet werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen. In einer ersten Ausführungsform kann die Fangsonde verlängert werden. In dieser Ausführungsform muss die Sonde entweder 5'-3' auf dem Kügelchen synthetisiert werden oder an das 5'-Ende angelagert werden, um ein freies 3'-Ende für die Polymerase-Extension zu liefern. Alternativ kann ein Assay vom Sandwich-Typ verwendet werden. In dieser Ausführungsform wird das Ziel auf dem Kügelchen durch eine Sonde gefangen. Dann wird ein Primer abgekühlt und verlängert. Wie bereits erwähnt, muss im letzteren Fall die Zielsequenz nicht markiert werden. Weiterhin -weil in Sandwich-Assays zwei spezifische Interaktionen erforderlich sind – führt dies zu erhöhten strengen Bedingungen, die für die Analyse von komplexen Proben besonders wichtig sind.
  • Weiterhin ist es auch möglich – wenn Zielanalyt und DBL beide an das Mittel binden – die Detektion von nicht markierten Zielanalyten mittels Dekodierungskonkurrenz durchzuführen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Methoden der Erfindung für die Array-Qualitätskontrolle nützlich. Vor dieser Erfindung sind keine Methoden beschrieben worden, die einen positiven Test der Leistungsfähigkeit einer jeden Sonde auf jedem Array bieten. Durch die Dekodierung des Arrays wird nicht nur dieser Test geliefert – sie liefert ihn auch durch die Verwendung der generierten Daten während des eigentlichen Dekodierungsprozesses. Daher sind keine zusätzlichen Experimente erforderlich. Die Erfindung erfordert nur einen Satz von Datenanalyse-Algorithmen, die mit der Software kodiert werden können.
  • Mit dem Verfahren der Qualitätskontrolle kann eine Vielzahl von systematischen und zufälligen Problemen in einem Array bestimmt werden. Beispielsweise können zufällige Staubkörnchen oder andere Kontaminanten dazu führen, dass einige Sensoren falsche Signale abgeben – dies kann bei der Dekodierung entdeckt werden. Auch der Wegfall von einem oder mehreren Mitteln aus verschiedenen Arrays kann nachgewiesen werden. Ein Vorteil dieses Qualitätskontrollverfahrens ist, dass es unmittelbar vor dem eigentlichen Assay implementiert werden kann und einen wahren Funktionstest für jeden einzelnen Sensor darstellt. Daher können alle Probleme, die zwischen dem Aufbau und der eigentlichen Anwendung des Arrays auftreten, entdeckt werden. Bei Applikationen, bei denen ein hoher Konfidenzgrad erforderlich ist und/oder eine erhebliche Chance eines Sensorversagens während des Experimentes besteht, können Dekodierung und Qualitätskontrolle sowohl vor als auch nach der eigentlichen Probenanalyse durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Arrays für eine Reagenzien-Qualitätskontrolle verwendet werden. In vielen Beispielen werden biologische Makromoleküle als Reagenzien verwendet und benötigen eine Qualitätskontrolle. Beispielsweise können große Mengen von Oligonukleotiden als Reagenzien zur Verfügung gestellt werden. Es ist üblicherweise schwierig, eine Qualitätskontrolle bei einer großen Anzahl verschiedener biologischer Makromoleküle durchzuführen. Die hierin beschriebene Methode kann dafür eingesetzt werden, indem die Reagenzien – statt der Arrays – (als DBLs formuliert) als Variable behandelt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die vorliegend beschriebenen Methoden bei der Array-Kalibrierung verwendet. Bei vielen Applikationen, wie z. B. der mRNA-Quantifizierung, ist es wünschenswert, ein Signal zu haben, das eine lineare Antwort auf die Konzentration des Zielanalyten darstellt oder alternativ, falls nicht linear, die Beziehung zwischen der Konzentration und dem Signal zu bestimmen, sodass die Konzentration des Zielanalyten geschätzt werden kann. Entsprechend liefert die vorliegende Erfindung Methoden zur Erstellung von Kalibrierungskurven parallel für viele Kügelchen in einem Array. Die Kalibrierungskurven können unter Bedingungen erstellt werden, welche die Komplexität der zu analysierenden Probe simuliert. Jede Kurve kann unabhängig von den anderen erstellt werden (z. B. für einen verschiedenen Konzentrationsbereich), aber zur gleichen Zeit wie alle anderen Kurven für den Array. Daher wird in dieser Ausführungsform das sequenzielle Dekodierungsschema mit verschiedenen Konzentrationen, statt verschiedenen Fluorophoren, implementiert, die als Code-„Markierungen” verwendet werden. Auf diese Weise kann das Signal als Antwort auf eine Konzentration für jedes Kügelchen gemessen werden. Diese Kalibrierung kann unmittelbar vor einer Assay-Anwendung durchgeführt werden, so dass jede Sonde auf dem Array bei Bedarf individuell kalibriert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Methoden der Erfindung auch bei der Assay-Entwicklung verwendet werden. Daher können mit den Methoden beispielsweise gute und schlechte Sonden bestimmt werden. Wie Fachleute erkennen, funktionieren einige Sonden nicht gut, weil sie nicht gut hybridisieren oder weil sie mit mehr als einer Sequenz kreuzhybridisieren. Diese Probleme werden während des Dekodierungsprozesses leicht entdeckt. Wegen der Fähigkeit, die Sondenleistung schnell zu beurteilen, können potenziell die Zeit und Ausgaben der Assay-Entwicklung stark reduziert werden.
  • Ebenso sind die Methoden in einer bevorzugten Ausführungsform bei der Quantifizierung bei der Assay-Entwicklung nützlich. Für viele Assays stellt die Fähigkeit, Unterschiede der Analytenkonzentrationen zwischen den Proben zu entdecken, sowie die Fähigkeit, diese Unterschiede zu quantifizieren und die absoluten Analytenkonzentrationen zu messen, und all dies in Anwesenheit eines komplexen Gemisches ähnlicher Analyte, große Herausforderungen dar. Ein Beispiel dieses Problems ist die Quantifizierung einer spezifischen mRNA in Anwesenheit der gesamtzellulären mRNA. Ein Ansatz, der als Grundlage der mRNA-Quantifizierung entwickelt wurde, macht vom Einsatz von vielen passenden und fehlgepaarten Sondenpaaren Gebrauch (Lockhart et al., 1996) und wird hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme Teil dieser Beschreibung. Obwohl der Ansatz einfach ist, erfordert er eine relativ große Anzahl Sonden. Bei diesem Ansatz wird eine quantitative Antwort auf eine Konzentration durch Mittelung der Signale aus einer Gruppe verschiedener Sonden für das Gen oder die Sequenz des Interesses gewonnen. Dies ist erforderlich, weil nur einige Sonden quantitativ reagieren, und es nicht möglich ist, diese Proben mit Gewissheit vorherzubestimmen. Ohne das Vorwissen ist nur die durchschnittliche Antwort auf eine entsprechend ausgewählte Sammlung von Sonden quantitativ. Bei der vorliegenden Erfindung kann dies jedoch im Allgemeinen bei Nukleinsäure-basierten Assays, ebenso wie bei anderen Assays, angewendet werden. Im Wesentlichen sollen mit dem Ansatz diejenigen Sonden identifiziert werden, die in einem bestimmten Assay quantitativ reagieren, statt sie aus einem Pool mit anderen Sonden zu mitteln. Dies geschieht mithilfe des oben beschriebenen Array-Kalibrierungsschemas, bei dem konzentrationsbasierte Codes verwendet werden. Die Vorteile dieses Ansatzes sind u. a.: Es werden weniger Sonden benötigt; die Richtigkeit der Messung hängt weniger von der Anzahl der verwendeten Sonden ab und die Antwort der Sensoren ist mit einem hohen Grad an Gewissheit bekannt, weil jede einzelne Sequenz auf effiziente Weise getestet werden kann. Wichtig ist der Hinweis, dass Sonden, die leistungsfähig sind, empirisch ausgewählt werden, wodurch die Schwierigkeiten und Ungewissheiten einer Vorhersage der Sondenleistung vermieden werden, insbesondere bei komplexen Sequenzgemischen. Im Gegensatz dazu wird bei bis heute durchgeführten Experimenten mit angeordneten Arrays eine relativ kleine Anzahl von Sequenzen durch quantitative „Spiking-Experimente” geprüft, bei denen eine bekannt mRNA dem Gemisch zugesetzt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden cDNA-Arrays für die Profilerstellung (Profiling) bei der RNA-Expression hergestellt. In dieser Ausführungsform werden individuelle cDNA-Klone (beispielsweise mithilfe PCR) aus cDNA-Bibliotheken amplifiziert, die in einem Wirt-Vektor-System vermehrt werden. Jede amplifizierte DNA ist an eine Population von Kügelchen gebunden. Verschiedene Populationen werden zusammen vermischt, um eine Kollektion von Kügelchen zu schaffen, welche die cDNA-Bibliothek repräsentieren. Die Kügelchen werden angeordnet, dekodiert (wie oben beschrieben) und in einem Assay verwendet (obwohl, wie es vorliegend beschrieben wurde, die Dekodierung auch nach dem Assay stattfinden kann). Der Assay wird mit RNA-Proben durchgeführt (ganze Zelle oder mRNA), die extrahiert, bei Bedarf markiert und mit dem Array hybridisiert werden. Durch eine vergleichende Analyse können die Unterschiede bei den Exprimierungsgraden einzelner RNAs nachgewiesen werden. Durch den Vergleich mit einem entsprechenden Satz von Kalibrierungsstandards können die absoluten RNA-Mengen quantifiziert werden.
  • Der cDNA-Array kann auch für Abbildungen („Mapping”) verwendet werden, z. B. zur Abbildung von Deletionen/Insertionen oder von Anzahländerungen im Genom, beispielsweise, von Tumoren oder anderen Gewebeproben. Dies kann durch Hybridisierung genomischer DNA erreicht werden. Statt cDNAs (oder ESTs, usw.) können auch andere STS (sequenzmarkierte Stellen), z. B. zufällige Genomfragmente für diesen Zweck angeordnet werden.
  • Einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nachstehend in den folgenden nummerierten Abschnitten beschrieben.
    • 1. Eine zusammengesetzte Array-Anordnung, umfassend: a) ein Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Assay-Positionen umfasst, wobei jede Assay-Position eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst und b) eine Population von Mikrokügelchen, die mindestens eine ersten und eine zweiten Subpopulation umfasst, worin jede Subpopulation ein bioaktives Mittel umfasst; worin besagte Mikrokügelchen auf jede der besagten Assay-Positionen verteilt sind.
    • 2. Eine Anordnung nach Abschnitt 1, worin jede der besagten Assay-Positionen einen im Wesentlichen ähnlichen Satz von bioaktiven Mitteln umfasst.
    • 3. Eine Anordnung nach Abschnitt 1, worin besagtes Substrat eine Mikrotiterplatte ist und jede Assay-Position eine Mikrotiter-Vertiefung ist.
    • 4. Eine Anordnung nach Abschnitt 1, worin jede diskrete Stelle eine Kügelchen-Vertiefung ist.
    • 5. Eine Anordnung nach Abschnitt 1, worin jede der besagten Subpopulationen weiterhin eine optische Signatur umfasst, die besagtes bioaktives Mittel identifizieren kann.
    • 6. Eine Anordnung nach Abschnitt 1, worin jede der besagten Subpopulationen weiterhin einen Identifikationsbindungsliganden umfasst, der einen Dekodierungsbindungsliganden bindet, sodass die Identität des bioaktiven Mittels aufgeklärt werden kann.
    • 7. Eine zusammengesetzte Array-Anordnung, umfassend: a) ein erstes Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Assay-Positionen umfasst; b) ein zweites Substrat, das eine Vielzahl von Arrayl-Positionen umfasst, wobei jede Array-Lokation diskrete Stellen umfasst und c) eine Population von Mikrokügelchen, die mindestens eine erste und eine zweite Subpopulation umfassen, worin jede Subpopulation ein bioaktives Mittel umfasst, worin besagte Mikrokügelchen auf jeder der besagten Array-Positionen verteilt sind.
    • 8. Eine Anordnung nach Abschnitt 7, worin besagtes erstes Substrat eine Mikrotiterplatte ist.
    • 9. Eine Anordnung nach Abschnitt 7 oder 8, worin besagtes zweites Substrat eine Vielzahl von optischen Faserbündeln umfasst, die eine Vielzahl von einzelnen Fasern umfassen, wobei jedes Bündel eine Array-Lokation umfasst und jede einzelne Faser eine Kügelchen-Vertiefung umfasst.
    • 10. Eine Anordnung nach Abschnitt 7, worin jede der besagten Subpopulationen weiterhin eine optischen Signatur umfasst, die besagtes bioaktives Mittel identifizieren kann.
    • 11. Eine Anordnung nach Abschnitt 7, worin jede der besagten Subpopulationen weiterhin einen Identifikationsbindungsliganden umfasst, der so an einen Dekodierungsbindungsliganden bindet, dass die Identität des bioaktiven Mittels aufge klärt werden kann.
    • 12. Eine Methode zur Dekodierung einer Array-Anordnung, umfassend: a) Bereitstellung einer Array-Anordnung, umfassend: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die einer Vielzahl von Assay-Positionen umfasst, wobei jede Assay-Position diskrete Stellen umfasst und ii) eine Population von Mikrokügelchen, die mindestens eine ersten und eine zweiten Subpopulation umfassen, worin jede Subpopulation ein bioaktives Mittel umfasst; worin besagte Mikrokügelchen auf den besagten Stellen verteilt sind; b) Hinzufügung einer Vielzahl von Dekodierungsbindungsliganden zu besagter Array-Anordnung zur Identifizierung der Position von mindestens einer Vielzahl der bioaktiven Mittel.
    • 13. Eine Methode zur Dekodierung einer Array-Anordnung, umfassend: a) Bereitstellung einer Array-Anordnung, umfassend: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Array-Positionen umfasst, wobei jede Array-Lokation diskreten Stellen umfasst; und ii) eine Population von Mikrokügelchen, die mindestens eine ersten und eine zweiten Subpopulation umfassen, worin jede Subpopulation einen bioaktiven Mittel umfasst worin besagte Mikrokügelchen auf den besagten Stellen verteilt sind; b) Hinzufügung einer Vielzahl von Dekodierungsbindungsliganden zu besagter Array-Anordnung zur Identifizierung der Position von mindestens einer Vielzahl der bioaktiven Mittel.
    • 14. Die Methode nach Abschnitt 12 oder 13, worin mindestens eine Subpopulation von Mikrokügelchen einen Identifikationsbindungsliganden umfasst, an den ein Dekodierungsbindungsligand binden kann.
    • 15. Die Methode nach Abschnitt 12 oder 13, worin besagte Dekodierungsbindungsliganden an besagte bioaktive Mittel binden.
    • 16. Die Methode nach Abschnitt 12 oder 13, worin besagte Dekodierungsbindungsliganden markiert sind.
    • 17. Die Methode nach Abschnitt 12 oder 13, worin die Position einer jeden Subpopulation bestimmt ist.
    • 18. Eine Methode zur Bestimmung der Anwesenheit einer oder mehrerer Zielanalyten in einer oder mehreren Proben, umfassend: a) In Kontakt bringen der besagten Probe mit einer Anordnung, umfassend: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Assay-Positionen umfasst, wobei jede Assay-Lokation diskrete Stellen umfasst und ii) eine Population von Mikrokügelchen, die mindestens eine ersten und eine zweiten Subpopulation umfassen, die jede ein bioaktives Mittel umfassen; worin besagte Mikrokügelchen so auf besagter Oberfläche verteilt sind, dass besagte diskrete Stellen Mikrokügelchen enthalten und b) Bestimmung der An- oder Abwesenheit des besagten Zielanalyten.
    • 19. Eine Methode zur Bestimmung der Anwesenheit von einem oder mehreren Zielanalyten in einer oder mehreren Proben, umfassend: a) Zugabe besagter Probe zu einem ersten Substrat, das eine Vielzahl von Assay-Positionen umfasst, und zwar so, dass besagte Probe in einer Vielzahl von besagten Assay-Positionen enthalten ist; b) In Kontakt bringen besagter Probe mit einem zweiten Substrat, umfassend: i) eine Oberfläche, die eine Vielzahl von Array-Positionen umfasst, wobei jede Array-Lokation diskrete Stellen umfasst und ii) eine Population von Mikrokügelchen, die mindestens eine ersten und eine zweite Subpopulation umfassen, wobei jede eine bioaktives Mittel umfasst; worin besagte Mikrokügelchen so auf besagter Oberfläche verteilt sind, dass besagte diskrete Stellen Mikrokügelchen enthalten und b) Bestimmung der An- oder Abwesenheit des besagten Zielanalyten.
  • Die folgenden Beispiele dienen einer vollständigeren Beschreibung der Art der Anwendung der oben beschriebenen Erfindung, ebenso wie der Darlegung der Art und Weise, die zur Ausübung verschiedener Aspekte der Erfindung als am besten erachtet werden. Es besteht Einvernehmen darüber, dass diese Beispiele in keiner Weise dazu dienen, den wahren Umfang dieser Erfindung zu begrenzen, sondern zu illustrativen Zwecken aufgeführt werden. Alle vorliegend zitierten Quellenangaben sind durch ausdrückliche Bezugnahme vollumfänglich Teil dieser Beschreibung.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Sechzehn Mikrokügelchen (Kügelchen) wurden kombinatorisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren (FAM und Cy3) markiert. In einer ersten Markierungsrunde wurden entweder mit FAM oder Cy3 markierte Oligonukleotide, die zum Oligonukleotid (IBL) auf dem Mikrokügelchen komplementär waren, mit dem Mikrokügelchen hybridisiert. Die Markierung der Oligonukleotide wurde mit den dem Stand der Technik bekannten Methoden durchgeführt. Die Hybridisierungsbedingungen sind dem Stand der Technik bekannt.
  • Nach der ersten Hybridisierungsrunde wurden die beiden Kügelchen-Pools in jeweils zwei Pools getrennt, wobei jeder entweder mit dem FAM- oder Cy3-markiertem Oigonukleotid markiert wurde. Dieses Verfahren wurde zwei weitere Male wiederholt. Daher wurde jedes Mikrokügelchen, nach vier sukzessiven Markierungsrunden, mit einem einmaligen Code markiert (siehe 1). Die Identität eines jeden Mikrokügelchens wurde durch Bestimmung der Identität eines jeden Fluorophors nacheinander aufgeklärt. Das terminale Fluorophor wurde identifiziert und dann entfernt, um das nächste Fluorophor zu identifizieren. Auf diese Weise wird die Identität von 16 Mikrokügelchen mit nur 4 Dekodierungsschritten bestimmt.
  • Beispiel 2
  • Ein Dekodierungsschema, ähnlich dem in Beispiel 1 beschriebenen, wurde für eine Vierfarben-Dekodierung implementiert. In diesem Beispiel wurden die Kügelchen wie in Beispiel 1 beschrieben markiert, außer, dass 4 Markierungen in jedem Stadium verwendet wurden. 4013 Kügelchen wurden mit Bod493, BodR6G, Bod564 und BodTXR markierten Oligonukleotiden markiert. 128 verschiedene Kügelchen-Typen wurden auf Grundlage einer sukzessiven Dekodierung der vier Farben identifiziert.
  • Beispiel 3
  • Eine alternative Methode zur Verwendung von vielen Farben ist der Gebrauch von ratiometrischen Intensitäten als ein Kodierungsschema. Es wird eine normierte Abbildung angefertigt, in der jedes Kügelchen seine „volle” Intensität zeigt. In nachfolgenden Dekodierungsstadien werden Intensitätscodes durch Hybridisierung von Gemischen aus „markierten”:”urmarkierten” komplementären Oligonukleotiden generiert. Beispielsweise zeigt 1 drei verschiedene Intensitätsnuancen (schwach, mittel und stark), die in ein Stadium übersetzt werden können, wo alle Komplemente als „starke” Nuancen anwesend sind. Ein Experiment, bei dem eine Grauskalen-Dekodierung bei 16 verschiedenen Kügelchen-Arten vorgenommen wird, ist in 3 zu sehen.
  • 3A zeigt das kombinatorische Pooling-Schema zur Markierung der Kügelchen mit verschiedenen Verhältnissen markierter Oligonukleotide. Ein bestimmtes Oligo ist entweder bei einem 100% Cy3-markierten, 40% Cy3-markierten (60% unmarkiert) oder 10% Cy3-markierten (90% unmarkiert) Anteil vorhanden. Dekodierte Oligos wurden mit dem Array für 2 Mim. bei einer Konzentration von 50 nM hybridisiert. Anschließend wurden zwei unabhängige, normierte Abbildungen (alle Oligo-Komplemente sind als 100% Cy3-markierte Arten vorhanden) angefertigt und die resultierenden Kügelchen-Intensitäten verglichen. Dies ist in 3B dargestellt, wo die normierten Werte gegeneinander aufgetragen wurden. Schlussendlich wurden die Alpha-Werte (Verhältnis der Kügelchen-Intensität im angezeigten Dekodierungsstadium zur Intensität in der normierten Abbildung) für drei Dekodierungsstadien (in (A) beschrieben) aufgetragen, um die Kügelchen zu identifizieren oder zu dekodieren. Im Stadium 1 sind nur zwei Peaks im Alpha-Werte-Histogramm festzustellen, weil nur 16 Kügelchen-Typen auf dem Array vorhanden sind. Drei unterscheidbare Peaks werden im zweiten und dritten Dekodierungsstadium festgestellt, was auf die Machbarkeit einer Grauskalen-Dekodierung hinweist.
  • Als Codes, durch welche die Kügelchen-Typen voneinander unterscheid bar sind, können die physikalischen Eigenschaften und verschiedene „Grade” der Eigenschaften verwendet werden. Daher sollte es möglich sein, damit sich eine Eigenschaft als stabil herausstellt, ein Kügelchen mit verschiedenen „Graden” einer bestimmten Eigenschaft zu durchdringen. Jeder „Grad” einer Eigenschaft sollte von anderen „Graden” quantitativ sauber getrennt werden. Der wichtige Punkt ist die Maximierung des dynamischen Messbereiches einer Eigenschaft und die Minimierung der Messbandbreite.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - US 5244636 [0005]
    • - US 5250264 [0005]
    • - US 08/818199 [0006, 0021, 0086]
    • - US 09/151877 [0006, 0021, 0086, 0134]
    • - US 5545531 [0007]
    • - WO 95/25116 [0019]
    • - WO 95/35505 [0019]
    • - US 98/09163 [0019, 0031]
    • - US 5700637 [0019]
    • - US 5807522 [0019]
    • - US 5445934 [0019]
    • - US 08/851203 [0019]
    • - US 09/187289 [0019]
    • - US 98/05025 [0021, 0031, 0134]
    • - US 98/21193 [0021]
    • - US 99/20914 [0021]
    • - US 99/14387 [0021]
    • - US 09/315584 [0021]
    • - US 99/04473 [0021]
    • - US 08/944850 [0031]
    • - US 08/519062 [0031]
    • - US 5644048 [0060]
    • - US 5386023 [0060]
    • - US 5637684 [0060]
    • - US 5602240 [0060]
    • - US 5216141 [0060]
    • - US 4469863 [0060]
    • - US 5235033 [0060]
    • - US 5034506 [0060]
    • - US 5270163 [0080]
    • - US 5475096 [0080]
    • - US 5567588 [0080]
    • - US 5595877 [0080]
    • - US 5637459 [0080]
    • - US 5683867 [0080]
    • - US 5705337 [0080]
    • - US 60/160027 [0169]
    • - US 60/161148 [0169]
    • - US 09/425633 [0169]
    • - US 60/160917 [0169]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Milanovich et al., ”Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application”, Proceedings of the SPIE 28th Annual International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics, Band 494, 1980 [0004]
    • - Seitz, W. R., ”Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics” in C. R. C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Band 19, 1988, S. 135–173 [0004]
    • - Wolfbeis, O. S., ”Fiber Optical Fluorosensors In Analytical Chemistry” in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications (S. G. Schulman, editor), Wiley & Sons, New York (1988) [0004]
    • - Angel, S. M., Spectroscopy 2 (4): 38 (1987) [0004]
    • - Walt, et al., ”Chemical Sensors and Microinstrumentation”, ACS Symposium Series, Band 403, 1989, S. 252 [0004]
    • - Wolfbeis, O. S., Fiber Optic Chemical Sensors, Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2. Band [0004]
    • - Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10): 1925 (1993) [0060]
    • - Letsinger, J. Org. Chem., 35: 3800 (1970) [0060]
    • - Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81: 579 (1977) [0060]
    • - Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14: 3487 (1986) [0060]
    • - Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984) [0060]
    • - Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988) [0060]
    • - Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26: 141 (1986) [0060]
    • - Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19: 1437 (1991) [0060]
    • - Briu, etal., J. Am. Chem. Soc., 111: 2321 (1989) [0060]
    • - Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114: 1895 (1992) [0060]
    • - Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992) [0060]
    • - Nielsen, Nature, 365: 566 (1993) [0060]
    • - Carlsson, et al., Nature, 380: 207 (1996) [0060]
    • - Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995)) [0060]
    • - Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30: 423 (1991) [0060]
    • - Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988) [0060]
    • - Letsinger, et al., Nucleosides & Nucleotides, 13: 1597 (1994) [0060]
    • - Kaptitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook [0060]
    • - Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4: 395 (1994) [0060]
    • - Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34: 17 (1994) [0060]
    • - Tetrahedron Lett., 37: 743 (1996) [0060]
    • - Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook [0060]
    • - Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) S. 169–176 [0060]
    • - Ravels, C & E Neves, 2. Juni 1997, Seite 35 [0060]
    • - Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, und Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al. [0070]
    • - Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993) [0070]
    • - Maniatis und Ausubel, supra [0070]
    • - Tijssen, supra [0070]
    • - Katalog der Pierce Chemical Company von 1994, technischer Abschnitt über Bindungslinker, Seite 155–200 [0077]
    • - Katalog und Handbuch von Pierce, Seite 155–200 [0077]
    • - Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4):275–308 (1991) [0077]
    • - Slinkin et al., Bioconi. Chem. 2: 342– 348 (1991) [0077]
    • - Torchilin et al., supra [0077]
    • - Trubetskoy et al., Bioconi. Chem. 3: 323–327 (1992) [0077]
    • - King et al., Cancer Res. 54: 6176–6185 (1994) [0077]
    • - Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5: 220–235 (1994) [0077]
    • - 6. Ausgabe des „Molecular Probes Handbook” von Richard P. Haugland [0115]
    • - Cordor et al., Science 261 (1993) [0175]
    • - Wang et al., Science, 280: 1077 (1998) [0175]
    • - Schafer et al., Nature Biotechnology 16: 33–39 (1998) [0175]
    • - Lockhart et al., 1996 [0192]

Claims (10)

  1. Eine zusammengesetzte Array-Anordnung, umfassend: (a) ein erstes Substrat (40), umfassend eine Vielzahl von Assay-Positionen (45); (b) ein zweites Substrat, umfassend eine Vielzahl von Array-Positionen (20), wobei jede Array-Position eine Vielzahl von diskreten Stellen (25, 21, 22, 23) umfasst, worin besagte Array-Positionen (20) so konfiguriert sind, dass sie relativ zueinander bewegbar sind und (c) mindestens ein erstes und ein zweites bioaktives Mittel, die an jede Array-Position gebunden sind, worin jede der besagten diskreten Stellen in besagten Array-Positionen nur eine einzige Art von bioaktivem Mittel enthält.
  2. Die Anordnung von Anspruch 1, worin die Assay-Positionen Vertiefungen umfassen.
  3. Die Anordnung von Anspruch 2, worin besagtes erstes Substrat eine Mikrotiterplatte ist.
  4. Die Anordnung von allen vorhergehenden Ansprüchen, worin besagte diskrete Stellen der Array-Positionen Vertiefungen (25) umfassen.
  5. Die Anordnung von Anspruch 4, worin besagte Vertiefungen der Array-Positionen mit einem Ende von mindestens einem optischen Faserbündel verbunden sind.
  6. Die Anordnung von Anspruch 4, worin besagte Vertiefungen der Array-Positionen mit einem Substrat verbunden sind.
  7. Die Anordnung von einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mindestens besagte erste und zweite bioaktive Mittel Nukleinsäuren sind.
  8. Die Anordnung von Anspruch 7, worin besagte Nukleinsäuren Nukleinsäurederivate sind.
  9. Die Anordnung von Anspruch 7, worin die diskreten Stellen der Array-Positionen mittels Photolithographie gebildet werden.
  10. Die Anordnung von einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die bioaktiven Mittel direkt mit den Array-Positionen gekoppelt sind.
DE29925020U 1998-12-28 1999-12-28 Zusammengesetzte Arrays mit Mikrokügelchen Expired - Lifetime DE29925020U1 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11396898P 1998-12-28 1998-12-28
US60/113,968 1998-12-28
US09/256,943 1999-02-24
US09/256,943 US6429027B1 (en) 1998-12-28 1999-02-24 Composite arrays utilizing microspheres
PCT/US1999/031022 WO2000039587A1 (en) 1998-12-28 1999-12-28 Composite arrays utilizing microspheres

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE29925020U1 true DE29925020U1 (de) 2009-09-10

Family

ID=26811698

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE29925020U Expired - Lifetime DE29925020U1 (de) 1998-12-28 1999-12-28 Zusammengesetzte Arrays mit Mikrokügelchen
DE69926260.7T Expired - Lifetime DE69926260T3 (de) 1998-12-28 1999-12-28 Kompositmatrix mit mikrokugeln
DE69941068T Expired - Lifetime DE69941068D1 (de) 1998-12-28 1999-12-28 Kompositmatrix

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69926260.7T Expired - Lifetime DE69926260T3 (de) 1998-12-28 1999-12-28 Kompositmatrix mit mikrokugeln
DE69941068T Expired - Lifetime DE69941068D1 (de) 1998-12-28 1999-12-28 Kompositmatrix

Country Status (8)

Country Link
US (3) US6429027B1 (de)
EP (3) EP1593967B1 (de)
JP (2) JP3566653B2 (de)
AT (2) ATE300047T1 (de)
AU (1) AU775056B2 (de)
CA (2) CA2353868C (de)
DE (3) DE29925020U1 (de)
WO (1) WO2000039587A1 (de)

Families Citing this family (386)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6287850B1 (en) * 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
CN1181720A (zh) * 1995-04-25 1998-05-13 伊萝莉公司 可远程编程的存储器材料及其应用
US6720149B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
US6387707B1 (en) * 1996-04-25 2002-05-14 Bioarray Solutions Array Cytometry
US7041510B2 (en) 1996-04-25 2006-05-09 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
EP2290364A1 (de) 1996-04-25 2011-03-02 BioArray Solutions Ltd. Lichtgesteuerte elektrokinetische Anordnung von Partikeln in der Nähe von Oberflächen
US6958245B2 (en) 1996-04-25 2005-10-25 Bioarray Solutions Ltd. Array cytometry
US7144119B2 (en) * 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US6327410B1 (en) * 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
EP0985142A4 (de) 1997-05-23 2006-09-13 Lynx Therapeutics Inc System und gerät zur sequentiellen behandlung von analyten
US7348181B2 (en) 1997-10-06 2008-03-25 Trustees Of Tufts College Self-encoding sensor with microspheres
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
US8236500B2 (en) 1997-10-23 2012-08-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Veterans Affairs Promoter variants of the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor
US6210910B1 (en) 1998-03-02 2001-04-03 Trustees Of Tufts College Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities
EP2360271A1 (de) 1998-06-24 2011-08-24 Illumina, Inc. Dekodierung von Arraysensoren mit Mikrosphären
US7510841B2 (en) * 1998-12-28 2009-03-31 Illumina, Inc. Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes
AU772719B2 (en) 1999-01-08 2004-05-06 Applera Corporation Fiber array for contacting chemical species and methods for using and making same
US7595189B2 (en) 1999-01-08 2009-09-29 Applied Biosystems, Llc Integrated optics fiber array
US6908737B2 (en) 1999-04-15 2005-06-21 Vitra Bioscience, Inc. Systems and methods of conducting multiplexed experiments
US7253435B2 (en) 1999-04-15 2007-08-07 Millipore Corporation Particles with light-polarizing codes
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
AU4476900A (en) 1999-04-20 2000-11-02 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6620584B1 (en) 1999-05-20 2003-09-16 Illumina Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US7604996B1 (en) 1999-08-18 2009-10-20 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
US6642046B1 (en) * 1999-12-09 2003-11-04 Motorola, Inc. Method and apparatus for performing biological reactions on a substrate surface
CA2393658A1 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
US7611869B2 (en) * 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
CA2399908A1 (en) * 2000-02-10 2001-08-16 Todd Dickinson Array of individual arrays as substrate for bead-based simultaneous processing of samples and manufacturing method therefor
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
EP1967595A3 (de) 2000-02-16 2008-12-03 Illumina, Inc. Paralleles Genotypisieren von mehreren Patientenproben
AU2001247660A1 (en) * 2000-03-21 2001-10-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Colorimetric artificial nose having an array of dyes and method for artificial olfaction
US6759235B2 (en) * 2000-04-06 2004-07-06 Quantum Dot Corporation Two-dimensional spectral imaging system
US7338773B2 (en) * 2000-04-14 2008-03-04 Millipore Corporation Multiplexed assays of cell migration
CA2408094A1 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 The Center For Blood Research, Inc. Colloid compositions for solid phase biomolecular analytical, preparative and identification systems
DE10065632A1 (de) * 2000-05-12 2001-11-15 Smtech Biovision Holding Ag Ec Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
ES2259666T3 (es) 2000-06-21 2006-10-16 Bioarray Solutions Ltd Analisis molecular de multiples analitos usando series de particulas aleatorias con especificidad de aplicacion.
EP1307283A2 (de) * 2000-06-28 2003-05-07 Illumina, Inc. Kompositarrays zur anwendung von mikroperlen und einer hybridisationskammer
EP1366185B9 (de) 2000-07-11 2007-10-17 Kirk Hogan Verfahren und zusammensetzungen zur bestimmung von perioperativen genomprofile
US7057704B2 (en) * 2000-09-17 2006-06-06 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US20050090021A1 (en) * 2000-10-06 2005-04-28 Walt David R. Self-encoding sensor with microspheres
US20030045005A1 (en) * 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US7060442B2 (en) 2000-10-30 2006-06-13 Regents Of The University Of Michigan Modulators on Nod2 signaling
AU2002235128A1 (en) * 2000-11-14 2002-05-27 Genetag Technology, Inc. Expression miniarrays and uses thereof
WO2002042775A2 (en) * 2000-11-27 2002-05-30 Genevention L.L.C. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
US6905816B2 (en) * 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
JP3525142B2 (ja) * 2001-01-12 2004-05-10 独立行政法人 科学技術振興機構 金属ナノウェルを用いた蛍光分析用素子及びその製造方法
WO2002057743A2 (en) * 2001-01-17 2002-07-25 Streamline Proteomics, Llc. Methods of analyzing and sorting one or more analytes
WO2002074911A2 (en) * 2001-03-19 2002-09-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Identification of gene expression alterations underlying the aging process in mammals
JP2004532404A (ja) * 2001-03-28 2004-10-21 ジェネテック・バイオテクノロジー・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド 多数のアナライトを検出するための装置および方法
EP1377827A2 (de) * 2001-04-10 2004-01-07 NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen in Reutlingen Stiftung Bürgerlichen Rechts Methode zur bestimmung von analytmolekülen in einer probe
DE10119468A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-24 Epigenomics Ag Mikroarray-Verfahren zur Anreicherung von DNA-Fragmenten aus komplexen Mischungen
US7572642B2 (en) 2001-04-18 2009-08-11 Ambrigen, Llc Assay based on particles, which specifically bind with targets in spatially distributed characteristic patterns
NL1017989C2 (nl) * 2001-05-03 2002-11-05 Univ Delft Tech Werkwijze voor het uitvoeren van een assay, inrichting daarvoor, alsmede een werkwijze voor het vervaardigen van een inrichting.
GB0113358D0 (en) * 2001-06-01 2001-07-25 Scient Generics Ltd Enhanced target capture
US20040048241A1 (en) * 2001-06-11 2004-03-11 Freeman Beverly Annette Methods for attaching molecules
US6824974B2 (en) * 2001-06-11 2004-11-30 Genorx, Inc. Electronic detection of biological molecules using thin layers
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
JP2005528582A (ja) * 2001-09-07 2005-09-22 コーニング インコーポレイテッド ハイスループット分析のためのマイクロカラム・プラットフォームに基づくアレイ
US7195913B2 (en) * 2001-10-05 2007-03-27 Surmodics, Inc. Randomly ordered arrays and methods of making and using
DE60204158T2 (de) 2001-10-05 2006-02-02 SurModics, Inc., Eden Prairie Beschichtungen mit immobilisierten partikeln sowie verwendungen derselben
CA2741049C (en) 2001-10-15 2019-02-05 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
US7381375B2 (en) * 2001-10-26 2008-06-03 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
AU2002363076A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-06 Virtual Arrays, Inc. Assay systems with adjustable fluid communication
US20080187949A1 (en) * 2001-10-26 2008-08-07 Millipore Corporation Multiplexed assays of cell migration
US6902921B2 (en) 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6956114B2 (en) 2001-10-30 2005-10-18 '454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
WO2003044483A2 (en) * 2001-11-15 2003-05-30 Arryx, Inc. Sample chip
US7335153B2 (en) * 2001-12-28 2008-02-26 Bio Array Solutions Ltd. Arrays of microparticles and methods of preparation thereof
US7255986B2 (en) 2002-01-31 2007-08-14 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Compositions for the diagnosis and treatment of epizootic catarrhal enteritis in ferrets
AU2003208935A1 (en) * 2002-02-07 2003-09-02 The Regents Of The University Of California Optically encoded particles
WO2005062866A2 (en) * 2003-12-22 2005-07-14 The Regents Of The University Of California Optically encoded particles, system and high-throughput screening
JP4274948B2 (ja) 2002-03-13 2009-06-10 シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト 核酸検出方法
US20030208936A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-13 Lee Charles Hee Method for manufacturing embroidery decorated cards and envelopes
US6730515B2 (en) * 2002-06-11 2004-05-04 Eastman Kodak Company Micro-array calibration means
US20040096622A1 (en) * 2002-06-19 2004-05-20 Ali Razavi Multi well plate with self sealing advantages
AU2003261168A1 (en) * 2002-07-19 2004-02-09 Althea Technologies, Inc. Strategies for gene expression analysis
WO2004013606A2 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Stratatech Corporation Species specific dna detection
US7473535B2 (en) * 2002-08-20 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Chemical reagents and methods for detection and quantification of proteins in complex mixtures
CA2496626A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Bionexus Ventures L.L.C. Selecting therapeutic human monoclonal antibodies from disease-specific libraries
US7595883B1 (en) 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
JP4087200B2 (ja) * 2002-09-17 2008-05-21 ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 粒子複合体及び該粒子複合体の作製方法
US7364846B2 (en) * 2002-10-11 2008-04-29 Molecular Devices Corporation Gene expression profiling from FFPE samples
US20080207465A1 (en) * 2002-10-28 2008-08-28 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
JP2004184312A (ja) * 2002-12-05 2004-07-02 Yokogawa Electric Corp 生体高分子検出方法およびバイオチップ
US8206904B2 (en) 2002-12-18 2012-06-26 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids
ATE525469T1 (de) 2002-12-18 2011-10-15 Third Wave Tech Inc Nachweis kleiner nukleinsäuren
US7297780B2 (en) 2003-01-06 2007-11-20 Third Wave Technologies, Inc. Reactive functional groups for preparation of modified nucleic acid
WO2004065000A1 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Illumina Inc. Chemical reaction monitor
TWI220766B (en) * 2003-04-17 2004-09-01 Au Optronics Corp Method for fabricating liquid crystal display panel array
US8150626B2 (en) * 2003-05-15 2012-04-03 Illumina, Inc. Methods and compositions for diagnosing lung cancer with specific DNA methylation patterns
US8150627B2 (en) 2003-05-15 2012-04-03 Illumina, Inc. Methods and compositions for diagnosing lung cancer with specific DNA methylation patterns
US20050181394A1 (en) * 2003-06-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20040259100A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
EP1636337A4 (de) 2003-06-20 2007-07-04 Illumina Inc Verfahren und zusammensetzungen zur ganzgenomischen amplifikation und genotypisierung
US20050019944A1 (en) * 2003-07-23 2005-01-27 Eastman Kodak Company Colorable microspheres for DNA and protein microarray
US20050019954A1 (en) * 2003-07-23 2005-01-27 Eastman Kodak Company Photochromic dyes for microsphere based sensor
US8022013B2 (en) * 2003-08-29 2011-09-20 Illumina, Inc. Method of forming and using solid-phase support
JP2005077284A (ja) * 2003-09-01 2005-03-24 Seiko Epson Corp 粒子アレイの製造装置及び製造方法と標的物質の検出方法
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
US8277760B2 (en) 2003-09-19 2012-10-02 Applied Biosystems, Llc High density plate filler
US7407630B2 (en) 2003-09-19 2008-08-05 Applera Corporation High density plate filler
US9492820B2 (en) 2003-09-19 2016-11-15 Applied Biosystems, Llc High density plate filler
US7998435B2 (en) 2003-09-19 2011-08-16 Life Technologies Corporation High density plate filler
US7695688B2 (en) * 2003-09-19 2010-04-13 Applied Biosystems, Llc High density plate filler
ES2375962T3 (es) 2003-09-22 2012-03-07 Bioarray Solutions Ltd Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas.
CA2899287A1 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
AU2004287069B2 (en) 2003-10-29 2009-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded DNA
US7259258B2 (en) * 2003-12-17 2007-08-21 Illumina, Inc. Methods of attaching biological compounds to solid supports using triazine
AU2004308379A1 (en) * 2003-12-22 2005-07-14 The Regents Of The University Of California Optically encoded particles with grey scale spectra
US20050136414A1 (en) * 2003-12-23 2005-06-23 Kevin Gunderson Methods and compositions for making locus-specific arrays
US7432057B2 (en) 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
US20050266432A1 (en) * 2004-02-26 2005-12-01 Illumina, Inc. Haplotype markers for diagnosing susceptibility to immunological conditions
DE102004021351A1 (de) * 2004-04-23 2005-11-17 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Funktionalisierter poröser Träger für Mikroarrays
US7462451B2 (en) 2004-04-26 2008-12-09 Third Wave Technologies, Inc. Compositions for modifying nucleic acids
AU2005250056A1 (en) 2004-06-03 2005-12-15 Athlomics Pty Ltd Agents and methods for diagnosing stress
CA2565967A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-29 Perkinelmer Las, Inc. Multiplexing assays for analyte detection
US8536661B1 (en) 2004-06-25 2013-09-17 University Of Hawaii Biosensor chip sensor protection methods
US7702466B1 (en) 2004-06-29 2010-04-20 Illumina, Inc. Systems and methods for selection of nucleic acid sequence probes
US7440930B1 (en) * 2004-07-22 2008-10-21 Adobe Systems Incorporated Training an attentional cascade
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
US7785785B2 (en) 2004-11-12 2010-08-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Charge perturbation detection system for DNA and other molecules
WO2006062745A2 (en) * 2004-11-23 2006-06-15 454 Life Sciences Corporation Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
US7647186B2 (en) * 2004-12-07 2010-01-12 Illumina, Inc. Oligonucleotide ordering system
JP2008524600A (ja) * 2004-12-16 2008-07-10 インヴィトロジェン コーポレーション 多重化アッセイの較正及び定量化用の量子ドットコード化ビーズセット、及びその使用方法
US7634142B1 (en) 2005-01-24 2009-12-15 Adobe Systems Incorporated Detecting objects in images using a soft cascade
EP2239342A3 (de) 2005-02-01 2010-11-03 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Reagentien, Verfahren und Bibliotheken zur Sequenzierung mit Kügelchen
EP2241637A1 (de) 2005-02-01 2010-10-20 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nukleinsäuresequenzierung durch schrittweise Duplexverlängerung
US9040237B2 (en) * 2005-03-04 2015-05-26 Intel Corporation Sensor arrays and nucleic acid sequencing applications
US9695472B2 (en) 2005-03-04 2017-07-04 Intel Corporation Sensor arrays and nucleic acid sequencing applications
US20070108465A1 (en) * 2005-03-10 2007-05-17 The Regents Of The University Of California Porous microstructure multi layer spectroscopy and biosensing
US20060246576A1 (en) * 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
EP1715344A1 (de) * 2005-04-22 2006-10-25 Universiteit Utrecht Holding B.V. Immobilisierung der Antigenkohlenhydrate, zum der pathogenen Mikroorganismen zu ermitteln
EP1880024A4 (de) 2005-05-12 2009-12-09 Third Wave Tech Inc Polymorphe ghsr-nukleinsäuren und verwendungen davon
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
WO2007006091A1 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Athlomics Pty Ltd Polynucleotide marker genes and their expression, for diagnosis of endotoxemia
US7595473B2 (en) * 2005-08-22 2009-09-29 Tufts University Method and system of array imaging
WO2007044711A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-19 University Of Florida Research Foundation, Inc. Multiple component nanoparticles for multiplexed signaling and optical encoding
US7803751B2 (en) * 2005-12-09 2010-09-28 Illumina, Inc. Compositions and methods for detecting phosphomonoester
WO2007076128A2 (en) 2005-12-23 2007-07-05 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
US11237171B2 (en) 2006-02-21 2022-02-01 Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
US8460878B2 (en) 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for detecting cells and cellular components in small defined volumes
AU2007237909A1 (en) * 2006-04-19 2007-10-25 Applied Biosystems, Llc. Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US8933209B2 (en) 2006-04-26 2015-01-13 Abbvie Inc. Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
KR100772897B1 (ko) * 2006-05-02 2007-11-05 삼성전자주식회사 향상된 잡음률을 나타내는 올리고머 프로브 어레이 및 그제조 방법
US10522240B2 (en) 2006-05-03 2019-12-31 Population Bio, Inc. Evaluating genetic disorders
US7702468B2 (en) 2006-05-03 2010-04-20 Population Diagnostics, Inc. Evaluating genetic disorders
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
US7674924B2 (en) 2006-05-22 2010-03-09 Third Wave Technologies, Inc. Compositions, probes, and conjugates and uses thereof
CN101541975B (zh) 2006-06-01 2013-04-03 第三次浪潮技术公司 核酸的检测
US7759062B2 (en) 2006-06-09 2010-07-20 Third Wave Technologies, Inc. T-structure invasive cleavage assays, consistent nucleic acid dispensing, and low level target nucleic acid detection
EP4108780A1 (de) 2006-06-14 2022-12-28 Verinata Health, Inc. Analyse seltener zellen mittels probentrennung und dna-etiketten
EP2589668A1 (de) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Analyse seltener Zellen mittels Probentrennung und DNA-Etiketten
WO2007147076A2 (en) 2006-06-14 2007-12-21 Living Microsystems, Inc. Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
WO2008058394A1 (en) 2006-11-15 2008-05-22 The University Of British Columbia Polymorphisms predictive of anthracycline-induced cardiotoxicity
US7813013B2 (en) * 2006-11-21 2010-10-12 Illumina, Inc. Hexagonal site line scanning method and system
EP2677309B9 (de) 2006-12-14 2014-11-19 Life Technologies Corporation Verfahren zur Sequenzierung einer Nukleinsäure mittels grosser FET-Arrays, geeignet zur Messung in einem begrenzten pH-Bereich
US11339430B2 (en) 2007-07-10 2022-05-24 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8930178B2 (en) 2007-01-04 2015-01-06 Children's Hospital Medical Center Processing text with domain-specific spreading activation methods
NZ579401A (en) 2007-02-07 2012-03-30 Decode Genetics Ehf Genetic variants contributing to risk of prostate cancer
US20080243865A1 (en) * 2007-03-28 2008-10-02 Oracle International Corporation Maintaining global state of distributed transaction managed by an external transaction manager for clustered database systems
EP2535425A1 (de) 2007-05-25 2012-12-19 Decode Genetics EHF. Genetische varianten auf chr 10q26 als marker zur verwendung bei der risikobeurteilung, diagnose, prognose und behandlung von brustkrebs
CN101320404B (zh) * 2007-06-06 2010-05-26 中国科学院半导体研究所 一种生物病毒的计算机自动分类方法
WO2009012343A2 (en) 2007-07-16 2009-01-22 California Institute Of Technology Arrays, substrates, devices, methods and systems for detecting target molecules
ES2556627T3 (es) 2007-08-30 2016-01-19 Trustees Of Tufts College Métodos para determinar la concentración de un analito en solución
US8877141B2 (en) * 2007-09-06 2014-11-04 Qiagen Sciences Llc System for preparing arrays of biomolecules
FR2921002B1 (fr) * 2007-09-13 2010-11-12 Innopsys Procede de depot simultane d'un ensemble de motifs sur un substrat par un macro timbre
EP2212434A1 (de) * 2007-10-01 2010-08-04 Applied Biosystems Inc. Chase-ligation-sequenzierung
WO2009047809A2 (en) * 2007-10-12 2009-04-16 Decode Genetics Ehf Sequence variants for inferring human pigmentation patterns
US7767441B2 (en) * 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
US7811810B2 (en) 2007-10-25 2010-10-12 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
US8697360B2 (en) 2007-11-30 2014-04-15 Decode Genetics Ehf. Genetic variants on CHR 11Q and 6Q as markers for prostate and colorectal cancer predisposition
US20090181390A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Signosis, Inc. A California Corporation High throughput detection of micrornas and use for disease diagnosis
US8202691B2 (en) 2008-01-25 2012-06-19 Illumina, Inc. Uniform fragmentation of DNA using binding proteins
AU2009213689B2 (en) * 2008-02-14 2014-11-20 Decode Genetics Ehf. Susceptibility variants for lung cancer
CN102066942B (zh) * 2008-03-12 2015-09-16 碧欧西蒙斯科技公司 使用二次离子质谱(sims)和相关技术高灵敏地检测和定量生物分子的方法
EP2274448B1 (de) 2008-03-15 2013-09-18 Hologic, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur analyse von nukleinsäuremolekülen während amplifikationsreaktionen
EP2274450A2 (de) 2008-04-01 2011-01-19 Decode Genetics EHF Suszeptibilitätsvarianten bei peripherer arterienkrankheit und bauchschlagader-aneurysma
EP2294214A2 (de) * 2008-05-07 2011-03-16 Illumina, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur bereitstellung von substanzen an und aus einem array
CN102203282B (zh) 2008-06-25 2014-04-30 生命技术公司 使用大规模fet阵列测量分析物的方法和装置
US20110111419A1 (en) * 2008-07-04 2011-05-12 deCODE Geneties ehf. Copy Number Variations Predictive of Risk of Schizophrenia
US20110168975A1 (en) * 2008-07-07 2011-07-14 Bruce Cohen Caged quantum dots
US8951735B2 (en) 2008-07-07 2015-02-10 Decode Genetics Ehf. Genetic variants for breast cancer risk assessment
JP2011530306A (ja) * 2008-08-12 2011-12-22 ディコーデ ジェネテクス イーエイチエフ 甲状腺癌のリスクアセスメントに有用な遺伝的変異
CA2733609C (en) 2008-08-14 2018-03-06 Nanostring Technologies, Inc. Stable nanoreporters
EP2329037B1 (de) * 2008-08-15 2015-01-28 Decode Genetics EHF Genetische varianten zur vorhersage des krebsrisikos
EP2318552B1 (de) 2008-09-05 2016-11-23 TOMA Biosciences, Inc. Verfahren zum stratifizieren und annotieren der behandlungsoptionen eines krebsmedikaments
US20100075439A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules by capture-and-release using reducing agents followed by quantification
US8222047B2 (en) * 2008-09-23 2012-07-17 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays
US20100075862A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
ES2728379T3 (es) * 2008-11-19 2019-10-24 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Procedimientos de análisis y dispositivos para reacciones biológicas entre una fase líquida y una fase sólida
WO2010068702A2 (en) * 2008-12-10 2010-06-17 Illumina, Inc. Methods and compositions for hybridizing nucleic acids
WO2010115100A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 L&C Diagment, Inc. Multiplex nucleic acid detection methods and systems
US8795963B2 (en) 2009-04-03 2014-08-05 Decode Genetics Ehf. Genetic markers for risk management of atrial fibrillation and stroke
EP2451975A4 (de) * 2009-05-08 2013-08-14 Decode Genetics Ehf Genetische varianten als risikofaktoren für prostatakrebs
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
US20120261274A1 (en) 2009-05-29 2012-10-18 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US8776573B2 (en) 2009-05-29 2014-07-15 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
AU2010269841A1 (en) 2009-07-10 2012-02-23 Decode Genetics Ehf Genetic markers associated with risk of diabetes mellitus
US9523701B2 (en) 2009-07-29 2016-12-20 Dynex Technologies, Inc. Sample plate systems and methods
GB0913258D0 (en) 2009-07-29 2009-09-02 Dynex Technologies Inc Reagent dispenser
KR20120040725A (ko) 2009-07-31 2012-04-27 위니버르시티 오브 베른 Ｈｃｖ 감염 환자에서 ｃ형 간염 결과를 진단 또는 예측하기 위한 방법
JP5954876B2 (ja) 2009-10-13 2016-07-20 ナノストリング テクノロジーズ， インコーポレイテッド ナノレポーターによるタンパク質の検出
CA2684636A1 (en) * 2009-10-30 2011-04-30 Sqi Diagnostics Systems Inc Multiplex microarrays and methods for the quantification of analytes
GB2475226A (en) 2009-11-03 2011-05-18 Genetic Analysis As Universal Prokaryote 16S ribosome PCR primer pair
DK2496720T3 (da) 2009-11-06 2020-09-28 Univ Leland Stanford Junior Ikke-invasiv diagnose af transplantatafstødning i organ-transplanterede patienter
US8500979B2 (en) * 2009-12-31 2013-08-06 Intel Corporation Nanogap chemical and biochemical sensors
US9073033B2 (en) 2010-01-19 2015-07-07 Illumina, Inc. Methods and compositions for processing chemical reactions
ES2647390T3 (es) 2010-02-11 2017-12-21 Nanostring Technologies, Inc Composiciones y métodos para la detección preferencial de ARN pequeños mediante hibridación con puente y ligación
US8236574B2 (en) 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
US8415171B2 (en) * 2010-03-01 2013-04-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
US9678068B2 (en) * 2010-03-01 2017-06-13 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods
ES2544635T3 (es) 2010-03-01 2015-09-02 Quanterix Corporation Métodos para extender el rango dinámico en ensayos para la detección de moléculas o partículas
CN103154718B (zh) 2010-06-30 2015-09-23 生命科技公司 感测离子的电荷堆积电路和方法
WO2012003380A2 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Life Technologies Corporation Array column integrator
TWI539172B (zh) 2010-06-30 2016-06-21 生命技術公司 用於測試離子感測場效電晶體（ｉｓｆｅｔ）陣列之裝置及方法
US11307166B2 (en) 2010-07-01 2022-04-19 Life Technologies Corporation Column ADC
TWI527245B (zh) 2010-07-03 2016-03-21 生命技術公司 具有微摻雜汲極之化學感測器
DK2601609T3 (en) 2010-08-02 2017-06-06 Population Bio Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DISCOVERING MUTATIONS CAUSING GENETIC DISORDERS
US8715932B2 (en) 2010-08-20 2014-05-06 Intel Corporation Nucleic acid sequencing
US8444835B2 (en) 2010-09-09 2013-05-21 Intel Corporation Electronic and fluidic interface
EP2617061B1 (de) 2010-09-15 2021-06-30 Life Technologies Corporation Verfahren und vorrichtung zur analytmessung
US8796036B2 (en) 2010-09-24 2014-08-05 Life Technologies Corporation Method and system for delta double sampling
CA2810931C (en) 2010-09-24 2018-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US8759038B2 (en) 2010-09-29 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing nucleic acids
WO2012055929A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Illumina, Inc. Sequencing methods
GB201021397D0 (en) 2010-12-16 2011-01-26 Genetic Analysis As Diagnosis of Crohn's disease
GB201021399D0 (en) 2010-12-16 2011-01-26 Genetic Analysis As Oligonucleotide probe set and methods of microbiota profiling
WO2012095872A1 (en) 2011-01-13 2012-07-19 Decode Genetics Ehf Genetic variants as markers for use in urinary bladder cancer risk assessment, diagnosis, prognosis and treatment
FR2970568B1 (fr) * 2011-01-14 2016-05-06 Centre Nat Rech Scient Nouvelles surfaces adhesives pour l'immobilisation de ligands
US9952237B2 (en) 2011-01-28 2018-04-24 Quanterix Corporation Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles
WO2012106081A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 Illumina, Inc. Methods for reducing nucleic acid damage
GB201102693D0 (en) 2011-02-16 2011-03-30 Genetic Analysis As Method for identifying neonates at risk for necrotizing enterocolitis
WO2012135340A2 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Nanostring Technologies, Inc. Compositions and methods for diagnosing cancer
EP3150750B1 (de) 2011-04-08 2018-12-26 Prognosys Biosciences, Inc. Peptidkonstrukte und testsysteme dafür
US20140302532A1 (en) 2011-04-12 2014-10-09 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patient's recovery from a brain injury
EP3401679A1 (de) 2011-04-20 2018-11-14 Life Technologies Corporation Verfahren, zusammensetzungen und systeme zur probenablagerung
US20140154209A1 (en) 2011-06-30 2014-06-05 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Polymorphisms associated with non-response to a hepatitis c treatment or susceptibility to non-spontaneous hepatitis c clearance
WO2013033073A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Ventana Medical Systems, Inc. Expression of ets related gene (erg) and phosphatase and tensin homolog (pten) correlates with prostate cancer capsular penetration
WO2013030786A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Method for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma outcome
CA3069089A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 Lineage Biosciences, Inc. Compositions and methods for analyzing heterogeneous samples
WO2013052862A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Genetic marker for predicting prognosis in patients infected with hepatitis c virus
EP2766483B1 (de) 2011-10-10 2022-03-23 The Hospital For Sick Children Verfahren und zusammensetzungen zum screening und zur behandlung von entwicklungsstörungen
EP2773779B1 (de) 2011-11-04 2020-10-14 Population Bio, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur diagnose, prognose und behandlung neurologischer erkrankungen
EP3483288B1 (de) 2011-11-30 2022-03-16 Children's Hospital Medical Center Personalisiertes schmerzmanagement und anästhesie: präventive risikoidentifizierung
US9970984B2 (en) 2011-12-01 2018-05-15 Life Technologies Corporation Method and apparatus for identifying defects in a chemical sensor array
WO2013096661A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Illumina, Inc. Methylation biomarkers for ovarian cancer
US8747748B2 (en) 2012-01-19 2014-06-10 Life Technologies Corporation Chemical sensor with conductive cup-shaped sensor surface
US8821798B2 (en) 2012-01-19 2014-09-02 Life Technologies Corporation Titanium nitride as sensing layer for microwell structure
CA2863887C (en) 2012-02-09 2023-01-03 Population Diagnostics, Inc. Methods of screening low frequency gdna variation biomarkers for pervasive developmental disorder (pdd) or pervasive developmental disorder - not otherwise specified (pdd_nos)
NO2694769T3 (de) 2012-03-06 2018-03-03
CN104379563B (zh) 2012-04-10 2018-12-21 加利福尼亚大学董事会 用于治疗癌症的组合物和方法
US8786331B2 (en) 2012-05-29 2014-07-22 Life Technologies Corporation System for reducing noise in a chemical sensor array
CN108267581A (zh) 2012-08-24 2018-07-10 耶鲁大学 用于高通量多重检测的系统、装置和方法
WO2014043519A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Population Diagnostics Inc. Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating neurological conditions
WO2014052855A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Population Diagnostics, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
WO2014074942A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Illumina, Inc. Risk variants of alzheimer's disease
US9080968B2 (en) 2013-01-04 2015-07-14 Life Technologies Corporation Methods and systems for point of use removal of sacrificial material
US9841398B2 (en) 2013-01-08 2017-12-12 Life Technologies Corporation Methods for manufacturing well structures for low-noise chemical sensors
US9932626B2 (en) 2013-01-15 2018-04-03 Quanterix Corporation Detection of DNA or RNA using single molecule arrays and other techniques
US8962366B2 (en) 2013-01-28 2015-02-24 Life Technologies Corporation Self-aligned well structures for low-noise chemical sensors
US8963216B2 (en) 2013-03-13 2015-02-24 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall spacer sensor surface
US8841217B1 (en) 2013-03-13 2014-09-23 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
US9835585B2 (en) 2013-03-15 2017-12-05 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
CN105051525B (zh) 2013-03-15 2019-07-26 生命科技公司 具有薄导电元件的化学设备
US9116117B2 (en) 2013-03-15 2015-08-25 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall sensor surface
EP2972279B1 (de) 2013-03-15 2021-10-06 Life Technologies Corporation Chemischer sensor mit stetigen sensoroberflächen
US20140274749A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Affymetrix, Inc. Systems and Methods for SNP Characterization and Identifying off Target Variants
CN105264366B (zh) 2013-03-15 2019-04-16 生命科技公司 具有一致传感器表面区域的化学传感器
UY35464A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras g12c.
CN114107458A (zh) 2013-03-15 2022-03-01 血统生物科学公司 测序免疫组库的方法
WO2014176435A2 (en) 2013-04-25 2014-10-30 Bergo Vladislav B Microarray compositions and methods of their use
US20140336063A1 (en) 2013-05-09 2014-11-13 Life Technologies Corporation Windowed Sequencing
US9778187B2 (en) 2013-06-06 2017-10-03 Koninklijke Philips N.V. Correction for osmotic pressure variations in chemo-optical sensor spots
US10458942B2 (en) 2013-06-10 2019-10-29 Life Technologies Corporation Chemical sensor array having multiple sensors per well
TWI659021B (zh) 2013-10-10 2019-05-11 亞瑞克西斯製藥公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ之抑制劑
JP6706206B2 (ja) 2013-11-11 2020-06-03 ライフ テクノロジーズ コーポレーション ロータアセンブリ及びそれを使用するための方法
DK3511422T3 (da) 2013-11-12 2023-02-06 Population Bio Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til diagnosticering, prognose og behandling af endometriose
CA2940422A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Children's Hospital Medical Center Methods and compositions for personalized pain management
EP3177738B1 (de) 2014-08-08 2019-10-09 Children's Hospital Medical Center Diagnoseverfahren zur unterscheidung von formen von ösophagealer eosinophilie
WO2016036403A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Population Diagnostics Inc. Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
WO2016049524A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2016049568A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of ras
CN107002071A (zh) * 2014-11-27 2017-08-01 株式会社日立高新技术 光点阵列基板、其制造方法、核酸聚合物解析方法以及装置
CN107407638B (zh) 2014-12-03 2021-01-12 伊索普莱西斯公司 细胞分泌特征的分析和筛选
US10605767B2 (en) 2014-12-18 2020-03-31 Life Technologies Corporation High data rate integrated circuit with transmitter configuration
US10077472B2 (en) 2014-12-18 2018-09-18 Life Technologies Corporation High data rate integrated circuit with power management
CN111505087A (zh) 2014-12-18 2020-08-07 生命科技公司 使用大规模 fet 阵列测量分析物的方法和装置
AU2016200047A1 (en) * 2015-01-07 2016-07-21 Personal Genomics, Inc. Oriented Loading Systems And Method For Orienting A Particle Loaded In A Well
EP3247384B1 (de) 2015-01-14 2023-10-04 The Regents of the University of Colorado, a body corporate In vitro verfahren zur diagnose von typ-1-diabetes mit insulinmimotopen
US11353448B2 (en) 2015-02-13 2022-06-07 California Institute Of Technology Methods and compositions for quantifying metabolites and proteins from single cells
ES2965764T3 (es) * 2015-02-24 2024-04-16 Hope City Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente
KR20180005178A (ko) 2015-04-10 2018-01-15 아락세스 파마 엘엘씨 치환된 퀴나졸린 화합물 및 이의 사용방법
WO2016168540A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Araxes Pharma Llc Fused-tricyclic inhibitors of kras and methods of use thereof
CA2992492A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Nanostring Technologies, Inc. Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
SG10202107055SA (en) 2015-07-17 2021-08-30 Nanostring Technologies Inc Simultaneous quantification of a plurality of proteins in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
CN108780081B (zh) 2015-08-10 2021-04-09 Essenlix公司 步骤简化、小样品、快速、易使用的生物/化学分析装置和方法
MX2018003148A (es) 2015-09-14 2019-02-20 Essenlix Corp Dispositivo y sistema para analizar una muestra, particularmente sangre, asi como metodos de uso de los mismos.
EP3341724B1 (de) 2015-09-14 2023-10-04 Essenlix Corporation Vorrichtung und system zum erfassen und analysieren von dampfkondensat, insbesondere ausgeatmetem atemkondensat, sowie verfahren zur verwendung davon
WO2017058915A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10858343B2 (en) 2015-09-28 2020-12-08 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356339A1 (de) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
EP3356359B1 (de) 2015-09-28 2021-10-20 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
EP3356354A1 (de) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
US10647703B2 (en) 2015-09-28 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356347A1 (de) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
EP3364977A4 (de) 2015-10-19 2019-09-04 Araxes Pharma LLC Verfahren zum screening von inhibitoren von ras
EP3377481A1 (de) 2015-11-16 2018-09-26 Araxes Pharma LLC 2-substituierte chinazolinverbindungen mit einer substituierten heterocyclischen gruppe und verfahren zur verwendung davon
WO2017100546A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
CA3168463A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Illumina, Inc. Distinguishing methylation levels in complex biological samples
WO2017123401A1 (en) 2016-01-13 2017-07-20 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for treating allergic inflammatory conditions
US9820957B2 (en) 2016-03-24 2017-11-21 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods of treating autoimmunity
US10822312B2 (en) 2016-03-30 2020-11-03 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
EP3481432A4 (de) 2016-07-05 2020-05-06 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Diagnose von col6-bedingten erkrankungen und verfahren zur behandlung davon
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
US10280172B2 (en) 2016-09-29 2019-05-07 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
CN110312711A (zh) 2016-10-07 2019-10-08 亚瑞克西斯制药公司 作为ras抑制剂的杂环化合物及其使用方法
WO2018089910A2 (en) 2016-11-11 2018-05-17 IsoPlexis Corporation Compositions and methods for the simultaneous genomic, transcriptomic and proteomic analysis of single cells
CN110225980B (zh) 2016-11-21 2023-01-06 纳米线科技公司 化学组合物及其使用方法
US11525783B2 (en) 2016-11-22 2022-12-13 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
MX2019007030A (es) 2016-12-15 2020-01-15 Univ California Composiciones y metodos para el tratamiento del cancer.
CA3048002A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Essenlix Corporation Devices and methods for authenticating a sample and use of the same
EP3571309A4 (de) 2017-01-20 2020-11-25 Children's Hospital Medical Center Verfahren und zusammensetzungen in bezug auf die oprm1-dns-methylierung für personalisiertes schmerzmanagement
EP3573971A1 (de) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1yl)prop-2-en-1-on-derivate und ähnliche verbindungen als kras-g12c-modulatoren zur behandlung von krebs
JP7327802B2 (ja) 2017-01-26 2023-08-16 アラクセス ファーマ エルエルシー 縮合ヘテロ－ヘテロ二環式化合物およびその使用方法
US11136308B2 (en) 2017-01-26 2021-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline and quinazolinone compounds and methods of use thereof
US11358959B2 (en) 2017-01-26 2022-06-14 Araxes Pharma Llc Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
WO2018140512A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
US10240205B2 (en) 2017-02-03 2019-03-26 Population Bio, Inc. Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test
CN111246945A (zh) 2017-02-07 2020-06-05 Essenlix公司 压缩开放流测定和使用
US11927560B2 (en) 2017-02-08 2024-03-12 Essenlix Corporation Bio/chemical material extraction and assay
EP3580565A4 (de) 2017-02-09 2021-04-21 Essenlix Corporation Assay mit verschiedenen abstandshöhen
WO2018148461A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Essenlix Corp. Assay with amplification
CN110770572B (zh) 2017-02-09 2023-08-18 Essenlix公司 比色测定
CA3053301A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Essenlix Corporation Assay with textured surface
US11639925B2 (en) * 2017-04-06 2023-05-02 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for measuring physiological properties of biological samples
SG10202113146UA (en) 2017-05-25 2021-12-30 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of kras
CN110831933A (zh) 2017-05-25 2020-02-21 亚瑞克西斯制药公司 喹唑啉衍生物作为突变kras、hras或nras的调节剂
JP2020521741A (ja) 2017-05-25 2020-07-27 アラクセス ファーマ エルエルシー がんの処置のための化合物およびその使用の方法
US11243201B2 (en) 2017-08-01 2022-02-08 Essenlix Corporation Sample collection, holding and assaying
US11280706B2 (en) 2017-08-01 2022-03-22 Essenlix Corporation Dilution calibration
CN112689758A (zh) 2017-08-01 2021-04-20 Essenlix公司 检查药物对微生物影响的装置和方法
US11393561B2 (en) 2017-10-13 2022-07-19 Essenlix Corporation Devices and methods for authenticating a medical test and use of the same
US11609224B2 (en) 2017-10-26 2023-03-21 Essenlix Corporation Devices and methods for white blood cell analyses
US11237113B2 (en) 2017-10-26 2022-02-01 Essenlix Corporation Rapid pH measurement
US10807095B2 (en) 2017-10-26 2020-10-20 Essenlix Corporation Making and tracking assay card
WO2019118652A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Essenlix Corporation Sample manipulation and assay with rapid temperature change
WO2019118936A2 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Essenlix Corporation Devices, systems, and methods for monitoring hair
US11156606B2 (en) 2018-01-11 2021-10-26 Essenlix Corporation Homogeneous assay (II)
JP7372927B6 (ja) 2018-02-12 2023-11-27 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド 遺伝子およびタンパク質の発現を検出する生体分子プローブおよびその検出方法
US11052060B2 (en) 2018-02-12 2021-07-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compounds and methods for treating autoimmunity
US11859250B1 (en) 2018-02-23 2024-01-02 Children's Hospital Medical Center Methods for treating eosinophilic esophagitis
US11013707B2 (en) 2018-03-23 2021-05-25 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Administration of oral methyldopa
SG11202011274YA (en) 2018-05-14 2020-12-30 Nanostring Technologies Inc Chemical compositions and methods of using same
EP3802886A1 (de) 2018-05-25 2021-04-14 Philip Morris Products S.A. Verfahren zur klassifizierung von pflanzenmaterial
PE20220773A1 (es) 2018-06-29 2022-05-16 Illumina Inc Cubetas de lectura
US11885952B2 (en) 2018-07-30 2024-01-30 Essenlix Corporation Optics, device, and system for assaying and imaging
WO2020033700A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Pml Screening, Llc Mathods for assessing the risk of developing progressive multifocal leukoencephalopathy caused by john cunningham virus by genetic testing
EP3872490B1 (de) * 2018-10-24 2023-03-08 Toppan Printing Co., Ltd. Becher für immunoassays, verfahren zu deren herstellung und immunoassay-verfahren
CN112639126A (zh) 2018-12-14 2021-04-09 伊卢米纳剑桥有限公司 降低测序期间用未标记的核苷酸的定相
SG11202012758WA (en) 2018-12-17 2021-01-28 Illumina Cambridge Ltd Primer oligonucleotide for sequencing
AU2019411266A1 (en) 2018-12-17 2021-01-07 Illumina Cambridge Limited Compositions for use in polyunucleotide sequencing
CN113008764B (zh) * 2020-06-17 2022-12-02 山东大学 一种单细胞功能评估试剂盒及评估方法
EP4228815A1 (de) 2020-10-19 2023-08-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. System und verfahren zur schnellen multiplexierten probenverarbeitung mit anwendungen für nukleinsäureamplifikationstests
US20230096386A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Illumina Cambridge Limited Polynucleotide sequencing
WO2024046838A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Evonik Operations Gmbh Multi-species chip to detect dna-methylation
WO2024046840A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Evonik Operations Gmbh Method of assessing protein production in cho cells
WO2024046839A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Evonik Operations Gmbh Dna-methylation detection in animal-derived products

Citations (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5244636A (en) 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5250264A (en) 1991-01-25 1993-10-05 Trustees Of Tufts College Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5445934A (en) 1989-06-07 1995-08-29 Affymax Technologies N.V. Array of oligonucleotides on a solid substrate
WO1995025116A1 (en) 1994-03-16 1995-09-21 California Institute Of Technology Method and apparatus for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5475096A (en) 1990-06-11 1995-12-12 University Research Corporation Nucleic acid ligands
WO1995035505A1 (en) 1994-06-17 1995-12-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for fabricating microarrays of biological samples
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5595877A (en) 1990-06-11 1997-01-21 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing nucleic acid ligands
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US9805025B2 (en) 2015-07-13 2017-10-31 Seal Software Limited Standard exact clause detection
US9809163B2 (en) 2015-04-14 2017-11-07 Harman International Industries, Incorporation Techniques for transmitting an alert towards a target area
US9821193B2 (en) 2012-11-01 2017-11-21 Acushnet Company Golf balls having multi-layered core with metal-containing center and thermoplastic outer layers
US9904473B2 (en) 2015-11-20 2018-02-27 International Business Machines Corporation Memory and processor affinity in a deduplicated environment
US9914387B2 (en) 2015-06-05 2018-03-13 Snap-Loc Cargo Control Systems, LLC Cargo control cinch strap system
US9920914B2 (en) 2012-03-20 2018-03-20 Martin Professional Aps Moving head light fixture with yoke and head position encoding means

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4200110A (en) 1977-11-28 1980-04-29 United States Of America Fiber optic pH probe
US4349510A (en) 1979-07-24 1982-09-14 Seppo Kolehmainen Method and apparatus for measurement of samples by luminescence
US4707454A (en) 1981-08-10 1987-11-17 Bio-Diagnostics, Inc. Fluorescent chlorophyll labeled assay reagents
US4499052A (en) 1982-08-30 1985-02-12 Becton, Dickinson And Company Apparatus for distinguishing multiple subpopulations of cells
AU567440B2 (en) 1982-11-20 1987-11-19 Thomas Paterson Whitehead Dispensing device and recording apparatus
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4672040A (en) 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
US4682895A (en) 1985-08-06 1987-07-28 Texas A&M University Fiber optic probe for quantification of colorimetric reactions
US4824789B1 (en) 1986-10-10 1996-08-13 Minnesota Mining & Mfg Gas sensor
US4798738A (en) 1986-10-10 1989-01-17 Cardiovascular Devices, Inc. Micro sensor
US4822746A (en) 1986-06-25 1989-04-18 Trustees Of Tufts College Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US5114864A (en) 1986-06-25 1992-05-19 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using fluid erodible controlled release polymers for delivery of reagent formulations
US5143853A (en) 1986-06-25 1992-09-01 Trustees Of Tufts College Absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US5254477A (en) 1986-06-25 1993-10-19 Trustees Of Tufts College Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods
US5252494A (en) 1986-06-25 1993-10-12 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using controlled release polymers and reagent formulations held within a polymeric reaction matrix
ATE66695T1 (de) 1986-12-01 1991-09-15 Molecular Biosystems Inc Verfahren zur erhoehung der empfindlichkeit von nukleinsaeure-hybridisierungstesten.
SE458968B (sv) 1987-06-16 1989-05-22 Wallac Oy Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser
US5194300A (en) 1987-07-15 1993-03-16 Cheung Sau W Methods of making fluorescent microspheres
US5132242A (en) 1987-07-15 1992-07-21 Cheung Sau W Fluorescent microspheres and methods of using them
US4785814A (en) 1987-08-11 1988-11-22 Cordis Corporation Optical probe for measuring pH and oxygen in blood and employing a composite membrane
US5002867A (en) 1988-04-25 1991-03-26 Macevicz Stephen C Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes
NO164622C (no) 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
US5575849A (en) 1988-11-25 1996-11-19 Canon Kabushiki Kaisha Apparatus for producing a substrate having a surface with a plurality of spherical dimples for photoconductive members
EP0392546A3 (de) 1989-04-14 1991-09-11 Ro Institut Za Molekularnu Genetiku I Geneticko Inzenjerstvo Verfahren zur Bestimmung von vollständigen oder partiellen Bestandteilen von sehr kurzen Sequenzen in Proben von Partikeln mikroskopischer Grösse mittels Hybridisierung mit Oligonukleotid-Sonden
US5087820A (en) 1989-05-31 1992-02-11 Digital Diagnostic Corp. Radiometric analysis system for solid support samples
US5176881A (en) * 1989-08-11 1993-01-05 The University Of Tennessee Research Corporation Fiber optic-based regenerable biosensor
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
EP0416148A1 (de) 1989-09-07 1991-03-13 RSM ANALYTISCHE INSTRUMENTE GmbH Einrichtung zum gleichzeitigen Messen von Mehrfachproben-Partikel-oder Quanten-Strahlungen
US5326692B1 (en) 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
DE69125441T2 (de) 1990-09-28 1997-11-06 Toshiba Kawasaki Kk Verfahren zum Gennachweis
US5105305A (en) 1991-01-10 1992-04-14 At&T Bell Laboratories Near-field scanning optical microscope using a fluorescent probe
US5320814A (en) 1991-01-25 1994-06-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently visualizing and chemically detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5244813A (en) 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor, apparatus, and methods for detecting an organic analyte in a fluid or vapor sample
US5380489A (en) 1992-02-18 1995-01-10 Eastman Kodak Company Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
ATE171543T1 (de) 1991-07-16 1998-10-15 Transmed Biotech Inc Verfahren und zusammensetzungen für die gleichzeitige analyse einer vielzahl von analyten
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US5770358A (en) 1991-09-18 1998-06-23 Affymax Technologies N.V. Tagged synthetic oligomer libraries
WO1993008472A1 (en) 1991-10-15 1993-04-29 Multilyte Limited Binding assay employing labelled reagent
US5888723A (en) 1992-02-18 1999-03-30 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
US5445970A (en) 1992-03-20 1995-08-29 Abbott Laboratories Magnetically assisted binding assays using magnetically labeled binding members
EP0565999A2 (de) 1992-04-16 1993-10-20 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung zur optischen Kopplung von zwei Gruppen von Wellenleitern
AU4329093A (en) 1992-07-02 1994-01-31 Erkki Soini Biospecific multiparameter assay method
ATE463744T1 (de) 1992-09-14 2010-04-15 Stanford Res Inst Int Hochkonvertierende reportermoleküle für biologische und andere testverfahren unter verwendung von laseranregungstechniken
US5674698A (en) * 1992-09-14 1997-10-07 Sri International Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5298741A (en) 1993-01-13 1994-03-29 Trustees Of Tufts College Thin film fiber optic sensor array and apparatus for concurrent viewing and chemical sensing of a sample
CA2102884A1 (en) 1993-03-04 1994-09-05 James J. Wynne Dental procedures and apparatus using ultraviolet radiation
JP3302458B2 (ja) 1993-08-31 2002-07-15 富士通株式会社 集積化光装置及び製造方法
ES2176308T3 (es) 1993-10-28 2002-12-01 Houston Advanced Res Ct Dispositivo de microestructura porosa que permite un flujo.
US5494798A (en) 1993-12-09 1996-02-27 Gerdt; David W. Fiber optic evanscent wave sensor for immunoassay
US5496997A (en) 1994-01-03 1996-03-05 Pope; Edward J. A. Sensor incorporating an optical fiber and a solid porous inorganic microsphere
WO1996003212A1 (en) 1994-07-26 1996-02-08 Sydney Brenner Multidimensional conduit combinatorial library synthesis device
US5512490A (en) 1994-08-11 1996-04-30 Trustees Of Tufts College Optical sensor, optical sensing apparatus, and methods for detecting an analyte of interest using spectral recognition patterns
US5695934A (en) 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US5585069A (en) 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
US5609826A (en) * 1995-04-17 1997-03-11 Ontogen Corporation Methods and apparatus for the generation of chemical libraries
US5690894A (en) 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US6074614A (en) 1995-06-07 2000-06-13 Molecular Devices Corporation Multi-assay plate cover for elimination of meniscus
US5656241A (en) 1995-09-07 1997-08-12 Optical Sensors Incorporated Method for manufacturing fiber optic sensors
US5981180A (en) 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
EP0852004B1 (de) 1995-10-11 2011-01-19 Luminex Corporation Gleichzeitige mehrfachanalyse klinischer proben
GB9521159D0 (en) 1995-10-16 1995-12-20 Brint Norman T A weapon
US5633972A (en) 1995-11-29 1997-05-27 Trustees Of Tufts College Superresolution imaging fiber for subwavelength light energy generation and near-field optical microscopy
US5814524A (en) 1995-12-14 1998-09-29 Trustees Of Tufts College Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations
US6660233B1 (en) * 1996-01-16 2003-12-09 Beckman Coulter, Inc. Analytical biochemistry system with robotically carried bioarray
US5837196A (en) * 1996-01-26 1998-11-17 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5649576A (en) * 1996-02-26 1997-07-22 Pharmacopeia, Inc. Partitioning device
ES2166987T3 (es) 1996-03-15 2002-05-01 Harvard College Metodo de formar articulos y superficies modeladas mediante micromoldeo capilar.
US5840256A (en) 1996-04-09 1998-11-24 David Sarnoff Research Center Inc. Plate for reaction system
EP2290364A1 (de) 1996-04-25 2011-03-02 BioArray Solutions Ltd. Lichtgesteuerte elektrokinetische Anordnung von Partikeln in der Nähe von Oberflächen
JP2002515044A (ja) 1996-08-21 2002-05-21 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ビーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーを配列し合成する迅速方法
US5854684A (en) 1996-09-26 1998-12-29 Sarnoff Corporation Massively parallel detection
DE19782097T1 (de) * 1996-11-06 1999-10-14 Sequenom Inc Zusammensetzungen und Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren an feste Träger
US5900481A (en) 1996-11-06 1999-05-04 Sequenom, Inc. Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports
JP4663824B2 (ja) 1996-12-31 2011-04-06 ハイ スループット ジェノミクス インコーポレイテッド 多重化分子分析装置および方法
US6023540A (en) * 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US6406845B1 (en) 1997-05-05 2002-06-18 Trustees Of Tuft College Fiber optic biosensor for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sample
AU756945B2 (en) 1997-05-23 2003-01-30 Bioarray Solutions Ltd Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
EP0985142A4 (de) 1997-05-23 2006-09-13 Lynx Therapeutics Inc System und gerät zur sequentiellen behandlung von analyten
US6037186A (en) * 1997-07-16 2000-03-14 Stimpson; Don Parallel production of high density arrays
US6071748A (en) * 1997-07-16 2000-06-06 Ljl Biosystems, Inc. Light detection device
WO1999005320A1 (en) 1997-07-22 1999-02-04 Rapigene, Inc. Multiple functionalities within an array element and uses thereof
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
US5922617A (en) * 1997-11-12 1999-07-13 Functional Genetics, Inc. Rapid screening assay methods and devices
WO1999060170A1 (en) 1998-05-21 1999-11-25 Hyseq, Inc. Linear arrays of immobilized compounds and methods of using same
WO1999067414A1 (en) 1998-06-24 1999-12-29 Glaxo Group Limited Nucleotide detection method
US6908770B1 (en) 1998-07-16 2005-06-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array
AU6131299A (en) 1998-08-26 2000-03-21 Trustees Of Tufts College Combinatorial polymer synthesis of sensors for polymer-based sensor arrays
CA2362054A1 (en) 1999-02-09 2000-08-17 John R. Stuelpnagel Intrabead screening methods and compositions

Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5445934A (en) 1989-06-07 1995-08-29 Affymax Technologies N.V. Array of oligonucleotides on a solid substrate
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5475096A (en) 1990-06-11 1995-12-12 University Research Corporation Nucleic acid ligands
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5595877A (en) 1990-06-11 1997-01-21 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing nucleic acid ligands
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5250264A (en) 1991-01-25 1993-10-05 Trustees Of Tufts College Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample
US5244636A (en) 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
WO1995025116A1 (en) 1994-03-16 1995-09-21 California Institute Of Technology Method and apparatus for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
WO1995035505A1 (en) 1994-06-17 1995-12-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for fabricating microarrays of biological samples
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US9920914B2 (en) 2012-03-20 2018-03-20 Martin Professional Aps Moving head light fixture with yoke and head position encoding means
US9821193B2 (en) 2012-11-01 2017-11-21 Acushnet Company Golf balls having multi-layered core with metal-containing center and thermoplastic outer layers
US9809163B2 (en) 2015-04-14 2017-11-07 Harman International Industries, Incorporation Techniques for transmitting an alert towards a target area
US9914387B2 (en) 2015-06-05 2018-03-13 Snap-Loc Cargo Control Systems, LLC Cargo control cinch strap system
US9805025B2 (en) 2015-07-13 2017-10-31 Seal Software Limited Standard exact clause detection
US9904473B2 (en) 2015-11-20 2018-02-27 International Business Machines Corporation Memory and processor affinity in a deduplicated environment

Non-Patent Citations (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
6. Ausgabe des "Molecular Probes Handbook" von Richard P. Haugland
Angel, S. M., Spectroscopy 2 (4): 38 (1987)
Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10): 1925 (1993)
Briu, etal., J. Am. Chem. Soc., 111: 2321 (1989)
Carlsson, et al., Nature, 380: 207 (1996)
Cordor et al., Science 261 (1993)
Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995))
Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114: 1895 (1992)
Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34: 17 (1994)
Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) S. 169-176
Kapiteln 6 und 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook
Kaptitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook
Katalog der Pierce Chemical Company von 1994, technischer Abschnitt über Bindungslinker, Seite 155-200
Katalog und Handbuch von Pierce, Seite 155-200
Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30: 423 (1991)
King et al., Cancer Res. 54: 6176-6185 (1994)
Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988)
Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14: 3487 (1986)
Letsinger, et al., Nucleosides & Nucleotides, 13: 1597 (1994)
Letsinger, J. Org. Chem., 35: 3800 (1970)
Lockhart et al., 1996
Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19: 1437 (1991)
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, und Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.
Maniatis und Ausubel, supra
Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992)
Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4: 395 (1994)
Milanovich et al., "Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application", Proceedings of the SPIE 28th Annual International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics, Band 494, 1980
Nielsen, Nature, 365: 566 (1993)
Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26: 141 (1986)
Ravels, C & E Neves, 2. Juni 1997, Seite 35
Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984)
Schafer et al., Nature Biotechnology 16: 33-39 (1998)
Seitz, W. R., "Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics" in C. R. C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Band 19, 1988, S. 135-173
Slinkin et al., Bioconi. Chem. 2: 342- 348 (1991)
Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81: 579 (1977)
Tetrahedron Lett., 37: 743 (1996)
Tijssen, supra
Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)
Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4):275-308 (1991)
Torchilin et al., supra
Trubetskoy et al., Bioconi. Chem. 3: 323-327 (1992)
Walt, et al., "Chemical Sensors and Microinstrumentation", ACS Symposium Series, Band 403, 1989, S. 252
Wang et al., Science, 280: 1077 (1998)
Wilbur et al., Bioconjugate Chem. 5: 220-235 (1994)
Wolfbeis, O. S., "Fiber Optical Fluorosensors In Analytical Chemistry" in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications (S. G. Schulman, editor), Wiley & Sons, New York (1988)
Wolfbeis, O. S., Fiber Optic Chemical Sensors, Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2. Band

Also Published As

Publication number Publication date
EP1593967A2 (de) 2005-11-09
DE69941068D1 (de) 2009-08-13
EP2083271A3 (de) 2009-09-09
DE69926260T2 (de) 2006-04-27
US6858394B1 (en) 2005-02-22
DE69926260D1 (de) 2005-08-25
ATE300047T1 (de) 2005-08-15
EP1593967A3 (de) 2007-04-25
ATE435423T1 (de) 2009-07-15
US6998274B2 (en) 2006-02-14
US20020187515A1 (en) 2002-12-12
EP1141712B2 (de) 2015-12-09
JP2002533727A (ja) 2002-10-08
CA2353868C (en) 2011-03-29
JP2004226415A (ja) 2004-08-12
EP1593967B1 (de) 2009-07-01
AU2391600A (en) 2000-07-31
EP2083271A2 (de) 2009-07-29
EP1141712B1 (de) 2005-07-20
CA2353868A1 (en) 2000-07-06
CA2729739C (en) 2013-01-29
DE69926260T3 (de) 2016-05-19
CA2729739A1 (en) 2000-07-06
EP1141712A1 (de) 2001-10-10
AU775056B2 (en) 2004-07-15
WO2000039587A1 (en) 2000-07-06
JP3566653B2 (ja) 2004-09-15
US6429027B1 (en) 2002-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69926260T2 (de) Kompositmatrix mit mikrokugeln
DE60008099T2 (de) Codierung und decodierung von sensor-arrays mittels nanokristalle
JP4954415B2 (ja) 試料のビーズをベースとした同時プロセシングのための基材としての個々のアレイのアレイおよびその製造法
US7510841B2 (en) Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes
US8795967B2 (en) Multiplex decoding of array sensors with microspheres
WO2003002979A2 (en) Multiplex decoding of array sensors with microspheres
JP2011221036A (ja) ハイブリダイゼーションチャンバーと微小球を利用した複合アレイ
AU2001271662A1 (en) Composite arrays utilizing microspheres with a hybridization chamber
EP1240498A2 (de) Dekodierung von matrixsensoren mit mikrokugeln

Legal Events

Date Code Title Description
R207 Utility model specification

Effective date: 20091015

R152 Utility model maintained after payment of third maintenance fee after eight years

Effective date: 20090910

R071 Expiry of right