DE2952498C2

DE2952498C2 - Spezifisches Bindungsuntersuchungsverfahren und Reagenzmittel zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE2952498C2
Application number: DE2952498A
Authority: DE
Inventors: Robert Charles Boguslaski; Robert Joseph Elkhart Ind. Carrico
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-01-18
Filing date: 1979-12-27
Publication date: 1983-11-10
Also published as: CA1133392A; JPS5596458A; US4238195A; DE2952498A1; GB2044449B; JPH0210382B2; GB2044449A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein spezifisches BIn- J5 dungsuntersuchungsverfahren zum Nachweis eines Liganden In oder der Llgandenbindungskapazltät von

einem nüssigen Medium gemäß dem Oberbegriff des

Patentanspruchs 1 und hierfür geeignete Reagenzmittel. Bei üblichen spezifischen Blndungsuntersuchungsme-

thoden wird eine Probe des zu untersuchenden flüssigen Mediums mit einem Reagenz unterschiedlicher Zusammensetzung vereint. Solche Zusammensetzungen enthalten ein markiertes Konjugat aus einer Bindungskomponente, die mit einer Markierung versehen Ist, wobei das

■»5 markierte Konjugat mit gegebenenfalls vorhandenen anderen Bestandteilen des Reagenzes unter Bildung eines Blndungsreaktionssystems reagiert und zwar unter Ausbildung von zwei Spezies oder Formen des markierten Konjugats, nämlich einer gebundenen Spezies und einer freien Spezies. Die relativen Mengen oder Anteile des markierten Konjugats In der gebundenen Spezies, verglichet, zu denen in der freien Spezies, sind eine Funktion der Anwesenheit (oder der Menge) des In der Probe nachzuweisenden Liganden oder der Llgandenblndungs kapazität.

Zur Beschreibung soll eine übliche kompetitive BIndungsuntersuchungsmethode nachfolgend erläutert werden. Bei einer solchen Methode besteht das Reagenz aus (1) einem markierten Konjugat in Form des nachzuwel senden Liganden (z. B. einem Antigen oder Hapten), ehemisch mit einer Markierung verbunden, und (2) einem spezifischen Bindungspartner für den Liganden (z. B. einem Antikörper). Bei Vereinigung der Probe und des Reagenzes würde der nachzuweisende Llgand und die Bindungskomponente des markierten Konjugats In einer Im wesentlichen nicht-dlskrlmlnlerenden Welse Im Wettbewerb um eine nlcht-kovalente Bindung an den spezifischen Bindungspartner stehen. Als Ergebnis kann

entweder die Menge des markierten Konjugats, die an den Bindungspartner gebunden wird (d. h. die, die sich mit der gebundenen Spezies ergibt) oder die Menge, die frei bleibt (d. h. die nicht an den Bindungspartner gebunden ist und somit die freie Spezies ergibt) als Funktion der Menge der Im Wettbewerb stehenden vorhandenen Liganden gemessen werden. Die Menge an markiertem Konjugat, die sich aus einer der beiden Spezies ergibt, wird durch die Messung, z. B. durch Überwachung der darin vorhandenen markierten Komponente, bestimmt.

Wenn das markierte Konjugat in der gebundenen Spezies und das in der freien Spezies Im wesentlichen durch die Mittel, die beim Überwachen der Markierungskomponente verwendet werden, nicht unterscheidbar sind, massen die gebundene Spezies und die freie Spezies physikalisch voneinander getrennt werden. Diese Art der Untersuchung wird als »heterogen« bezeichnet. Kann man die gebundene Spezies und die freie Spezies des markierten Konjugats unterscheiden, so erfolgt eine »homogene« Bestimmung, wobei die Trennstufe vermieden wird.

Die erste entdeckte Art einer hochempfindlichen spezifischen Bindungsuntersuchungsmethode war der Radlo-Immunoassay, bei welchem radioaktive Isotopen als Markierungskomponente verwendet werden. Eine solche Untersuchungsmethode muß zwangsläufig die heterogene Methode anwenden, weil der überuachbare Charakter der Markierung qualitativ in der freien und In der gebundenen Spezies unverändert bleibt. Wegen der Unbequemlichkeit und der Schwierigkeit bei der Handhabung von radioaktiven Stoffen sind viele neue Untersuchungssysteme entwickelt worden, bei welchen man andere als Radioisotopen für die M,;klenjngskomponente verwendet, einschließlich Enzyme, Bakteriophagen, Metalle und Organometallkomplfr-;, Coenzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, zyklische Reaktanten, organische prostetische Gruppen, chemllumlneszente Reaktanten und fluoreszierende Moleküle.

Solche bisher entwickelten spezifischen Bindungsuntersuchungen, bei denen eine fluoreszierende Markierung verwendet wird, beruhen auf einer photogenen Anregung des Fluoreszlerungsmlttels, d. h. einer Anregung des Fluoreszierungsmittels durch Bestrahlung mit Licht auf einen energiereichen Zustand, bei dem es Licht emittiert. Das Fluoreszlerungsmittel kann gemessen werden, indem man das gesamte Licht oder einen Llchtpeak, der emittiert wird, oder Irgendeine andere nachweisbare Eigenschaft des emittierten Lichtes, wie dessen Polarlslerung, mißt. Die Anforderung an das einfallende Licht für die Einleitung der Messung des Fluoreszlerungsmlttels ist sehr unvorteilhaft bei den bekannten Untersuchungsmethoden unter Verwendung von fluoreszierenden Bindungsmitteln- Bei der Messung muß man mechanische und elektronische Instrumente anwenden, um mit dem Problem des störenden Hintergrundlichtes aus einfallender Strahlung fertig zu werden. Andere spezifische Blndungsuntersuchungsmethoden, die man bisher entwickelt hat, verwenden chemilumineszente Markierungen, d. h. solche, bei denen Licht durch eine chemische Reaktion produziert wird. Eine einfallende Strahlung Ist hler r.jcht erforderlich, um das Überwachungssystem bei diesen Untersuchungsmethoden zu initiieren, jedoch Ist die Empfindlichkeit solcher chemllumlneszenter Blndungsuntersuchungsmethoden zur Zeit noch theoretisch begrenzt, well das als Markierung verwendete Material gemäß dem Stand der Technik unabdingbar ein bei der lichtproduzierenden Reaktion verbrauchbarer Reaktant Ist. Weiterhin sind Bindungsuntersuchungen auf Basis von chemllumlneszenten Verbindungen Im allgemeinen empfindlich gegenüber einer Beeinflussung der Lichtproduktion durch Proteine.

Der Stand der Technik, hinsichtlich der vorerwähnten Fluoreszlenings- und Chemllumineszenzbindungsuntersuchungsmethoden, wird nachfolgend hinsichtlich der entsprechenden Veröffentlichungen näher erläutert.

Das grundlegende Konzept hinsichtlich der Verwendung von Fluoreszierungsmltteln als Markierungen in

to spezifischen Untersuchungsmethoden wird in US-PS 37 20 760 erläutert. Hierbei werden Fluorescelnderlvate, Insbesondere Fluoresceinisothiocyanat, als Markierungsmittel beschrieben. Bei einer solchen Untersuchung würde man übliche fluorome!tische Methoden zur Über waeäung der Markierung anwenden. Das Fluoreszle- rungsmlttel kann durch Bestrahlen mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt werden und das fluoreszierte Licht, das bei unterschiedlichen Wellenlängen auftritt, wird gemessen. Es wurden verschiedene Verbesserungen der grundlegenden Fluoreszenzblndungsuntersuchungsmethoden entwickelt und diese werden in den US-PS

39 92 631, 3999 948, 40 2Ü 151, 40 25 3IG, 40 36 946 und

40 58 732 beschrieben. Diese Fluoreszlerungsmittelmethoden bauen auf heterogenen Methoden auf, d. h. daß die Markierung In der gebundenen oder der freien Spezies nach deren Trennung gemessen wird.

Eine Reihe von Fluoreszlerungsmittelblr.dungsuntersuchungen der homogenen Art sind entwickelt worden, wodurch man die Im allgemeinen nachteilige Trennstufe

jo vermeiden kann. Ein solches Verfahren Ist die Fluoreszenzpolarlsierungsmethcde gemäß US-PS 41 15 699, die darauf beruht, daß bei der Bestrahlung mit polarisiertem Licht von gewissen Fluoreszierungsmlttel-Ligand-Konjugaten, wenn diese an einen Bindungspartner (z. B. einen

!3 Antikörper) gebunden sind, eine Lichtemission eintritt, die eine unterschiedliche Polarisierung hat. Auf diese Welse können die gebundene und die freie Spezies in dem markierten Konjugat wirksam durch eine Überwachungsreaktion unterschieden werden.

•«ο Eine andere homogene Fluoreszlerung^cüttel verwendende Bindungsuntersuchungsmethode beruht auf einem Auslöschen oder Verstärken der Fluoreszenz beim Binden des FluoreszlerungsmlUel-Liganden-Konjugats durch dessen Bindungspartner. Beispiele für diese

■»'> Methode werden In der BE-PS 8 58 722 und der DE-OS 27 16 276 und 27 16 515 beschrieben. Eine Variation dieser Untersuchungsmethoden wird In US-PS 39 96 345 beschrieben, bei der eine spezifische auslöschende Substanz als Gegenpart zu e'jier fluoreszierenden Markierung

■><> verwendet wird.

Chemilumineszente Blndungsuntersuchungsmethoden werden In der US-PS 41 04 029 beschrieben. Wie schon vorhei dargelegt, werden bei den Untersuchungsmethoden auf Basis von chemllumlneszenten Verbindungen

5> verbrauchbare Reaktanten als Markierung verwendet und dadurch wird theoretisch die Empfindlichkeit limitiert. Außerdem werden diese Methoden durch Proteine unzuverlässig. Die Einleitung einer fotochemischen Reaktion In Abwesenheit von äußerem Licht durch chemische, thermische oder elektrische Anregung eines chemllumlneszenten Materials Ist In folgenden Durchschriften beschrieben: US-PS 36 89 391; Rauhut et al, J. Am. Chem. Soc. 88: 3604 (1966); Rauhut et al. Accounts of Chem. Res. 2: 80 (1969); und Maulding et al, J. Org. Chem. 33: 250 (1968). Die Anwendung dieses Phänomens auf analytische Methoden wird In diesen Druckschriften nicht beschrieben, die schon vor den Druck-

Schriften, die Fluoreszlerungsmitteluntersuchungsmethoden betreffen, veröffentlicht wurden.

Es wurde nun gefunden, daß man fluoreszlerungsmlttelmarkierte spezifische Blndungsuntersuchungsmethoden vorteilhaft überwachen kann, ohne daß eine fotogene Anregung erfolgt, indem man auf chemischem Wege erzeugte energiereiche Substanzen zum Anregen des fluoreszenten Markierungsmittel verwendet.

Die Erfindung bezieht sich auf ein spezifisches Bindungsunterbüchungsverfahren zum Nachweis eines Liganden in oder der Ligandenbindungskapazltät von einem flüssigen Medium, bei dem das flüssige Medium mit einem Reagenzmittel vereinigt wird, das als einziges markiertes Konjugat eine mit einer fluoreszierenden Markierung versehene Bindungskomponente enthält, und durch die Vereinigung ein Bindungsreaktionssystem gebildet wird aus einer gebundenen Spezies und einer freier». Spezies des markierten Konjugats und bei dem die Menge der entweder In der gebundenen Spezies oder In der freien Spezies enthaltenden fluoreszierenden Markierung als Maß der Menge des Lig.inden oder der Ligandenbindungskapazität in dem flossigen Medium gemessen wird, und Ist dadurch gekennzeichnet, daß man die fluoreszierende Markierung dadurch anregt, daß man in Gegenwart der Markierung eine chemische Reaktion durchführt, deren Produkt eine hochenergiereiche Substanz ist, aus welcher Energie auf die Markierung übertragen wird und das durch die angeregte fluoreszierende Markierung emittierte Licht mißt.

Bei der vorliegenden Untersuchungsmethode kann eine der üblichen homogenen oder heterogenen Untersuchungsmethoden angewendet werden.

O O

Das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anzuwendende Reagenzmlitel umfaßt wenigstens einen Partner eines chemischen Reaktionssystems, welches ein Produkt bildet, das die fluoreszierende Markierung zur Emittierung von Licht anzuregen vermag. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Reagenzmittel (Π Wasserstoffperoxid oder ein chemisches System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid und (2) Oxalylchlorid, ein Oxamid oder einen bis-Oxalatester.

Erfindungsgemäß wird die Überwachungsreaktion in dem speziellen gewünschten Bindungsreaktionssystem (d. h. in der abgetrennten gebundenen oder freien Spezies, wenn man eine heterogene Methode durchführt, oder bei der vereinten Spezies, bei einer homogenen Methode) durchgeführt, indem man das Reagenz, das unter Bildung eines hochcnergiereichen Reaktionsproduktes reagiert und in der Lage rst. Energie auf die Fluoreszierungsmarkisrung zu übertragen und diese in den angelegten Zustand zu bringen, zugibt. Wenn man die Anregung des Fluoreszierungi -ittels in Richtung des Grundzustandes der Energie abnennen laßt, wird Energie in Form von Licht emittiert. Zum Beispiel können Wasserstoffperoxid und verschiedene reaktive bis-Oxalatester in Form eines hochenergiereichen 7wischenprodii'-tes reagieren, von dem man annimmt, daß es entweder 1,2-Dio\äthandion oder aktiviertes Kohlendioxid it. Dieses Zwischenprodukt überträgt Energie auf das Fluoreszierunesmittel. welches anschließend Licht mit einem Spektrum emittiert, das im wesentlichen seinem normalen Fluoreszenzspektrum entspricht. Diese Gesamtreaktion kann wie folgt beschrieben werden:

H₂O₂ + R — O — C — C — O — R + Fluoreszierungsmittel Licht (hv) + 2 R — OH + 2CO₂ + Fluoreszierungsmittel

worin R einen organischen Rest, Im allgemeinen Aryl, und hv elektromagnetische Strahlung Im Infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Bereich bedeutet. Wie In der Reaktionsgleichung gezeigt wird, Ist die Fluoreszlerungsmarklerung weder ein verbrauchbarer Reakcant noch wird er während der Reaktion in Irgendeiner Weise chemisch verändert.

Die vorliegende Erfindung hat eine Reihe von Vor'ei-. len gegenüber den bekannten Fluoreszenz- und Chemllumfneszenzblndungsuntersuchungsmethoden. Ein Vorteil besteht darin, daß verhältnismäßig einfache Nachweisinstrumente verwendet werden können und daß Infolgedessen die Notwendigkeit einer Lichtquelle, von Bandenfiltern und Vorrichtungen, um die Streuung des einfallenden Lichtes auf den Fotodetektor zu korrigieren, wie man sie bei flucrometrlschen Messungen benötigt, überflüssig werden. Ein weiterer Vorteil gegenüber dem üblichen fluorometrlschen Nachwels Ist der, daß kein einfallendes Licht benötigt wird, um die Llclitproduktion zu initiieren und daß alles gebildete Licht, ohne Wellenlängenbeschränkung, gemessen werden kann. Ein theoretischer Vorfell gegenüber den Chemllumlneszenzblndungsuntersuchungen des Standes der Technik besteht In einer verbesserten Empfindlichkeit aufgrund der Tatsache, daß sich die Markierung nicht wie ein verbrauchbares Reaktant toenimfnt. Da außerdem eine Vielzahl von Fluoreszierungsmafkl<:rungen mit unterschiedlichen Maxima für Ihre jeweilige Lichtemission für die Bestimmung von unterschiedlichen Liganden verwendet werden kann, können gleichzeitig viele Untersuchungen durchgeführt werden. Außerdem besteht beim vorliegenden Untersuchungsverfahren auch nicht das Problem hinsichtlich des Proteln-»Quenchlng«, wie es bei den Chemilumineszenzuntersuchungen des Standes der Technik der Fall ist.

Im folgenden werden folgende Begriffe mit den nachfolgenden Bedeutungen, wenn nicht anders angegeben, verwendet: »Ligand« Ist eine Substanz oder eine Klasse von verwandten Substanzen, deren Gegenwart oder Menge In einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; »spezifischer Bindungspartner des Liganden« ist jede Substanz oder Klasse oder Unterklasse, die eine spezifische Bindungsafflnltät zu dem Liganden im Gegen-Si.a zu anderen Substanzen hat; »spezifisches Bindungsanalog des Llg-inden« Ist jede Substanz oder Klasse einer Substanz, die sich Im wesentlichen wie der Ligand Im Hinblick auf die Bindungsaffinität des spezifischen Bindungspartners des Liganden verhält; und »Reagenz« oder »Reagenzmlitel« Ist eine Zusammensetzung, eine Vorrichtung oder ein Untersuchungsset, das die Reagentlen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Uniersuchungsmethode enthält.

Die erfindungsgemäße Untersuchungsmethode kann zum Nachwels von allen Liganden verwendet werden, für die ein spez'fischer Bindungspartner vorhanden Ist, bzw. für den Nachwels der Kapazität eines Flüsslgmedlums. einen solchen Liganden (im allgemeinen aufgrund der Gegenwart eines Bindungspartners für den Liganden

In dem Medium) zu binden. Der Llgand lsi Im allgemel nen ein Peptid, Protein, Kohlehydrat, Glykoproteln. Steroid oder ein anderes organisches Molekül. IUr welches In einem biologischen System ein spezifischer Blndungspartner vorliegt oder synthetisiert werden kann. Der Llgand Ist, funktionell ausgedrückt. Im allgemeinen aus der Gruppe bestehend aus Antlgenen und Antikörpern dazu, Maptenen und Antikörpern da/u. Hormonen. Vitaminen, Metabollten und pharmakologlschen Mitteln und deref/ Rezeptoren und Bindungssubstanzen ausgewählt. Heispiele für l.lgamicn sind Immunologisch aktive Poh peptide und Proteine mit einem Molekulargewicht /wischen 1000 und 4 000 0Of). /.B. Antikörper und Antigene. Polypeptide und Proteine sowie auch ll.iptetu- mit einem Molekulargewicht /wischen 100 und 1500 Heispiele für solche antlgenen Polypeptide sind Xnglotensln I und II. ('-Peptide. (Kytoeln. Vasopressln. Neurnphysln. (iastrln. Secrelln und Cilucagon. Beispiele tür antigene Proteine sind Insulin, chorionisches Gonadotropin (/ B HCCi), carcinocmbryonlsehcs Antigen (C I.A), Mvoulobin. Hämoglobin, lolllkclstlmullcrcndes Hormon, humanes Wachstumshormon, thyroldstlnuilierendes Hormon • TSH), humanes placcntales [.acingcn. Thvroxlnblndungsglobulln (TBCi), Intrlnslkfaklor. Transcohalamtn. Enzyme, wie Alkallphosphata.se und Mllchsäurederndrogenase und hepalllisassozllerte Antigene, wie Hepatitis B Onerflachenantlgen (HBAg). Hepatitis B cAntigen (HB, Ag) und Hepatitis B Kernantlgen illB Ag) Beispiele Tür Antikörperliganden sind solche Antikörper der IgG. IgL. IgM und IgA Klassen, die spe/ilisch tür alle der hler beschriebenen Antigene oder Haptene sind. Haptenlliianden sind /. B. Thyroxin. Llothyronln. Östrogene, wie Östriol. Prostaglandine. Vitamine, wie Biotin. Vitamin Bu. Folsäure, Vitamin L. Vitamin A und Ascorbinsäure (Vitamin C) und Arzneimittel, wie Carb.ime/epin, ChI-nldln, Dlgoxln, Dlgltoxin. Theophyllin, l'henobarbitral. PrimicJon. Dipncnyinyuaniuin. Morphin. Nikotin und dergleichen

Das zu untersuchende Medium kann eine natürliche oder künstlich gebildete flüssigkeit sein, von welcher man annimmt, daß sie den Liganden oder eine Bindungskapazltat dafür enthält und sie lsi im allgemeinen eine biologische Flüssigkeit oder eine Verdünnung davon oder ein Behandlungspn.dukt einer solchen biologischen Flüssigkeit. Biologische Flüssigkelten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können, sind z. B. Serum. Plasma. Urin. Speichel und amniotische und cerebrospinale Flüssigkeiten Andere Stoffe, wie Feststoffe, z. B. Gewebe, können untersucht werden. Indem man sie in eine Flüssigform bringt, z. B. durch Auflösen des Feststoffs in einer Flüssigkeit oder durch Flüssige.xtraklion des Feststoffs.

Die erfindungsgemäß verwendete fluoreszierende Markierung kann jede fluoreszierende Substanz sein. d. h jede Substanz, die bei Erregung zu einem hochenerglereichen Zustand, wie bei Bestrahlung oder beim Aussetzen gegenüber einem hochenergiereichen Reaktionsprodukt, wie bei der vorliegenden Erfindung, anschließend strahlt oder Licht emittiert. Das Phänomen der Fluoreszenz, wie es bekannt ist, ist das Ergebnis von Veränderungen des Energiezustandes von Elektronen in der Elektronenkonfiguration des fluoreszierenden Mittels. Im Falle der Anregung durch einfallendes Licht einer bestimmten Energie (d. h. innerhalb eines bestimmten Wellenlängenbereiches), werden Elektronen zu einem Zustand hoher Energie angeregt und beim Nachlassen des energiereichen Zustandes gehen sie auf ein niedrigeres stabileres Niveau über und Energie wird in Form von Licht emit-

tiert. Wegen des damit verbundenen F.nergleverlustes In Form von anderen Energien als Licht während der Fluoreszenz, hat das emittierte Licht Im allgemeinen eine niedrigere Energie und Infolgedessen eine längere Wellenlänge als das einfallende Licht.

Von den üblichen fluoreszierenden Mitteln werden besonders solche bevorzugt, die eine organische Struktur haben, die leicht an eine Bindungskomponente In dem jeweils zu verwendenden Blndungsreakilonssysiem unter Bildung des benötigten markierten Konjugats gekuppelt wird. Beispiele für solche bevorzugten fluoreszierenden Mittel sind Lissamln-Rhodamln B, Rhodaniln B. Fluorescein. ^cU0-DlphenyIanthracen. Perylen. Ruhen. Pyren oder lluores/lcrende Derlcate davon, wie das Isocyana!. Isothlocyanat, Silurechlorld oder Sulfonylchlorlddcrivate Das fluoreszierende Mittel wird an das für die Untersuchung ausgesuchte Bindungsmittel gekuppelt 'diese Komponente Ist im allgemeinen der Llgand. ein spezifisches Bindungsanalog des Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner des Liganden, wie nachfolgend noch beschrlenen wird), wobei die Bindung direkt erfolgen kann oder, wie dies meistens vorkommt, über eine BrUkkengruppe. so daß die gewünschte Fluores/enzeigenschaft der Fluoreszenzmarkierung In dem markierten Konjugat erhalten bleibt. Nach dein gegenwärtigen Stand der Technik umfaßt eine solche Brückengruppe Im allgemeinen 1 bis 50 und vorzugsweise etwa 1 bis 15 Kohlenstoffatome t/der Heteroatome (z. B. Stickstoff. Sauerstoff. Schwefel und Phosphor) In der Kette. Als eine chemische Gruppe hat die Brückengruppe im allgemeinen ein MoIekulargewlcht. das 1000 nicht übersteigt und vorzugsweise weniger als 200 beträgt. Die genaue chemische Struktur der Brückengruppe, die Bindungen zwischen der Fluoreszenzmarkierung und der Bindungskomponente und die jeweiligen Endgruppen der Brückengruppe hängen von der genauen Art des fluoreszierenden Mittels und der verwendeten Binii-ürsgskompcnenie ab. Synthetische Kupplungsverfahren, bei denen die fluoreszenzmarklerte Bindungskomponente (d. h. das markierte Konjugat) gebildet wird, sind an sich bekannt.

Reaktionen, bei denen hochenerglerelche Zwischenreaktionsprodukte entstehen, die In der Lage sind, die Fluoreszenzmarkierung anzuregen, sind ebenfalls an sich bekannt. Solche Zwischenprodukte können z. B. durch Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Oxalylchlorld; Oxamld, wie U'-Oxalyl-bls-(benzlmldazol), N,N'-Dimeihyl-N.N'-dlnitrooxamld und N,N'-bls-(PhenylsulfonyD-parabamat, gebildet werden oder mit bis-Oxalatester. wie bis-(2.4-Dinitrophenyl)-oxalat, bls-(PentachlorphenyD-oxalat. bis-(4-Nltro-3-trlfluormethylphenyl)-ox»- lat, bis-(4-Nltro-2-formylphenyI)-oxalat und bls-(PentafluorphenyD-oxalat. Beispiele für den Stand der Technik beschreibende Druckschriften, die die Anregung des fluoreszierenden Mittels durch chemische Reaktionsprodukte beschreiben, sind: US-PS 36 89 491, Rauhut et al. *A Study of Oxalic Ester Chemiluminescent Reactions«, United States Department of Commerce, National Technical Information Service Report AD-775, 882; Mauldlng et al. J. Org. Chem. 33: 250 (1968); Rauhut et al, J. Am. Chem. Soc. 88: 3604 (1966); und Rauhut et al. Accounts of Chem. Res. 2:80(1969).

Wie schon dargelegt, kann die vorliegende Untersuchungsmethode alle üblichen homogenen oder heterogenen Untersuchungsmethoden umfassen.

Die Rcägenzmitiei, die die zur Durchfahrung einer gewünschten Untersuchungsmethode gemäß der vorliegenden Erfindung benötigten Reaktionspartner enthalten, können in einer geeigneten Verpackungsform vorlle-

gen, ζ. B. als eine Zusammenstellung, oder In Mischung, wenn es die Verträglichkeit der Reagenllen möglich macht, in einer Anordnung für den Test oder als ein Untersuchungsset, d. h. einer verpackten Kombination eines Behältets. welcher die erforderlichen Reagenllen enthalt. Eingeschlossen in die Reagenzmittel sind Reagentlen wie sie TQr das Blndungsreaktlonssystem benötigt werden, wobei Immer ein markiertes Konjugal df» vorher angegebenen Art erforderlich Ist. Solche BIndungsreaktlonsreagentien können zusatzlich zu dem markierten Konjugal einen Bindungspartner für den Liganden und dergleichen einschließen Wird eine heterogene Blndungsmethodc angewendet, so können mit den Blndungsreaktlonsreagentlen ein unlösllchmachendes Reagenz und ein chemisches Mittel, um entweder die gebundene oder die freie Spezies unlöslich zu machen, eingeschlossen sein.

Beispielsweise würde ein typischer Set eines Blndungsreaktlonsreagenzes zur Durchführung einer homogenen kornpcüiivcn BtaduRgsuriisrsischur.g for einen Anügen llganden (1) eine fluoreszlerungsmittelmarkierte Form des Llganden oder eines Bindungsanalogs davon und (2) einen Antikörper oder ein Antigen enthalten. Ein typischer Set von Reagentlen für einen Antlgenllganden für eine heterogene kompetltive Bindungsuntersuchung würde (1) eine fluoreszlerungsmittelmarkierte Form des Llganden oder eines Bindungsanalogs davon und (2) eine unlöslichgemachte Form des Antikörpers oder des Antigens snthalten. Die sehr zahlreichen möglichen Veränderungen der Blndungsreaktlonsreagentlen und die Formen, In denen diese auf den Markt kommen können, si .i dem Fachmann vertraut.

Außer den vorerwähnten Blndungsreaktlonsreagentlen enthalten die Reagenzmittel wenigstens einen Partner eines chemischen Reaktionssystems, welches ein Produkt bildet, das die fluoreszierende Markierung zur Emittierung von Licht anzuregen vermag. Vorzugswelse umfaßt das Reagenzmittel (1) Wasserstoffperoxid oder Irgendein übliches chemisches System, welches Wasserstoffperoxid erzeugt und (2) Oxalylchlorid, ein Oxamid oder einen bls-Oxalatester, wobei die letzteren beiden Verbindungsklassen die bevorzugten zuvor beschriebenen Spezies einschließen.

Selbstverständlich können die Reagenzmittel noch weitere Reagentlen enthalten, die aus dem Stand der Technik bekannt sind und die aus technischen oder anwendungstechnischen Gesichtspunkten wünschenswert sind, z. B. Puffer, Verdünnungsmittel, Standards und dergleichen.

Die Erfindung wird nachfolgend durch die Beschreibung von Beispielen naher erläutert.

Reagentlen

Lissamin-Rhodamln B. Wasserstoffperoxid (50%ig) und Slsomycin wurden als handelsübliche Produkte erhalten. bls-<2,4-Dlnltrophenyl)-oxalat wurde nach dem Verfahren von Rauhut et al, J. Amer. Chem. Soc. 88: 6522 (1967) hergestellt. Antikörper, die mit Slsomycin reagierten wurden in Kaninchen gezüchtet, die mit Gentamicin, gekuppelt an Rinderserumalbumin, Immunisiert worden waren [Nature New Bio!. 239: 214 (1972)].

Dünnschichtchromatografie

Vorbeschichtete Platten aus Kieselgel wurden verwendet. Das Lösungsmittel wurde hergestellt, indem man kräftig gleiche Volumina an Methanol, Chloroform und Ammoniumhydroxid vermischte und gebildete niedrigere Phase sammelte.

Papierelektrophorese

Elektrophorese wurde auf 28 χ 34 cm Blattern von Whatman 3MM brand paper durchgeführt nach der llängestreifenmethode, beschrieben von Williams et al, Science 121: 829 & 830 (1955). Als Puffer wurde 0,01 M Pyrldln-Acetat, pH 5,0, angewendet. Ein Potential von etwa 17 V/cm wurde während 5 Stunden angelegt.

Nlnhydrinreaktlon

Materlallen mit Amlnoresten wurden auf Dünnschlchtplatten und Elektrophoresepapler mit dem NInhydrln-Sprühreagenz nach Brenner und Niederweiser, Meihods In Enzymology II: 39-59 (1967) nachgewiesen.

Reinigung von Lissamin-Rhodamln B

Dünnschichtchromatografie spaltete das handelsübliche Lissamin-Rhodamln B In 15 bis 20 Rotkomponenten auf, wobei der Hauptbestandteil einen Rf von 0,31 hatte.

?.'. Eiwa 7 g der Rohm'schung wurden rr>!! 500 nil siedendem wasserfreien Äthanol verrührt und die Mischung wurde noch heiß filtriert. Das Flltrat wurde über eine Sephadex-LH-20 Säule (5 χ 50 cm) In wasserfreies Äthanol gegeben. Die Säule wurde mit 6 I Äthanol gewaschen, wobei 25 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die die rote Farbe enthaltenden Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatografie untersucht und diejenigen, die Lissamon-Rhodamin B (Rf= 0,31) enthielten, wurden zusammengegeben und auf einem Drehverdampfer getrocknet. Dieses Material wurde welter durch Chromatografie über eine 1 Mikrometer (um) dicke Schicht von Kieselgel gereinigt. Es wurden etwa 120 mg des Farbstoffs in Methanol auf eine 20 χ 20 cm Platte gegeben und das Chromatogramm wurde mit dem vorher erwähn-

r> ten Lösungsmittel entwickelt. Das kräftig rote Band wurde von der Platte abgeschabt und der Farbstoff wurde von dem Gel mit Methanol elulert.

Herstellung des markierten Konjugats (fiuoreszenzmarkiertes Sisomicin)

100 mg (0.18 mMol) des gereinigten Lissamin-Rhodamln B wurden In 5 ml Thionylchlorid wählend 45 Minuten rückflußbehandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und Thionylchlorid wurde auf einem Drehverdampfer abgedampft. Der Rückstand wurde In 20 bis 30 ml Chloroform gelöst und getrocknet. Dies Verfahren wurde zweimal wiederholt. Durch Dünnschichtchromatografie wurde dieses Reaktlonsgemlsch in 15 bis 20 Komponenten aufgelöst. Der trockene Rückstand wurde in 3 bis 4 ml Dlmethylacetamid gelöst und zu einer Lösung gegeben, die 44 mg Sisomicin (freie Base) (0,1 mMol) In 5 ml Dlmethylacetamid und 40 μΙ Triäthylamln (0,29 mMol) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtempe ratur stehen gelassen und dann wurde das Lösungsmittel auf einem Drehverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser verrührt und das unlösliche Material wurde durch Filtrieren abgetrennt. Die wasserunlösliche Fraktion wurde in Methanol gelöst und schien eine neu trale Ladung zu haben bei der Untersuchung durch Elek trophorese. Das wasserlösliche Material bestand aus neutralen und positiv geladenen roten Komponenten, sowie aus nicht-umgesetzten Sisomicin. Es wurde über eine 2,5x23 cm Säule aus Sephadex CM-25, ins Glelchge wicht gebracht mit 04 M Ammonlumformlat, chromato- grafiert Das Chromatogramm wurde mit einem Llneargradlenten, erzeugt aus 500 mi 0,5 M Ammonlumformlat und 500 ml 24 M Ammoniumformiat, entwickelt. Frak-

Il

Honen (13 ml) wurden gesammelt und die Absorption bei 555 nm wurde gemessen. Die Fraktionen 60 bis 65 wurden zusammengegeben und zur Entfernung von Wasser und Ammonlumformlat lyophlllslert. Der Rückstand wurde In 2 bis 3 ml Wasser gelöst und welter durch Pa- ·> Pierelektrophorese gereinigt. Drei Bänder wanderten In unterschiedlichen Geschwindigkeiten zur Kathode. Diese wurden auselnandffgeschnltten und vom Papier mit Wasser elulert. Das Produkt (Slsomlcln-Fluoreszlerungsmlttel-Konjugat), das bei der Elektrophorese am schnell- sten wanderte, wurde für die weiteren Untersuchungen verwendet

Lichtbildende Reaktion

Ein 200 bis 500 μI Aliquot des Fluoreszlerungsmlüels r> in 0,1 M irls-dlydroxymethyD-amlnomethan-hydrochlorld (Trls-HCD-Puffer. pH 8,0, wurde In ein 7 χ 70 mm Reagenzglas gegeben. Eine vorbisllmmte Menge von 50'*, (V/V) Wasserstoffperoxid wurde zu jeder Probe gegeben. Das Reagenzglas wurde In ein Fotometer gege- 2r. ben und aus einer Spritze wurden 2,0 ml von 20 mMol bls-(2,4-Dlnltrophenyl)-oxalat eingespritzt. Die Llchtblldung wurde 20 Sekunden nach Einspritzen aufgezeichnet.

Lichtmessungen

Die llchtbildenden Reaktionen wurden In 7 χ 70 mm Reagenzgläsern durchgeführt, die auf einen Fotomultlpller montiert waren. Ein Bandendurchlaß-Interferrenzfllter mit einer 10 nm Halbbandenbrelte wurde zwischen das Reagenzglas und den Fotomultlpller gegeben. Die "' Wellenlängen für die maximale Durchlässigkeit des Filters betrug 579 nm. Die Abdeckung über dem Reagenzglas hatte eine Öffnung, bedeckt mit einer Gummifolie. Eine Injektionsnadel wurde durch die Folie zum Einspritzen einer Lösung des Oxalatesters In das Reagenz- '' glas gestoßen. Die Llchtblldung wurde aufgezeichnet In Einheiten der Instrumentenahlesung

Heterogene Untersuchungsmethode

Bfndungsreaktlonen zwischen Antikörper, dem Slsoml- ⁴" cln-FluoreszIerungsmlttel-Konjugat und Sisomicin wurden In 0,1 M Trls-HCI-Purfer auf pH 8.0 (400 μΙ Endvolumen) bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Konjugat und Sisomicin wurden zusammengegeben und dazu wurde zuletzt der Antikörper gegeben. Die Blndungsre- ^4> aktlon ließ man 20 Minuten fortschreiten. Dann wurden 150 μΐ einer Lösung aus 500 g/l Carbowax 6000-Polyäthylenglykol In 0.1 M TrIs-HCI. pH 8.0. zugegeben und das gebildete Protelnpreclpltat (einschließlich der »gebundenen Spezies«) wurde durch Zentrifugieren sedlmentlert. 350 μΙ Anteile der überstehenden Flüssigkeit (der »freien Spezies«) wurden In saubere 7x70 mm Reagenzgläser Überführt. Dazu wurde Wasserstoffperoxid gegeben und die Lichtmessungen wurden in der vorher angegebenen Weise vorgenommen. . "

Ergebnisse

Messungen von Llssamin-Rhodamin B durch Lichtbildung

Die Zugabe von bis-(2,4-DinItrophenyl)-oxalat zu dem Reaktionsgemisch, enthaltend Llssamln-Rhodamln B und Wasserstoffperoxid, benötigte 2 bis 4 Sekunden. Innerhalb von 5 bis 10 Sekunden erreichte die Llchtemlsslon Ihre maximale Intensität und nach 15 Sekunden war sie vollständig. Wurde der Oxalatester zu dem Wasserstoffperoxid ohne das Fluoreszlerungsrnittel zugegeben, so wurde Licht mit etwa dem gleichen Zeitverlauf wie oben angegeben erzeugt. Ohne das Interferenzfilter überlagerte dieses Licht Jen Fotodetektor, ausgenommen bei der niedrigsten Verstärkung. Das Interferenzfilter schnitt etwa 99,5'\, dieses Kintergrundllchtes heraus.

Bindungsreaktion zwischen Antikörper und dem Slsomlcln-Fluoreszlerungsmlttel-Konjugat

Eine bestimmte Menge des Slsomlcln-Fluoreszierungsmlttel-Konjugats wurde mit unterschiedlichen Mengen an Antlserum Inkubiert und dann wurden die gebundene und die ungebundene Form des Konjugats In der vorher erwähnten Welse getrennt. Die Menge des ungebundenen Konjugals (freie Spezies) wurde mittels der Llchtblldungsreaktlon gemessen. Das erzeugte Licht nahm In dem Mulle, wie die Menge des Antikörpers abnahm, zu 100 μΙ des Antlserums schienen 90% des Konjugats zu binden. Wurde Llssamln-Rhodamln B mit der gleichen Menge an Antlserum Inkubiert, so verringerte sich die I.lchterzeugung um etwa 20'\. Islehe nachfnlwmle Tabelle 1). Nicht Immunes Kaninchenserum verminderte glelchf.ills die Lichtproduktion durch das Slsomicin-Fluoreszlerungsnilttel, aber die Wirkung war merklich geringer als die mit der gleichen Menge des Antlserums beobachtete.

Tabelle 1 Antikörperbindung

an das Sisomicin-Fluoreszierungsmittel-Konjugat

60

Sisomicin- Fluoreszierungs- mittel	Lissamin- Rhodamin B	Anti- serum	nicht- immunes Serum	Licht produktion
(nM)	(nM)	(μΙ)	(μΐ)
_	_	_	_	119
-	-	IQ	-	158
-	-	100	-	160
-	-	-	10	140
-	-	-	100	2C5
375	-	-	-	919
375	-	5	-	851
375	-	10	-	670
375	-	20	-	580
375	-	50	-	485
375	-	100	-	241
375	-	-	10	865
375	-	-	50	745
375	-	-	100	796
-	125	-	-	1109
-	125	10	-	1142
-	125	100	-	895
-	125	-	10	1300
_	125	_	100	1136

65

Kompetitive Bindungsreaktionen (heterogene)

Unterschiedliche Mengen an Sisomicin und bestimmte Mergen des Slsomlcin-Fluoreszierungsmittel-K.onjugats lieli man mit einer begrenzten Menge des Antikörpers reagieren. Die Menge des ungebundenen Konjugats wurde nach der Lichtbildungsreaktion gemessen. Die

Llchiblldung nahm In clem Made zu. wie die Menge an Sisomicin erhöht wurde. Bei der größten verwendete Menge betrug die gemessene Llchlproduktlon 79'v, der in Abwesenheit des Antikörpers gemessenen.

Sisomicin konnte In Mengen von nur i,3 uMol nachgewiesen werden. Die Daten In Tabelle 2 zeigen, daß das Sisomicln-Fluoreszierungsmlttel-Konjugal spezifisch an den Antikörper gebunden ist.

Tabelle 2

!Competitive Bindungsuntersuchung für Sisomicin

Sisomicin-Fluoreszierungs-
miUel-konji'gal
(nM)

Sisomicin Antiserum

Lichtproduktion

ΙμΜ)

(μΙ)

375
375
375
375
375
375
375
375
375
375
375
375

0,025
0,050
0,125
0,250
0,625
1,25
5,00
10,30

iöO 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

250

360

370

1830

1840

580

550

530

540

560

550

620

870

1380

1520

Bindungsreaktionen Oberwacht ohne Trennung

des gebundenen Antikörpers und des ungebundenen

Slsomlcln-Fluoreszlerungsmittel-Konjugats

(homogene Untersuchung)

Unterschiedliche Mengen an Antiserum wurden mit bestimmten Mengen des Sisomlcln-Fluoreszlerungsmittel-Konjugats Inkubiert. Dann wurden die Reaktionsmischungen bei der !!einbildenden Reaktion ohne Trennung der antikörpergebundenen und ungebundenen Formen des Konjugats verwendet Die Ergebnisse In Tabelle 3 zeigen, daß die Lichtproduktion In dem Maße zunahm, wie die Antikörpermenge abnahm. Nlchtlmmunes Kaninchenserum hatte eine verhiiltnlsniiiliig geringe Wirkung auf die Lichtproduktion.

Es wurden konipetltlve Blndungsreaktionen mit unterschiedlichen Mengen an Sisomicin und bestimmten Mengen an Slsonilcln-Fhioreszlerungsinlttel-Konjuga! und Antiserum durchgeführt (Tabelle 3). Die Llchtproduktlon bei diesen Reakttonsmlschungen wurden ohne vorhergehende Trennung der gebundenen von der ungebundenen Form des Konjugats durchgeführt Zunehmende Mengen an Slcomlcln führten zu einer erhöhten Lichtproduktion, obwohl die Änderung der Llchtproduktlon nicht so ausgeprägt war wie die.'wenn eine Irennungsstufe eingeschlossen war.

Tabelle 3

!Competitive Bindungsuntersuchung für Sisomicin ohne vorhergehende Trennung der antikörpergebundenen und -ungebundenen Formen des Sisomicin-Fluoreszierungsmittel-Konjugats

Sisomicin- Lissamin- Siso- Anti- Licht-

Fluoreszierungs- Rhodamin B micin serum produktion

mittel

(nM) (nM) (μΐ) (μΐ)

- 125

125
125

375
375

375

375
375

375

-	-	140
-	100	170
-	-	1310
-	100	930
25	100	980
-	-	QlO
5	-	860
-	100	610
-	100	640
2,5	100	670
5	100	680
12,5	100	720
25	100	800

Claims

Patentansprüche:

1. Spezifisches Bindu!^untersuchungsverfahren zum Nachweis eines Liganden in oder der Ligandenbindungskapazitat von einem flüssigen Medium, bei dem das flüssige Medium mit einem Reagenzmittel vereinigt wird, das als einziges markiertes Konjugat eine mit einer fluoreszierenden Markierung versehene Bindungskomponente enthält, und durch die Verein!- gung ein Bindungsreaktionssystem gebildet wird aus einer gebundenen Spezies und einer freien Spezies des markierten Konjugats und bei dem die Menge der entweder in der gebundenen Spezies oder in der freien Spezies enthaltenen fluoreszierenden Markierung als Maß der Menge des Liganden oder der Llgandenbindungskapazität In dem flüssigen Medium gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die fluoreszierende Markierung dadurch anregt, daß man in Gegenwart der Markierung eine chemische Reaktion durchführt, deren Produkt eine hochenergiereiche Substanz ist, aus welcher Energie auf die Markierung übertragen wird und das durch die angeregte fluoreszierende Markierung emittierte Licht mißt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Oxalylchlorid, einem Oxamld oder einem bls-Oxalat Ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Reaktion eine Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Oxalylchlorid, einem Oxamld, ausgewählt aus Ι,Γ-Oxalyl-bMbenzimldazol), N,N'-Dimethyl-N,N'-<ilnitro-oxamld und N,N'-fs-(Phenylsulfonyl)-parabamat oder einem bis-Oxalatester, ausgewählt aus bis-(2,4-Dlnltrophenyl)-oxalat. bis-IPentachlorphenyD-oxalc;. bls-(4-Nltro-3-trifluormethylphenyD-oxalat, bls-(4-Nltro-2-formylphenyD-oxalat und bis-(Pentafluorphenyl)-oxalat, Ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Marklerung Llssamin-Rhodamin B, Rhodamln B, Fluorescein, 9,10-Dlphenylanthracen, Perylen, Rubren, Pyren oder ein fluoreszierendes Derivat davon ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszlerungsmarklerung Llssamln-Rhodamln B ist und die Anregung durch die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit einem bis-Oxalatester erfolgt.

6. Verfahren gemäß Anspruch S, dadurch gekennzeichnet, daß der bls-Oxalatester bls-(2,4-Dlnltrophenyl)-oxalat Ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine homogene Uniersuchur.gsmethode Ist, bei welcher die fluoreszierende Markierung in der vereinten gebundenen und freien Spezies des markierten Konjugats gemessen wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6 vom heterogenen Typus, dadurch gekennzeichnet, daß die gebundene Spezies und die freie Spezies des markierten Konjugats getrennt werden und daß die fluoreszlerende Markierung in einer der getrennten Spezies gemessen wird.

9. Reagenzmittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens einen Partner eines ehemischen Reaktionssystems umfaßt, welches ein Produkt bildet, das die fluoreszierende Markierung zur Emittierung von Licht anzuregen vermag.

10. Reagenzmittel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz (1) Wasserstoffperoxid oder ein chemisches System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid und (2) Oxalylchlorid, ein Oxamld oder einen bls-Oxalatester umfaßt.

11. Rengenzmlttel gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Oxamld ausgewählt ist aus l,I'-OxaIyI-bis-(benzlmldazol), N,N'-Dimethyl-N,N'-dlnltrooxamld und N,N'-bis-(PhenylsuIfonyl)-paraba- mat, und daß der bls-Oxalatester ausgewählt ist aus bis-(2,4-DinltrophenyI)-oxalat, bls-( Pentachlorphenyl)-oxalat, bis-(4-Nitro-3-trlfluormethyl-phenyI)-oxalat, bis-{4-Nitro-2-fonny!phenyI)-oxalat und bIs-(PentafiuorphenyD-oxalat.

is 12. Reagenzmittel gemäß einem der Ansprüche 9

bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Markierung Llssamin-Rhodamin B, Rhodamln B, Fluorescein, 9,10-DlphenylantWricen, Perylen, Rubren, Pyren oder ein fluoreszierendes Derivat davon ist.

13. Reagenzmittel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Markierung Lissamln-Rhodamln B Ist und daß das Reagenz (1) Wasserstoffperoxid oder ein chemisches System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid und (2) einen bls-Oxalatester umfaßt.

14. Reagenzmittel gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der bls-Oxalatester bls-(2,4-DinltrophenyD-oxalat ist.