DE2954385C2

DE2954385C2 -

Info

Publication number: DE2954385C2
Application number: DE2954385A
Authority: DE
Inventors: Hideo Misaki; Yoshifumi Horiuchi; Kazuo Matsuura; Saburo Harada; Satoshi Tagata Shizuoka Jp Takenaka
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-03-25
Filing date: 1979-03-22
Publication date: 1989-10-26
Also published as: US4246342A; FR2436182B1; IT7967627A0; FR2436182A1; GB2020018B; SE445928B; DK156253C; DE2911481A1; FR2420760A1; SE7902648L; IT1165650B; FR2420760B1; GB2020018A; CA1143640A; GB2043650A; GB2043650B; DK156253B; DK119679A; DE2911481C2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Reagenz für analytische Zwecke sowie ein Verfahren zur Bestimmung von Brenztraubensäure damit.

Es ist bekannt, daß man die Umsetzung von Brenztraubensäure zu Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid in Anwesenheit von Phosphat und Sauerstoff durch das Enzym Pyruvatoxidase katalysieren kann.

Aus "Methods in Enzymology", Vol. 1, Seite 483, ist bereits ein Reagenz bekannt, das Pyruvatoxidase enthält. Aber die in dem bekannten Reagenz vorhandene Pyruvatoxidase stammt von Lactobacillus delbrückii. Dieses Enzym hat ein pH-Optimum von annähernd 5,5, also im sauren Bereich, und hat infolgedessen nachteilige Wirkung bei der Untersuchung von Serum-GPT oder anderen diagnostischen Enzymen im Serum.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Reagenz für analytische Zwecke zu schaffen, mit dem sich Brenztraubensäure und Serum-GPT sehr leicht und mit sehr hoher Genauigkeit in einer diese enthaltenden Probe bestimmen lassen.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Reagenz vorgesehen, das die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebene Pyruvatoxidase enthält, wobei noch in den Unteransprüchen 2 bis 4 für die Aufgabenlösung vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Reagenz beansprucht sind. Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Bestimmung von Brenztraubensäure unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenz.

Das erfindungsgemäße Reagenz ist, wie gefunden wurde, für diagnostische Analysen besonders gut geeignet. Es läßt sich Brenztraubensäure in einer Brenztraubensäure als solche oder ein Brenztraubensäure freisetzendes System enthaltenden Analysenprobe damit sehr genau anhand entweder einer verbrauchten Komponente oder einer gebildeten Komponente einfach meßtechnisch ermitteln.

Die im erfindungsgemäßen Reagenz und für das erfindungsgemäße Verfahren benötigte Pyruvatoxidase läßt sich nach dem in der DE-PS 29 11 481 beschriebenen Verfahren gewinnen.

Die Merkmale der Erfindung und deren technische Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung mit Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Ansprüchen und der Zeichnung. Es zeigt

Fig. 1 Analysenergebnisse der Zersetzung von Brenztraubensäure an einer Sauerstoffelektrode mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 2 Analysenergebnisse von Serum an der Sauerstoffelektrode mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 3 Analysenergebnisse der colorimetrischen Methode für Brenztraubensäure mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 4 Ergebnisse der quantitativen Analyse von Serum-Brenztraubensäure mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 5 Analysenergebnisse von ADP mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 6 Analysenergebnisse von Glycerin, Triglycerid und Serum-Triglycerid mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 7 Ergebnisse der Analyse von GPT- und GOT-Aktivität mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 8 Korrelationsdiagramm der Analyse von GPT-Aktivität mit dem erfindungsgemäßen Reagenz,

Fig. 9 Korrelationsdiagramm der Analyse von GOT-Aktivität mit dem erfindungsgemäßen Reagenz und

Fig. 10 in grafischer Darstellung das Optimum des pH-Wertes für die im erfindungsgemäßen Reagenz enthaltene Pyruvatoxidase.

Zur Untersuchung der Wirkung verschiedener Substanzen auf die Enzymaktivität im Reagenz wurden 5 mM der nachstehend angegebenen Substanzen dem Reaktionssystem zugesetzt.

Man erkennt, daß das Enzym durch EDTA inhibiert und durch Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, Mn⁺⁺ und Co⁺⁺ aktiviert wird.

Die Wirkung der Eliminierung der folgenden Substanzen aus dem Untersuchungssystem auf die Enzymaktivität wird nachstehend veranschaulicht.

Im Fall der Eliminierung von Phosphat wurde dabei als Puffersubstanz 0,1 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer verwendet.

Das Ergebnis zeigt, daß das System Thiaminpyrophosphat und FAD als Cofaktor und Phosphat als Substrat erfordert.

Weiterhin wurde der Sauerstoffverbrauch bei der Enzymreaktion durch Sauerstoffelektrode gemessen, und der Sauerstoff wurde im Verhältnis zu einer Enzymaktivität (Bildung von Wasserstoffperoxid) proportional verbraucht. Die Ergebnisse sind nachfolgend veranschaulicht.

Die Prüfungen wurden wie folgt durchgeführt:
Sauerstoffverbrauch:
Gerät zum Messen von gelöstem Sauerstoff (Handelsbezeichnung YSI-dissolved oxygen meter Model-53)
Acetylphosphat:
F. Lipmann et al., J. Biol. Chem., 134, 463-464 (1940)
Wasserstoffperoxid:
Methode unter Verwendung von N,N-Dimethylanilin, 4-Aminoantipyrin und Meerrettich-Peroxidase.

Für die Prüfung des erfindungsgemäßen Reaktionssystems wurde folgender Ansatz zubereitet:

0,5 M Kaliumpyruvat\|0,1 ml
0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,0)	0,2 ml
0,2% 4-Aminoantipyrin	0,1 ml
0,2% N,N-Dimethylanilin	0,2 ml
0,2 M MgCl₂	50 µl
10 mM Thiaminpyrophosphat	20 µl
Peroxidase (45 U/ml)	0,1 ml
1 mM FAD	10 µl
Destilliertes Wasser	0,22 ml

Diese Reaktionsmischung (1,0 ml) wurde 3 Minuten lang bei 37°C angezüchtet. Die Enzymlösung (20 µl) wurde dieser Lösung zugesetzt, und es wurde 10 Minuten lang bei 37°C fortgezüchtet. Zur Beendigung der Reaktion wurden 0,1 M ETDA enthaltender 0,1 M Citratpuffer (pH 6,0, 2 ml) zugesetzt. Es wurde die gebildete Violettfärbung colorimetrisch bei 565 nm gemessen.

Eine Einheit (1 U) der Enzymaktivität wurde definiert als diejenige Aktivität, mit der je Minute 1 µMol Wasserstoffperoxid gebildet wurde.

Zur Aktivierung des Pyruvatoxidase-Reaktionssystems wurden FAD, Thiaminpyrophosphat und Phosphat zugesetzt. Zur weiteren Aktivierung des Enzyms wurde ein ionenabgebendes Salz, das Calcium-, Kobalt-, Magnesium- und/oder Manganionen freizusetzen vermag, vorzugsweise als Chlorid beigegeben. Als Indikator für Wasserstoffperoxid wurde vorzugsweise ein Farbstoffindikator oder ein Fluoreszenzindikator ausgewählt.

Je nach Art der durchzuführenden Enzymreaktion kann die Menge und das Mengenverhältnis der Komponenten in dem Enzymreaktionssystem zweckmäßig eingestellt werden, und zwar bezogen auf die Menge an Pyruvat, die Temperatur und die Dauer der Enzymreaktion unterschiedlich. Beispielsweise kann man für einen Test 1-20 U Pyruvatoxidase, 0,1-20 nMol FAD, 0,05-0,5 µMol Thiaminpyrophosphat, 1-10 µMol anorganisches Phosphat und 0,05-10 µMol des ionenfreisetzenden Salzes verwenden. Die Pyruvatoxidase kann in mikroverkapselter oder immobilisierter Form kovalent an einen organischen oder anorganischen Träger oder an einem Träger adsorbiert eingesetzt werden. Die molare Einsatzmenge des Indikators für das Wasserstoffperoxid ist wenigstens äquimolar der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge oder wird in einem Überschuß beigegeben. Falls die Peroxidase verwendet wird, setzt man sie vorteilhaft in einer Menge von 0,5-20 U je Test ein. Diese Komponenten des Enzymreaktionsgemisches werden vorzugsweise in gelöster Form benutzt, und die Lösung wird mit dem Puffer auf den geeigneten pH-Wert eingestellt.

Das so zubereitete enzymatische Reaktionssystem wird für die Analyse von Brenztraubensäure eingesetzt. Man kann irgendein beliebiges Untersuchungsmaterial damit analysieren, das Pyruvat enthält. Beispielsweise kann man Brenztraubensäure als solche analysieren, man kann Brenztraubensäure in Serum oder Urin analytisch ermitteln, und man kann Brenztraubensäure in Enzymreaktionssystemen, in denen sie gebildet wird, messen. Beispielsweise für solche Reaktionssysteme sind Milchsäure und Laktatdehydrogenase (LDH), ADP und Pyruvatkinase sowie Glycerin, Glycerinkinase und Pyruvatkinase. Weitere Beispiele für enzymatische Reaktionen, bei denen Brenztraubensäure gebildet wird und die untersucht werden können, sind folgende:

Diese Enzymreaktionen dienen nur als Beispiele; solche pyruvatbildenden Reaktionen laufen ab bei Kombination von Enzym und entsprechendem Substrat, beispielsweise in biologischen Untersuchungsproben. Wie zuvor beispielsweise erläutert, kann die erfindungsgemäße Analysenmethode nicht nur für die Untersuchung von Pyruvat, sondern auch für die Prüfung von Enzym, Enzymaktivität oder Substrat angewendet werden.

Man führt die Untersuchung so durch, daß man mit dem Probenmaterial und dem Reaktionsgemisch inkubiert. Als Reaktionsgemisch wird vorzugsweise ein Reagenz aus den notwendigen Bestandteilen eingesetzt. Als Untersuchungsergebnisse werden eine verbrauchte oder eine gebildete Komponente gemessen. Vorzugsweise ermittelt man meßtechnisch die Menge an verbrauchtem Sauerstoff, zweckmäßig mit einem Gerät, in dem der Sauerstoff in einer Lösung aufgenommen wird. In einem solchen Fall ist kein Indikator für Wasserstoffperoxid erforderlich. Wenn als Untersuchungsergebnis eine gebildete Komponente gemessen werden soll, mißt man zweckmäßig die Menge an Wasserstoffperoxid, beispielsweise mittels eines Wasserstoffperoxid-Elektrodenmeßgeräts, wie beispielsweise einem YSI-Oxidasemeter. Man kann auch mittels eines Indikators für Wasserstoffperoxid die Meßergebnisse colorimetrisch oder fluorometrisch ermitteln. Zweckmäßig führt man die Untersuchung 10 bis 60 Minuten lang bei 20-40°C, vorzugsweise bei 35-37°C, durch.

Als Indikator für Wasserstoffperoxid dient vorteilhaft die Kombination einer oder mehrerer Farbstoffe oder Fluoreszenzsubstanzen, die durch Wasserstoffperoxidkupplung bewirkt wird. Beispiele für solche Kombinationsindikatoren sind eine vierwertige Titanverbindung und Xylenolorange, die durch Wasserstoffperoxid zu einer stabilen roten Farbe gekuppelt werden, oder Phenol oder N,N-Dimethylanilin oder Homovanillinsäure, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase. Anstelle von 4-Aminoantipyrin kann man auch 4-Aminophenazon einsetzen. Es wird die Färbung oder Fluoreszenz gemessen. Man kann in ähnlicher Weise eine Kombination von 2,6-Dichlorphenol-Indophenol und Peroxidase oder eine Kombination von Guajakol und Peroxidase verwenden. Den Indikator bereitet man zweckmäßig zuvor als Lösung zu. Die colorimetrischen und fluorometrischen Werte werden als Absorption bei geeigneter Wellenlänge, beispielsweise 565 nm, gemessen.

Die Menge an Brenztraubensäure kann man anhand entsprechender Standardkurven aus den Meßwerten für verbrauchten Sauerstoff oder gebildetes Wasserstoffperoxid ablesen bzw. berechnen.

Ähnlich können mit dem Fachmann bekannten Untersuchungsmethoden Phosphat als verbrauchte Komponente und Acetylphosphat als gebildete Komponente als Meßwerte ermittelt werden.

Wie zuvor erläutert, enthält ein erfindungsgemäße Reagenz für analytische Zwecke, insbesondere für diagnostische Analysen, Pyruvatoxidase. Ein solches Reagenz kann für zahlreiche Untersuchungen eingesetzt werden. Im einzelnen kann man solche diagnostische Analysen, wie dies zuvor bereits illustriert wurde, zur Untersuchung von Pyruvat in pyruvatenthaltenden Lösungen oder in Serum oder Urin prüfen, man kann die Enzymaktivität von LDH, Pyruvatkinase, GPT, GOT, Glycerinkinase, Lipase, Lipoproteinlipase, Kreatininphosphokinase, Myokinase oder Thiokinase untersuchen und kann biologische Komponenten, wie beispielsweise Laktat, ADP, Glycerin, Triglycerid, Kreatinin oder Fettsäure mittels erfindungsgemäßer Reagenzien und Analysenmethoden vorteilhaft prüfen.

Beispiel 1

Reagenz für Pyruvatanalyse (an Sauerstoffelektrode)
Pyruvatoxidase\|300 U
FAD	0,5 µMol
Thiaminpyrophosphat	10 µMol
MnCl₂	25 µMol
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)	1,0 ml
Saccharose	0,5 g
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)	5 ml

Das Gemisch wurde lyophilisiert; so wurde das Reagenz für Untersuchungen von Brenztraubensäure (für Sauerstoffelektrodenmessung, 50 Tests) zubereitet.

Beispiel 2

Reagenz für Pyruvatanalyse (für colorimetrische Untersuchungen)
Reagenzteil (I)
Pyruvatoxidase	200 U
FAD	0,5 µMol
Thiaminpyrophosphat	10 µMol
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)	1,0 ml
Saccharose	0,5 g
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)	5 ml
Peroxidase (100 U/mg, Meerrettich)	2,5 mg
0,3% 4-Aminoantipyrin	5 ml

Das Gemisch wurde lyophilisiert; so wurde das Reagenz (Reagenzteil I) für Pyruvatanalyse (colorimetrische Messung, 50 Tests) zubereitet. Zusätzlicher Reagenzteil (II) bestand aus 0,2% wäßrigem N,N-Dimethylanilin mit 25 µMol MnCl₂ (50 ml); und der Reagenzteil (III) zum Abstoppen der Reaktion bestand aus 0,1 M Citratpuffer (pH 6,0, 100 ml) mit 0,1 M EDTA.

Beispiel 3

Ein wie in Beispiel 1 beschrieben hergestelltes Reagenz wurde in destilliertem Wasser (50 ml) gelöst, und eine Mehrzahl von gleichen Teilmengen der Lösung (1,0 ml) wurde in einen Reaktionsbehälter eingebracht, Dazu wurden 5,0 mM Pyruvatlösung (je 0-100 µl) oder menschliches Serum 50 µl und 5,0 mM Pyruvatlösung (je zusätzlich 0-100 µl) zugegeben, es wurde bei 37°C bebrütet und der Sauerstoffverbrauch durch eine Sauerstoffelektrode galvanisch gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse die Menge an Lösung und auf der Ordinate die Menge an verbrauchtem Sauerstoff abgetragen.

Weiterhin wurde ein wie in Beispiel 1 beschrieben hergestelltes Reagenz in destilliertem Wasser (25 ml) gelöst, und es wurden Teilmengen (0,5 ml) in einen Reaktionsbehälter eingefüllt und darin durch Beigabe von wäßriger Lösung (0,5 ml), die menschliches Serum (0-0,5 ml) enthielt, inkubiert und bei 37°C bebrütet. In Fig. 2 sind die Versuchsergebnisse in Form des an einer galvanischen Sauerstoffelektrode gemessenen Sauerstoffverbrauchs veranschaulicht. Auf der Abszisse ist die Menge an Serum und auf der Ordinate die Menge an verbrauchtem Sauerstoff abgetragen.

Aus den Fig. 1 und 2 kann man erkennen, daß gute lineare Proportionalität zwischen Sauerstoffverbrauch und Probenmenge besteht.

Beispiel 4

Der gemäß Beispiel 2 zubereitete lyophilisierte Reagenzteil (I) wurde durch Zugabe von Reagenzteil (II) (50 ml) gelöst, und gleiche Lösungsmengen (1 ml) wurden in kleinen Teströhrchen bei 37°C inkubiert. Es wurden 5 mM Kaliumpyruvatlösung (je 0-50 µl) oder menschliches Serum (50 µl), dem 5 mM Kaliumpyruvatlösung (je 0-50 µl) zugegeben worden waren, dazu gefüllt, und es wurde 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Dann wurden zur Beendigung der Reaktion Reagenzteil (III) (2 ml) hinzugefügt, und die Absorption bei 565 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse die Lösungsmengen und auf der Ordinate die Absorptionswerte abgetragen. Wie man erkennt, konnten bei diesen Untersuchungen gute lineare Relation und quantitative Ergebnisse erzielt werden, und das Resultat stimmt mit der Kalibrierungskurve für H₂O₂ (2,5 mM H₂O₂, 0-50 µl) überein.

Weiterhin wurden gleich große Proben an menschlichem Serum (0-0,5 ml) in kleine Teströhrchen eingefüllt und durch Zugabe von destilliertem Wasser bis auf 0,5 ml aufgefüllt. Es wurde jeweils eine Lösung (1,0 ml) an wie in Beispiel 2 beschriebenem Reagenzteil (I) mit zugesetztem Reagenzteil (II) beigegeben und 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Reagenzteil (III) (1,1 ml) beendet, und es wurde colorimetrisch bei 565 nm gemessen. In Fig. 4 sind die Ergebnisse aufgezeichnet; es ist auf der Abszisse die Menge an Serum und auf der Ordinate die Absorption bei 565 nm abgetragen. Wie erkennbar wurden gute quantitative Ergebnisse erhalten.

Beispiel 5

Reaktionsgemisch
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)\|0,2 ml
10 mM MnCl₂	50 µl
0,2% N,N-Dimethylanilin	0,2 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin	0,1 ml
Peroxidase (45 U/ml)	0,1 ml
10 mM Thiaminpyrophosphat	20 µl
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)	25 µl
20 mM Phosphoenolpyruvat	0,1 ml
Pyruvatkinase (4000 U/ml)	5 µl
5 mM ADP	0-50 µ

Das zuvor beschriebene Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von destilliertem Wasser auf 1,0 ml eingestellt und bei 37°C angezüchtet. Dann wurde Lösung von Pyruvatoxidase (200 U/ml, 20 µl) zugesetzt und 10 Minuten lang bei 37°C fortgezüchtet. Durch Zugabe von 0,1 M EDTA in 0,1 M Citratpuffer (pH 6,0, 2,0 ml) wurde die Reaktion abgestoppt, und dann wurde die Absorption bei 565 nm gemessen. Aus Fig. 5 ist zu ersehen, daß bei dieser Untersuchung von ADP gute quantitative Ergebnisse durch Ermittlung des aus dem Reaktionsgemisch von ADP, Pyruvatkinase, Phosphoenolpyruvat und den sonstigen Bestandteilen gebildeten Wasserstoffperoxids erhalten wurden. Aus Fig. 5 erkennt man auch, daß ebenso gute Linearität erreicht wird, wenn anstelle von 5 mM ADP 2,5 mM Wasserstoffperoxid eingesetzt wurden. In Fig. 5 sind auf der Abszisse die eingesetzten Lösungsmengen und auf der Ordinate die Absorptionswerte abgetragen.

Beispiel 6

Reagenz zur Untersuchung von Triglycerid
Reagenzteil (I)
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)	10 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin	5 ml
Peroxidase (100 U/mg)	2,5 mg
Thiaminpyrophosphat	10 µMol
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)	1,25 ml
Phosphoenolpyruvat	100 µMol
Pyruvatkinase (4000 U/ml)	0,1 ml
Pyruvatoxidase (200 U/ml)	2 ml
Lipoproteinlipase (3000 U/ml)	0,5 ml
Glycerinphosphokinase (300 U/ml)	1,0 ml
ATP	100 µMol
Dieser Reagenzteil wurde lyophilisiert. @	Reagenzteil (II) @	25 µMol MnCl₂ in 0,2% Dimethylanilin	50 ml
Reagenzteil (III) @	(Lösung zum Abstoppen der Reaktion) @	0,1 M EDTA in 0,1 M Citratpuffer (pH 6,0)	100 ml

Beispiel 7

Reagenzteil (I) gemäß Beispiel 6 wurde mittels Reagenzteil (II) in Lösung gebracht, und es wurden je gleiche Mengen (1,0 ml) dieser Lösung in Teströhrchen eingefüllt.

Dazu wurden je Untersuchungsproben (0-50 µl) an 1,02 µMol/ml Triglycerid enthaltendem menschlichem Serum, 5 mM Glycerinlösung, 4,2 mM Triolein in 0,1% Tensidlösung (Handelsprodukt Triton X-100) oder 2,5 mM Wasserstoffperoxidlösung zugegeben, und es wurde 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Wie aus Fig. 6 ersichtlich, konnte bei allen Untersuchungen gute Linearität beobachtet werden. In Fig. 6 sind auf der Abszisse die Mengen an Untersuchungssubstanz und auf der Ordinate die Absorptionswerte abgetragen.

Beispiel 8 Ein Reagenz zur Untersuchung von Serum-Transaminase (für 100 Tests) (1) Ein Reagenz zur Untersuchung von GPT (für 100 Tests)

Reagenzteil (I)
Dieser lyophilisierte Reagenzteil enthielt folgende Bestandteile:

Pyruvatoxidase\|400 U
FAD	500 nMol
Thiaminpyrophosphat	150 µMol
L-Alanin	20 mMol
α-Ketoglutarat	1 mMol
Saccharose	1 g
4-Aminoantipyrin	150 µMol
Peroxidase	450 U
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)	2,5 ml
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)	30 ml
Reagenzteil (II) @	(100 ml wurden für Reagenzteil (I) verwendet @	42 µMol MnCl₂ in 0,2% Dimethylanilinlösung	210 ml
Reagenzteil (III) @	(Lösung zum Abstoppen der Reaktion) @	(200 ml wurden für Reagenzteil (I) verwendet, 2,0 ml jeweils für einen Test) @	0,1 M EDTA in 0,2 M Citratpuffer (pH 5,0)	420 ml

(2) Reagenz zur Untersuchung von GOT (für 100 Tests)

Reagenzteil (I)
Dieser lyophilisierte Reagenzteil enthielt die folgenden Bestandteile:

Pyruvatoxidase\|400 U
FAD	500 nMol
Thiaminpyrophosphat	150 µMol
L-Asparaginsäure	20 mMol
α-Ketoglutarat	1 mMol
Oxaloacetatdecarboxylase	200 U
Saccharose	1 g
4-Aminoantipyrin	150 µMol
Peroxidase	450 U
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)	2,5 ml
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)	30 ml

Reagenzteil (II) und Reagenzteil (III):
Die gleichen wie zuvor unter (1) beschrieben.

Beispiel 9

Gemäß Beispiel 8 (1) zubereitete Reagenzteile (I) (für Untersuchung der GPT-Aktivität) und (2) (für Untersuchung der GOT-Aktivität) wurden durch Zugabe von jeweils Reagenzteil (II) (100 ml) gelöst. Je gleiche Einzelmengen (1,0 ml) der Lösung wurden in kleine Teströhrchen eingefüllt und 5 Minuten lang bei 37°C angezüchtet (angezüchtete Lösung des Reagenzteils [I]). Standard-Serumlösungen (20 µl) (Handelsprodukte der Firma Calciochem Co., Handelsbezeichnung Maxitol, die GPT 700 K U/ml und GOT 1000 K U/ml enthielten), in konstanten Mengenverhältnissen verdünnt, wurden zugegeben, und dann wurde 10 Minuten lang bei 37°C fortgezüchtet. Durch Zugabe des Reagenzteils (III) (2,0 ml) wurde die Reaktion abgestoppt, und dann wurde die Absorption bei 565 nm gemessen. Wie aus Fig. 7 zu entnehmen, wurde für beide Enzymaktivitäten Linearität bis zur optischen Dichte von etwa 1,0 (Enzymaktivität: etwa 750 K U/ml) erhalten.

Beispiel 10

Zu jeder der wie in Beispiel 9 beschrieben angezüchteten Lösungen des Reagenzteils (I) wurden 20 µl an menschlichem Serum zugesetzt (45 Proben), und es wurde 20 Minuten lang bei 37°C fortgezüchtet. Durch Zugabe von Reagenzteil (III) (2,0 ml) wurden die Reaktionen beendet, und es wurden die Absorptionswerte bei 565 nm gemessen.

Einige Proben mit dem menschlichen Serum wurden auch mittels der LKB-Methode untersucht (Ultraviolett-Absorptionsmethode, GOT-Untersuchungsreagenz und GPT-Untersuchungsreagenz, hergestellt von LKB Corp.), und es wurde die Korrelation mit der Aktivität von GPT und GOT aufgetragen. Wie in Fig. 8 veranschaulicht, wurden für die GPT-Untersuchung der Korrelationskoeffizient r=0,998 und die Regressionsgleichung y=0,00295 x+0,0032 gefunden.

Die Korrelationswerte für die GOT-Untersuchung sind in Fig. 9 aufgetragen; es resultierten der Korrelationskoeffizient r=0,966 und die Regressionsgleichung y=0,00287 x+0,0180.

Die als Enzym im erfindungsgemäßen Reagenz enthaltene Pyruvatoxidase wirkt wie folgt:

Das Enzym katalysiert die oxidative Reaktion von Brenztraubensäure, anorganischem Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid

CH₃COCOOH + HOPO₃^-- + O₂ → CH₃COOPO₃^-- + CO₂ + H₂O₂.

Es wurde die Wirkung des pH-Wertes auf die Pyruvatoxidaseaktivität gemessen. Für die Untersuchung wurden Phosphatpufferlösungen im pH-Bereich 6-8 verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die Absorption bei 565 nm abgetragen. Das Optimum des pH-Wertes lag wie folgt

FERM BP-465
pH 6,3-7,5
FERM BP-466	pH 7,5-8,5
IFO 12219	pH 7,0-8,0
IFO 12317	pH 6,8-7,5

Je nach Phosphatkonzentration und Art des Metallions wurde eine geringe Variation beobachtet.

Claims

1. Reagenz für analytische Zwecke, das aus einem Pyruvatoxidase enthaltenden Reaktionssystem besteht, dadurch gekennzeichnet, daß es eine aus den Mikroorganismen Aerococcus viridans IFO 12219, Aerococcus viridans IFO 12317, Pediococcus sp. FERM BP-465 oder Streptococcus sp. FERM BP-466 hergestellte Pyruvatoxidase enthält.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es neben der Pyruvatoxidase Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD), Thiaminpyrophosphat, Phosphat und ein Calcium-, Kobalt-, Magnesium- und/oder Manganionen abgebendes Salz enthält.

3. Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Indikator für Wasserstoffperoxid enthält.

4. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikator für Wasserstoffperoxid eine Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und Phenol oder N,N-Dimethylanilin oder Homovanillinsäure vorhanden sind.

5. Verfahren zur Bestimmung von Brenztraubensäure in einer Brenztraubensäure als solche oder ein Pyruvat freisetzendes System enthaltenden Untersuchungsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchungsprobe mit einem Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 behandelt und eine verbrauchte Reaktionskomponente oder eine gebildete Reaktionskomponente meßtechnisch ermittelt.