DE2952498A1

DE2952498A1 - Spezifische bindungsuntersuchungsmethode zum nachweisen eines liganden in einem fluessigen medium und reagentien zur durchfuehrung der methode

Info

Publication number: DE2952498A1
Application number: DE19792952498
Authority: DE
Inventors: Robert Charles Boguslaski; Robert Joseph Carrico
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-01-18
Filing date: 1979-12-27
Publication date: 1980-07-24
Also published as: CA1133392A; GB2044449B; DE2952498C2; JPH0210382B2; GB2044449A; JPS5596458A; US4238195A

Description

HOlWMANN · ISITIjJL Sh PARI¹::Eli

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) ■ D IPl. -I NG. W. E ITLE - D C. RE K. NAT. K. HO FfMAN N ■ D I Pt.· I NG. W. IEH N

DIPL.-ING. K. rOCHSlE ■ DR. RER. NAT. B. HANSLN ARABEUASTP.ASSE < (STERNHAUS) · D-βΟΟΟ MÜNCHEN 81 · TE !.EFON (0C9) »11087 . TE IE X 05-79619 (PATH f)

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MIhES LABORATORIES INC., ELKJIART, INDIANA / USA

Spezifische Bindungsuntersuchungsmethodo zum Nachweisen eines Liganden in einem flüssigen Medium und Reagentien zur Durchführung der Methode

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Reagentien dafür der homogenen und heterogenen spezifischen Bindungsart zur qualitativen oder quantitaiven Bestimmung eines Liganden in oder der LigandenbJndungskapazität von einem flüssigen Medium. Die Erfindung betrifft insbesondere eine

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spezifische Bindungsuntersuchungsmethode mit einem verbesserten Fluoreszierungsmarkierungsmittel.

Bei üblichen spezifischen Bindungsuntersuchungsmethoden wird eine Probe des zu untersuchenden flüssigen Mediums mit einem Reagenz unterschiedlicher Zusammensetzung vereint. Solche Zusammensetzungen enthalten ein markiertes Konjugat aus einer Bindungskomponente, die mit einer Markierung versehen ist, wobei das markierte Konjugat mit gegebenenfalls vorhandenen anderen Bestandteilen des Reagenzes unter Bildung eines Bindungsreaktionssystems reagiert und zwar unter Ausbildung von zwei Spezies oder Formen des markierten Konjugats, nämlich einer gebundenen Spezies und einer freien Spezies. Die relativen Mengen oder Anteile des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies, verglichen zu denen in der freien Spezies, sind eine Funktion der Anv/esenheit (oder der Menge) des in der Probe nachzuweisenden Liganden oder der Ligandenbindun <jskapazität.

Zur Beschreibung soll eine übliche kompetitive Bindungsuntersuchungsmethode nachfolgend erläutert werden. Bei einer solchen Methode besteht das Reagenz aus (1) einem markierten Konjugat in Form des nachzuweisenden Liganden (z.B. einem Antigen oder Hapten), chemisch mit einer Markierung verbunden, und (2) einem spezifischen Bindungspartner für den Liganden (z.B. einem Antikörper). Bei Vereinigung der Probe und des Reagenzes würde der nachzuweisende Li gand und die Bindungskomponente des markierten Konjugats in einer im wesentlichen nicht-diskriminierenden V'eise im Wettbewerb um eine nicht-kovalente Bindung an den spezifischen Bindungspartner stehen. Als Ergebnis kann entweder die Menge des markierten Konjugats, die an den

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Bindungspartner gebunden wird (d.h. die, die sich mit der gebundenen Spezies ergibt) oder die Menge, die frei bleibt (d.h. die nicht an den Bindungspartner gebunden ist und somit die freie Spezies ergibt) als Funktion der Menge der in Wettbewerb stehenden vorhandenen Liganden gemessen werden. Die Menge an markiertem Xonjugat, die sich aus einer der beiden Spezies ergibt, wird durch die Messung, z.B. durch überwachung der darin vorhandenen markierten Komponente, bestimmt.

Wenn das markierte Konjugat in der gebundenen Spezies und das in der freien Spezies im wesentlichen durch die Mittel, die beim überwachen der Markierungskomponente verwendet werden, nicht unterscheidbar sind, müssen die gebundene Spezies und die freie Spezies physikalisch voneinander getrennt werden. Diese Art der Untersuchung wird als "heterogen" bezeichnet. Kann man die gebundene Spezies und die freie Spezies des markierten Konjugats unterscheiden, so erfolgt eine "homogene" Bestimmung, wobei die Trennstufe vermieden wird.

Die erste entdeckte Art einer hochempfindlichen spezifischen Bindungsuntersuchungsmethode war die Radiοimmunoassay, bei welcher radioaktive Isotopen als Markierungskomponente verwendet werden. Eine solche Untersuchungsmethode muss zwangsläufig die heterogene Methode anwenden, weil der überwachbare Charakter der Markierung qualitativ in der freien und in der gebundenen Spezies unverändert bleibt. Wegen der Unbequemlichkeit und der Schwierigkeit bei der Handhabung von radioaktiven Stoffen sind viele neue Untersuchungssysteme entwickelt worden, bei welchen man andere als Radioisotopen für die Markierungskomponente verwendet,

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einschliesslich Enzyme, Bakteriophage, Metalle und Organo- «etallkomplexe, Coenzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, zyklische Reaktanten, organische prostetische Gruppen, chemiluraineszente Reaktanten und fluoreszierende Moleküle.

Solche bisher entwickelten spezifischen Bindungsuntersuchungen, bei denen eine fluoreszierende Markierung verwendet wird, beruhen auf einer photogenen Anregung des Fluoreszierungsmittels, d.h. einer Anregung des Fluoreszierungsmittels durch Bestrahlung mit Licht auf einen energiereichen Zustand, bei dem es Licht emittiert. Das Fluoreszierungsiaittel kann gemessen werden, indem man das gesamte Licht oder einen Liehtpeak,der emittiert wird, oder irgendeine andere nachweisbare Eigenschaft des emittierten Lichtes, wie dessen Polarisierung, misst. Die Anforderung an das einfallende Licht für die Einleitung der Messung des Fluoreczierungsmittels ist sehr unvorteilhaft bei den bekannten üntersuchungsmethoden unter Verwandung von fluoreszierenden BindungsmitteIn. Bei der Messung muss man mechanische und elektronische Instrumente anwenden, um mit dem Problem des störenden Hintergrundlichtes aus einfallender Strahlung fertig zu werden. Andere spezifische Bindungsuntersuchungsmethoden, die man bisher entwickelt hat, verwenden chemilumineszente Markierungen, d.h. solche, bei denen Licht durch eine chemische Reaktion produziert wird. Eine einfallende Strahlung ist hier nicht erforderlich, um das Überwachungssystem bei diesen üntersuchungsmethoden zu initiieren, jedoch ist die Empfindlichkeit solcher chemiluinineszenter Bindungsuntersuchungsmethoden zur Zeit nt>ch theoretisch begrenzt, weil das als Markierung verwendete Material gemäss dem Stand der Technik unabdingbar ein bei der 1ichtproduzieren_a den Reaktion verbrauchbarer Reaktant ist. Weiterhin sind

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Bindungsuntersuchungen auf Basis von chemilumineszenten Verbindungen im allgemeinen empfindlich gegenüber einer Beeinflussung der Lichtproduktion durch Proteine.

Der Stand der Technik, hinsichtlich der vorerwähnten Fluoreszierungs- und Chemilumineszenzbindungsuntersuchungsmethoden, wird nachfolgend hinsichtlich der entsprechenden Veröffentlichungen näher erläutert.

Das grundlegende Konzept hinsichtlich der Verwendung von Fluoreszierungsmitteln als Markierungen in spezifischen Untersuchungsmethoden wird in US-PS 3 720 760 erläutert. Hierbei werden Fluoresceinderivate, insbesondere Fluoresceinisothiocyanat, als Markiefungsmittel beschrieben. Bei einer solchen Untersuchung würde man übliche fluorometrische Methoden zur überwachung der Markierung anwenden. Das Fluoreszierungsmittel kann durch Bestrahlen mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt werden und dns fluoreszierte Licht, das bei unterschiedlichen Wellenlängen auftritt, wird gemessen. Es wurden verschiedene Verbesserungen der grundlegenden Fluoreszenzbindungsuntersuchungsmethoden entwickelt und diese werden in den US-PSen 3 992 631, 3 999 948, 4 O2O 151, 4 025 31O, 4 036 946 und 4 058 732 beschrieben. Diese Fluoreszierungsmittelmethoden bauen auf heterogenen Methoden auf, d.h. dass die Markierung in der gebundenen oder der freien Spezies nach deren Trennung gemessen wird.

Eine Reihe von Fluoreszierungsraittelbindungsuntersuchungen der homogenen Art sind entwickelt worden, wodurch man die im allgemeinen nachteilige Trennstufe vermeiden kann. Ein solches Verfahren ist die Fluoreszenzpolarisierungsmethode

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gemäss US-PS 4 115 699, die darauf beruht, dass bei der Bestrahlung mit polarisiertem Licht von gewissen Fluoresziorungsmittel-Ligand-Konjugaten, wenn diese an einen Bindungspartner (z.B. einen Antikörper) gebunden sind, eine Lichtemission eintritt, die eine unterschiedliche Polarisierung hat. Auf diese Weise können die gebundene und die freie Spezies in dem markierten Konjugat wirksam durch eine Uberwachungsreaktion unterschieden werden.

Eine andere homogen Fluoreszierungsmittel verwendende Bindungsuntersucnungsmcthode beruht auf einem Auslöschen oder Verstärken der Fluoreszenz beim Binden des Fluoreszierungsmittel-Liganden-Kcnjugats durch dessen Bindungspartner. Beispiele iür diese Methode werden in der BE-PS 858 722 und der DE-OS 27 16 276 und 27 16 515 beschrieben. Eine Variation diener Untersuchungsmethoden wird in US-PS 3 S96 345 beschrieben, bei der eine spezifische auslöschende Substanz air» Gegenpart zu einer fluoreszierenden Markierung verwendet wird.

CbemiluiTiinoGzente Bindungsuntersuchungsmethoden werden in der US-PS 4 104 029 und den US-Patentanmeldungen 894 836 und 894 838 vom 10. April 1978 der vorliegenden Anmelderin beschrieben. Wie schon vorher dargelegt, werden bei den Untersuchungsmethoden auf Basis von chemilumineszenten Verbindungen verbrauchbare Reaktanten als Markierung verwendet und dadurch wird theoretisch die Empfindlichkeit limitiert. Ausserdem v/erden diese Methoden durch Proteine unzuverlässig.

Eine gewisse Ähnlichkeit zu der vorliegenden Erfindung findet sich in US-PS 3 689 391; Rauhut et al, J. Am. Chem.

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Soc. 88:3604 (1966); Rauhut et al. Accounts of Chem. Res. 2:80 (1969); und Maulding et al, J. Org. Chem. 33:250 (1968). Dort wird eine fotochemische Reaktion in Abwesenheit von äusserem Licht durch chemische, thermische oder elektrische Anregung eines chemilumineszenten Materials eingeleitet. Die Anwendung dieses Phänomens auf analytische Methoden wird in diesen Druckschriften nicht beschrieben, die schon vor den Druckschriften, die Fluoreszierungsmitteluntersuchungsmethoden betreffen, veröffentlicht wurden.

Es wurde nun gefunden, dass man fluoreszierungsirdttelmarkierte spezifische Bindungsuntersuchungsmethoden vorteilhaft überwachen kann, ohne dass eine fotogene Anregung erfolgt, indeja man chemische Mittel zum Anregen des fluoreszenten Markierungsmittel verwendet. Die Erfindung betrifft deshalb eine Verbesserung bei einer spezifischen Bindungsuntersuchungsraethode zum Bestimmen eines Liganden in oder eier Ligandenbindungskapazität von einem flüssigen Medium, bei dem das flüssige Medium mit einem Reagenz vereint wird, welches ein markiertes Konjugat enthält aus einer Bindungskomponente, inkorporiert mit einer fluoreszenten Markierung, wobei die Kombination ein Bindungsreaktionssystem bildet aus einer gebundenen Spezies und einer freien Spezies des markierten Konjugats und die Menge der fluoreszenten Markierung entweder in der gebundenen oder der freien Spezies eine Funktion der Gegenwart oder der Menge des Liganden oder der Ligandenbindungskapazität in dem flüssigen Medium ist und wobei man die Markierung in einem oder beiden der Spezies des markierten Konjugats misst. Die Verbesserung besteht darin, dass man in der Messstufe die Markierung chemisch anregt, damit diese Licht emittiert, worauf man dann das von dem angeregten Fluoreszierungsmittcl emittierte Licht misst. Die fluoreszente

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Markierung wird vorzugsweise dadurch angeregt, dass man sie einer Substanz aussetzt, die in der Lage ist, eine solche Anregung und Lichtemission zu verursachen, z.B. indem man sie einem hochenergiereichen Zwischenreaktionsprodukt, das in Gegenwart der Markierung durch Umsetzung von Wasserstoffperoxid und Oxalylchlorid, einem Oxamid oder einem bis-Oxalatester gebildet wird, aussetzt. Bei der vorliegenden Untersuchungsmethode kann eine der üblichen homogenen odcrr heterogenen Untersuchungsmethoden angewendet werden.

Das verbesserte Reagenz besteht aus Reagentien, die für das anqiewendete Bindungtjreaktionssystem geeignet sind und in Kombination mit chemischen Mitteln zur Erzeugung einer hochenergiereichen Substanz, die in der Lage ist, das Fluoreszjcrungsmarkierungsmittel anzuregen, d.h. aus einer Vielzahl von Reaycntien, die reagieren unter Bildung eines hochenergiereichen Zwischenreaktionsproduktes. Gemüss einer bevorzugten Ausführungsform umfassen solche Mitte] (1) Wasserstoffperoxid oder ein übliches chemisches System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid und (2) Oxalylchlorid , ein Oxamid oder einen bis-Oxalatester.

Erfindungsgemäss wird die Uberwachungsreaktion in dem speziellen gewünschten Bindungsreaktionssystem (d.h. in der abgetrennten gebundenen oder freien Spezies, wenn man eine heterogene Methode durchführt, oder bei der vereinten Spezies, bei einer homogenen Methode)durchführt indem man das Reagenz, das untex Bildung eines hochenergierciichen Reaktionsproduktes reagiert und in der Lage ist. Energie auf die Fiuoreszierangsmarkierung zu übertragen und diese in den angeregten. Zustand zu bringen, zugibt. Wenn

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man die Anregung des Fluoreszierungsmittels in Richtung des Grundzustandes der Energie abnehmen lässt, wird Energie in Form von Licht emittiert. Zum Beispiel können Wasserstoffperoxid und verschiedene reaktive bis-Oxalatester in Form eines hochenergiereichen Zwischenproduktes reagieren,von dem man annimmt, dass es entweder 1,2-Dioxäthandion oder aktiviertes Kohlendioxid ist. Dieses Zwischenprodukt überträgt Energie auf das Fluoreszierungsmittel, v/elches anschliessend Licht mit einem Spektrum emittiert, das im wesentlichen seinem normalen Fluoreszenzspektrum entspricht. Diese Gesamtreaktion kann wie folgt beschrieben werden:

0 0

ir H

H₇O₀ + R-O-C-C-O-R + Fluoreszierungsmittel >

Licht (htf) + 2 R-OH + 2CO₂ f Fluoreszierungsmittel

worin R einen organischen Rest, im allgemeinen Aryl, und hv elektromagnetische Strahlung im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Bereich bedeutet. Wie in der Reaktionsgleichung gezeigt wird, ist die Fluoreszierungsmarkierung weder ein verbrauchbarer Reaktant noch wird er während der Reaktion in irgendeinerweise chemisch verändert.

Die vorliegende Erfindung hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber den bekannten Fluoreszenz- und Chemilumineszenzbindungsuntersuchungsmethoden. Ein Vorteil besteht darin, dass verhältnismässig einfache Nachweisinstrumente verwendet werden können und dass infolgedessen die Notwendigkeit einer Lichtquelle, von Bandenfiltern und Vorrichtungen, um die

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Streuung des einfallenden Lichtes auf den Fotodetektor zu korrigieren, wie man sie bei fluorometrischen Messungen benötigt, überflüssig werden. Ein weiterer Vorteil gegenüber dem üblichen fluorometrischen Nachweis ist der, dass kein einfallendes Licht benötigt wird, um die Lichtproduktion zu initiieren und dass alles gebildete Licht, ohne Wellenlängenbeschränkimg,' gemessen werden kann. Ein theoretischer Vorteil gegenüber den Chemilumineszenzbindungsuntersuchungen des Standes der Technik besteht in einer verbesserten Empfindlichkeit aufgrund der Tatsache, dass sich die Markierung nicht wie ein verbrauchbarer Reaktant benimmt. Da ausserdein eine Vielzahl von Fluoreszierungsmarkierungen mit unterschiedlichen Maxima für ihre jeweilige Lichtend ss ion für die Bestimmung von unterschiedlichen Liganden verwendet werden kann, können gleichzeitig viele Untersuchungen durchgeführt werden. Ausserdein besteht beim vorliegenden Untersuchungsverfahren auch nicht das Problem hinsichtlich des Protein--"Quenching" , wie es bei den Chemiluminenzenzuntersuchungen des Standes der Technik der Fall ist.

Im folgenden werden folgende Begriffe mit den nachfolgenden Bedeutungen, wenn nicht anders angegeben, verwendet: "Ligand" ist eine Substanz oder eine Klasse von verwandten Substanzen, deren Gegenwart oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; "spezifischer Bindungspartner des Liganden" ist jede Substanz oder Klasse oder Unterklasse, die eine spezifische Bindungsaffinität zu dem Liganden im Gegensatz zu anderen Substanzen hat; "spezifisches" B'indüngsanarög des Li'gänden¹* ist jede Substanz oder Klasse einer Substanz, die sich im wesentlichen wie der Ligand im Hinblick auf die Bindungsaffinität des spezifischen

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Bindungspartners des Liganden verhält; und "Reagenz" oder "Reagenzmittel" ist eine Zusammensetzung, eine Vorrichtung oder ein Untersuchungsset, das die Reagentien zur Durchfüh- ' rung der erfindungsgemässen Untersuchungsmethode enthält.

Die vorliegende Untersuchung kann zum Nachweis von allen Liganden verwendet v/erden, für die ein spezifischer Bindungspartner vorhanden ist und infolgedessen für den Nachweis der Kapazität eines Flüssiginediums einen Liganden (im allgemeinen aufgrund der Gegenwart eines Bindungspartners für den Liganden in dem Medium) zu binden. Der Ligand ist im allgemeinen ein Peptid, Protein, Kohlehydrat, Glykoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Molekül, für welches in einem biologischen System ein spezifischer Bindungspartner vorliegt oder synthetisiert werden kann. Der Ligand ist, funktionell ausgedrückt, im allgemeinen aus der Gruppe bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu, Haptenen und Antikörpern dazu, Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmakologischen Mitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen ausgewählt. Beispiele für Liganden sind immunologisch aktive Polypoptide und Proteine mit einem Molekulargewicht zwische 1.000 und 4.000.000, z.B. Antikörper und Antigene, Polypeptide und Proteine sowie auch Haptene mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1.500. Beispiele für solche antigenen Polypeptide sind Angiotension I und II, C-Peptide, Oxytocin, Vasopressin, Neurophysin, Gastrin, Secretin und Glucagon. Beispiele für antigene Proteine sind Insulin, chorionisches Gonadotropin (z.B. HCG), carcinoürr.bryonisches /\ntigen (CEA), Myoglobin, Hämoglobin, follikelstimulierendes Hormon, humanes Wachstumshormon, thyroidstiitiulierendes Hormon (TSH) , humanes placentales Lactogen, Thyroxinbindungsglobulin (TBG), Intrinsikfaktor,

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Transcobalamin, Enzyme, wie Alkaliphosphatase und Milchsäuredehydrogenase und hSpatitisassoziierte Antigen, wie Häpatitis B Oberflächenantigen (HB Ag), Häpatitis B e-Antigen (HB Ag) und Häpatitis B Kernantigen (HB Ag). Beispiele für Antikörperliganden sind solche Antikörper der IgG, IgE, IgM und IgA Klassen, die spezifisch für alle der hier beschriebenen Antigene oder Haptene sind. Haptenliganden sind z.B. Thyroxin, Liothyronin, Östrogene, wie östriol, Prostaglandine, Vitamine, wie Biotin, Vitamin K.-i Folsäure, Vitamin E, Vitamin A und Ascorbinsäure (Vitamin C) und Arzneimittel, wie Carbamezepin, Chinidin, Digoxin, Digitoxin, Theophyillin, Phenobarbital, Primidon, Dipheny.lhydanthion, Morphin, Nikotin und dergleichen.

Das zu untersuchende Medium kann eine natürlich oder künstlich gebildete Flüssigkeit sein, von welche man annimmt, dass sie den Liganden oder eine Bindungskapazität dafür enthält und sie ist im allgemeinen eine biologische Flüssigkeit oder eine Verdünnung davon oder ein Behandlungsprodukt einer solchen biologischen Flüssigkeit. Biologische Flüssigkeiten, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren untersucht werden können, sind z.B. Serum, Plasma, Urin, Speichel und amni©tische und cerebrospinale Flüssigkeiten. Andere Stoffe, wie Feststoffe, z.B.Gewebe, können untersucht werden, indem man sie in eine Flüssigform bringt, z.B. durch Auflösen des Feststoffs in einer Flüssigkeit oder durch Flüssigextraktion des Feststoffs.

Das erfindungsgemäss verwendete fluoreszierende Mittel kann jede fluoreszierende Substanz sein, d.h. jede Substanz, die bei Erregung zu einem hochenergiereichen Zustand, wie bei Bestrahlung oder beim Aussetzen gegenüber einem

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hochenergiereichen Reaktionsprodukt, wie bei der vorliegenden Erfindung, anschliessend strahlt oder Licht emittiert. Das Phänomen der Fluoreszenz, wie es bekannt ist, ist das Ergebnis von Veränderungen des Energiezustandes von Elektronen in der Elektronenkonfiguration des fluoreszierenden Mittels. Im Falle der Anregung durch einfallendes Licht einer bestimmten Energie (d.h. innerhalb eines bestimmten Wellenlängenbereiches), werden Elektronen zu einem Zustand hoher Energie angeregt und beim Nachlassen des energiereichen Zustandes gehen sie a-af ein niedrigeres stabileres Niveau über und Energie wird in Form von Licht emittiert. Wegen des damit verbundenen Energievex-lustes in Form von anderen Energien als Licht während der Fluoreszenz, hat das emittierte Licht im allgemeinen eine niedrigere Energie und infolgedessen eine längere Wellenlänge als das einfallende Licht.

Von den üblichen fluoreszierenden Mitteln werden besonders solche bevorzugt, die eine organische Struktur haben, die leicht an eine Bindungskomponente in dem jeweils zu verwendenen Bindungsreaktionssystem unter Bildung des benötigten markierten Konjugats gekuppelt wird. Beispiele für solche bevorzugten fluoreszierenden Mittel sind Lissamin-Rhodamin B, Rhodamin B, Fluorescein, 9,10-Diphenylanthracen, Perylen, Ruben, Pyren oder fluoreszierende Dericate davon, wie das isocyanat, Isothiocyanate, Säurechlorid oder Sulfonylchloridderivate. Das fluoreszierende Mittel wird an das für die Untersuchung ausgesuchte Bindungsmittel, geh-uppelt (diese Komponente ist im allgemeinen der liig-and, "ein"spezifisches Bindungsanalog des

Liganden oder ein spezifischer Bindungspartner des Liganc|en, wie nachfolgend noch beschrieben wird) , wobei die

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Bindung direkt erfolgen kann oder, wie dies meistens vorkommt, über eine Brückengruppe, so dass die gewünschte Fluoreszenzeigenschaft der Fluoreszenzmarkierung in dem markierten Konjugat erhalten bleibt. Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik umfasst eine solche Brückengruppe im allgemeinen 1 bis 50 und im allgemeineren etwa 1 bis 15 Kohlenstoffatome oder Heteroatome (z.B. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor) in der Kette. Als eine chemische Gruppe hat die Brückengruppe im allgemeinen ein Molekulargewicht, das 1.000 nicht übersteigt und im allgemeinen weniger als 200 beträgt. Die genaue chemische Struktur der Brückengruppe, die Bindungen zwischen der Fluoreszenzmarkierung und der Bindungskomponente und die jeweiligen Endgruppen der Brückengruppe !längen von der genauen Art des fluoreszierenden Mittels und der verwendeten Bindungskomponente ab. Das synthetische Kupplungsverfahren, bt:i dem die flucrenzenzmarkierte Bindungnkomponente (d.h. das markierte Konjugat) gebildet wird, ist bekannt.

Die Herstellung von hochenergiereichen Zwischenreaktionsprodukten, die in der Lage sind, die Fluoreszenzmarkieruny anzuregen, ist bekannt. Solche Zwischenprodukts können z.B. durch Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit Oxalylchlorid; Oxaniid, wie 1 ,1 '-Oxalyl-bis-(benzimidazol) , N,N'-Diniethyl-Ν,Ν¹-dinitrooxamid und N,N¹ -bis- (Phenylsulfonyl) parabamat, gebildet werden oder bis-Oxalatester, wie bis-(2,4-DiniLrophenyl)-oxalat, bis-(Pentachlorphenyl)-oxalat, bis-(4-Nitro-3-trifluormethylphenyl)-oxalat, bis-(4-Nitro-2-formylphenyl)-oxalat und bis-(Pentafluorphenyl)-oxalat. Beispiele für den Stand der Technik beschreibende Druckschriften, die die Anregung des fluoreszierenden Mittels

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durch chemische Reaktionsprodukte beschrieben, sind: US-PS 3 689 491, Rauhut et al. "A Study of Oxalic Ester Chemiluminescent Reactions", United States Department of Commerce, Nationcil Technical Information Service Report AD-775,882; Maulding et al, J. Org. Chem. 33:250 (1968); Rauhut et al, J. Am. Chem. Soc. 88:3604 (1966); und Rauhut et al, Accounts of Chem. Res. 2:80 (1969).

Wie schon dargelegt, kann die vorliegende Untersuchungsmethode alle üblichen homogenen oder heterogenen Untersuchungsmethoden umfassen. Nachfolgend wird ein kurzer Überblick überdie verschiedenen Arten der homogenen und heterogenen Untersuchungsmethoden gegeben.

Eine homogene Untcrcuchungsmethode, d.h. eine Untersuch ungs-· methode;, bei der keine physikalische Trennung der gebundenen Spezies und der freien Spezies benötigt wird, ist möglich, wenn die Umsetzung zwischen der Bindungskomponente in dom markierten Konjugat und einem entsprechenden Bindung.spartner eine messbare Veränderung ergibt, entweder im positiven oder negativen Sinne, hinsichtlich des durch die Fluoreszenzmarkierung bei der chemischen Anregung emittierten Lichtes. In diesem Falle kann man die Verteilung der Fluoreszenzmarkierung zwischen der gebundenen Spezies und der freien Spezies feststellen, indem man das Reagenz, das benötigt wird um ein hochenergiereiches Zwischenprodukt zu bilden, direkt zu den vereinten Spezies zugibt und das emittierte Licht misst (im allgemeinen ausgedrückt als Gesamtlicht odej- als Peakintensität). Es gibt

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eine Reihe von manipulativen Methoden, um eine homogene Untersuchung durchzuführen, wobei die bekanntesten Methoden die Direktbindungs- und die kompetitive Bindungstochnik sind. ·

Bei der Direktbindungstechnik wird ein flüssiges Medium, von dem man annimmt, dass es den nachzuweisenden Liganden enthält, mit einem Konjugat, das die Fluoreszen2mar·- kierung gekuppelt an einen spezifischen Bindungspartner des Liganden enthält, in Berührung gebracht und jede Veränderung der Lichtemission durch die Fluoreszenzmarkierung wird aufgezeichnet. Bei der kompetitiven Bindungstechnik wird das flüssige Medium mit einem spezifischen Bindungspartner aus Liganden in Berührung gebracht sowie mit einem markierten Konjugat, umfassend die Fluoreszenzmarkierung, gekuppelt an den Liganden oder an ein spezifisches Bindungsanalog davon, und anschliessend wird jede Veränderung der Lichtemission durch die Fluoreszenzmarkierung aufgezeichnet. Bei beiden Verfahren wird die Fluoreszenzmarkeirung gemessen, indem man das flüssige Medium mit. den Reagentien, die unter Bildung von hochenergiereichen Zwischenprodukten für die Anregung der Markierung reagieren, in Berührung bringt. Die qualitative Bestimmung des Liganden in dem Medium führt man durch, indem man die Lichtemission bei der Untersuchung des flüssigen Mediums mit der in einem flüssigen Medium vergleicht, welches bekannte Mengen des Liganden enthält.

im allgemeinen kann man bei der Durchführung der homogenen Untersvichungstechnik die Komponenten für die spezifische Bindungsreaktion, d.h. das flüssige Medium, von dem man annimmt, dass es dftn Liganden enthält, das markierte Konjugat und/oder einen spezifischen Bindungspartner des Liganden

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in allen Mengen, auf jede Art und in jeder Reihenfolge vereinigen, unter der Voraussetzung, dass die Lichtemission der Fluoreszenzmarkierung merkbar verändert wird, wenn das flüssige Medium den Liganden in einer für die Zwecke der Untersuchung ausreichenden Menge oder Konzentration enthält. Vorzugsweise sind alle Komponenten bei der spezifischen Bindungsreaktion in dem flüssigen Medium löslich.

Wendet man die direkte homogene Bindungstechnik an, so sind die Komponenten in der Bindungsreaktion das flüssige Medium, von dem man annimmt, dass es den Liganden enthält, und eine Menge eines Konjugats, enthaltend die Fluoreszenzmarkierung, gekuppelt an einen spezifischen Partner des Liganden. Die Lichtemission des konjugierten fluoreszenzgebenden Mittels verändert sich bei Berührung mit dem flüssigen Medium (im allgemeinen umgekehrt) innerhalb des Ausmasses der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner in dem markierten Konjugat. Das heisst, dass beim Ansteigen der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Lichtemission aus dem konjugierten fluoreszierenden Mittel im allgemeinen abnimmt.

Wendet man eine homogene kompetitive Bindungstechnik an, so sind die Komponenten der Bindungsreaktion das flüssige Medium, von dem man annimmt, dass es den Liganden enthält, eine Menge eines Konjugats aus einer fluoreszierenden Markierung, gekuppelt an den Liganden oder an ein spezifisches Bindungsanalog des Liganden, und eine Menge des spezifischen Bindungspartners des Liganden. Der spezifische Bindungspartner wird gleichzeitig oder nacheinander mit dem markierten Konjugat oder dem flüssigen Medium in Berührung gebracht. Da alle Liganden in dem flüssigen Medium

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im Wettbewerb stehen mit dem Liganden oder dem spezifischen Bindungsanalog davon in dem markierten Konjugat, um sich mit dem spezifischen Bindungspartner zu verbinden, verändert sich die Lichtemission des konjugierten fluoreszierenden Mittels bei Berührung mit dem flüssigen Medium (im allgemeinen direkt) in dem Ausmasse der Bindung zwischen dem Liganden in dem flüssigen Medium und dem spezifischen Bindungspartner. Das heisst, dass beim Ansteigen der Menge des Liganden in dem flüssigen Medium die Lichtemission aus dem konjugierten fluoreszierenden Mittel im allgemeinen auch ansteigt.

Die Bestimmung der Ligandenbindungskapazität eines flüssigen Mediums (d.h. die Gegenwart eines spezifischen Bindungspartnois dos Liganden in einem flüssigen Medium) kann durch eine homogene Technik erfolgen, indem man das flüssige Medium mit einem Konjugr^t aus der fluoreszierenden Mai'kiex'ung, gekuppelt an den Liganden oder einem spezifischen Bindungsanalog davon, in Berührung bringt. Die Lichtemission des konjugierten fluoreszierenden Mittels bei Berührung mit dem flüssigen Medium verändert sich (im allgemeinen umgekehrt ) mit dem Grau der Bindung zwischen der Bindungskapazität des flüssigen Mediums und dem Liganden oder dessen Analog in dem markierten Konjugat, ähnlich zu der Bindung bei der direkten Bindungstechnik zur Bestimmung des Liganden in der vorher angegebenen Weise.

Die Verwendung einer fluoreszierenden Markierung kann auch bei der üblichen heterogenen Untersuchungsmethode angewendet werden, bei welcher die gebundene und die freie Spezies des markierten Konjugats getrennt und die Menge der Markierung der einen oder der anderen bestimmt wird. Die Reagentien

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zur Bestimmung bei einer solchen heterogenen Untersuchung können viele Formen annehmen. Im allgemeinen besteht ein solches Mittel aus zwei Grundbestandteilen, nämlich (1) einem spezifischen Bindungspartner des Liganden und (2) einem markierten Konjugat, das normalerweise eine markierte Form von (a) des Liganden, (b) einem spezifischen Bindungsanalog des Liganden oder (c) des spezifischen Bindungspartners ist. Die Bindungsreaktionsbestandteile werden gleichzeitig oder nacheinander mit dem zu untersuchenden flüssigen Medium vereint und nach einer angemessenen Inkubationszeit wird das markierte Konjugat an seinen entsprechenden kompetitiven Bindungspartner gebunden, so dass das Ausmass der Bindung, d.h. das Verhältnis der Menge des markierten Konjugats, gebunden an einen Bindungspartner (gebundene Spezies) , zu der ungebundenen (freien Spezicf;) eine Funktion der Menge des vorhandenen Liganden ist. Es fo)yt eine kurze Beschreibung einiger der verschiedenen heterogenen Bindungsinethoden, die bei der Durchführung des erfinduncjijgemässen Verfahrens angewendet werden können. Für das nachfolgende Diagramm ist folgende Legende anzuwenden:

Symbol^ Definition:

L in der Probe nachzuweisender Ligand

Ligand oder spezifisches Bindungsanalog davon B Bindungspartner für den Liganden

Markierung, d.h. fluoreszierendes Mittel unlösliche Phase

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> Inkubationszeit

(sep) geeignete Trennung der gebundenen und der ■ freien Spezies

(lim) limitiert; anwesend in einer geringeren Menge als an die gesamten verfügbaren Bindungsstellen unter den ausgewählten Reaktionsbedingungen während der ausgewählten Inkubationszeit gebunden werden kann, d.h. den Bestandteil, mit dem die anderen Bestandteile hinsichtlich der Bindung im Wettbewerb stehen

(exe) überschuss; anwesend in einer Menge, die grosser ist als für die Bindung an die gesamten verfügbaren Bindungsstellen unter den ausgewählten Reaktionsbedingungen während der ausgewählten Inkubationszeit benötigt wird.

(1) Kompetitive heterogene Methoden

(a) I.» + Ch) + B (lim) >+ unlöslichinachendes

Mittel für B oder

L)* (sep)

Dies ist die klassische kompetitive Bindungsmethode. Beispiele für unlöslichmachende Mittel sind spezifische nnsfallnndp. Antikttrp^r- spezifische unlüslichmachehde Antikörper und wenn B oder (lJ* ein proteinhaltiges Material ist, Proteinausfaller, Wie Ammoniumsulfat, oder wenn B oder (ΐΛ ein kleines adsorbierbares

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Molekül ist, dextranbeschichtete Aktivkohle. Eine Beschreibung ähnlicher Systeme findet sich in Biochem. J. 88:137 (1973) und US-PS 3 839 153,

(b) L + Q* + l-B(lim) » (sep)

Diese Methode wird im allgemeinen als Festphasentechnik bezeichnet. Eine Beschreibung entsprechender Raioimmunoassay- und Enzymimmunoassay-Methoden findet sich in den US-PSen 3 505 019, 3 555 143, 3 646 346 und 3 654 090.

(c) L + B* + HL (lim) > (sep)

siehe US-PS 3 654 090

(d) L + H-L + B* (lim) » (sep)

siehe US-PS 3 950 752

Weitere Einzelheiten hinsichtlich der heterogenen kompetitiven Bindungsinethoden finden sich in Skelley Clin. Chcm. 19(2):146-186 (1973).

(2) Stufenweise gesättigte heterogene Methoden

(a) L + B(exe) > +(^)*(sxc) > + unlöslichma-

chendes Mittel für B oder tsep)

Bei der stufenweisen Sattigungsaiethode werden einige oder alle der Bindungsstellen an B, die nach der ersten Inkubationszeit zurückbleiben.

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an den markierten Bestandteil gebunden.

(b) L + [-B(exc) > + (T)* (exe) * (sep)

Beschreibung von ähnlichen Radioimmunoassay- und Enzymimmunoassay-Methoden finden sich in US-PS 3 720 760 und J. Immunol. 209:129 (1972)

(c) L + B* (exe) * + hL(exc) > (sep)

(3) "Sandwich"-heterogene Methode

(a) L + J-B (exe) > + B (exe) > (sep)

Bei der Sandwichmethode werden einige oder alle der Liganditioleküle an den unlöslich gemachten Bindungspartner des markierten Bestandteils gebunden.

siehe: US-PSen 3 720 760 und 3 867 517 und Haberman, Z. C3in. Chem. u. Clin. Biochem. 8:51-55 (1970)

(b) L + B (exe) > HB (exe) >· (sep)

Dies ist die sogenannte "umgekehrte" Sandwichmethode, sie US-PS 4 098 876.

Eine weitere Diskussion der bei der üblichen heterogenen Untersuchungsmethode auftretenden Parameter, wie eine ausführlichere Besehreibung der Untersuchungsmethoden und alternative; TiejijtititiLliOtloii Γίηαϋΐι sich in Principles ΰΓ CoiiipuLiLiv« Protein-Binding Asssys, ed. Odell and Daughaday, J.B. Lippincott Co. (Philadelphia T972) und Radioimmunoassay Methods, ed. Kirkham and "Hunter, Churchill Livingstone (Edinburgh (1971).

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Es ist selbstverständlich, dass manipulative Schemata, bei denen eine andere Reihenfolge der Zugabe und andere Bindungsreaktionsmethoden vorkommen, für die Durchführung einer · homogenen und heterogenen spezifischen Bindungsuntersuchungsmethode angewendet werden können, ohne dass man von der vorliegenden Erfindung abweicht.

Die Reagenzmittel der vorliegenden Erfindung umfassen alle wesentlichen chemischen Elemente, die zur Durchführung einer gewünschten Untersuchungsmethode bei der vorliegenden Erfindung benötigt v/erden. Die Reagenzmittel liegen in einer geeigneten Verpackungsform vor, z.B. als eine Zusammenstellung, oder in Mischung, wenn es die Verträglichkeit der Reagentien möglich macht, in einer Anordnung für den Test oder als ein Untersuchungsset, d.h. einer verpackten Kombination eines Behälters, welcher die erforderlichen Reagentien enthält. Eingeschlossen in die Reagenzmittel sind Reagentien wie sie für das Bindungsreaktionssystem benötigt werden, wobei immer ein markiertes Konjugat der vorher angegebenen Art erforderlich ist. Solche Bindungsreaktionsreagentien können zusätzlich zu dem markierten Konjugat einen Bindungspartner für den Liganden und dergleichen einschliessen. Wird eine heterogene Bindungsmethode angewendet, so können mit den Bindungsreaktionsreagentien ein unlöslichmachendes Reagenz und ein chemisches Mittel,um entweder die gebundene oder die freie Spezies unlöslich zu machen, eingeschlossen sein.

Beispielsweise würde ein typischer Set eines Bindungsreaktionsreagenzes zur Durchführung einer homogenen kompetitiven Bindungsuntersuchuo^ für einen Antigenliganden (1) eine fluoreszieruTigsmittelmarkierte Form des Liganden oder eines

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Bindungsanalogs davon und (2) einen Antikörper oder ein Antigen enthalten. Ein typischer Set von Reagentien für einen Antigenliganden für eine heterogene kompetitive Bindungsuntersuchung würde (1) eine fluoreszierungsmittelmarkierte Form des Liganden oder eines Bindungsanalogs davon und (2) eine unlöslichgemachte Form des Antikörpers oder dos Antigens enthalten. Die sehr zahlreichen möglichen Veränderungen der Bindungsreaktionsreagentien und die Formen, in denen diese auf den Markt kommen können, sind dem Fachmann vertraut und in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.

Ausser den vorerwähnten Bindungsreaktionsreagentien können die vorliegenden Reagenzmittel auch die zuvor beschriebene Vielzahl an Reagenticn enthalten, die in Gegenwart der fluoreszierenden Markierung reagieren unter Bildung von hochenorgiereichen Zwischenreaktionsprodukten, welche daraufhin die Markierung in einem hochenergiereichen Zustand anregen und die Emittierung von Licht verursachen. Vorzugsweise besteht diese Vielzahl an Reagentien aus (1) Wasserstoffperoxid oder irgendeinem üblichen chemischen System, welches Wasserstoffperoxid erzeugt und (2) Oxalylchlorid, einem Oxamid oder einem bis-Oxalatestcr, wobei die letzteren beiden Verbindungsklassen die bevorzugten zuvorbeschriebencn Spezies einschliesst.

Selbstverständlich können die Reagenzmittel noch weitere Reagentien enthalten, die aus dem Stand der Technik bekannt sind und clic aus technischen oder anwendung»technischen Gesichtspunkten wünschenswert sind, z.B. Puffer, Verdünnungsmittel, Standards und dergleichen. Das heisst, dass die Reagenzmittel der vorliegenden Erfindung alle Elemente enthalten können, die aus dem Stand der Technik

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bekannt sind und die bisher für solche Zwecke verwendet wurden und bei denen die Markierung eine fluoreszierende Markierung gemäss der vorliegenden Erfindung ist und solche Reagenzmittel können zusätzlich die zuvor erwähnten Reagentien enthalten, die zur Erzeugung des hochenergiereichen Zwischenreaktionsproduktes geeignet sind.

Die Erfindung wixd nachfolgend in den Beispielen beschrieben, die jedoch nicht limitierend auszulegen sind.

Lissamin-Rhodamin B wurde von Pfaltζ und Bauer (Stamford, Conn. USA) erhalten, VJasserstoffperoxid (50 %-ig von Fischer Scientific (Fairlawn, N.J., USA) und Sisomycin von Schering Corp. (Bloomfield, N.J., USA), bis-(2,4-Dinitrophenyl)-oxalat wurde nach dem Verfahren von Rauhut et al, J. Anier. Chem. Soc. 88:6522 (1967) hergestellt. Antikörper, die mit Sisomycin reagierten wurden in Kaninchen gezüchtet, die mit Gentamicin, gekuppelt an Rinderserumalbumin, immunisiert worden waren (Nature New Biol. 239:214 (1972)).

Vorbeschichtete Platten aus Kieselgel (Kieselgel 60, Merck, Darmstadt) wurden verwendet. Das Lösungsmittel wurde hergestellt., indem wan kräftig gleiche Volumina du MeLhanol, Chloroform und Ammoniumhydroxid vermischte und die gebildete niedrigere Phase sammelte.

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Elektrophorese wurde auf 28 χ 34 cm Blättern von Whatman 3MM brand paper (Reeve Angel, Clifton, N.J., USA) durchgeführt nach derHängestreifenmethode, beschrieben von Williams et al, Science 121:829 & 830 (1955). Als Pufferwurde 0,01 M Pyridin-Acetat, pH 5,0, angewendet. Ein Potential von etwa 17 V/cm wurde während 5 Stunden angelegt.

Materialien mit Aminoresten wurden, auf Dünnschichtplatten und Elektrophoresepap.ter mit dein Ninhydrin-Sprühreagenz vcn Brenner und Niederweiser, Methods in Enzymology 11:39-59 (106 7) η ach g G-wi csen.

Dünnschichtchromatografie spaltete das handelsübliche lii.sKamin-Rhodamin B in 15 bis 2O Rotkomponenten auf, wobei der Hauptbestandteil einen Rf von 0,31 hatte. Etwa 7 g der Rohmischung wurden mit 500 ml siedendem wasserfreien Äthanol verrührt und die Mischung wurde noch heir.a filtriert. Das Filtrat wurde über eine Sephadex LH-20 Säule (5 χ 50 cm) in wasserfreies Äthanol gegeben. Die Säule wurde mit 6 1 Äthanol gewaschen, wobei 25 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die die rote Farbe enthaltenden Fraktionen wurde« durch Dünnschichtchromatografie untersucht und diejenigen, die Lissamon-Rhodamin D (Rf = 0,31) enthielten, wurden zusammengegeben und auf einem Drehverdampfer

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getrocknet. Dieses Material wurde weiter durch Chromatografie über eine 1 Mikrometer (um) dicke Schicht von Kieselgel (Quantum, Fairfield, N.J., USA) gereinigt. Es wurden etwa 120 mg des Farbsto-fs in Methanol auf eine 20 χ 20 cm Platte gegeben und das Chromatogramm wurde mit dem vorher erwähnten Lösungsmittel entwickelt. Das kräftig rote Band wurde von der Platte abgeschabt und der Farbstoff wurde von dem Gel mit Methanol eluiert.

Herstellung des markierten_Kon^u23ts__(fluorec^enzmarkiertes

100 mg (0,18 mmol) des gereinigten Lissamin-Rhodamin B wurden in 5 ml Thionylchlorid während 4 5 Minuten rückflussbehandelt. Die Reaktionsminchung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und Thionylchlorid wurde auf einem Drehverdumpfor abgedampft. Der Rückstand wurde in 2O bis 30 ml Chloroform gelöst und getrocknet. Dies Verfahren wurde zweimal wiederholt. Durch Dünnschichtchromatografie wurde dieses Re aktionsgemiöch in 15 bis 2O Komponenten aufgelöst. Dor trockene Rückstand wurde in 3 bis 4 ml Dimethylacetamid gelöst und zu einer Lösung gegeben, die 44 mg Sisomicin (freie Base) (0,1 mmol) in 5 ml Dinethylacetamid und 40 ul Triäthylamin (0,29 mmol) enthielt. Die Reaktionsinischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde das Lösungsmittel auf einem Drehverdampfer entfernt.

Material wurde durch Filtrieren abgetrennt. Die wasserunlösliche Fraktion wurde in Methanol gelöst und schien eine neutrale Ladung zu haben bei der Untersuchung durch Elektrophorese. Das wasserlösliche Material bestand aus

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neutralen und positiv geladenen roten Komponenten, sowie aus nicht-umgesetzten Sisomicin. Es wurde über eine 2,5 χ 23 cm Säule aus Sephadex CM-25, ins Gleichgewicht gebracht mit 0,5 M Ammoniumformiat, chromatografiert. Das Chromatogramm wurde mit einem Lineargradienten, erzeugt aus 500 rnl O,5 M Ammoniumformiat und 500 ml 2,5 M Ammoniumformiat, entwickelt. Fraktionen (13 ml) wurden gesammelt und die Absorption bei 555 nm wurde gemessen. Die Fraktionen 60 bis 65 wurden zusammengegeben und zur Entfernung von Wasser und Ammoniumformiat liophylisiert. Der Rückstand wurde in 2 bis 3 ml Wasser gelöst und weiter durch Papierelektrophorese gereinigt. Drei Bänder wanderten in unterschiedlichen Geschwindigkeiten zur Kathode. Diese wurden auseinandergeschnitten und vom Papier mit Wasser eluiert. Das Produkt (Sisomicin-Fluoreszierungnmittel-Konjucjat) , das bei der Elektrophorese am schnellsten wanderte, wurde für die weiteren Untersuchungen verwendet.

Ein 200 bis 500 μΐ Aliquot des Fluoreszierungsmittels in 0,1 M tris-(Hydroxymcthyl)-aminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl) Puffer, pH 8,0, wurde in ein 7 χ 70 mm Reagenzglas gegeben. Eine vorbestimmte Menge von 50 % (V/V) Wasserstoffpcroxid v.'urde zu jeder Probe gegeben. Das Reagenzglas wurde in ein Fotometer gegeben und aus einer Spritze wurden 2,0 ml von 20 liunol bis- (2 , Ί-Dinitrophenyl) -oxaiat eingespritzt. Die Lichtbildung wurde 20 Sekunden nach Einspritzen aufgezeichnet.

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Lichtmessungen

Die lichtbildenden Reaktionen wurden in 7 χ 70 mm Reagenzgläsern durchgeführt, die auf einem Fotomultiplier (Typ PM 27OD von International Light, Newburyport, Mass., USA) montiert waren. Ein Bandendurchlass-Interferrenzfilter (Ditric Optics, Marlboro, Mass., USA) mit einer 10 nm Halbbandenbreite wurde zwischen das Reagenzglas und den Fotomultiplier gegeben. Die Wellenlänge für die maximale Durchlässigkeit des Filters betrug 579 nm. Die Abdeckung über dem Reagenzglas hatte eine öffnung, bedeckt mit einer Guminifolie. Eine Injektionsnadel wurde durch die Folie zum Einspritzen einer Lösung des Oxalatesters in das Reagenzglas gestossen. Die Lichtbildung wurde aufgezeichnet in Einheiten de?; Instrumentenablesung.

Bindungsreaktionen zwischen Antikörper, dem Sisomicin-Füuoreszierungsmittel-Konjugat und Sisomicin wurden in 0,1 M Tris-HCl-Puffer auf pH 8,0 (400ul Endvolumen) bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Konjugat und Sisomicin wurden zusanunengcgeben und dazu wurde zuletzt der Antikörper gegeben. Die Bindungsreaktion liess man 20 Minuten fortschreiten. Dann wurden 150ul einer Lösung aus 500 g/l Carbowax 6000-Polyäthylenglykol (BDH Laboratories, Pool«, England) in 0,1 M TrIs-HCl, pH 8,0, zugegeben und das gebildete Prcteinpxecipitat, .Xeinschlifisslioh der "gebundenen Spezies") wurde durch Zentrifugieren sedimentiert. 350 ul Anteile der überstehenden Flüssigkeit·"(der "freien Spezies") wurden in saubere 7 χ 70 mm Reagenzgläser überführt. Dazu wurde Wasserstoffperoxid gegeben und die Lichtmessungen urden in der vorher angegebenen Weise vorgenommen.

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ERGEBNISSE

Messungen von Lissamin-Rhodamin_B_durch_LicJ2tbildung

Die Zugabe von bis-(2,4-Dinitrophenyl)-oxalat zu dem Reaktionsgemisch, enthaltend Lissamin-Rhodamin B und Wasserstoffperoxid, benötigte 2 bis 4 Sekunden. Innerhalb von 5 bis 10 Sekunden erreichte die Lichtemission ihre maximale Intensität und nach 15 Sekunden war sie vollständig. Wurde der Oxalatester zu dem Wasserstoffperoxid ohne das Fluoroszierungsmittel zugegeben, so wurde Licht mit etwa dem gleichen Zeitverlauf wie oben angegeben erzeugt. Ohne das Interferenzfilter überlagerte dieses Licht den Fotodetektor, ausgenommen bei der niedrigsten Verstärkung. Dns Interferenzfilter schnitt etwa 99,5 % dieses Hintergrundlj chtes hei aus.

Eine bestirumte Menge des Sisomicin-Fluoreszierungsmittel-Konjugats wurde mit unterschiedlichen Mengen an Antiserum inkubiert und dann wurden die gebundene und die ungebundene Form des Konjugats in der vorher erwähnten Weise getrennt. Die Menge des ungebundenen Konjugats (freie Spozies) wurde mittels der Lichtbildungsreaktion gemessen. Das erzeugte

LiCilt IiQii~i in «_iGIu i'SiSSC, WiO die Mtiiiyt: όίβώ AnLiKOjTpCi*S ilxC) —

nahm, zu. 100ul des Antiserums schienen 9Q--% des Konjugats zu binden. Wurde Lissamin-Rhodamin B mit der gleichen Menge an Aiitiserum inkubiert, so verringerte sich die Lichterzeugung um etwa 20 % (siehe nachfolgende Tabelle. 1). Nicht

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03 C030/062 3 ORIGINAL INSPECTED

immunes Kaninchenserum verminderte gleichfalls die Lichtproduktion durch das Sisomicin-Fluoreszierungsmittel, aber die Wirkung war merklich geringer als die mit der gleichen Menge des Antiserums beobachtete.

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Tabelle 1

ANTIKÖRPERBINDUNG ΛΝ DAS SISOMICIN-FLUORESZIERUNGSMITTEL-KONJUGAT ·

Sisomicin- Fluoreszie- rungsmittel (nM)	-	-	I.issamin- Rhodamin B (nM)	Anti- serum	5	nicht immunes Serum (yal)	Lichtpro duktion
-		-	-	-	10	-	119
-	—	-	10	20	-	158
-	-	100	50	-	160
-	-	-	100	10	140
-	-	-	-	100	205
375	-	-	-	-	919
375	-	-	-	851
375	-	~	-	670
37 S	--	10	-	580
375	-·	100	-	485
375	-	-	-	241
375	-	-	10	865
375	-	50	745
375	-	100	796
125	-	1109
125	-	1142
125	-	895
125	10	1300
125	100	1136

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Unterschiedliche Mengen an Sisomicin und bestimmte Mengen des Sisomicin-Fluoreszierungsmittel-Konjugats liess man mit einer begrenzten Menge des Antikörpers reagieren. Die Menge des ungebundenen Konjugats wurde nach der Lichtbildungsreaktion gemessen. Die Lichtbildung nahm in dem Masse zu, wie die Menge an Sisomicin erhöht wurde. Bei der grössten verwendeten Menge betrug die gemessene Lichtproduktion 79 % der in Abwesenheit des Antikörpers gemessenen.

Sisomicin konnte in Mengen von nur 1,3 nmol nachgewiesen werden. Die Daten in Tabelle 2 zeigen, dass das Sisomicin-Fluoreszierungsmittel-Konjugat spezifisch an den Antikörper gebunden ist.

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Tabelle 2

KOMPETITIVE BINDUNGSÜNTERSUCHÜNG FÜR SISOMICIN

Sisomicin- Fluoreszierungs- mittel-Konjugat (nM)	Sisomicin (yuM)	Antiserum	Lichtproduk tion
—	-	-	250
-	-	100	360
-	5	100	370
375	-	-	1830
375	5	-	1840
375	-	100	580
375	-	100	550
375	O,O25	100	530
375	0,050	100	540
375	0,125	1OO	560
375	0,250	100	550
375	0,625	100	620
375	1,25	100	870
375	5,00	100	1380
375	1O,3O	100	1520

mittel-Koniugat.s (homnoenp Unfprsiidmnr)

Unterschiedliche Mengen an Antisfcrum wurden mit bestimmten Mengen des Sisomicin-Fluoreszierungsmittel-Konjugats inkubiert. Dann wurden die Reaktionsmischungen bei der lichtbildenden Reaktion ohne Trennung der antikörperctebundenen und

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ungebundenen Formen des Konjugats verwendet. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass die Lichtproduktion in dem Masse zunähme, wie die Antikörpermenge abnahm. Nichtr immunes Kaninchenserum hatte eine verhältnismässig geringe Wirkung auf die Lichtproduktion.

Es wurden kompetitive Bindungsreaktionen mit unterschiedlichen Mengen an Sisomicin und bestimmten Mengen an Sisomicin-Fluoreszierungsmittel-Konjugat und Antiserum durchgeführt (Tabelle 3). Die Lichtproduktion bei diesen Reaktionsmischungen wurde ohne vorhergehende Trennung der gebundenen von der ungebundenen Form des Konjugats durchgeführt. Zunehmende Mengen an Sicomicin führten zu einer erhöhten Lichtproduktion, obwohl die Änderung der Lichtproduktion nicht so ausgeprägt war wie die, wenn eine Trennungsstufe eingeschlossen war.

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Tabelle 3

KOMPETITIVE BINDUNGSUNTERSUCHUNG FÜR SISOMICIN OHNE VORHERGEHENDE TRENNUNG DER ANTIKÖRPERGEBUNDENEN UND -UNGEBUNDENEN FORMEN DES SISOMICIN-FLUORESZIERUNGSMITTEL-KONJUGATS

Sisomicin- Fluoreszie- runcjsmi ttel (nM)	Lissamin- Rhodamin B (nM)	Sisomicin (yuM)	Anti- serum (^D	Lichtpro duktion
-	-	-	-	140
-	-	-	100	170
-	125	-	-	1310
-	125	-	100	930
	125	25	100	980
375	-	-	-	910
37 5	-	5	-	860
37b	-	-	100	610
375	-	-	1OO	640
375	-	2,5	100	670
375	-	5	100	680
375	-	12,5	100	720
375		25	100	800

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Claims

1 'AT K is TAN WAtTK DK. ING. E. HOFMANN ί1»30.1?7ί·) . DIPI.-!NG. W. CIHE · OR. RER. NAT. K. HOFFMANN . Ol PL.-ING. W. LEHN DIPL.IHG. K. FUCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN AkAItLLi1STRAiSCi(STiRNHAUS) · Ü-8000 MO N C H E N 81 · TELt FON (08?) 911087 . TELE X 05-2961? (PATH E) P 29 52 4-)8.9 32 876 MILES LABORATORIES INC., ELKHART, INDIANA / USA Spezifische Bindungsuntersuchungsinethode zum Nachweisen eines Liganden in einem flüssigen Medium und Reagentien zur Durchführung der Methode PATENTANSPRÜCHE

1. Spezifisches Bindungsuntersuchungsverfahren zum Nachweis eines Liganden in oder der ligandenbindenden Kapazi tät von einem flüssigen Medium, bei dem das flüssige Medium mit einem Reagenz vereint wird, das ein mar-

mit einer fluoreszierenden Markierung versehen ist, enthält, und durch die Vereinigung ein Bindungsreaktions system gebildet wird aus einer gebundenen Spezies

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ORIGINAL INSPECTED

und einer freien Spezies des markierten Konjugats und wobei die Menge der in entweder der gebundenen Spezies oder der freien Spezies enthaltenen fluoreszierenden Markierung eine Funktion der Gegenwart oder der Menge des Liganden oder der Ligandenbiiidungskapazität in dem flüssigen Medium ist, und wobei man die fluoreszierende Markierung misst, dadurch 'gekennzeichnet , dass man die fluoreszierende Markierung misst, indem man die Markierung chemisch anregt, so dass dadurch die Markierung Licht emittiert und dass man das durch die angeregte fluoreszierende Markierung emittierte Licht misst.

2. Verfahren gonäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Markierung durch Aussetzen gegenüber einer Substanz angeregt wird, wobei durch dieses Aussetzen die Anregung verursacht und Licht emittiert wird.

3r Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die chemische Anregung dadurch erfolgt, dass man in Gegenwart der Markierung eine chemische Reaktion durchführt und dass das Produkt dieser chemischen Reaktion eine hochenergiereiche Substanz ist, aus welcher Energie auf die Markierung übertragen wird.

4. Verfahren gemäss Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Substanz das Reaktionsprodukt von Nasserstoffperoxid mit Oxalylchlorid, einem Oxamid oder einembis-Oxalat ist.

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5. Verfahren gemäss Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Substanz das Produkt aus der Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Oxalylchjorid; einem Oxamid, ausgewählt aus 1,1'-Oxalyl-bis~(benzimidazol), N,N'-Dimethyl-Ν,Ν¹-dinitrooxamid und N,N'-bis-(Phenylsulfonyl)-parabamat; oder einem bis-Oxalatester, ausgewählt aus bis-(2,4-Dinitrophenyl)-oxalat, bis-(Pentachlorphenyl)-oxalat, bis-(4-Nitro-3-trifluormethyIphenyl)-oxalat, bis-(4-Nitro-2-formylphenyl)-oxalat und bis-(Pentafluorphenyl)-oxalat, ist.

6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , dass die Fiuoreszierungsmarkierung Lissamin-Rhodamin B, Rhodamin B, Fluorescein, 9,10-Diphenylanthracen, Perylen, Rubren, Pyren oder ein fluoreszierendes Derivat davon ist.

7. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Fluoreszierungsmarkierung Lissarnin-Rhodamin B ist und chemisch durch Aussetzen gegenüber einem hochenergiereichen Zwischenprodukt angeregt wird, das durch die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit einem bis-Oxalatester gebildet wird.

8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , dass der bis-Oxalatester bis-(2,4-Dinitrophenyl)-oxalat. ist.

9. Verfahren gemäss Anspruch "!, dadurch gekennzeichnet , dass der Ligand ein Antigen oder ein Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper

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dazu, oder ein Hormon, Vitamin oder ein pharmakologisches Mittel oder ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür ist.

10. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass es eine homogene Untersuchung smethode ist, bei welcher die fluoreszierende Markierung in der vereinten gebundenen Spezies und freien Spezies des markierten Konjugats gemessen wird.

11. Verfahren gemäcs Anspruch 1 vom heterogenen Typus, dadurch gekennzeichnet , dass die gebundene Spezies und die freie Spezies des markierten Konjugats getrennt werden und dass die fluoreszierende Markierung in einem der getrennten Spezies gemessen wild.

12. Reagenzmittel zun Nachweis eines Liganden oder einer Ligandenbindungskapazität in einem flüssigen Medium durch eine spezifische Bindungsuntersuchungsmethodo, wobei das Reagenz ein markiertes Konjugat enthält aus einer Bindungskomponente, die mit einer fluoreszierenden Markierung versehen ist, und das Reagenz in der Lage ist, bei Kontakt mit dem zu untersuchenden flüssigen Medium mit dem Liganden oder der Ligandenbindunyskapazität in dem Medium ein Bindungsreaktionssystoüi mit einer gebundenen spezies oder einer freien Spezies des markierten Konjugats zu bilden und wobei die Menge der fluoreszierenden Markierung in der gebundenen Spezies oder der freien Spezies einer Funktion äer Gegenwart des Liganden oder der Ligandenbindungskapaz.i tat in dem flüssigen Medium ist, dadurch

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ORIGINAL INSPECTED

gekennzeichnet , dass ein Reagenz vorhanden ist, das unter Ausbildung einer Substanz, die in der Lage ist, die fluoreszierende Markierung unter ' Emitticrung von Licht anzuregen, reagiert.

13. Reagenzmittel gentäss /vnspruch 12, dadurch g e k e η η zeichnet , dass das Reagenz (1) Wasserstoffperoxid oder ein chemisches System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid und (2) Oxalylchlorid, ein Oxamid oder einen bis-Oxalatester umfasst.

14. Reegenzmittel gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass das Oxamid ausgewählt ist 1,1 '-Oxalyl-bis-(benziniidazol) , N,N¹ -Dimethyl~N,N'-dinitrooxamid und N,N'--bis-(Pbenylsulfonyl)-parabamat und dass der bin-Cxalatester ausgewählt ist aus bis-(2,4-Dinitrophenyl)-oxalat, bis-(Pentachlorphenyl)-oxalat, bis-(4-Nitro-3-trifluonnethylphenyl)-oxalat, bis-(4"Nitro-2-formylphenyl)-oxalat und bis~(Pontaflucrpbenyl)-oxalat.

15. Reagenzmittel gemäss Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet , dass die fluoreszierende Markierung Lissamin-Rhodamin B, Rhodamin B, Fluorescein, 9,10-Diphenylanthracen, Perylen, Rubren, Pyren oder eine fluoreszierendes Derivat davon ist.

16. Reagenzmittel gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Markierung Lissamon-Rhodamin B ist und dass das Reagenz (1) Wasserstoffperoxid oder ein chemisches System zur Erzeugung von Viasserstoffperoxid und (2) einen bis-Oxalafc· ester umfasst.

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17. Reagenzmittel gemäss Anspruch 16, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der bis-Oxalatester bis-(2,4-Dinitrophenyl)-oxalat ist.

18. Reagenzmittel gemäss Anspruch 12, dadurch g e k e η η zeichnet , dass der Ligand ein Antigen oder Antikörper dazu, ein Hapten oder ein Antikörper dazu, oder ein Hormon, Vitamin oder ein pharmazeutisches Mittel oder ein Rezeptor oder eine Bindungssubstanz dafür ist.

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