DE2951221A1 - Testmittel zur bestimmung von glucose in einer koerperfluessigkeit, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung bei der bestimmung von glucose - Google Patents
Testmittel zur bestimmung von glucose in einer koerperfluessigkeit, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung bei der bestimmung von glucoseInfo
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- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
Description
PATKNTANWÄI/i'H
flR. ING. E. HOI ΓΜΑΝΝ (1930-1976) · D I Pl-I N G. V/. E ITlE · 0 R. RC R. N AT. K. H OTFMM-.1 Il . D I Pt.-IN G. W. IEK N
DIPI..-ING. K. MJCHSlE · DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABEtIASIRASSCi(STERNHAUS) · D-ΐΟΟΟ MD N CU EN β) · TElEfON (OüS>) Π IOD/ . TE LE X 55-2VM? (PATH EJ
32 850 o/fg
Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana / USA
Testmittel zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit
Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung bei der Bestimmung von Glucose
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Diagnosetests und insbesondere Tests, die zur qualitativen und quantitativen
Bestimmung von Glucose geeignet sind, und wobei Glucose in ein Peroxid überführt wird.
·.: lucoseoxidase wandelt Glucose enzymatisch in Gluconsäure und
L.isserstof fperoxid um. Das dabei gebildete Wasserstoffperoxid
eines Indikatorsystems, das oxidiert wird, und dabei eine
Anzeige liefert, wie eine Farbänderung, reduziert werden. Dor chromogene Indikator o-Toliclin ist seit geraumer Zeit in Glucose·
testsysteme?! verwendet worden, aber man erhält dabei Ergebnisse,
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bei denen der oxidierte Indikator durch störende Substanzen,
wie Ascorbinsäure, reduziert wird. Ausserdcm ist die Sicherheit
von o-Tolidin fraglich.
Aus den GB-PSen 1 464 359 und 1 464 360 ist die Verwendung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin und ähnlichen Verbindungen
und die Anwendung dieser Verbindungen zum Nachweis und zum Bestimmen von Wasserstoffperoxid oder von Bestandteilen, die
unter Bildung von Peroxiden reagieren, bekannt. Die Konzentration der dort angegebenen Benzidin-Derivate ist dort ganz unterschiedlich,
aber im allgemeinen werden nicht mehr als etwa 4>
mg/ml der Imprägnierlösung verwendet.
Bei der Verwendung von Benzidin-Derivaten, in den in den GB-PSen
angegebenen Konzentrationen findet eine verhältnismässig langsame Bildung einer Farbe statt, oder man erhält Farben, die
über einen gewissen Zeitraum nicht stabil sind. In letzterem Falle neigt die entwickelte Farbe beim Stehen dazu, zu verblassen
oder sich zu verändern, und die Ablesungen sind deshalb mit einem Fehler behaftet und es ist sehr schwer oder unmöglich, die Ablesung
mit untrainiertem Personal durchzuführen.
Es ist ein Hauptziel der Erfindung, einen verbesserten Test für die Glucosebestimmung zu zeigen. Es ist ein weiteres Ziel
der Erfindung, einen verbesserten Glucosetest zu zeigen, unter Verwendung von Materialien, die sicher gehandhabt werden können.
Verbunden mit dieser Aufgabe ist ein Test für die Bestimmung von Glucose, bei welcher die gebildete Farbe über einen langen Zeitraum
stabil bleibt.
Zur Lösung der vorstehenden Aufgabe dient erfindungsgemäss
ein neues Testmittel aus Glucoseoxidase, einer peroxidativ
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aktiven Substanz und einem 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin-Indikator,
wobei der letztere in einer ausreichenden Menge vorliegtι um bei Berührung des Testmittels mit einer vorbestimmten
Menge einer glucosehaltigen Probe ausreichend schnell ein stabiles gefärbtes Reaktionsprodukt zu liefern.
Fig. 1 ist eine grafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen
Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imprägnierlösung gemäss
Formel (I) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei
man diese Kurve erhielt, indem man K/S, was nachfolgend noch erläutert wird, gegen die Glucosekonzentration
aufträgt.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen
Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imprägnierlösung gemäss
Formel (II) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei man die Kurve erhält, indem man K/S gegen die Glucosekonzentration
aufträgt.
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen
Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imprägnierlösung gemäss Formel
(III) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei man
die Kurve erhält, indem man K/S gegen die Glucosekonzentration aufträgt.
Fig. 4 ist eine qrafische Darstellung der in Tabelle I enthaltenen
Daten bei Verwendung einer Glucosetestvorrichtung, die unter Anwendung einer Imrpägnierlösung gemäss Formel
(IV) in Beispiel 1 hergestellt worden war, wobei man
die Kurve erhält, indem man k/S gegen die Glucosekonzentration aufträgt.
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Fig. 5 ist eine grafische Darstellung der beobachteten prozentualen Farbänderung, definiert als (Λκ/S)/
K/S χ 100 für die Testvorrichtung, welche zum Erhalt der in Fig. 1 bis 4 angezeigten Daten verwendet wurde.
Im Gegensatz zu den Zusammensetzungen des Standes der Technik sind die erfindungsgemässen praktisch frei von dem Problem
der Farbzersetzung oder -verblassung. Diese unerwartete Eigenschaft beobachtet man bei einem Ansteigen der Konzentration des
3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin-Indikators. Deshalb unterscheidet
sich die Erfindung von den bekannten Verfahren darin, dass sie schnell eine Farbe ergibt, die im Anschluss an ihre Bildung
stabil bleibt. Man muss nicht warten, bis sich der Farbindikator stabilisiert, noch muss man sich um eine ständige Veränderung
der Farbe während der Zeit nach Einleiten der Farbbildung kümmern. Infolge dessen wird durch die Erfindung eine Zusammensetzung und
ein Mittel zur Verfügung gestellt, bei dem man 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin
anwendet und welches schnell bei Berührung mit einer Glucose im Bereich von einer geringen aber wahrnehmbaren
Menge bis zu wenigstens etwa 500 mg/dl enthaltenden Probe eine stabile Farbe ergibt.
Erfindungsgemäss werden Testmittel zur Verfügung gestellt, wie
eine Zusammensetzung, eine Testvorrichtung, ein Verfahren zur Herstellung der Testvorrichtung sowie ein Verfahren zur Bestimmung
von Glucose in einer Probe. Insbesondere umfassen die Testmittel Glucoseoxidase, eine peroxidativ aktive Substanz,
wie Peroxidase, und einen 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin-Indika-
tor in einer Menge, die ausreicht, um bei Kontakt des Testmittels mit einer vorbestimmten Menge einer glucosehaltigen
Probe schnell ein stabil gefärbtes Reaktionsprodukt zu liefern, das wahrscheinlich aus einer reduzierten und oxidierten Form
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des Indikators in stabilem Gleichgewicht besteht. Das stabile gefärbte Reaktionsprodukt wird in einem Zeitraum von nicht
mehr als etwa 60 Sekunden und insbesondere zwischen etwa 30 und 60 Sekunden nach Kontakt des Testmittels mit der
zu prüfenden Körperflüssigkeit gebildet.
Die Konzentration von 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin in bezug
auf die Menge der vorhandenen Glucoseoxidase in dem Testmittel der Erfindung ist kritisch. In Übereinstimmung mit der Erfindung
liegt das 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin in den Testmitteln
in einer Konzentration von wenigstens etwa 2,5 mMol (roM) pro
1000 internationale Einheiten (I.U.) an Glucoseoxidaseaktivität vor.
Die 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin-Verbindungen sind auch deshalb
besonders vorteilhaft, weil deren nichtkarzinogenen Eigenschaften bekannt sind.
Weiterhin wird eine Testverrichtung zur Bestimmung von Glucose
gezeigt, welche aus einem Träger oder einer Matrix besteht, in welcher die Testmittel gemäss der Erfindung enthalten sind.
Eine Testvorrichtung kann die Form einer Tablette oder vorzugsweise eines Teststreifens haben. Ein längliches Blatt aus dem
Trägermaterial, in welches die Testmittel der Erfindung eingebracht worden sind, kann als Testvorrichtung verwendet werden.
Bei der Herstellung und Verteilung können diese länglichen Blätter von Vorratsrollen, wie Filterpapiermaterial, entnommen
wulucu. Luc »υΐϋ^ιαωιΐ) wiiu ^.Lj. ilciycaLCiiLf j-iiuciii muli ca.jiC=il
Träger mit einer Lösung der erfindungsgemässen Testmittel imprägniert
und den so imprägnierten Träger anschliessend trocknet.
Das Bestiminungsverfahren für Glucose in einer Flüssigkeitsprobe besteht darin, dass man eine Probe mit dem Testmittel oder
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der Testvorrichtung gemäss der Erfindung in Berührung bringt,
und die entstehende Farbänderung beobachtet.
In der nachfolgenden Beschreibung werden bestimmte Ausdrücke aus Gründen der Klarheit verwendet, aber diese Ausdrücke beziehen
sich immer nur auf eine bestimmte Ausführungsform der Erfindung, die als Beispiel dient und in keiner Weise die
Grenzen des Umfangs der Erfindung angibt.
Die Testmittel gemäss der Erfindung können viele physikalischen
Formen annehmen und schliessen viele bestimmte 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine
ein, unabhängig von der Form. Es werden diese Testmitte], zusammen mit bekannten Additiven, wie Stabilisierungsmitteln,
die man gewünschtenfalls zusätzlich verwenden kann, beschrieben. Die Testmittel werden zum Nachweis von Glucose
verwendet, indem man sie mit einer Probe, wie urin, Blut, Serum, Rückenmarkflüssigkeit oder der überstehenden Flüssigkeit von
Gewebekulturen und dergleichen, in Berührung bringt.
Die verschiedenen verwendbaren Benzidin-Indikcitoren schliessen
3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidine, bei denen das Alkyl ein C-C.-Alkyl
ist, ein, wobei 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin besondere
bevorzugt wird. Andere verwendbare Tetraalkylbenzidine sind 3-Methyl-, 3'-Methyl-, 5-Ä'thyl-, 5 '-Äthylbenzidin und 3, 3', 5,5'-Tetraäthylbenzidin.
Wie aus diesen Beispielen hervorgeht, können alle vier Alkylgruppen gleich oder verschieden sein.
Verwendbare Glucoseenzyme sind solche, die mit der zu prüfenden glucosehaltigen Flüssigkeit ein vorbestimmtes Reaktionsprodukt,
wie Wasserstoffperoxid, liefern. Z.B. kann man Glucoseoxidase aus Schimmelpilzen verwenden. Diese werden im allgemeinen als
Flavo-Proteinarten bezeichnet, weil sie als prosthetische Gruppe oder Coenzym ein Flavin oder Isoalloxazin enthalten.
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Vorzugsweise ist ein duales Enzymsystem vorhanden: ein Enzym
wandelt Glucose unter Bildung von Wasserstoffperoxid um, während
das andere Enzym peroxidative Aktivität hat. Substanzen mit peroxidativer Aktivität, die für die vorliegende Erfindung geeignet
sind, kann man aus den verschiedenen organischen und anorganischen Quellen auswählen. Man kann Pflanzenperoxidasen,
wie Meerrettichperoxidase oder Kartoffelperoxidase, verwenden.
Anorganische Verbindungen mit Peroxidaseaktivität schliessen Jodide, wie Natrium- und Ammoniumjodide und Molybdate, wie
Kalium- und Ammoniummolybdate, ein. Ausserdem kann man Urohämin
und eine Anzahl anderer Porphyrin-Substanzen mit peroxidativer Aktivität verwenden. Weitere Substanzen, die keine Enzyme sind,
aber peroxidative Aktivität aufweisen, sind Verbindungen wie Eisensulfocyanat , Eiscntannat, Ferri-Ferrocyanid, Kaliumchromsulfat
und dergleichen.
Weil die Zusammensetzungen, z.B. zur Messung von Blutglucose,
bei einem pH im Bereich von etwa 4 bis etwa 7,5 gehalten werden sollen, ist für diesen Zweck ein Puffersystem aus Tris(hydroxymethyl/aminomethan,
Malonsäure und Dinatriummaionat besonders geeignet.
Ein Interpolymer aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid ist für die Formulierung eines erfindungsgemässen Glucoseindikators
gleichfalls geeignet. Ein solches Interpolymer wird unter dem Handel.'snamen Gantrez AN-139 von der GAF Corporation
vertrieben. Löst man dieses Interpolymere in Alkohol, so bildet es ein Partiell-Esterderivat und wenn das Interpolymer in Wasser
gelöst wird, bildet es ein Säurederivat. Weil die Testmittel gemäss der vorliegenden Erfindung typischerweise aus wässrigen
alkoholischen Medien hergestellt werden, enthalten die Zusammensetzungen
ir. Endprodukt entweder ein Säurederivat oder ein Teilesterderivat oder eine Mischung der Derivate. Die Gegenwart
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des vorerwähnten Interpolymer-Derivats zusammen mit Polyvinylpyrrolidon
(PVP) mit beispielsweise einem Durchschnittsmolekuüargewicht
von etwa 40.000 verstärkt die Farbe ganz erheblich, wenn farbbildendo Indikatoren das Wasserstoffperoxid in Gegenwart
von Peroxidase oxidiert werden. Diese Farbverstärkung macht eine noch schärfere Unterscheidung der verschiedenen
Farbschattierungen für unterschiedliche Glucosegehaltniveaus in einer gegebenen Flüssigkeitsprobe möglich. Dies ist für den
Arzt besonders wichtig, der einen beginnenden diabetischen Zustand diagnostizieren muss.
Die Erfindung betrifft auch Testvorrichtungen, welche die Testmittel gemäss der Erfindung enthalten, und ein Verfahren
zur Herstellung solcher Testvorrichtungen, bei welcher man Testmittel
in einen Träger einbringt. Ausser der vorerwähnten Imprägnierung kann die Kombination des Trägers mit den Testmitteln auch
durch andere geeignete Verfahren, wie Drucken oder Sprühen der Testzusammensetzung auf den Träger vorgenommen werden.
Vorzugsweise wird die Testvorrichtung hergestelle, indem man
4 einen Träger mit einer ersten Lösung, enthaltend etwa 4x10
bis etwa 8 χ 10 internationale Einheiten an Glucoseoxidaseaktivität
und etwa 22 χ 10 internationale Einheiten an Peroxidaseaktivitat
pro Liter imprägniert und nach dem Trocknen des Trägers diesen mit einer zweiten Lösung mit wenigstens 6 g 3, 3',5,5'-Tetraalkylbenzidin
pro Liter für jeweils 1x10 internationale
Einheiten an Glucoseoxidaseaktivität pro Liter der ersten Lösung imprägniert. Nach der zweiten Imprägnierung wird der imprägnierte
Träger wiederum getrocknet.
Dor Ausdruck "Träger" bezieht sich auf Matrices, die unlöslich
sind und ihre strukturelle Einheit in einer physiologischen oder einer anderen zu prüfenden Flüssigkeit beibehalten. Geeignete
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Matrices sind papier, Cellulose, Holz und synthetische Harz-vliese,
Glasfasern, Gewebe und Vliese, Gelatin, verschiedene organische Polymere, wie Polypropylen und andere Materialien,
die als Filmbildner dein Fachmann bekannt sind. Alternativ kann
der Träger auch die Form einer verpressten oder geformten Tablette, die ein übliches Trägermaterial enthält, annehmen.
Für die bessere Handhabung kann man den Träger an einen unlöslichen Trägerteil oder einen in die Hand zu nehmenden Teil
befestigen, der aus Polystyrol bestehen kann.
Wird die Testzusammensetzung zum Nachweis von Glucose im Blut angewendet, so wird die Oberfläche der imprägnierten Trägermatrix
vorteilhafterweise mit einem halbdurchlässigen, transparenten Schutzfilm aus A'tbylcellulose oder einem anderen geeigneten
Material überzogen. Dies kann man vornehmen, indem man eine Schicht aus Ä'thylcellulose, gelöst in Benzol, aufbringt, z.B.
auf die Oberfläche der imprägnierten Trägermatrix, und dann das Lösungsmittel durch Verdampfungstrocknung entfernt. Alternativ
kann die Äthylcellulose auch Teil bei der zweiten Iinprägnierlösung
sein, wie dies im Beispiel gezeigt wird.
Glucoseindikatoren in Form von behandelten Trägermatrices werden oft vor Gebrauch über erhebliche Zeiträume gelagert, und deshalb
ist es wünschenswert, dass man Reagenzien wählt, die nicht leicht an der Luft autooxidabel sind. Es ist auch zweckmässig,
die Trägermatrix vor Licht zu schützen und in einigen Fällen ist es wünschenswert, die Trägermatrix in Feuchtigkeit abweisenden
Verpackungen, die erst kurz vor ihrer Anwendung geöffnet werden, aufzubewahren.
Gewünschtenfalls kann eine Trägermatrix so behandelt werden, dass sie eine Hintergrundfärbung mit einer bestimmten Farbe aufweist,
z.B. gelb, so dass die Farbe, die durch die Testreaktion gebildet wird, sich mit der Hintergrundfarbe mischt und
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unterschiedliche Färbungen ergibt/ die den Konzentrationen
der zu untersuchenden Flüssigkeit oder Lösung entspricht. Es kann insbesondere wünschenswert sein, die Matrix gelb
zu färben, wenn die gebildete Farbprobe blau ist.
Die Testvorrichtung wird mit Vorteil angewendet, indem man sie kurz in die Testprobe eintaucht oder indem man auf andere
Weise die Testprobe auf die Trägermatrix aufbringt, wodurch eine merkliche Farbänderung beim Vorliegen von Glucose erfolgt.
Die Volumenkapazität des Trägers dient dazu, die Menge der durch diesen absorbierten Probe zu beschränken, überschüssige Probe
kann man durch Waschen oder Aufsaugen entfernen, so dass dadurch die Menge der zu prüfenden Probe und deren Volumen, die tatsächlich
in die Trägermatrix eingebracht wird, begrenzt wird. Die Testvorrichtung kann in gleicher Weise verwendet werden, wenn
als Proben Plasma, Serum oder andere Flüssigkeiten untersucht werden.
Extinktionsablesungen der durch die in der Probe enthaltenen Glucose gebildeten Farbe kann man mit handelsüblichen Spektrofotometern,
wie einem Bekcmann DK-2 Spektrofotometer der Beckmann Instruments Inc., Fullerton, California/USA, oder einem
Spektrokolorimeter SCF-1 der Israel Electro-Optical Industry
Ltd. vornehmen.
Für ganz genaue Bestimmungen von Glucosekonzentrationen kann
man eine fotoelektrische Colorimetrie oder Spektrofotometrie zur Bestimmung der Farbanzeigung anwenden. Das EYETON -Beugungs·-
Colorimeter (Arnes Company, Division of Miles Laboratories Inc.) ist ein tragbares Instrument, das zur quantitativen Messung der
Gesamtblutglucose bestimmt ist, zusammen mit DEXTROSTIX -Reagenzstreifen (Arnes Company, Division of Miles Laboratories Inc.).
Das EYETONE-Beugungs-Colorimeter misst das an der Oberfläche
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der Reagenzfläche des Reagenzstreifens reflektierte Licht und
wandelt diese Messung durch eine elektronische Schaltung in eine Ablesung um, die genau an einer kalibrierten metrischen
Skala des Instrumentes ablesbar ist und Blutglucose im Bereich von 10 bis 400 mg/100 ml anzeigt. Je höher die Menge an Blutglucose,
umso dunkler ist der Streifen und umso weniger Licht wird reflektiert. Umgekehrt ist bei einem niedrigeren Blutglucoseniveau
der Streifen heller und die Lichtreflexion grosser.
Die hier beschriebene, farbbildende Mischung ist besonders geeignet, weil sie eine einzigartige Farbansprechung ergibt, die mit dem
EYETONE-Beugungs-Colorimeter in gleicher Weise gemessen werden kann wie bei DEXTROSTIX-Reagenzstreifen. Alternativ kann man
halbquantitative Ergebnisse erzielen, wenn man den erfindungsgemassen
Glucose-Indikator und die Farbe dann mit einer Skala
von Standardfarben verg]eicht, die man mit bekannten G.lucosekonzentrationen
unter Anwendung des gleichen Glucose-Indikators erzielt hat.
Die Beziehung zwischen K (dem Absorptionskoeffizienten der
Probe) und der Konzentration der absorbierenden Spezies (d.h. Glucose) wird durch die Kubelka-Monk-Gleichung hergestellt,
die, zusammen mit einer ausführlichen Diskussion der Beugungsspektrofotometrie
in Kortumi, G., Reflectance Spectroscopy, Springer-Verlag Inc., New York, 1969, beschrieben wird.
Der Ausdruck K/S, wie er im Beispiel verwendet wird, bedeutet das Verhältnis, das durch die Formel (1-R) /2R gegeben ist, wobei
R die Extinktion und S der Streuungskoeffizient des jeweils
verwendeten Trägers ist. Deshalb ist K/S proportional der Menge des bei der Umsetzung gebildeten Chromogens. Die Ablesungen
in den Beispielen erfolgten bei den angegebenen Wellenlängen.
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Mcerrettich-Peroxidase und Glucoseoxiöase, wie sie in den Beispielen
verwendet wurde, stammten von The Research Products Division, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana. Ein Copolymer
aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid (Gantrez ΛΝ-139)
und Polyvinylpyrrolidon (VPV/ wurde von der GAF Corp., Chemical
Products, New York, N.Y., erhalten. Das bei der Zubereitung der Lösung verwendete Lösungsmittel kann Wasser, eine physiologische
Lösung, ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol oder eine Mischung davon sein.
Die Beispiele sind nur beschreibend, ohne dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise beschränken. Für den Fachmann ist es
ersichtlich, dass man eine Reihe von Änderungen und dergleichen hinsichtlich der Bestandteile und der Parameter vornehmen kann,
ohne vom Geist der Erfindung abzugleichen.
Es wurden Vorrichtungen hergestellt, in denen Zusammensetzungen zur quantitativen Bestimmung von Glucose eingebracht waren. Die
bei der Zubereitung der Vorrichtungen verwendeten Zusammensetzungen
hatten jeweils unterschiedliche Konzentrationen des Indikators 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB). Die Wirkung dieser
Unterschiede auf die Stabilität der Farbe im Laufe der Zeit wurde untersucht.
Eine erste Imrpägnierlösung wurde aus folgenden Bestandteilen in den anaeaebenen Mengen hergestellt:
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Komponenten | Menge |
Äthanol | 25 ml |
H2O | 40,5 ml |
Glucoseoxidase | |
(5 χ 103 I.U./ml) | 1 ,6 ml |
Meerrett ich- | |
peroxidasc | |
(90,8 I.U./mg) | 250 mg |
Citrat-Puffer | |
(1,8 M;pH 4,8) | 25 ml |
Gantrex ΛΝ-139 | |
in HpO | |
(10% Gew./Vol.) | 12 ml |
PVD | 300 mg |
Endkonzentration 25 % Volumen/Volumen
8 χ 104 I.ü./l
22 χ -\0D I.U./l
0,36 Molar (M)
1,2 % Gew./Volumen 3 % Gew./Vol.
Eine zweite Imprägnierlösung wurde aus den zu prüfenden TMB-Konzentrrttionen
hergestellt, indem man jeweils 10, 25, 50 bzw. 75 g TMB zu vier 1,0 1 Lösungen von Chloroform, enthaltend jeweils
17,5 g Äthylcellulose, gab. Die Endkonzentration von TMB
in diesen Imprägnieriösungen betrug 41,9, 104, 208 bzw. 312 mMol (mM) und die Formulierungen dieser Lösungen wurden mit I, II, III
und IV bezeichnet. Das Verhältnis der millimolaren Mengen an TM3 in den Imprägnierlösungen I bis IV zu der Zahl der Internationalen
Einheiten (I.U.) a" Glucoseoxidase in der ersten Imprägnierlösung
war 0,52, 1,30, 2,60 bzw. 3,90 mMol pro 1.000 I.U.. Ebenso betrugen die Gewichtsverhältnisse von TMB in den Irnprägnierlösugen
I bis IV zu der Anzahl der internationalen Einheiten an (ilunoseoxida.se in der ersten Imprägnierlösung 0,125, 0,313, 0,625
bzw. 0,038 g/1000 I.U.. Alle diese Beziehungen werden in der
Tabelle I für die jeweiligen Lösungen I bis IV gezeigt.
Vier Blätter Eaton-Dikeman 205 (E & D) Filterpapier wurden bis zur
Sättigung mit der ersten Imprägnierlösung imprägniert und bei 800C
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getrocknet. Jedes der so imprägnierten Blätter wurde dann bis
zur Sättigung in einer einzelnen der zweiten Imprägnierlösungen imprägniert und bei 600C getrocknet.
Die so behandelten Papiere wurden in 0,5 cm χ 1 cm Streifen
unter Ausbildung von Testvorrichtungen geschnitten. Diese Testvorrichtungen v/urden auf ein doppelseitiges Klebepapier
aufgebracht und dann auf einem organoplastischen Trägerteil fixiert. Jede Testvorrichtung enthielt annähernd 1,7 I.V. GIucoseoxidase
und 5,4 I.U. Peroxidase. Die endgültigen Mengen an TMB in den Vorrichtungen, welche die Formulierungen I bis
IV enthielten, betrugen annähernd 0,22, 0,55, 1,10 bzw. 1,6 mg.
Die Vorrichtungen mit den jeweiligen Formulierungen wurden geprüft,
indem man sie jeweils einzeln in jeweils vier wässrige Glucoselösungen tauchte. Die Gluccsekonzcntrationen in diesen
Lösungen waren 93, 201,9, 302,4 und 372,2 mg/dl. Nach der Sättigung des Trägers der einzelnen Vorrichtungen in der Probe iiess man
die Reaktion 60 Sekunden ablaufen. Dann wurde alle überschüssige Probe aus der Vorrichtung abgewaschen, indem man J; .o:-
richtung einen Augenblick unter strömendes Wasser hielt und überschüssige Flüssigkeit mit üblichem Gesichtstuch aufsaugte.
Die Vorrichtung wurde dann in eine Aufzeichnungs-Beugungsspektrofotometer
gegeben und die Farbänderung wurde bei 550Nanometer (nm) 20 Sekunden und dann nochmals 60 Sekunden nach dem
Waschen gemessen. Die Extinktionswerte wurden in K/S-VJerte in der vorher angegebenen Weise überführt und die Ergebnisse
werden in Tabelle 1 gezeigt.
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ORIGINAL INSPECTED
Formel I - 0,52 mM (0,125 g/ TMP pro 1000 I.U. Glucoseoxidase
(GOD)
Glucosemenge (mg/dl) |
20 | K Sekunden |
K Sekunden |
/ s | 60 | Sekunden |
93 | 0,219 | 0,278 | 0,215 | |||
201 ,9 | 0,677 | 0,630 | 0,558 | |||
302,4 | 1 ,460 | 1 ,170 | 1 ,000 | |||
372,2 | 1 ,710 | 1 ,550 | 1,150 | |||
Formel II - 1,3ß mM | (0,31! | 3g/ TMB pro 1 | 000 | I.U. | GOD | |
Glucosemenge (mg/dl) |
20 | K Sekunden |
/ S | 60 | Sekunden | |
93 | 0,238 | 0,239 | ||||
201 ,9 | 0,651 | 0,640 | ||||
302,4 | 1 ,200 | 1 ,100 | ||||
372,2 | 1 ,560 | 1 ,310 | ||||
Formel III - 2,60 mM | (0,625 g/ TMB pro | 1000 | I. U. | GOD | ||
Glucosemenge (mg/dl) |
20 | / s | 60 | Sekunden | ||
93 | 0,283 | |||||
201 ,9 | 0,634 | |||||
302,4 | 1 ,160 | |||||
372,2 | 1,530 |
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Formel IV - 3,90 ηM (0,938 g)TMB pro 1000 I.U. GOD
Glucosemonge (mg/dl) |
9 |
93 | 4 |
201 , | 2 |
302, | |
372, | |
K / S | 2o Sekunden | 60 Sekunden |
0,279 | 0,281 | |
0,716 | 0,715 | |
1 ,280 | 1 ,210 | |
1 ,480 | 1 ,430 | |
Fig. 1 bis 4 geben grafisch die in Tabelle I für die Vorrichtungen,
enthaltend Formulierungen I bis IV angebebenen Werte an. Die durchgehenden Linien geben die K/S-Ablesung,
die 20 Sekunden nach dem Waschen der Vorrichtung gemessen wurde, an, und die gebrochenen Linien geben die K/S-Ablesung
nach 60 Sekunden an. Fig. 5 ist eine grafische Darstellung und gibt den Prozentsatz der beobachteten Farbänderung an,
ausgedrückt als ( K/S )/K/S χ 100) für die die Formulierungen I bis IV enthaltenden Vorrichtungen.
Eine stabile blaue Farbe wurde praktisch unmittelbar nach Entfernen
der überschüssigen Probe von der Vorrichtung mit den Formulierungen III und IV beobachtet, während eine nachlassende
Färbung, die einen Fehler im Nachweis der Glucosemengen ergab, bei den Vorrichtungen mit den Formulierungen I und II festgestellt
wurde. Die Vorrichtungen mit den Formulierungen III und IV haben höhere TMB-Konzentrationen und ergeben im wesentlichen
einen unmittelbaren Farbendpunkt, der anschliessend stabil bleibt.
Fig. 1 und 2 zeigen, dass eine beachtliche Änderung in den Ablesungen bei 20 Sekunden und bei 60 Sekunden erfolgt. Diese
Ablesungen sind proportional der gebildeten Menge des Chromogen. Die Menge der durch solche Vorrichtungen gemessenen Glucose
ist deshalb absolut unzuverlässig. Die praktisch identischen Ablesungen, die in den Fig. 3 und 4 gezeigt werden, demonstrieren
die Stabilität der erfindungsgemäsn gebildeten Farbe.
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Fig. 5 zeigt den Prozentsatz der Farbänderung zwischen der Ablesung nach 20 Sekunden und nach 60 Sekunden, der mehr als
30 % bei der Formulierung I ausmacht und weniger als 30 % bei der Formulierung III. Durch die Erfindung wird deshalb
gegenüber dem Stand der Technik eine mehr als 10-fache Verbesserung
erzielt.
030062/0601
e e
r s e
it e
Claims (16)
1. Testmittel zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe,
dadurch gekennzeichnet ,
dass es Glucoseoxidase, eine peroxidativ aktive Substanz
und einen 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin-Indikator in einer
ausreichenden Menge enthält, um bei Berührung des Testinittels
mit einer vorbestimmten Menge einer glucosehaltigen
Probe ein stabiles gefärbtes Reaktionsprodukt zu bilden.
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ORIGINAL INSPECTED
2351221
2- Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Reaktionsprodukt reduzierte
und oxidierte Formen des Indikators in stabilem Gleichgewicht
enthält.
3. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 3,3',5,5'-Tetraalkylbenzidin
in einer Konzentration von wenigstens etwa 3,5 mMol pro
1000 internationale Glucoseoxidase-Aktivitätseinheiten
vorliegt. .
4. Testmittel geraäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, dass das 3,31 ,5^5 '-Tetra--
alkylbenzidin ein 3,3*,5,5'-Tetramethylbenzidin ist.
5. Testmittel gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das 3,3' ,5,5'-Tetraalkylbenzidin 3-Methyl-3 ·-methyl
f5-äthylf5''-äthylbenzidin
ist.
6. Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet , dass sie aus einem Träger, der mit einem Testmittel gemäss einem
der Ansprüche 1 bis 3 verbunden ist, besteht.
7. Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet , dass es aus einem Träger, der mit, einem Testmittel gemäss
Anspruch 4 verbunden ist, besteht.
8. Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet , dass es aus einem Träger, der mit einem Testmittel gemäss Anspruch
5 verbunden ist, besteht.
030062/0601
9. Testvorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeit:»
dadurch gekennzeichnet , dass Äie Vorrichtung aus einer Trägermatrix besteht, in weicher
«ine 0,5 χ 1 cm Trägermatrix eingelagert ist, welche etwa 2,7 internationale Glucoseoxidase-Einheiten* etwa 5#4
Internationale Peroxidase-Einheiten und wenigstens 1,1 mg
Tetramethylbenzidin enthält.
10. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflussigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger mit einem
Testmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3 vereint.
11. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet , dass man einen Träger mit einem
Testmittel gemäss Anspruch 4 vereint.
12. Verfahren -zur Herstellung einer Vorrichtung zur Bestimmung
von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet , dass man einen Träger mit einem
Testmittel gemäss Anspruch 5 vereint.
13. Verfahren zur Bestimmung, von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe , dadurch gekennzeichnet , dass
man eine vorbestimmte Menge der Probe mit dem Testmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Berührung bringt und
die entstehende Farbänderung beobachtet.
14. Verfahren zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe,
dadurch gekennzeichnet , dass man eine vorbestimmte Menge der Probe mit dem Testmittel nach
Anspruch 4 in Berührung bringt und die entstehende Farbänderung beobachtet.
030062/0601
15. Verfahren zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe,
dadurch gekennzeichnet , dass man eine vorbestimmte Menge der Probe mit dem Testmittel
nach Anspruch 5 in Berührurtg bringt und die entstehende Farbänderung
beobachtet.
16. Verfahren zur Bestimmung von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe,
dadurch gekennzeichnet , dass man die Probe mit der Testvorrichtung gemäss Anspruch 6
in Berührung bringt und die entstehende Farbänderung beobachtet.
030062/0601
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