DE2939165C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebenen
cytotoxischen Produkte und das im Anspruch
6 angegebenen Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Ansprüche 2 bis 5 betreffen
Ausgestaltungen des Anspruchs 1 und die Ansprüche 7 bis 12
Ausgestaltungen des Anspruchs 6.
Seit vielen Jahren hat die Krebsbehandlung zu zahlreichen
Untersuchungen Anlaß gegeben. Insbesondere sind bereits
zahlreiche Substanzen zur Chemotherapie des Krebses durch
mehr oder weniger selektive Zerstörung der Krebszellen
vorgeschlagen worden. Obwohl gewisse Fortschritte erzielt
werden konnten, wird die Chemotherapie des Krebses durch
die unspezifische Toxicität antineoplastischer Mittel gegenüber
normalen Zellen mit hoher Teilungsrate, wie die
Stammzellen der blutbildenden Organe, begrenzt. Wenn es
der Behandlung nicht gelingt, auch die letzten Krebszellen
zu vernichten, führen diese schließlich zu einem Rezidiv
des Krebses.
Um die Toxicität von Cytostatica gegenüber normalen Zellen
zu vermindern, ist schon eine Reihe von Versuchen ausgeführt
worden [siehe insbesondere: Compte rend. Acad. des
Sciences de Paris 246, S. 1626 (1958); Brit. Med. J. 3.
S. 495 (1972); Science 169, S. 68 (1970); und Cancer
Research 35, S. 1182 (1975)]. Bei diesen Versuchen zielte
man darauf ab, Moleküle mit cytotoxischer Aktivität mit
Antikörpern zu koppeln, die gegen die Krebszellen gerichtet
sind, um dadurch in einzigartiger Weise ihre Fixierung an
den Zielzellen zu erreichen. Diese Versuche haben jedoch
in der Praxis nicht die gewünschten Resultate erbracht,
hauptsächlich, weil die von den Antikörpern getragenen
cytotoxischen Substanzen bei der Einführung in den
Organismus aktiv blieben und die Teilung der normalen
Zellen hemmten, bevor sie die Krebszellen erreichten.
Es ist bekannt, daß Ricin, ein toxisches Lectin aus den
Samen von Ricinus communis, aus zwei Polypeptidketten
aufgebaut ist, die durch eine Disulfidbrücke miteinander
verbunden sind. Die Kette A oder "Wirkungskette" hat eine
hohe cytotoxische Aktivität durch Hemmung der
Proteinsynthese in der Zelle. Die Kette A vermag jedoch
nicht wesentlich in die Zelle einzudringen und dort ihre
biologische Aktivität zu entfalten. Dagegen hat die Kette
B oder "Haptenkette" des Ricins die Eigenschaft, an der
Oberfläche der Zelle Saccharidmotive zu erkennen und mit
ihnen eine sehr feste Bindung einzugehen. Bestimmte
Vorgänge ermöglichen dann das Eindringen des Ricin-Moleküls
in das Innere der Zelle, wo nun die Kette A ihre toxische
Wirkung ausüben kann. Die Toxizität des Ricins ist um so
unspezifischer, je mehr Zellen der Gesamtheit der
tierischen Zellen determinierende Saccharide tragen, die
von der Kette B erkannt werden.
Moolten et al. beschreiben in Ann. New York Acad. of
Sciences 277, 690-699 (1976) ein Produkt, das dadurch
bis zu einem gewissen Grad cytotoxische Eigenschaften hat,
das zwischen der Kette A des Ricins und einem Anti-(C 58-NT)-D-globulin
(s. S. 694) Bindung besteht. Die Verbindung
zwischen den beiden Molekülteilen wird mit Hilfe der
Reaktion von Glutaraldehyd bewirkt. Realisiert man das
Produkt gemäß Moolten, et al., zeigt sich jedoch, daß dieses
Produkt die sehr vorteilhaften Eigenschaften der Kette A des
Ricins schnell verliert und daß dies wahrscheinlich wegen
der mittels Glutaraldehyd geschaffenen Molekülbrücke
geschieht.
Die bei diesem Versuch in vitro erhaltene Spezifizität war
dazu außerordentlich gering, und zwar aus folgenden
Gründen:
Die Kette A war vor dem Konjugieren mit den Antikörpern
nicht von der Kette B isoliert worden.
Die verwendeten Antikörper waren nicht rein, sondern
enthielten noch wesentliche Mengen von Proteinen, die keine
Antikörper waren, sowie andere Antikörper als diejenigen,
die spezifisch gegen das Ziel-Antigen gerichtet waren.
Die Kopplung des Toxins mit den Antikörpern wurde, wie
gesagt, mit Hilfe von Glutaraldehyd ausgeführt, eine
Verbindung, die leicht zu einer Denaturierung der
Antikörper oder des Toxins durch Bildung von Brücken führt,
die nicht im Innern einer Peptidkette oder zwischen
Peptidketten angeordnet sind, was zu einer von Zufall
bestimmten Polymerisation führt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die
Bereitstellung dauerhaft aktiver Substanzen für die
Krebsbehandlung, die die cytotoxische Kette A des Ricins
enthalten und die mit einem spezifischen Immunglobulin der
Krebszellen in bestimmter Weise gekoppelt ist.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung werden künstliche
gemischte Moleküle, auch als "konjugierte" Moleküle
bezeichnet, hergestellt, in denen die Kette A des Ricins
durch die kovalente Bindung vom Disulfid-Typ nicht mit der
Kette B, sondern mit einer Proteinstruktur verbunden ist,
die selektiv ein Antigen an der Oberfläche von dieses
Antigen tragenden Zellen zu erkennen vermag. Diese
Proteinstruktur kann ein spezifisches Immunglobulin des
gewünschten Antigens oder ein Fragment dieses Immunglobulin
sein, das das gleiche spezifische Erkennungsvermögen hat.
Diese Substanzen haben die Eigenart, daß sie beim Einführen
in den Organismus inaktiv bleiben und erst nach der
Fixierung an und dem Eindringen in die Zielzellen aktiv
werden. Das verwendete Immunglobulin kann ein spezifischer
Antikörper für ein bestimmtes Antigen oder ein Fragment
dieses Moleküls mit einem spezifischen Erkennungsvermögen
für das Antigen sein, beispielsweise Fragmente, die
üblicherweise mit Fab, F(ab)′ oder F(ab′)₂ bezeichnet
werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die in den
Ansprüchen 1 bis 5 definierten Stoffe und die in den
Ansprüchen 6 bis 12 definierten Verfahren zu ihrer
Herstellung. Die erfindungsgemäßen konjugierten
Verbindungen haben eine ausgeprägte Spezifizität für die
Zielzellen und sind zur Krebsbehandlung geeignet.
Die Samen von Ricinus communis (Wunderbaum) beinhalten ein
toxisches Lectin, das unter dem Namen Ricin bekannt ist.
Sie enthalten außerdem noch ein anderes, weniger giftiges
Lectin, das wegen seiner agglutinierenden Wirkung auf Zellen
und insbesondere die Erythrocyten als Agglutinin bezeichnet
wird. Dieses Agglutinin ist aus zwei Untereinheiten
aufgebaut, die - wie das Ricin - durch eine Disulfidbrücke
miteinander verbunden sind und aus zwei Glykoproteinketten
bestehen.
Darüber hinaus enthält das Ricin noch andere Proteine verschiedener
Natur sowie eine große Menge von Lipiden, die
das Rizinusöl bilden.
Die Gewinnung des Ricins beginnt mit dem Mahlen der Samen
von Ricinus communis. Man erhält einen Brei, der von den
Lipiden mit Hilfe eines Fettlösungsmittels befreit werden
muß, beispielsweise durch wiederholtes Ausziehen mit Äthyläther.
Nach dem Trocknen wird das erhaltene Pulver in der
Kälte durch Verrühren mit einer schwach sauren NaCl-Lösung
extrahiert, am besten bei einer Temperatur unterhalb 4°C.
Nach dem Abtrennen der unlöslichen Bestandteile wird der
Extrakt intensiv dialysiert, zuerst gegen Wasser, dann gegen
eine Pufferlösung von geringer Ionenstärke (10millimolare
Tris-HCl-Lösung von pH 7,7). Im Laufe der Dialyse
fällt ein geringer Niederschlag aus, der durch Filtrieren
oder Zentrifugieren abgetrennt wird.
Der so erhaltene Extrakt enthält die gesamten löslichen
Proteine der Ricinussamen, nämlich Ricin, Agglutinin und
verschiedene andere Proteine. Die Lösung kann bei -20°C
eingefroren und bei dieser Temperatur mehrere Wochen aufbewahrt
werden.
Die Reingewinnung des Ricins aus dem Rohextrakt ist schon
in der Literatur beschrieben worden. Im allgemeinen werden
chromatographische Methoden angewendet: Ionenaustauschchromatographie,
Molekularsiebchromatographie oder Affinitätschromatographie.
Sehr oft werden diese verschiedenen
Methoden miteinander kombiniert, was zu langwierigen und
empfindlichen Verfahren führt, mit denen nur schwer wesentliche
Mengen Ricin zu gewinnen sind. Mit Hilfe des
Verfahrens gemäß der Erfindung ist es möglich, reines
Ricin durch einmalige Affinitätschromatographie zu erhalten,
bei der zuerst die Fremdproteine und dann das Agglutinin
abgetrennt werden. Hierzu wird der Rohextrakt auf
eine Säule aus "Sepharose 4B" (Agarose-Gel in Form kugelförmiger
Teilchen in einer Konzentration von 4%) gegeben,
die dann eluiert wird. Zuerst werden mit einer 50millimolaren
Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,7 die Proteine
des Ricinussamens eluiert, die keine Lectine sind;
dann eluiert man mit einer 0,28- bis 0,56millimolaren
Galactoselösung das reine Ricin. Durch Eluieren mit einer
0,1molaren Galactoselösung erhält man das Agglutinin.
Die Trennung zwischen den beiden Bestandteilen durch eine
einzige Chromatographie ist vollständig, wenn die Menge
der "Sepharose 4B" so groß ist, daß die Gesamtbeladung der
Säule mit Proteinen das Aufnahmevermögen der Säule nicht
überschreitet.
Nach diesem Schritt läßt sich durch Konzentration mittels
Ultrafiltration leicht eine Lösung von reinem Ricin in einem
Puffer von schwacher Ionenstärke erhalten, die 5 bis
10 mg/ml Produkt und auch noch ein wenig (etwa 0,4 mmol/l)
Galactose enthält. Nach dem Einfrieren bei -20°C kann
diese Lösung mehrere Wochen aufbewahrt werden.
Die beiden das Ricin bildende Ketten können durch selektive
Spaltung der einzigen sie verbindenden Disulfidbrücke
getrennt werden. Diese Spaltung wird mit Hilfe eines Reduktionsmittels,
wie 2-Mercaptoäthanol oder Dithiothreitol,
in einer Konzentration von mindestens 2% im Reaktionsmittel
bewirkt.
Die Trennung der beiden Ketten mit Hilfe von Ionenaustauschern
auf verschiedenen Trägern ist schon beschrieben worden.
Diese Methoden beruhen im wesentlichen auf den verschiedenen
isoelektrischen Punkten der beiden Ketten. Bei
dem Verfahren gemäß der Erfindung wird bei der Trennung
der beiden Ketten A und B des Ricins nicht nur der Unterschied
in den isoelektrischen Punkten der beiden Ketten,
sondern auch ihre verschiedene Affinität zu chromatographischen
Polysaccharid-Trägern genutzt, die Galactosederivate
enthalten. Die Verwendung solcher Träger bietet
auch den Vorteil, daß Spuren eventuell nicht gespaltenen
Ricins, die in der Mischung noch vorkommen könnten, zurückgehalten
werden.
In der Praxis wird die nach dem vorstehend beschriebenen
Verfahren erhaltene Lösung des Ricins in einem Puffer mit
schwacher Ionenstärke bei Umgebungstemperatur mit soviel
Reduktionsmittel (z. B. 2-Mercaptoäthanol) versetzt, daß
dessen Konzentration 2,5% beträgt, und auf eine Säule aus
"DEAE CL Sepharose 6B" (ein zur Ionenaustauscherchromatographie
verwendetes Agarose-Gel, das durch Vernetzen von
Agarose mit 2,3-Dibrompropanol, Entfernen von Sulfatgruppen
durch alkalische Hydrolyse, Einführen von Diäthylaminoäthyl-Gruppen
und Konzentrieren auf 6% im Gel hergestellt
wird) in dem gleichen Puffer wie derjenige, der das Reduktionsmittel
enthält, gegeben. Die beiden Ketten werden
durch Ionenbindung an DEAE-Gruppen an dem Material gebunden,
die Kette B außerdem noch durch Affinität zur Sepharose-Grundmasse.
Die Kette A wird mit einer Pufferlösung von höherer Ionenstärke
und mit höherem pH-Wert in Gegenwart des Reduktionsmittels
eluiert, um eine Rekombination der beiden Ketten
zu verhindern (Pufferlösung: 0,1-molare Tris-HCl-Lösung
mit einem pH-Wert von 8,4, die 0,1 mol/l NaCl und 2,5%
2-Mercaptoäthanol enthält). Unter diesen Bedingungen bleibt
die Kette B völlig gebunden; sie kann mit einer Mischung
aus der gleichen Pufferlösung, 0,2 mol/l NaCl und 0,1 mol/l
Galactose eluiert werden.
Bei einem anderen Verfahren zum Trennen der Ketten A und B
wird zur Chromatographie ein Träger verwendet, auf dem
sich gleichzeitig Ionenaustausch- und Molekularsiebvorgänge
abspielen. Benutzt wird "QAE Sephadex A 50" (stark basischer
Ionenaustauscher, der durch Anlagerung quaternärer
Ammoniumgruppen über Ätherbindungen an Sephadex oder ein
Dextran-Gel erhalten wird), aus dem die reine Kette A mit
100millimolaren Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 8,4,
die 0,5% 2-Mercaptoäthanol enthält, eluiert wird. Die
Kette B läßt sich mit der gleichen Pufferlösung, die noch
75 mmol/l NaCl enthält, eluieren.
In beiden Fällen ist die Wahl des chromatographischen Trägers
sehr wichtig. Bei Versuchen mit anderen Trägern konnte
keine gute Abtrennung der Kette A erzielt werden.
Die nach dem einen oder anderen beschriebenen Verfahren
erhaltene Kette A hat sich bei verschiedenen analytischen
Prüfungen als sehr rein erwiesen, so daß eine weitere Reinigung
nicht notwendig ist. Für die Kopplung mit Antikörpern
werden jedoch verhältnismäßig konzentrierte Lösungen
benötigt, die kein Reduktionsmittel enthalten dürfen. Die
nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene
Lösung der Kette A in Tris-Puffer wird daher gegen eine
10millimolare Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von
6,5 dialysiert, wodurch das Tris, das Natriumchlorid, das
2-Mercaptoäthanol und Spuren Galactose entfernt werden.
Die so erhaltene Lösung wird auf eine Säule aus Carboxymethylcellulose
gegeben, aus der die Kette A mit einer 125millimolaren
Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, die 1 mmol/l
EDTA enthält, eluiert wird. Man erhält so eine verhältnismäßig
konzentrierte Lösung, die etwa 5 mg/ml Kette A
enthält und zur Kopplungsreaktion verwendet werden kann.
Man kann die verdünnte Lösung auch dadurch konzentrieren
und reinigen, daß man sie auf einem Träger aus "C. M.
Sepharose" einer kombinierten Einwirkung von Ionenaustausch-
und Affinitätsvorgängen unterwirft. Man kann so
eine verhältnismäßig konzentrierte Lösung von sehr hoher
Reinheit erhalten. Aus einer solchen Lösung fällt beim
Abkühlen die Kette A in kristalliner Form aus.
Die so hergestellte Kette A (in Form einer konzentrierten
Lösung oder in Kristallform) zeigt keine unspezifische
Toxicität gegenüber Zellsystemen oder tierischen
Organismen mehr und kann daher zur Herstellung konjugierter
Verbindungen verwendet werden, deren Spezifität
ausschließlich von den Antikörpern bestimmt wird.
Die Herstellung der Antikörper wird so
ausgeführt, daß man reine Antikörper erhält, die keine
Moleküle ohne Antikörperaktivität enthalten, so daß die
Antikörper den konjugierten Endprodukten höchste Wirkungsspezifität
verleihen, ein Merkmal, das bei den in der
Literatur beschriebenen Präparaten nicht beobachtet wird.
Die Immunisierung wird nach einem klassischen Verfahren
wiederholt über mehrere Monate ausgeführt, um bei den
Tieren eine Hyperimmunisierung zu erzielen. Man erhält
so mehrere Liter Immunserum, da man bis zur Reinigung
bei -20°C aufbewahren kann.
Die Reinigung wird mit Hilfe der Immunadsorption an einem
Sepharose-Gel 4B ausgeführt, das durch Behandeln mit Bromcyan
aktiviert wird und an dem ein dem zu reinigenden Antikörper
entsprechendes Antigen angelagert wird. Nach dem
Abtrennen der flüssigen Phase können alle nicht an das
Gel gebundene Proteine durch gründliches Waschen entfernt
werden; dann setzt man die an das Gel gebundenen Antikörper
durch ein geeignetes Eluierungsmittel frei. Diese
Methode kann auf verschiedene Antikörper mit unterschiedlichen
Spezifitäten angewendet werden.
Auch diese Weise kann die Gesamtheit der Antikörper so
fraktioniert werden, daß man Antikörper mit höchster Affinität
für das Antigen erhält. Bei einem Überschuß von
Antikörpern im Verhältnis zu der an dem Gel gebundenen
Menge Antigen hält das Gel bevorzugt Antikörper von höchster
Affinität zurück.
In der Praxis arbeitet man mit einem Überschuß an Antikörpern,
so daß nur ein Teil der Antikörper des Immunserums
von der Säule gebunden wird, während der Rest beim
Waschen entfernt wird. Unter diesen Bedingungen ist die
mittlere Affinität der durch das Waschen entfernten Antikörper
geringer als diejenige der Antikörper, die an die
Säule gebunden sind und später eluiert werden. Man erhält
so eine Gesamtheit von Antikörpern mit einer homogeneren
Affinität als diejenige der in dem Ausgangsimmunserum enthaltenen
Antikörper.
Wenn man mit einer großen Menge Antikörper arbeiten will,
zu deren Reinigung Säulen großer Abmessungen erforderlich
sind, bestimmt man zuvor die Menge Immunserum, die auf
einer vorgegebenen Menge antigenhaltigen Gels verarbeitet
werden kann, indem man eine Reihe von Mikroimmunadsorptionen
mit steigenden Mengen Immunserum ausführt. Durch Bestimmung
des Antikörpergehalts in der ablaufenden Flüssigkeit
mit Hilfe von Radioimmunmethoden läßt sich das Verhältnis
von Antigen/Antikörper festlegen, bei dem die unerwünschte
Fraktion der zu Beginn eingeführten Antikörper mit der
Flüssigkeit abläuft.
Dieser Teil betrifft erfindungsgemäß das Verbinden eines
spezifischen Immunglobulins eines bestimmten Antigens oder
eines Fragments dieses Moleküls mit der Fähigkeit zur
spezifischen Erkennung des Antigens mit der Kette A des
Ricins über eine kovalente Bindung vom Disulfid-Typ. Für
die Wahl einer Disulfid-Bindung zwischen der Kette A und
dem Immunglobulin sprachen folgende Argumente:
Diese Art der Bindung ist diejenige, die im natürlichen
Ricinmolekül vorkommt, und man darf annehmen, daß sie
besonders geeignet ist, die Kette A in einer Beschaffenheit
darzubieten, die ihr Eindringen in die Zelle
erleichtert und dabei die grundlegende biologische Eigenschaft,
die Hemmung der Proteinsynthese, aufs beste
erhält.
Diese Bindungsart ist biochemisch labil, so daß gewährleistet
ist, daß die so gekoppelte Kette A sich im Innern
der Zelle von dem Trägerprotein lösen kann.
Die Kette A des Ricins hat in ihrer Struktur nur einen
einzigen Cysteinrest, so daß eine einzige SH-Gruppe
zur Herstellung einer Disulfidbindung ausreicht.
Infolgedessen sind die durch Umwandlung der SH-Gruppe
in eine Disulfidbrücke gebildeten konjugierten Verbindungen
chemisch gut definiert und modifizieren nicht
die Struktur der Kette A, so daß die Erhaltung der biologischen
Aktivität gewährleistet ist.
Es gibt wirksame Methoden zur Herstellung einer solchen
Disulfidbindung unter verhältnismäßig milden Bedingungen,
so daß eine Unversehrtheit der biologischen Eigenschaften
der die konjugierten Verbindungen bildenden Komponenten
gewährleistet ist.
Zur Herstellung derartiger konjugierter Verbindungen müssen
die zu koppelnden Proteine mindestens ein Schwefelatom
enthalten, das natürlicherweise zur Bildung der gesuchten
Disulfidbrücke befähigt ist oder künstlich dazu befähigt
gemacht werden kann; diese Schwefelatome können in den
Proteinen von vornherein enthalten sein oder chemisch in
diese eingeführt werden. Wie vorstehend bereits erwähnt,
enthält die Kette A des Ricins natürlicherweise ein einziges
Schwefelatom, das die gewünschte Kopplung ermöglicht.
Es ist das Schwefelatom der Thiolgruppe in dem einzigen
Cysteinrest in der Kette A. Bei dem Immunglobulinen oder
ihrer Fragmenten sind mehrere Fälle in Betracht zu ziehen:
- 1. In den Proteinen der vollständigen Immunglobuline kommen
natürlicherweise weder eine freie Thiolgruppe noch
andere Schwefelatome vor, die zu einer Kopplung herangezogen
werden können. In das Molekül des Immunglobulins
muß man daher ein oder mehrere Schwefelatome
künstlich in der Weise einführen, daß
die biolgischen Eigenschaften des Immunglobulins nicht wesentlich verändert werden;
das Schwefelatom oder die Schwefelatome mit einem oder mehreren Molekülen der Kette A des Ricins eine Disulfidbrücke bilden können. - 2. Bei dem Fragment Fab sind die Verhältnisse die gleichen wie bei dem vorstehend beschriebenen Fall.
- 3. Bei Verwendung eines Fragmentes vom Typ Fab′ kann man das in der freien Thiolgruppe enthaltene Schwefelatom zum Ankoppeln der Kette A benutzen. Man kann aber auch künstlich ein oder mehrere Schwefelatome einführen; in diesem Falle ist es zweckmäßig, die freie Thiolgruppe zuvor in stabiler Weise zu blockieren, beispielsweise durch Alkylierung.
- 4. Wenn man schließlich ein Immunglobulinfragment F(ab′)₂ ankoppeln will, muß man wie bei einem vollständigen Immunglobulin künstlich eine oder mehrere Schwefelgruppen in das Fragment F(ab′)₂ einführen.
In allen Fällen, in denen in das Immunglobulin oder seine
Fragmente ein oder mehrere schwefelhaltigen Radikale eingeführt
werden, ist jede Substitution an der Erkennungsstelle
für das Antigen oder in seiner unmittelbaren Umgebung
zu vermeiden, da dadurch die Erkennungseigenschaften
des Antikörpers beeinträchtigt werden könnten. Um jedes
Risiko auszuschließen, kann man die Erkennungsstelle für
das Antigen während der Substituionsreaktion vorübergehend
blockieren, indem man den Antikörper zuvor mit dem spezifischen
Antigen oder einem anderen Antigen, das eine Kreuzreaktion
ergibt, oder auch einem geeigneten Hapten behandelt.
Die Behandlung zum zeitweiligen Schutz kann entweder in
flüssiger Phase ausgeführt werden, wenn der Antigen- (oder
Hapten-)Antikörper-Komplex in dem Reaktionsmittel löslich
ist; sie kann in heterogener Phase vorgenommen werden,
wenn dieser Komplex von Natur aus unlöslich oder mit Hilfe
eines geeigneten Verfahrens absichtlich unlöslich gemacht
worden ist, insbesondere durch Fixieren des Antigens (oder
Haptens) an einen unlöslichen Träger in der Weise, daß der
so erhaltene modifizierte Träger eine ausreichende Affinität
für den Antikörper hat.
Nach ausgeführter Substitution wird die Erkennungsstelle
des Antikörpers für das Antigen mit Hilfe eines geeigneten
Verfahrens zum Entfernen des Antigens wieder deblockiert,
um das spezifische Erkennungsvermögen des Antikörpers wiederherzustellen.
Zur Herstellung der Disulfidbrücke zwischen den beiden
Proteinen kann man nicht einfach die beiden zu paarenden
Komponenten, die beide eine SH-Gruppe enthalten, zusammenbringen
und eine Oxydation vornehmen. Unter diesen Bedingungen
ist die Kopplungsreaktion eine Gleichgewichtsreaktion,
die nur schwer vollständig in eine Richtung verläuft.
Darüber hinaus ist die erwünschte Reaktion von der
Bildung von Polymeren begleitet, die die beiden Komponenten
enthalten, so daß die Ausbeute an dem gewünschten Produkt
sehr gering ist und dieses außerdem schwer zu entfernende
Verunreinigungen enthält.
Erfindungsgemäß wird die Herstellung der konjugierten Verbindungen
in der Weise vorgenommen, daß man eines der Proteine,
das eine freie SH-Gruppe hat, mit dem anderen Protein
umsetzt, nachdem dessen SH-Gruppe mit Hilfe eines geeigneten
schwefelhaltigen Radikals in ein gemischtes Disulfid
überführt und dadurch reaktionsfähiger gemacht
worden ist. Die Herstellung der konjugierten Verbindung
kann duch folgendes Schema wiedergegeben werden:
P¹-SH + P²-S-S-X → P¹-S-S-P² + XSH ,
worin P¹ und P² die zu koppelnden beiden Proteine und X
ein aktivierendes Radikal bedeuten. Aus diesem Schema wird
sofort ersichtlich, daß die Kopplungsreaktion in jedem
Falle stattfinden kann, ob nun P¹ das Immunglobulin oder
sein Fragment und P² die Kette A des Ricins darstellen
oder umgekehrt.
Um die freie SH-Gruppe der Kette A des Ricins zu aktivieren,
verwendet man eine Lösung der Kette A, die nach dem
vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist,
und unterwirft die Kette A einer Austauschreaktion gemäß
folgender Gleichung:
P²-SH + X-S-S-X P²-S-S-X + XSH (1)
worin P²-SH die Kette A des Ricins und X ein aktivierendes
Radikal bedeuten.
Insbesondere bezeichnet X eine Pyridyl-(2)- oder -(4)-Gruppe,
die mit einem oder mehreren Alkylradikalen, Halogen oder
Carboxylgruppen substituiert sein kann, oder eine Phenylgruppe,
die mit einer oder mehreren Nitro- oder Carboxylgruppen
substituiert sein kann. Die Reaktion (1) ist eine
Gleichgewichtsreaktion, aber das Gleichgewicht kann dadurch
nach rechts verschoben werden, daß man einen großen
molaren Überschuß des Reagenzes XSSX einsetzt, das im allgemeinen
nicht kostspielig und leicht erhältlich ist. Das
Fortschreiten der Reaktion kann man durch Spektrophotometrie
im ultravioletten oder sichtbaren Bereich des Lichtes
kontrollieren, da die sich bildende Verbindung XSH in
diesen Bereichen das Licht stark absorbiert. Wenn die Reaktion
den gewünschten Fortschritt erreicht hat, werden das
Reagenz X-S-S-X und das Reaktionsprodukt X-SH durch Dialyse
oder Filtration über ein Molekularsieb-Gel entfernt.
Auf diese Weise erhält man eine reine Lösung der Verbindung
P²-S-S-X in dem gewählten Puffer. Falls notwendig,
kann man diese Lösung durch Einfrieren für mehrere Wochen
konservieren.
Ferner stellt man ein Immunglobulin her, das mit einer SH-Gruppe
substituiert ist. Zu diesem Zweck verwendet man die
nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Immunglobulin-Lösung
entweder als solche oder nach Blockierung
der Erkennungsstelle für das Antigen mit einem entsprechenden
Hapten und Entfernung des überschüssigen Haptens.
Durch Einwirkung von S-Acetyl-mercaptobernsteinsäure
auf das Protein kann man über die freien Aminogruppen
eine oder mehrere S-Acetyl-mercaptosuccinyl-Gruppen je Mol
Protein anlagern und dann durch Einwirkung von Hydroxylamin
in beschriebener Weise [Arch. Biochem. Biophys. 119,
S. 41-49 (1967)] freie Thiol-Gruppen bilden. Mit Hilfe
einer Dialyse kann man überschüssige Reagenzien und niedermolekulare
Reaktionsprodukte entfernen.
Alle diese Operationen werden in einem Phosphatpuffer mit
einem pH-Wert von 7,0 und bei Temperaturen ausgeführt, die
die Umgebungstemperaturen nicht überschreiten. Die am Ende
erhaltene Lösung wird von dem Hapten befreit, falls ein
solches als zeitweiliges Blockierungsmittel verwendet worden
ist. Wenn notwendig, kann die Lösung durch Ultrafiltration
o. dgl. konzentriert werden. Die Kopplung zwischen
den beiden Reaktionsteilnehmer kann durch einfaches
Zusammenbringen der Komponenten in wäßriger Lösung bei
Umgebungstemperatur für die Dauer von einigen Stunden bis
zu einem Tag nach folgendem Schema vorgenommen werden:
Das Fortschreiten der Reaktion kann durch spektrophotometrische
Bestimmung der gebildeten Verbindung X-SH verfolgt
werden. Diese wird durch Dialyse entfernt, und man erhält
eine Lösung der konjugierten Verbindung, die noch gereinigt
werden muß. Dies ist unbedingt notwendig, um vor allem
P²-S-S-X-Moleküle zu entfernen, die nicht reagiert haben
und die beim Verbleiben in dem Präparat diesem eine
unspezifische Toxicität verleihen könnten.
Das Reinigen kann nach verschiedenen bekannten Methoden
ausführt werden, beispielsweise durch fraktioniertes Fällen
mit einem mit Wasser oder Salzlösungen mischbaren organischen
Lösungsmittel, durch Permeations-Gel-Chromatographie
oder durch Affinitätschromatographie auf einer
Säule, die aus einem unlöslichen Träger besteht, auf dem
ein Antigen (oder Hapten) fixiert ist, gegen das der bei
der Herstellung der konjugierten Verbindung verwendete
Antikörper gerichtet ist.
Diese Reinigungsverfahren können direkt auf die dialysierte
Lösung aus der Kopplungsstufe angewendet werden. Man
erhält jedoch bessere Ergebnisse und vermeidet insbesondere
von Polymeren der konjugierten Verbindung, wenn man die
verbliebenen freien SH-Gruppen zuvor durch Umsetzung mit
einem Blockierungsreagenz, wie N-Äthylmaleinsäureimid,
schützt.
Die zum Koppeln benötigten Produkte sind hier die Kette A
des Ricins und das Immunglobulin (oder sein Fragment),
das durch eine Trägergruppe mit einem oder mehreren aktivierten
Schwefelatomen substituiert ist. Als Kette A des
Ricins wird das bei der beschriebenen Reinigung erhaltene
Produkt verwendet. Das mit einem aktivierten Schwefelatom
substituierte Immunglobulin wird aus dem Immunglobulin
selbst durch Substituieren mit einem selbst ein aktiviertes
Schwefelatom enthaltenden Reagenz gemäß folgender
Gleichung hergestellt:
Prot + Y-R-S-S-X → Prot-Y′-R-S-S-X ,
worin bedeuten:
Prot das Immunglobulin,
Y eine Gruppe, die das Eingehen einer kovalenten Bindung zwischen dem Reaganz und dem Protein ermöglicht,
R eine Gruppe, die gleichzeitig die Substituenten Y und -S-S-X enthalten kann, und
X ein aktivierendes Radikal.
Y eine Gruppe, die das Eingehen einer kovalenten Bindung zwischen dem Reaganz und dem Protein ermöglicht,
R eine Gruppe, die gleichzeitig die Substituenten Y und -S-S-X enthalten kann, und
X ein aktivierendes Radikal.
Die funktionelle Gruppe Y ist so beschaffen, daß sie mit
beliebigen funktionellen Gruppen in den Seitenketten der
das zu substituierende Protein aufbauenden Aminosäuren eine
kovalente Bindung eingehen kann. Unter diesen sind endständige
Aminogruppen der in dem Protein enthaltenden Lysylradikale
besonders angezeigt. In diesem kann Y insbesondere
sein:
eine Carboxylgruppe, die sich mit Aminogruppen des Proteins in Gegenwart eines Kopplungsmittels, wie eines Carbodiimids, vor allem eines in Wasser löslichen Derivats, wie 1-Äthyl-3-(3-diäthylaminopropyl)-carbodiimid, verbindet;
ein Carbonsäurechlorid, das direkt mit den zu acylierenden Aminogruppen zu reagieren vermag;
ein sogenannter "aktiver" Ester, wie ein o- oder p-, Nitro- oder Dinitrophenyl-ester oder ein Ester des N-Hydroxysuccinimids, der direkt mit den zu acylierenden Aminogruppen reagiert;
ein inneres Anhydrid einer Dicarbonsäure, wie Bernsteinsäureanhydrid, das spontan mit Aminogruppen reagiert und Amide bildet;
eine Iminoester-Gruppe
eine Carboxylgruppe, die sich mit Aminogruppen des Proteins in Gegenwart eines Kopplungsmittels, wie eines Carbodiimids, vor allem eines in Wasser löslichen Derivats, wie 1-Äthyl-3-(3-diäthylaminopropyl)-carbodiimid, verbindet;
ein Carbonsäurechlorid, das direkt mit den zu acylierenden Aminogruppen zu reagieren vermag;
ein sogenannter "aktiver" Ester, wie ein o- oder p-, Nitro- oder Dinitrophenyl-ester oder ein Ester des N-Hydroxysuccinimids, der direkt mit den zu acylierenden Aminogruppen reagiert;
ein inneres Anhydrid einer Dicarbonsäure, wie Bernsteinsäureanhydrid, das spontan mit Aminogruppen reagiert und Amide bildet;
eine Iminoester-Gruppe
worin R¹ eine Alkylgruppe
ist, die mit Aminogruppen des Proteins gemäß
folgender Gleichung zu reagieren vermag:
X ist eine funktionelle Gruppe, die mit einer freien
Thiol-Gruppe zu reagieren vermag.
Insbesondere kann X eine Pyridyl-(2)- oder -(4)-Gruppe, die
durch Alkylradikale, Halogen oder Carboxylgruppen substituiert
sein kann, oder auch eine Phenylgruppe sein, die
vorzugsweise durch eine oder mehrere Nitro- oder Carboxylgruppen
substituiert ist. X kann ferner eine Alkoxycarbonylgruppe,
wie Methoxycarbonyl, sein.
R bezeichnet ein Radikal, das gleichzeitig die Substituenten
Y und S-S-X enthalten kann. Es wird so gewählt, daß es
keine funktionellen Gruppen enthält, die bei den weiteren
Reaktionen die verwendeten Reaktionsteilnehmer oder synthetisierten
Produkte nachteilig beeinflussen. Insbesondere
kann R eine Gruppe
mit n zwischen 2 und 10
oder eine Gruppe R³-CH-CH-R⁴ sein, worin R⁴ Wasserstoff
oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und
R³ ein gegenüber den später verwendeten Reaktionsteilnehmern
inerter Substituent, wie eine Amidgruppe
worin R⁵ eine geradkettige oder verzweigte
Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere eine
tert.-Butylgruppe, ist, bedeuten.
Die Reaktion der Verbindung Y-R-S-S-X mit dem Immunglobulin
wird in homogener flüssiger Phase, meist in Wasser
oder in einer Pufferlösung, vorgenommen. Wenn die Löslichkeit
der Reaktionsteilnehmer es erfordert, kann man dem
Reaktionsmittel bis zu 20 Vol.-% eines mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittels, wie einen Alkohol, insbesondere
tert.-Butanol, zusetzen.
Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur ausgeführt; die
Reaktionsdauer liegt zwischen einigen und 24 Stunden. Danach
kann man durch Dialyse die Produkte mit verhältnismäßig
niedrigem Molekulargewicht und insbesondere überschüssiges
Reagenz entfernen. Mit Hilfe dieses Verfahrens
können 1 bis 5 Substitutionsgruppen je Mol Protein eingeführt
werden.
Unter Verwendung derartiger Verbindungen wird die Kopplung
mit der Kette A des Ricins dadurch ausgeführt, daß man die
beiden Proteine in wäßriger Lösung bei einer Temperatur,
die 30°C nicht überschreiten darf, zusammenbringt. Die
Reaktion dauert einige Stunden bis zu einem Tag und verläuft
nach folgender Gleichung:
Prot-Y′-R-S-S-X + P¹-SH → Prot-Y′-R-S-S-P¹ + X-SH ,
worin Prot-Y′-R-S-S-X das am Schwefelatom aktivierte substituierte
Immunglobulin (oder sein Fragment) und P¹-SH die
Kette A des Ricins bedeuten. Die erhaltene Lösung wird zum
Entfernen verhältnismäßig niedermolekularer Produkte dialysiert;
dann kann die konjugierte Verbindung nach bekannten
Verfahren, wie sie bei der Beschreibung des ersten Verfahrens
zur Herstellung der konjugierten Verbindung angegeben
sind, gereinigt werden.
An Hand nachstehender Beispiele wird die Erfindung veranschaulicht.
In diesen Beispielen bedeutet TPE eine 0,125m
Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, die
1 mmol/l Äthylendiaminintetraessigsäure (EDTA) enthält.
1 kg ganze, nicht geschälte Samen von Ricinus communis
wurden in einer Messermühle so zerkleinert, daß ein Brei
entstand, der sorgfältig mit 2 l auf 4°C abgekühltem
Äthyläther ausgezogen wurde. Nach dem Entfernen des Äthers
wurde die Entfettungsoperation noch zweimal mit jeweils
2 l Äther wiederholt. Nach dem letzten Entfernen des Äthers
wurde der Rückstand an der Luft getrocknet und bildete
400 g entfettetes Pulver. Dieses Pulver wurde in 3400 ml
einer auf 4°C abgekühlten 0,14m Natriumchlorid-Lösung
suspendiert, und der pH-Wert der Suspension wurde durch
Zusatz von Essigsäure auf 4 eingestellt. Die mit Eis gekühlte
Suspension wurde durch 30 s dauerndes intensives
Durchmischen in einem Messermixer homogenisiert und dann
unter fortgesetzter Eiskühlung 30 min stehengelassen. Dieser
Zyklus aus Homogenisieren und Stehengelassen wurde achtmal
wiederholt.
Nach beendeter Extraktion wurde die Suspension zentrifugiert,
und es wurden etwa 3400 ml einer klaren Lösung erhalten.
Diese wurde in ein Dialysierrohr von 10 cm Breite
übergeführt und zuerst gegen (kontinuierlich erneuertes)
destilliertes Wasser 48 Stunden und danach 24 Stunden gegen
10millimolare Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,7,
die mit einem Durchsatz von 1 l/h kontinuierlich erneuert
wurde, dialysiert. Auf diese Weise wurden 3400 ml einer
Rohlösung erhalten, die 12 mg/l Proteine enthielt. Diese
Lösung konnte bei -20°C gelagert werden.
Eine Kolonne von 100 mm Innendurchmesser wurde mit 5 l
"Sepharose 4B" gefüllt und mit 4°C abgekühlter 10millimolarer
Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,7 ins
Gleichgewicht gebracht.
Auf die Kolonne wurden 1700 ml - also die Hälfte - der nach
dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Rohlösung
mit einem Durchsatz von 300 ml/h gegeben. Sodann
wurde die Säule mit 3 l 10millimolarem Tris-HCl-Puffer
mit einem pH-Wert von 7,7 unter Beibehaltung des gleichen
Durchsatzes gewaschen. Das Filtrat, das die nicht an der
Säule fixierten Proteine enthielt, wurde verworfen.
Danach wurde die Säule unter Anwendung des gleichen Durchsatzes
mit 4 l des gleichen Puffers, der 0,050 g/l
(0,28 mmol/l) Galactose enthielt, eluiert und die Fraktion
aufgefangen. Anschließend wurde die Säule - ebenfalls unter
Anwendung eines Durchsatzes von 300 ml/h - mit 4 l der
gleichen Pufferlösung, die 0,100 g/l (0,56 mmol/l) Galactose
enthielt, eluiert und die erhaltene Fraktion mit der
vorhergehenden vereinigt, so daß 8 l Lösung erhalten wurden,
die etwa 300 µg/ml Ricin enthielt.
Um die Säule für eine weitere Behandlung benutzen zu können,
wurde sie mit 1 l Tris-HCl-Pufferlösung mit einem
pH-Wert von 7,7, die 18 g/l (0,1 mol/l) Galactose enthielt,
eluiert. Die dabei gewonnene Fraktion, die im wesentlichen
das Agglutinin enthielt, wurde verworfen. Nach dem Waschen
mit einem weiteren Liter der gleichen Pufferlösung, dann
mit mehreren Litern reinem Tris-HCl-Puffer mit pH 7 war
die Kolonne wieder betriebsbereit.
Die andere Hälfte der nach dem Verfahren des Abschnitts a)
erhaltenen Rohlösung wurde in gleicher Weise aufgearbeitet.
Die eluierten Fraktionen wurden vereinigt, so daß 16 l
einer Lösung des Ricins in 10millimolarem Tris-HCl-Puffer
von pH 7,7 mit einem mittleren Galactose-Gehalt
von 0,075 g/l erhalten wurden.
Diese Lösung wurde durch Membranfiltration in einer Zelle
von 150 mm Durchmesser unter Verwendung einer Membran, die
kugelförmigen Moleküle mit einem Molekulargewicht < 30 000
passieren ließ, konzentriert. Es wurden schließlich 762 ml
einer Lösung des Ricins in dem ursprünglichen Puffer erhalten,
die 6,7 mg/l Ricin enthielt. Diese Lösung konnte bei
-20°C gelagert werden.
Das so erhaltene Ricin hatte folgende charakteristische
Eigenschaften:
Molekulargewicht: 66 000 ± 5000, bestimmt durch Elektrophorese
in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat [J. Biol.
Chem. 244, S. 4406-4412 (1969)];
Isoelektrischer Punkt: 7,1, bestimmt durch Elektrophorese in einem Flüssigkeitsfaden [Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 5, Teil II, Seite 501, hrsg. von T. S. und E. Work (Nordholland)].
Isoelektrischer Punkt: 7,1, bestimmt durch Elektrophorese in einem Flüssigkeitsfaden [Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 5, Teil II, Seite 501, hrsg. von T. S. und E. Work (Nordholland)].
Alle auf das Ricin angewandten klassischen analytischen
Methoden lassen den Schluß zu, daß das nach vorstehend beschriebenem
Verfahren erhaltene Ricin rein ist.
150 ml der nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltenen
Ricin-Lösung, die etwa 1 g Ricin enthielt, wurden mit
3,75 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt und 2 h bei 20°C stehengelassen.
Diese Lösung wurde sodann auf eine Kolonne von 50 mm Innendurchmesser
gegeben, die mit 1800 ml "DEAE CL Sepharose 6B"
gefüllt war, die zuvor mit 0,1m Tris-HCl-Puffer von pH 8,4,
die 2,5 Vol.-% 2-Mercaptoäthanol enthielt, ins Gleichgewicht
gebracht worden war.
Die Säule wurde mit 300 ml 0,1m Tris-HCl-Puffer, pH 8,4,
der 0,1 mol/l NaCl und 2,5 Vol.-% 2-Mercaptoäthanol enthielt,
eluiert. Es wurde eine einzige Fraktion (von etwa
450 ml) aufgefangen, die die durch Elektrophorese identifizierte
Kette A in einer Konzentration von etwa 0,89 mg/ml
enthielt.
Diese Fraktion wurde sorgfältig in einem Dialyserohr von
10 mm Breite gegen 10millimolaren Phosphatpuffer, pH 6,5,
dialysiert. Danach wurde die Lösung auf eine Kolonne von
25 mm Innendurchmesser gegeben, die 300 ml Carboxymethylcellulose
CM 52, die mit 10millimolarem Phosphatpuffer,
pH 6,5, konditioniert war, enthielt. Unter
diesen pH- und Ionenstärke-Bedingungen wurde die Kette A
gebunden und konnte mit TPE eluiert werden. Es wurden so
67 ml einer Lösung der Kette A erhalten, die 5,72 mg/ml
Kette A enthielt.
Die Kette A hatte folgende charakteristischen Eigenschaften,
die in der gleichen Weise wie diejenigen des Ricins
(Beispiel 1) bestimmt wurden:
Molekulargewicht: 30 000 ± 3000;
Isoelektrischer Punkt: 7,5.
Isoelektrischer Punkt: 7,5.
Darüber hinaus wurde mit Hilfe der DTNB-Methode [Methods
in Enzymology 25, S. 457 (1972), Academic Press] festgestellt,
daß die Kette A bei einem ungefähren Molekulargewicht
von 30 000 0,96 val/mol SH-Gruppen enthält.
Die zur Trennung verwendete Säule aus "DEAE CL Sepharose 6B"
kann zur erneuten Benutzung durch Waschen mit 0,1m
Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 0,1 mol/l NaCl und 0,1 mol/l
Galactose enthält, regeneriert werden. Diese Lösung eluiert
die an der Säule fixierte Kette B. Danach muß die
Säule zur erneuten Gewinnung der Kette A wieder mit 0,1m
Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 2,5 Vol.-% 2-Mercaptoäthanol
enthält, ins Gleichgewicht gebracht werden.
Die in verdünnter Lösung erhaltene Kette A wurde auf eine
Chromatographie-Kolonne von 16 mm Innendurchmesser aufgegeben,
die 10 ml "Carboxymethyl-Sepharose" enthielt, die
mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden
war. Unter diesen Bedingungen wurde die Kette A adsorbiert
und konnte danach mit TPE-Puffer eluiert werden. Die Rückgewinnung
war quantitativ.
Bei einer Aufgabe von 150 ml Lösung der Kette A wurden
Fraktionen mit einer mittleren Konzentration der Kette A
von 10 mg/ml erhalten, die insgesamt 90% der auf die Säule
gegebenen Menge entsprachen.
Die so erhaltene Lösung hatte eine sehr hohe Reinheit.
Eine Lösung der Kette A mit einer Konzentration von
10 mg/ml wurde auf 4°C abgekühlt. Nach einigen Tagen bildeten
sich Kristalle, deren Analyse nach dem Wiederlösen
ergab, daß sie die gleichen physikochemischen Eigenschaften
(Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt) und biologischen
Wirkungen (Hemmung der Proteinsynthese) wie die
Kette A in der Lösung hatten, aus der sie entstanden waren.
70 ml einer nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltenen
Ricin-Lösung, die 4 mg/ml Ricin enthielt, wurde mit 1,75 ml
2-Mercaptoäthanol versetzt und 2 h bei 20°C stehengelassen.
Die Lösung wurde dann auf eine Kolonne gegeben, die 800 ml
"QAE Sephadex A 50" enthielt, das mit 100millimolarer
Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 0,5 Vol-% 2-Mercaptoäthanol
enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Eluieren
wurde mit dem gleichen Puffer ausgeführt.
Aus der aufgegebenen Lösung wurde eine Fraktion von 170 ml
erhalten, die 0,9 ml/mg Kette A enthielt und nach dem Verfahren
des Beispiels 2 ab der Dialyse weiterbehandelt
wurde. Die so erhaltene Kette A hatte die
gleichen Eigenschaften wie die nach dem Verfahren des Beispiels
2 gewonnene Kette A. Um die Säule zu regenerieren,
wurde die noch gebundene Kette B mit 100millimolarem
Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 0,15 mol/l NaCl enthielt, eluiert
und dann mit 10millimolarem Tris-HCl-Puffer, pH 7,7,
gewaschen.
Mit "Antikörper Anti-DNP" bezeichnet man Antikörper, die
gegen das Radikal 2,4-Dinitrophenyl gerichtet sind.
Das gewünschte Immunogen wurde nach einem klassischen Verfahren
durch Einwirkenlassen von 2,4-Dinitrobenzolsulfonat
auf tierisches q-Globulin hergestellt, wobei 52 2,4-Dinitrophenyl-Gruppen
je Mol Protein (DNP₅₂-BGG) gebunden wurden.
Durch Immunisieren mit diesem Produkt läßt sich eine
Fraktion von Antikörpern bilden, die spezifisch gegen das
Hapten 2,4-Dinitrophenyl gerichtet sind.
Drei Ziegenböcke wurden durch Injektion von 5 mg DNP₅₂-BGG
in einer Emulsion aus 2 Volumenteilen physiologischer
Kochsalzlösung, gepuffert auf pH 7,4, und 1 Volumenteil
kompletten Freundschen Adjuvans immunisiert. Nach der
ersten Immunisierung wurden 7 Folgeimpfungen im Laufe eines
Jahres vorgenommen. Gleichzeitig wurde von jedem Tier
12mal venös 1 l Blut entnommen. Daraus wurde Serum hergestellt
und bei -20°C konserviert. Nach der Reinigung
wurden 17 Entnahmen vereinigt und durch Erhitzen völlig
inaktiviert. Sodann wurde das Serum 30 min mit 20 000 g
zentrifugiert, um die denaturierten Proteine und Aggregate
zu entfernen, und schließlich durch Papier filtriert, um
suspendierte Fettstoffe abzutrennen. Das so erhaltene Serum
wurde anschließend gereinigt.
In diesem Verfahrensschritt sollen die Anti-DNP-Antikörper
im Serum an ein Trägerprotein des 2,4-Dinitrophenyl-Haptens
gebunden werden, das auf einem festen Träger fixiert ist.
Das Immunadsorptionsgel wurde nach einem klassischen Verfahren
aus 1630 mg Albumin aus menschlichem Serum, das
35 Dinitrophenylgruppen enthielt (DNP₃₅-HSA) und 100 g
(Trockengewicht) "Sepharose 4B" hergestellt. Eine spektrophotometrische
Analyse der Waschwässer nach dem Koppeln
bei 280 nm und 360 nm ergab eine Bindung von 95% der
DNP₃₅-HSA. Zwei Waschbehandlungen wurden ausgeführt: zuerst
bei pH 3,0 mit einem Glycinhydrochlorid-Puffer, 0,8molar,
der 1 mol/l NaCl enthielt, dann bei pH 10,0 mit
einem 0,1m Boratpuffer, der 1 mol/l NaCl enthielt. Danach
wurde das Gel mit einem Arbeitspuffer ins Gleichgewicht
gebracht, der einem 0,1m Phosphatpuffer, pH 7, bestand,
der 0,01 g/ml Natriumazid enthielt.
Vor der Ausführung der Adsorption an das in vorstehend beschriebener
Weise vorbereitete Gel erschien es zweckmäßig,
das anzuwendende Volumenverhältnis Serum/Gel zu bestimmen,
um an den Träger nur Anti-DNP-Antikörper von höchster Affinität
zu binden. Um dieses Ergebnis zu erzielen, ist man
schon in der Weise verfahren, daß man nur 50% der im Serum
vorhandenen Gesamtantikörperaktivität an die Säule fixierte
und die übrigen 50% in der überstehenden Flüssigkeit
ließ.
Bei einem gegebenen Serum wird die Bestimmung der Menge
des benötigten Gels durch Arbeiten mit kleinen Mengen unter
analytischen Bedingungen ausgeführt. Aliquote Teile
von 125 µl des Immunadsorptionsgels werden mit in geometrischer
Reihe mit dem Faktor 2 steigenden Mengen von 0,2
bis 8 ml Serum in Berührung gebracht. Nach Inkubation wird
die überstehende Flüssigkeit mit Hilfe eines klassischen
Radioimmunversuchs [Handbook of Experimental Immunology,
Bd. 1, Kap. 15, S. 1-18, hrsg. von D. M. Weir, 2. Aufl.
1973] auf Anti-DNP-Antikörperaktivität untersucht, wobei
man ε-N-(2,4-Dinitrophenyl)-L-lysin auf den Phenylring in
3- und 5-Stellung titriert.
Man kann dann für jeden Test die in der überstehenden
Flüssigkeit verbliebene Antikörperaktivität durch den prozentualen
Anteil (A) der in dem Ausgangsimmunserum vor der
Gel-Behandlung vorhandenen Aktivität ausdrücken und eine
Kurve A (%) = f (Mengenverhältnis Serum/Gel) zeichnen. Aus
diesem Diagramm kann man ablesen, bei welcher Serummenge
nach Behandlung mit 125 µl Gel 50% der Antikörperaktivität
in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben. Diese Menge
betrug bei dem beschriebenen Versuch 4 ml oder 32 ml Serum
je Milliliter Immunadsorptionsgel
Nach der Bestimmung des Verhältnisses wurden in einem 10-l-Behälter
6150 ml Immunserum mit 193 ml Immunadsorptionsgel
1 h bei Umgebungstemperatur verrührt und dann über Nacht
bei 4°C stehengelassen.
Nach Zentrifugieren (10 min bei 1000 g) wurde das Gel abgetrennt
und das feste Sediment erneut in der überstehenden
Flüssigkeit suspendiert. Diese Suspension wurde auf eine
Chromatographiekolonne (26 mm ⌀, 400 mm Länge) gegeben,
die mit einem Kühlmantel ausgerüstet war und auf 4°C gehalten
wurde. Ferner war die Kolonne mit einem Gerät zur
Messung und Registrierung der optischen Dichte bei 280 nm
und einer Vorrichtung zum Auffangen der Fraktionen versehen.
Nach beendeter Aufgabe der Suspension wurde die Säule
mit 8 l 0,1m Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,01 g/ml Natriumazid
enthielt, gewaschen. Das Waschen wurde 40 h bei
4°C und danach 24 h bei Umgebungstemperatur ausgeführt.
Am Ende der Waschbehandlung war die optische Dichte bei
280 nm außerordentlich gering (OD < 0,04).
Die an der Säule fixierten Anit-DNP-Antikörper wurden mit
einem großen Überschuß einer Lösung des 2,4-Dinitrophenyl-Haptens
eluiert.
Verwendet wurde eine 0,2m Lösung von 2,4-Dinitrophenol in
dem vorstehend beschriebenen Phosphatpuffer, dessen pH-Wert
durch Zusatz von Soda auf 7,0 eingestellt worden war.
Diese Lösung muß vor Licht geschützt aufbewahrt werden.
Zum Eluieren wurden 2,8 l dieser Lösung verwendet, die die
Kolonne mit einem Durchsatz von 125 ml/h passierten. Um das
2,4-Dinitrophenol aus dem Eluat zu entfernen, wurde dieses
sofort auf eine zweite Kolonne gegeben, die 300 ml Ionenaustauschharz
"Dowex 1×10" (Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat
mit quaternären Aminogruppen) enthielt, das mit dem
zum Waschen verwendeten Phosphatpuffer ins Gleichgewicht
gebracht worden war.
Die Antikörper wurden mit einem einzigen Proteingipfel,
gefolgt von einem Nachlauf, eluiert. Die erhaltenen Fraktionen
wurden in eine Fraktion mit einer optischen Dichte
0,9 (Fraktion B₁, 700 ml) und in eine zweite Fraktion aus
den anderen Fraktionen (Fraktion B₂, 2000 ml) eingeteilt.
Die Proteinkonzentration der Fraktionen wurde nach einem
im J. Immun. Meth. 15, S. 101-109 (1977) beschriebenen Verfahren
bestimmt.
Die Fraktion B₁ enthielt 15,4 g oder 22 g/l Antikörper,
die Fraktion B₂ etwa 1 g oder 0,5 g/l Antikörper. Die
Antikörper können in dem zum Waschen verwendeten 0,1m
Phosphatpuffer, pH 7, der 0,01% Natriumazid enthält, bei
-20°C konserviert werden.
Verschiedene physikochemische Methoden, insbesondere die
Dünnschicht-Elektrophorese in Agarose-Gel, die Immunelektrophorese
und die Gel-Filtration durch eine Säule aus
"Sephadex G 200" (Dextran-Gel in Perlenform, das durch
Vernetzung von Dextran-Fraktionen mit Epichlorhydrin erhalten
wird) lassen den Schluß zu, daß die erhaltenen Antikörper
rein und insbesondere keine nachweisbaren Mengen
Albumin (weniger als 1/500) der Antikörper und Immunglobuline
M in den Präparaten zugegen sind.
Die immunologische Aktivität der gereinigten Antikörper
wurde nach der NAHM-Aktivität [J. Immunol. 119, 1, S. 301
(1977)] bestimmt und mit derjenigen des Ausgangsimmunserums
sowie der in der überstehenden Flüssigkeit bei der
Immunadsorption enthaltenden Antikörper (Fraktion A₁) verglichen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die gereinigten Antikörper
(Fraktion B₁) bieten:
eine höhere mittlere Affinität als das Ausgangsimmunserum und eine viel höhere mittlere Affinität als die Fraktion A₁;
eine größere Homogenität der Affinität als das Ausgangsimmunserum.
eine höhere mittlere Affinität als das Ausgangsimmunserum und eine viel höhere mittlere Affinität als die Fraktion A₁;
eine größere Homogenität der Affinität als das Ausgangsimmunserum.
15 ml einer Lösung der Kette A in dem Phosphatpuffer (Beispiel
2), die 1,4 mg/ml Kette A enthielt, wurde mit 8 ml
einer 1,425millimolaren Lösung von Dipyridyl-disulfid-(2,2′)
in dem gleichen Puffer gemischt. Die Lösung wurde 1 1/2 h
bei Umgebungstemperatur unter Lichtabschluß stehengelassen.
Es wurde eine Lösung der an der Thiol-Gruppe aktivierten
Kette A erhalten, die 0,9 mg/ml Protein enthielt. Nach
der Reaktion ergab eine spektrophotometrische Prüfung bei
343 nm, daß das gebildete Produkt 0,9 aktivierte S-S-N-Pyr-Gruppen
(Pyr = Rest des Pyridinringes) je Mol Kette A enthielt.
Die Lösung wurde durch 18stündige kontinuierliche
Dialyse bei einer Temperatur von 5°C gegen TPE gereinigt.
Die gereinigte Lösung wurde bei -20°C aufbewahrt.
Zu 3,3 ml Anti-DNP-Antikörper-Lösung (Beispiel 4), die
25,8 mg/ml reine Antikörper enthielt, wurden 0,37 ml einer
wäßrigen Lösung von 2,4-Dinitrophenol mit einer Konzentration
von 0,57 mg/ml zugesetzt, und das Gemisch wurde
10 min bei Umgebungstemperatur gerührt. Diese Lösung wurde
quantitativ zu 3,06 mg S-Acetyl-mercaptobernsteinsäureanhydrid
zugefügt [Arch. Biochem. Biophys. 96, S. 605-612,
(1969)], und das Gemisch wurde 2 h unter Rühren bei Umgebungstemperatur
stehengelassen.
Danach wurde diese Lösung mit 0,47 ml 0,1m wäßrigen
Hydroxylamin-Lösung, pH 8,0, versetzt und 1 1/2 h bei Umgebungstemperatur
stehengelassen. Das Präparat wurde gegen
viermal 3 l TPE 89 h bei 5°C dialysiert; dann wurde
die dialysierte Lösung 10 min bei 4°C mit 27 000 g zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine
Säule aus "Dowex 1×8" der Körnung 0,07 bis 0,037 mm in
Phosphatform gegeben, um das an den Erkennungsstellen des
Antigens fixierte 2,4-Dinitrophenol zu entfernen.
Die Säule wurde mit TPE bei Umgebungstemperatur eluiert
und die Lösung durch Membranfiltration konzentriert. Es
wurden 4,55 ml Lösung erhalten, die 17,0 mg/ml Mercaptosuccinyl-Antikörper
enthielt.
Nach einer in "Arch. Biochem. Biophys." 119, S. 41-49 (1969)
beschriebenen Methode konnte festgestellt werden, daß das
Antikörpermolekül mit 4 Mercaptosuccinyl-Gruppen je Mol
Antikörper substituiert war.
12,4 ml der Lösung der aktivierten Kette A des Ricins
(hergestellt nach dem Verfahren des Abschnitts a) mit einer
Konzentration von 1 mg/ml oder 0,413 µmol wurden mit
6,5 ml einer Lösung von 4 Mercaptosuccinyl-Gruppen enthaltenden
Anti-DNP-Antikörper (hergestellt nach dem Verfahren
des Abschnitts b) mit einer Konzentration von
15 mg/ml oder 0,658 µmol gemischt. Das Gemisch wurde 20 h
bei Umgebungstemperatur und Lichtausschluß stehengelassen.
Die spektrophotometrische Bestimmung des freigesetzten
Pyridinthiols-(2) im Reaktionsmittel ergab, daß 0,251 µmol
der Kette A mit 0,658µmol Antikörper gekoppelt worden
waren. Das Präparat wurde dreimal gegen 5 l TPE 75 h bei
5°C dialysiert; dann wurde die erhaltene Lösung (17 ml)
durch eine Sterilisationsmembranfilter (0,45 µm) filtriert
und bei -20°C aufbewahrt. Zur Weiterbehandlung wurde das
Produkt durch Gel-Filtration über "Sephadex G 200" gereinigt.
Hierzu wurden 7 ml der Lösung 10 min mit 27 000 g
zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit
0,6 ml einer Lösung von N-Äthylmaleinsäureimid einer Konzentration
von 0,645 mg/ml in TPE 30 min in der Ruhe bei
Umgebungstemperatur behandelt. Danach wurde die Lösung
in absteigender Richtung durch eine Kolonne (von 26 mm ⌀)
filtriert, die 473 ml "Sephadex-Gel G 200" enthielt. Das
Produkt wurde mit TPE mit einem Durchsatz von 16 ml/h eluiert
und der Ablauf in Fraktionen von 2 ml aufgefangen.
In jeder Fraktion wurde die Antikörperkonzentration durch
Spektrophotometrie bei 280 nm und die Konzentration der
Kette A durch Hemmung der Proteinsynthese bestimmt. So
konnte die Existenz zweier Elutionsgipfel nachgewiesen
werden, die beide die Antikörper und die Kette A enthielten
und die in zwei den beiden Gipfeln entsprechenden
Lösungen a und b eingeteilt wurden.
Der erste Gipfel (Lösung a) entsprach einer konjugierten
Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht 800 000.
Dieses Präparat enthielt eine konjugierte Verbindung aus
polymerisierten Antikörpern, die sich über bei der Isolierung
der Mercaptosuccinyl-Antikörper über intermolekular
gebildete Schwefelbrücken polymerisiert hatten.
Der zweite Gipfel (Lösung b) enthielt Proteine mit einem
mittleren Molekulargewicht von 190 000, da einer konjugierten
Verbindung entspricht, in der die Antikörper nicht
polymerisiert sind.
Mit Hilfe analytischer Bestimmungen konnte festgestellt
werden, daß die Lösung a 423 µg/ml Antikörper und 20 µg/ml
Kette A oder ungefähr im Mittel 0,2 mol Kette A je Mol Antikörper
enthielt. Die Lösung b enthielt 171 µg/ml Antikörper
und 13 µg/ml Kette A oder ungefähr im Mittel 0,4 mol
Kette A je Mol Antikörper.
Diese Verbindung kann in zwei Stufen aus Dipyridyl-disulfid-(2,2′)
ohne Reinigung des Zwischenproduktes gemäß
folgender Reinigung hergestellt werden:
4 g Dipyridyl-disulfid-(2,2′) wurden in 25 ml Methylenchlorid
gelöst, und in die Lösung wurde 30 min Chlor eingeleitet.
Im Laufe der Reaktion bildete sich ein Niederschlag,
von dem die Flüssigkeit im Hochvakuum abgedampft
wurde. Der trockene Rückstand wurde für den nachstehend
beschriebenen Verfahrensschritt verwendet.
2,4 g des 2-Chlorsulfanyl-pyridins wurden in 40 ml Methylenchlorid
gelöst, und unter Kühlen in einem Eisbad wurde
langsam unter Rühren eine Lösung von 1,75 g 3-Mercaptopropionsäure
in 10 ml Methylenchlorid zugesetzt. Nach beendetem
Zusatz wird die Lösung noch 15 h bei Raumtemperatur
gerührt. Dann wurden 50 ml Wasser zugesetzt und die
Lösung durch Zusatz von 1n Sodalösung auf einen pH-Wert
von 4,5 eingestellt. Die organische Phase wurde abgetrennt,
über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum von
dem Lösungsmittel befreit. Es wurde ein öliger Rückstand
erhalten, der kristallisierte und 1,8 g Kristalle lieferte.
Diese wurden durch Lösen in 16,8 ml einer 0,5m wäßrigen
Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Zusatz von Aktivkohle, Abfiltrieren
und Ausfällen des Produktes durch Zusatz von
etwa 0,5 ml konzentrierter Essigsäure bis zu einem pH-Wert
von 3 bis 3,5 gereinigt. Der Niederschlag wurde im Hochvakuum
getrocknet und ergab 1,3 g eines festen Produktes
mit einem Schmelzpunkt von 62-64°C.
Um alle Spuren von Thiol-Gruppen, die in dem verwendeten
Produkt vorkommen könnten, zu alkylieren, wurden 13 ml einer
Anti-DNP-Antikörper-Lösung mit einer Konzentration von
23,6 mg/ml in einem 0,1m Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 1 ml
einer 1,29 mg/ml N-Äthylmaleinimid enthaltenden TPE-Lösung
gemischt. Das Gemisch wurde 5 h bei Umgebungstemperatur
gerührt; dann wurde die Lösung bei 5°C 15 h mit
einem Durchsatz von 500 ml/h gegen TPE dialysiert.
Der Inhalt des Dialysesackes (12 ml mit einer Konzentration
von 21,4 mg/ml) wurde mit 24 ml einer wäßrigen Lösung
von 19,9 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid
55,7 mg [Pyridyl-disulfanyl-(2)]-propionsäure und 14 mg
1-Hydroxy-benzotriazol gemischt. Die Mischung wurde 16 h
bei Umgebungstemperatur gerührt und dann 10 min mit 27 000 g
zentrifugiert. Danach wurde die Lösung bei 5°C 23 h mit
einem Durchsatz von 500 ml/h gegen TPE kontinuierlich dialysiert.
Es wurde so 34 ml einer Lösung erhalten, die
7,2 mg/ml Proteine enthielt. Durch spektrophotometrische
Bestimmung des durch den Austausch mit dem reduzierten
Glutathion freigesetzten Pyridinthiols-(2) bei 343 nm
wurde festgestellt, daß Antikörper gebildet worden waren,
die 4 Aktivatorgruppen je Mol Antikörper enthielten.
16 ml der Lösung der aktivierten Antikörper mit einer
Konzentration von 5,9 ml/ml wurden mit 20 ml mit einer
Lösung der Kette A des Ricins in TPE mit einer Konzentration
von 2,8 mg/ml gemischt. Das Gemisch wurde 24 h bei
Umgebungstemperatur unter Lichtausschluß ruhig stehengelassen.
Dann wurde es 10 min mit 27 000 g zentrifugiert.
Die Bestimmung des im Laufe der Reaktion freigesetzten
Pyridinthiols-(2) ergab, daß 1,123 µmol Kette A mit
0,638 µmol Antikörper oder im Mittel 1,76 Äquivalente der
Kette A je Mol Antikörper gekoppelt worden waren.
Die Lösung wurde 21 h bei 5°C mit einem Durchsatz von
720 ml/h kontinuierlich gegen TPE dialysiert. Der Inhalt
des Dialysesackes (34 ml) wurde mit 1 ml einer 12,5 mg/ml
enthaltenden N-Äthylmaleinimid-Lösung versetzt, 5 h bei
Umgebungstemperatur stehengelassen und dann bei -20°C
konserviert.
Diese Lösung der konjugierten Verbindung wurde mit Hilfe
einer Filtration durch eine Säule aus "Sephadex G 200"
unter den im Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen fraktioniert.
Es wurden so drei Lösungen erhalten:
die Lösung c, die eine konjugierte Verbindung mit
einem mittleren Molekulargewicht von
300 000 enthielt;
die Lösung d, die eine konjugierte Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 190 000 enthielt; und
die Lösung e, die eine konjugierte Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 160 000 enthielt.
die Lösung d, die eine konjugierte Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 190 000 enthielt; und
die Lösung e, die eine konjugierte Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 160 000 enthielt.
Die Zusammensetzung der konjugierten Verbindungen in den
verschiedenen Lösungen ist in nachstehender Tabelle wiedergegeben:
Diese Säure wird in zwei Stufen aus 3-[Priridyl-disulfanyl-(2)]-propionsäure
ohne Reinigung des Zwischenproduktes
gemäß folgender Reaktion hergestellt:
0,430 g der nach dem Verfahren des Beispiels 6 a) hergestellten
3-[Pyridyl-disulfanyl-(2)]-propionsäure wurden
in 3 ml Pyridin gelöst, und die Lösung wurde in einem Eisbad
abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 0,230 g pulverförmiges
N-Hydroxy-succinimid, dann 0,453 g ebenfalls
pulverförmiges Dicyclohexyl-carbodiimid gegeben. Die
Mischung wurde 20 h bei 4°C gerührt und dann zur Abtrennung
des Niederschlages von dem gebildeten Dicyclohexylharnstoff
filtriert. Der Niederschlag wurde mit Pyridin
gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt.
Dann wurde das Pyridin im Hochvakuum bis zur Trockene
abgedampft. Der Rückstand wurde mit Äthylacetat aufgenommen.
Es bildete sich erneut ein Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff,
der abfiltriert wurde. Das Äthylacetat wurde
im Hochvakuum bis zur Trockene verdampft und die Waschbehandlung
mit Äthylacetat zweimal wiederholt. Es wurden
so 0,610 g des erwarteten Esters erhalten.
Das gesamte Produkt wurde in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst.
Zu dieser Lösung wurde ein Lösung von 0,288 g 6-Aminocapronsäure
in 2,5 ml Wasser gegeben. Dann wurde eine
der 6-Aminocapronsäure stöchiometrisch entsprechende Menge
(0,222 g) Triäthylamin zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,0
einzustellen. Unter fortgesetzten Rühren wurde das Gemisch
20 h bei 4°C reagieren gelassen. Danach wurde das Reaktionsmittel
im Hochvakuum zur Trockene verdampft, und
der Rückstand in 10 ml Wasser wieder aufgenommen. Die Lösung
wurde durch Zusatz von Essigsäure bis pH 4,5 angesäuert.
Es bildete sich ein Niederschlag, der durch Dekantieren
abgetrennt und dann in Äthylacetat gelöst wurde.
Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert
und im Hochvakuum zur Trockene gedampft.
Es wurden 0,600 g eines noch zu reinigenden Produktes
erhalten. Die Reinigung wurde durch Verteilungschromatographie
auf einer Siliciumdioxid-Säule unter Bedingungen
ausgeführt, die durch eine Analyse des Produktes mit Hilfe
der Dünnschichtchromatographie in einem Chloroform-Aceton-Essigsäure-Gemisch
(80 : 15 : 5) ermittelt wurden.
0,410 g des Produktes wurden auf eine Kolonne von 2 cm
Innendurchmesser gegeben, die 160 ml Silicagel
(Korngröße 60-230 Maschen) gefüllt war, die mit
Chloroform ins Gleichgewicht gebracht worden war. Eluiert
wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von Methanol
in Chloroform. Das reine Produkt wurde mit einem 2%igen
Methanol gemischt. Die Lösungsmittel wurden im Hochvakuum
zur Trockene verdampft.
Es wurde ein hellgelbes Produkt von pastöser Konsistenz
erhalten, das durch sein Magnetkernresonanzspektrum charakterisiert
wurde.
Zu 9 ml der Anit-DNP-Antikörper-Lösung in der TPE-Puffer
mit einer Konzentration von 11,4 mg/ml wurden 9 ml eines
2 : 1-Gemisches von Wasser und tert.-Butanol gegeben, das
5,3 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid und
13,7 mg 6-[3-(Pyridyl-disulfanyl-2)-propionylamino]-hexansäure
enthielt. Die Lösung wurde dann nach dem Verfahren
des Beispiels 6 weiterbehandelt.
Die Bestimmung der aktivierten Antikörper ergab einen
mittleren Substitutionsgrad von 0,6 Aktivatorgruppen je
Mol Antikörper.
Die Antikörperlösung wurde durch Membranfiltration auf
einen Gehalt von 11,1 mg/ml konzentriert.
48,8 mg der modifizierten Antikörper wurden mit 35,6 mg
der Kette A des Ricins in einer Konzentration von 7,9 mg/ml
in TPE-Puffer zur Reaktioin gebracht. Das Reaktionsgemisch
wurde dann im wesentlichen nach dem Verfahren des Beispiels
6 weiterbehandelt. Der mittlere Kopplungsgrad betrug
0,5 Kette A je Mol Antikörper. Die Reinigung der
konjugierten Verbindung durch Filtration wurde nach dem
Verfahren des Beispiels 6 ausgeführt.
Die nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhaltene Antikörper-Lösung
wurde gegen einen 0,12m Acetatpuffer, pH 4,7,
dialysiert. Zu 45 ml dieser Lösung, die 500 mg Antikörper
enthielt, wurden 3 ml einer Lösung von Pepsin (Schweinepepsin
E. C. 3.4.1, zweimal kristallisiert, 3200 µ/mg)
mit einer Konzentration von 10 mg/ml zugesetzt, und das
Gemisch wurde 20 h bei 37°C bebrütet. Das Fortschreiten
der Hydrolyse wurde mit Hilfe der Elektrophorese in Gegenwart
von Natriumdodecylsulfat [J. Biol. Chem. 244, S. 4406
bis 4412(1969)] durch Verschwinden der Bande bei 150 000 D
(Dalton), die dem nichthydrolysierten Antikörper entspricht.
Die Hydrolyse wurde durch Einstellen des Reaktionsmittels
auf pH 7,0 mit Hilfe 1n Sodalösung unterbrochen; dann
wurde die Lösung zentrifugiert und das Unlösliche entfernt.
Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Kolonne von
50 mm Innendurchmesser gegeben, die mit 1800 ml "Sephadex
G 150" gefüllt war, das mit 0,1m Phosphatpuffer,
pH 7,0, ins Gleichgewicht gebracht worden war.
Das Eluieren wurde mit dem gleichen Puffer ausgeführt.
Der erste Gipfel wurde in zwei Fraktionen aufgefangen;
die erste (200 ml) enthielt 70 mg Fragment F(ab)₂′ des
Antikörpers, die zweite (100 ml) enthielt 70 mg einer
Mischung von Fragment F(ab)₂′ und einem Verunreinigungsfragment
mit einem Molekulargewicht von 50 000 D. Der
zweite Gipfel enthielt Proteinfragmente mit einem mittleren
Molekulargewicht von 10 000 D; dieses Eluat wurde
verworfen.
Das in der ersten Fraktion des ersten Gipfels enthaltene
reine Fragment F(ab)₂′ wurde durch Membranfiltration auf
einen Gehalt von 16 mg/ml konzentriert und bei -20°C
konserviert.
Molekulargewicht:
95 000 D (bestimmt nach Eichung des Gels "Sephadex G 150";
Isoelektrischer Punkt:
zwischen pH 7,7 und 8,8 (bestimmt nach Elektrofokussierung auf einer LKB-Platte).
95 000 D (bestimmt nach Eichung des Gels "Sephadex G 150";
Isoelektrischer Punkt:
zwischen pH 7,7 und 8,8 (bestimmt nach Elektrofokussierung auf einer LKB-Platte).
Zu 15 ml der F(ab)₂′-Lösung mit einer Konzentration von
15,6 mg/ml wurden 15,3 ml eines 2 : 1-Wasser/tert.-Butanol-Gemisches
gegeben, das 17,3 mg 1-Äthyl-3-(dimethylamino-propyl)-carbodiimid
und 50,4 mg 3-[Pyridyl-disulfanyl-(2)]-propionsäure
enthielt. Das Gemisch wurde 20 h auf 30°C
gehalten; dann wurde die Lösung 23 h bei 4°C gegen den
TPE-Puffer kontinuierlich dialysiert. Die spektrophotometrische
Bestimmung bei 343 nm des durch Austausch mit
dem reduzierten Glutathion freigesetzten Pyridinthiols-(2)
ergab, daß die Aktivierung des Fragments F(ab)₂′ zu einem
mittleren Substitutionsgrad 1,5 Aktivatorgruppen je Mol
F(ab)₂′ geführt hatte.
Die so erhaltene Lösung des aktivierten F(ab)₂′ wurde durch
Ultrafiltration auf 10 mg/ml konzentriert.
Zu 13,8 ml der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren
erhaltenen Lösung des aktivierten F(ab)₂′ mit einer
Konzentration von 10 mg/ml wurden 13,8 ml einer Lösung
der Kette A des Ricins in TPE-Puffer mit einer Konzentration
von 8 mg/ml gegeben. Die Mischung wurde 24 h unter
Stickstoffatmosphäre und Lichtausschluß bei Umgebungstemperatur
stehengelassen, dann bei 4°C 10 min mit 27 000 g
zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen.
Die Bestimmung des im Laufe der Reaktion freigesetzten
Pyridinthiols-(2) ergab, daß der mittlere Kopplungsgrad
1,2 Äquivalente der Kette A je Mol F(ab)₂′ betrug.
Die Lösung wurde auf eine Kolonne von 50 mm Innendurchmesser
gegeben, die 1730 ml "Sephadex G 200" enthielt. Das
Eluieren wurde mit TPE-Puffer ausgeführt. Es wurden Fraktionen
mit einem Volumen von weniger als 8,4 ml aufgefangen
und nach dem Verfahren der Beispiele 5 und 6 analysiert.
Das Produkt der Konjugierung erschien in einem
Gipfel.
Die den Gipfel der konjugierten Verbindung bildenden Verbindung
wurden in drei Gruppen von Lösungen eingeteilt:
Lösung f: Vorderfront des Gipfels;
Lösung g: mittlerer Bereich des Gipfels; und
Lösung h: Rückfront des Gipfels.
Lösung g: mittlerer Bereich des Gipfels; und
Lösung h: Rückfront des Gipfels.
Die Analyse der Lösung g durch Bestimmung ihrer Hemmwirkung
auf die Proteinsynthese (Test 1) und ihres Proteingehaltes
erbrachte folgende Ergebnisse:
In einer ersten Stufe wurde duch Ultrafiltration konzentriert:
255 ml der Lösung g der konjugierten Verbindung
(mit einem Kette A-Gehalt von 148 µg/ml) wurden so auf eine
Konzentration von 381 µg/ml gebracht. Die Lösung wurde
dann auf das 10fache mit destilliertem Wasser verdünnt,
um die Ionenstärke des Mediums herabzusetzen.
Die Lösung (400 ml mit einer Konzentration von 38 µg/ml
Kette A) wurde auf eine Kolonne von 9 mm Innendurchmesser
gegeben, die 5,7 ml "C. M. Sepharose" enthielt, die mit
10millimolarem Phosphatpuffer, pH 6,5, dem 1 mmol/l Di
natrium-äthylendiaminotetraacetat zugesetzt worden war,
ins Gleichgewicht gebracht worden war.
Die Lösung wurde mit einem Durchsatz von 80 ml/h aufgegeben.
Unter diesen Bedingungen wurde die gesamte konjugierte
Verbindung an der Säule fixiert. Nach beendeter Aufgabe
wurden noch 4,5 ml der Pufferlösung durchlaufen gelassen;
dann wurde die konjugierte Verbindung mit TPE-Puffer unter
Anwendung des gleichen Durchsatzes eluiert.
Die konjugierte Verbindung erschien in einem einzigen Gipfel.
Der Endteil des Gipfels enthielt wenig Proteine und
wurde verworfen. Die übrigen Fraktionen wurden in Gruppen
eingeteilt, und es wurde die Konzentration der Kette A
bestimmt.
Diese Bestimmung ergab, daß durch das Konzentrieren an
"C. M. Sepharose" die Konzentration der Kette A der konjugierten
Verbindung auf 3,6 mg/ml erhöht werden kann. Der
Vorgang verläuft quantitativ, und die Fraktionen, die eine
Lösung mit einer Konzentration von 3,6 mg/ml enthalten,
stellen insgesamt 76% der auf die Kolonne gegebenen Menge
der konjugierten Verbindung dar.
Reines IgM wurde aus Ascitesflüssigkeit hergestellt, die
von der OLAC Ltd. erhältlich ist (monocloner, cytotoxischer
Antikörper Thy-1.2 F7 D5).
Zu 50 ml der den Antikörper enthaltenden Ascitesflüssigkeit
wurden 15 g Ammoniumsulfat-Pulver zugesetzt. Nach dem
Lösen wurde die Mischung 1 h bei 4°C stehengelassen und
dann 20 min mit 17 000 g zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Der Rückstand
wurde in 20 ml 0,1m Phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst und
die Lösung gegen 10 l des gleichen Puffers dialysiert. Die
so erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne mit einem Innendurchmesser
von 50 mm gegeben, die 1800 ml "Sepharose 6B"
enthielt, die mit dem 0,1m Phosphatpuffer von pH 7,0
ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Eluieren wurde
mit dem gleichen Phosphatpuffer vorgenommen. Der erste Gipfel
enthielt Aggregate des IgM. Der zweite Gipfel wurde in
zwei Fraktionen aufgefangen: die erste Fraktion (die Vorderfront
bis zur Spitze des Gipfels) bestand aus reinem
IgM; die zweite Fraktion enthielt eine Mischung aus IgM
und einem verunreinigenden Protein mit einem Molekulargewicht
von etwa 660 000 D. Diese zweite Fraktion wurde
erneut mit Ammoniumsulfat behandelt, der gebildete Niederschlag
abzentrifugiert und in dem 0,1m Phosphatpuffer von
pH 7,0 gelöst. Die Lösung wurde auf die "Sepharose 6B"-Säule
gegeben, die zuvor gewaschen worden war. Bei der
Elution, die wie beim ersten Mal mit 0,1m Phosphatpuffer
von pH 7,0 ausgeführt wurde, erschienen wiederum zwei Gipfel.
Der zweite Gipfel enthielt reines IgM. Bei den beiden
Filtrationen über "Sepharose 6B" konnte somit jeweils eine
Fraktion gewonnen werden, die reines IgM enthielt. Diese
beiden Fraktionen wurden vereinigt, und das Ganze wurde
bei 4°C Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration
von 300 mg/ml behandelt. Das Präparat wurde sodann 20 min
mit 17 000 g zentrifugiert und der Rückstand in einem
100millimolaren Phosphatpuffer, pH 7,4, der 400 mmol/l
NaCl enthielt, gelöst.
Dieses Verfahren ergab 8 ml einer Lösung, die 6,4 mg/ml
reines IgM enthielt. Zur Charakterisierung der beiden
Fraktionen wurde eine analytische Elektrophorese in Gegenwart
von Natriumdodecylsulfat ausgeführt. Das erhaltene
reine IgM ergab bei der Analyse zwei nahe beieinanderliegende
Bande, die einem Molekulargewicht von sehr nahe bei
900 000 D entsprachen.
Zu 7,6 ml der IgM-Lösung mit einer Konzentration von
7,0 mg/ml wurden 0,46 ml eines 1 : 5-Wasser/tert.-Butanol-Gemisches
gegeben, das 2,9 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid
und 7,7 mg 3-Pyridylsulfanyl-(2)-propionsäure
enthielt. Die Mischung wurde 20 h auf 30°C gehalten
und dann kontinuierlich gegen den 0,1m Phosphatpuffer
von pH 7,4, dem 400 mmol/l NaCl und 1 mmol/l Dina
trium-äthylendiamintetraacetat zugesetzt worden waren, dialysiert.
Die Dialyse wurde 23 h bei 4°C mit einem Durchsatz
von 500 ml/h fortgesetzt. Danach wurde die Lösung
bei 4°C 10 min mit 27 000 g zentrifugiert und die überstehende
Flüssigkeit gewonnen. Die spektrophotometrische
Bestimmung bei 343 nm des durch mit dem reduzierten Glutathion
freigesetzten Pyridinthiols-(2) ergab, daß die Aktivierung
des Antikörpers zu einem mittleren Substitutionsgrad
von 13 Aktivatorgruppen je Mol IgM geführt hatte.
Die nach dem Verfahren des Beispiels 2 erhaltene Lösung der
Kette A wurde kontinuierlich gegen 0,1m Phosphatpuffer,
pH 7,4, dem 400 mmol/l NaCl und 1 mmol/l Dinatrium-äthylen
diamintetraacetat zugesetzt worden waren, dialysiert. Die
Dialyse wurde mit 20 h bei 4°C mit einem Durchsatz von
500 ml/h ausgeführt.
Zu 6,8 ml der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren
hergestellten IgM-Lösung wurden 3,9 ml der dialysierten
Lösung der Kette A mit einer Konzentration von 7,4 mg/ml
zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 h bei Umgebungstemperatur
unter Stickstoffatmosphäre und Lichtausschluß stehengelassen.
Eine Bestimmung des bei der Reaktion freigesetzten
Pyridinthiols-(2) ergab einen mittleren Kopplunggrad von
9,7 Äquivalenten der Kette A je Mol IgM.
Die Lösung wurde auf eine Kolonne mit einem Innendurchmesser
von 50 mm gegeben, die 1727 ml "Spharose 6B" enthielt,
die mit dem beim Koppeln verwendeten Puffer ins
Gleichgewicht gebracht worden war. Das Eluieren wurde mit
dem gleichen Puffer vorgenommen. Es wurden Fraktionen mit
einem Volumen bis 3,7 ml aufgefangen und analysiert. Das
konjugierte Produkt erschien in zwei Gipfeln: der erste
entsprach einer konjugierten Verbindung mit einem höheren
Molekulargewicht als das des IgM, der zweite einer konjugierten
Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht,
das etwa demjenigen des IgM gleich war. Der mittlere Teil
dieses Gipfels (Lösung i) wurde aufbewahrt.
Die konjugierte Verbindung der Lösung i hatte folgende
Merkmale:
Die konjugierten Verbindungen und die bei ihrer Herstellung
verwendeten Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer
biolgischen Eigenschaften, insbesondere ihrer anticancerogenen
Wirkung, untersucht. Die Grundlagen der verschiedenen
Prüfverfahren werden nachstehend beschrieben.
Die grundlegende biologische Eigenschaft der Kette A des
Ricins ist die Hemmung der mikrosomalen Proteinsynthese
durch Veränderung der Ribosomen-Untereinheit 60S.
Bei der Prüfung in vitro wird ein Modell der zellfreien
Proteinsynthese unter Verwendung subzellulärer Fraktionen
von Rattenleber verwendet, die in geeigneter Weise ergänzt
sind und in Gegenwart einer künstlichen Botschafter-RNS -
der Polyuridylsäure - ¹⁴C-Phenylalanin einbauen können.
Zur Herstellung der subzellulären Fraktionen und zur Messung
des ¹⁴C-Phenylalanin-Einbaues wurde eine Abänderung
des in "Biochem. Biophys. Acta" 312, S. 608-615 (1973) beschriebenen
Verfahrens benutzt, bei dem einmal eine mikrosomale
Fraktion und eine Cytosol-Fraktion der Rattenhepatocyten
verwendet wurde. Die die Kette A enthaltende Probe
wird in Form einer in geeigneter Weise mit 50millimolarer
Tris-HCl-Pufferlösung, pH 6,7, die 0,2% 2-Mercaptoäthanol
und 15 µg/ml bovines Serumalbumin enthält, verdünnten Lösung
eingeführt.
Aus der Anzahl der gezählten Impulse im Vergleich zu einer
markierten Probe ohne Hemmer wird die prozentuale Hemmung
des Einbaus von ¹⁴C-Phenylalanin in die Proteine einer
jeden die Kette A des Ricins enthaltenden Probe berechnet.
Aus diesen Ergebnissen läßt sich die Konzentration der
Kette A in dem Reaktionsmedium berechnen, die den Einbau
von Radioaktivität in die Proteine um 50% hemmt. Mit Hilfe
dieser Inhibitorkonzentration IC-50 kann jedes die Kette A
enthaltendes Präparat charakterisiert werden.
Mit Hilfe dieses Verfahrens kann auch die Menge der Kette A
bestimmt werden, die in einer Probe enthalten ist. Man
braucht nur die durch Probe verursachte prozentuale
Hemmung mit derjenigen einer Standardprobe unter identischen
Versuchbedingungen zu vergleichen.
Bei diesem Verfahren wird die Wirkung der untersuchten
Substanz auf den Einbau von ¹⁴C-Leucin in eine Kultur von
Krebszellen bestimmt.
Hierzu werden Hela-Zellen verwendet, die durch Biopsie
eines menschlichen cervicalen Adenocarcinoms gewonnen und
durch Monoschichtkultur in einer Reihe gehalten werden.
Die Zellen werden in Gegenwart der zu untersuchenden Substanz
bebrütet; danach wird ihr Gehalt an eingebautem
¹⁴C-Leucin bestimmt. Diese Messung wird nach einer modifizierten
Methode ausgeführt, die in "J. Biol. Chem." 249
(11), S. 3557-3562 (1974) beschrieben ist. Zur Bestimmung
des Grades der Proteinsynthese wird ein ¹⁴C-Leucin-Radioindikator
verwendet. Die eingebaute Radioaktivität wird an
durch Filtration isolierten Zellen bestimmt.
Aus diesen Messungen lassen sich Dosis/Wirkung-Graphen
zeichnen, auf deren Abszisse die Konzentration der untersuchten
Substanz und auf deren Ordinate das eingebaute
¹⁴C-Leucin in Prozent der Menge aufgetragen ist, die in
unbehandelte markierte Zellen eingebaut worden ist.
Man kann so für jede untersuchte Substanz die Konzentration
bestimmen, bei der der Einbau von ¹⁴C-Leucin zu 50%
gehemmt wird - die Inhibitorkonzentration IC-50. Es hat
sich bestätigt, daß die Bestimmung des ¹⁴C-Leucin-Einbaus
in die Gesamtzellen Werte für die IC-50 ergibt, die mit
den nach der klassischen Methode zur Messung der Proteinsynthese
gefundenen Werte übereinstimmen.
Wenn man die mit den Anti-DNP-Antikörpern hergestellten
konjugierten Verbindungen untersuchen will, müssen die
Hela-Zellen von den Antikörpern erkannt werden und daher
an ihrer Oberfläche Haptenmotive aufweisen. Die Hela-Zellen
müssen deshalb durch Markieren mit einem geeigneten
Hapten in Zielzellen umgewandelt werden. In der Praxis
wählt man hierzu als Hapten die 2,4,6-Trinitrophenyl-Gruppe
(TNP). Das Fixieren der TNP-Gruppe auf den Hela-Zellen
wird nach einem in "Biochem. Biophys. Acta" 255, S. 79-90
(1972) und "J. Immunol." 111, S. 930-937 (1973) beschriebenen,
modifizierten Verfahren durch Einwirkenlassen von
2,4,6-Trinitrobenzol-sulfonat (TNBS) vorgenommen.
Die Abänderung der Methode besteht im wesentlichen in der
Wahl der Reaktionsparameter: Temperatur 4°C und Abbruch
durch einen Überschuß von Lysin nach 15 s Reaktionsdauer.
Diese Markierung kann aus mehreren Gründen beibehalten
werden:
geringe toxische Wirkung des TNBS auf die Hela-Zellen;
hochgradige Kreuzreaktion zwischen DNP und TNP;
vergleichbarer Einbau von ¹⁴C-Leucin in markierte und nicht markierte Zellen.
hochgradige Kreuzreaktion zwischen DNP und TNP;
vergleichbarer Einbau von ¹⁴C-Leucin in markierte und nicht markierte Zellen.
Eine Konzentration von 10 mg/ml TNBS im Reaktionsmedium
bewirkt eine Fixierung von 7 · 10⁷ den Antikörpern zugänglichen
Haptenmotiven auf jeder Zelle. Die Assoziations
konstante zwischen Anti-DNP-Antikörpern und den Haptenmotiven
beträgt 1,2 · 10⁷.
Für konjugierte Verbindungen mit Anti-Thy-1.2-Spezifität
werden Zellen vom Stamm WEHI-7 (Lymphome von Balb/C-Mäusen)
verwendet, die vom SALK INSTITUTE, San Diego, Californien
(USA) bezogen werden können. Diese Zellen bedürfen keiner
Markierungsbehandlung, da sie von Natur aus an der Oberfläche
das Antigen Thy-1.2 tragen. Die Bebrütung mit der
konjugierten Verbindung und die Messung des Grades der
Proteinsynthese wird nach dem vorstehend beschriebenen
Verfahren vorgenommen.
Der Hämagglutinationstest [J. Biol. Chem. 249, S. 803 (1974)]
dient zum Vergleich der Fähigkeit verschiedener Präparate,
sich an die Membran menschlicher Erythrocyten der Gruppe
0 rh negativ anzulagern.
Der Test kann wie folgt ausgeführt werden:
entweder direkt (Test 3) durch Zusammenbringen der zu untersuchenden Substanz mit den Erythrocyten, wobei man je nach der Dosis der Substanz eine negative oder positive Reaktion erhält; oder
indirekt (Test 4). In diesem Falle erhöht man nach der Ausführung des indirekten Testes die Empfindlichkeit der Feststellung der eventuell an den Erythrocythen fixierten Substanz durch den Zusatz von Erythrocyten, die durch Dekantieren aus dem Reaktionsmedium eines die zu untersuchende Substanz erkennende Antikörper enthaltenden Immunserums abgetrennt worden sind und deren eigene hämagglutinierende Wirkung durch Absorption an Erythrocyten der gleichen Wirkung der gleichen Gruppe beseitigt worden ist.
entweder direkt (Test 3) durch Zusammenbringen der zu untersuchenden Substanz mit den Erythrocyten, wobei man je nach der Dosis der Substanz eine negative oder positive Reaktion erhält; oder
indirekt (Test 4). In diesem Falle erhöht man nach der Ausführung des indirekten Testes die Empfindlichkeit der Feststellung der eventuell an den Erythrocythen fixierten Substanz durch den Zusatz von Erythrocyten, die durch Dekantieren aus dem Reaktionsmedium eines die zu untersuchende Substanz erkennende Antikörper enthaltenden Immunserums abgetrennt worden sind und deren eigene hämagglutinierende Wirkung durch Absorption an Erythrocyten der gleichen Wirkung der gleichen Gruppe beseitigt worden ist.
Zur Prüfung der aktuten Toxicität wird die zu untersuchende
Substanz in isotonischer Lösung einer Anzahl von Tieren
intraperitoneal oder intravenös eingespritzt. Die Tiere
werden 7 Tage beobachtet, und es wird die Mortalität für
jede Dosis festgestellt. Sodann wird die Dosis bestimmt,
bei der 50% der Tiere nicht überleben (DL₅₀).
Das gewählte Modell besteht in einer Untersuchung des Einflusses
der zu prüfenden Substanz auf die Entwicklung
fester Tumoren bei dem Versuchstier nach dem Einspritzen
von Krebszellen.
Bei der experimentellen Ausführung werden "nude"-Mäusen
(kong. nu/nu Bolmholtgaard), von denen bekannt ist, daß
sie allogene oder xenogene Transplantate nicht abstoßen,
Hela-Zellen mit dem Hapten TNP eingespritzt und durch
gleichzeitiges oder späteres Injizieren der zu prüfenden
Substanz behandelt.
Es wurden verschiedene Versuchsmethoden entwickelt:
Bestimmt wird der Umfang des sich eventuell entwickelnden
Tumors durch Messen zweier zueinander senkrechter Durchmesser
nach der in "Ann. d'Immunol." (Institut Pasteur)
124 C, S. 567-572 (1973) beschriebenen Methode.
Am Ende des Versuchs wird das Tier getötet und der Umfang
des Tumors durch Bestimmung des Gewichts der gesammelten
Tumoren gemessen.
Die vorstehend beschriebenen Methoden wurden zur Untersuchung
der Eigenschaften der konjugierten Verbindungen
und der zu ihrer Herstellung verwendeten Substanzen angewendet.
Das Ricin und die Kette A wurden in vitro und auf Toxicität
auch in vivo geprüft. Darüber hinaus wurde auch die
gereinigte Kette A nach dem Konzentrieren an "CM Sepharose",
in der Tabelle als Kette (A)p bezeichnet, diesen Prüfungen
unterworfen.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I wiedergegeben.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Ricin in einem zellfreien
System eine erheblich stärkere Hemmwirkung als in einem
Zellsystem ausübt. Im zellfreien System hemmt die Kette A
die Proteinsynthese ebenfalls stark; dagegen kann sie in
einem zellhaltigen Milieu keine Wirkung ausüben, da sie
von der Kette B getrennt ist.
Das Gleiche ist bei den Hämagglutinationstests und dem
Test auf akute Toxicität zu beobachten, bei denen Ricin
viel aktiver als die Kette A ist.
Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß durch das Konzentrieren
an "CM Sepharose" die unspezifische Toxicität der
Kette A durch Erhöhen der Reinheit des Präparates noch
weiter vermindert werden kann. Die hochreine Kette A zeigt
auch in einem Zellsystem eine sehr geringe unspezifische
Toxicität; dies geht klar aus dem Aktivitätsverhältnis
zwischen dem Ricin und der Kette (A)p bei diesem Test hervor,
das über 10 000 beträgt.
Erschöpfungsadsorptionsversuche mit der Kette A unter Verwendung
zunehmender Überschüsse an Hela-Zellen und Erythrocyten,
die mit der Kette A in Berührung gebracht wurden,
und Messung der Zelltoxicität der Kette A in der überstehenden
Flüssigkeit nach der Adsorption (Test 2) ergaben:
Die Zelltoxicität der nicht an "CM Sepharose" konzentrierten
Kette A wird durch Adsorption verringert und
auf das Niveau der Toxicität der Lösung der Kette A
abgesenkt, die an "CM Sepharose" konzentriert und
nicht absorbiert worden ist.
Dagegen wird die Toxicität des an "CM Sepharose" konzentrierten Präparates durch Absorption nicht mehr verringert; dies wird durch das völlige Fehlen einer Affinität der so hergestellten Kette (A)p zu den Plasmamembranen der Zellen bestätigt und läßt andererseits den außerordentlich hohen Reinheitsgrad des Produktes erkennen.
Dagegen wird die Toxicität des an "CM Sepharose" konzentrierten Präparates durch Absorption nicht mehr verringert; dies wird durch das völlige Fehlen einer Affinität der so hergestellten Kette (A)p zu den Plasmamembranen der Zellen bestätigt und läßt andererseits den außerordentlich hohen Reinheitsgrad des Produktes erkennen.
Die Anti-DNP-Antikörper zeigten bei dem Test auf Hemmung
der Proteinsynthese im Zellsystem selbst bei der höchsten
geprüften Konzentration von 10-6 mol/l keine Wirkung.
Auch bei der Prüfung auf akute Toxicität wurden bei den
höchsten geprüften Dosen von 1,6 mg Antikörper je Tier
keine Anzeichen von Toxicität beobachtet.
Eine erste Versuchsreihe war dazu bestimmt, die Unversehrtheit
der Eigenschaften der Kette A einerseits und der
Antikörper andererseits in den konjugierten Präparaten
festzustellen.
Zuerst konnte durch einen Radioimmuntest (Handbook of Experimental
Immunology, hrsg. von D. M. Weir, 2. Aufl.,
Bd. 1, Kap. 15, S. 1-18, 1973) ermittelt werden, daß die
Aktivität der Anti-DNP-Antikörper in der konjugierten Verbindung
der Aktivität der freien Antikörper gleich ist.
Die hemmende Wirkung der Kette A in der konjugierten Verbindung
auf die Proteinsynthese außerhalb der Zelle wurde
einmal mit einer Probe der konjugierten Verbindung (Lösung a
des Beispiels 5) und ein andermal mit einer identischen
Probe bestimmt, die im Hinblick auf die Spaltung
der Disulfidbrücke 30 min mit einer 0,2%igen 2-Mercaptoäthanol-Lösung
versetzt worden war.
Im ersten Fall wurde eine IC-50 von 59,4 ng/ml Kette A,
im zweiten Fall eine solche von 9,2 ng/ml erhalten, was
einem Aktivitätsverhältnis von 1 : 6,6 entspricht.
Dies zeigt, daß der größte Teil der Hemmwirkung auf die
Proteinsynthese erst auftrat, nachdem die konjugierte Verbindung
zum Sprengen der Disulfidbindung mit 2-Mercaptoäthanol
behandelt worden war.
Die Tatsache, daß eine Hemwirkung auch ohne Behandlung mit
2-Mercaptoäthanol nachweisbar sein kann, steht dieser
Schlußfolgerung nicht entgegen, da das Versuchsmilieu
Thiole enthalten kann, die zum Teil eine Freisetzung der
mit dem Antikörper gekoppelten Kette hervorrufen können.
Abschließend kann festgestellt werden, daß die konjugierten
Verbindungen die Eigenschaften ihrer Bestandteile unverändert
lassen.
Mit einer anderen Versuchsreihe wurde die therapeutische
Wirksamkeit der konjugierten Verbindungen bestimmt.
Die Fig. 1 und 2 sind Graphen, aus denen die prozentuale
Hemmung des Einbaus von ¹⁴C-Leucin in mit TNP markierten
Hela-Zellen in Abhängigkeit von der angewendeten
Dosis der konjugierten Verbindung (ausgedrückt durch die
Konzentration in nmol/ml). Die diesen Figuren zugrunde
liegende konjugierte Verbindung war die in den Beispielen
5 und 6 beschriebene Verbindung aus Anti-DNP-Antikörper
und Kette A. Zu Vergleichszwecken ist auch die Wirkung
dieser Verbindung auf nicht markierte Hela-Zellen (gestrichelte
Linien) dargestellt.
Die Graphen der Fig. 1 und 2 wurden mit der konjugierten
Verbindung des Beispiels 5 (Lösung b) und der konjugierten
Verbindung des Beispiels 6 (Lösung e) erhalten.
Sie zeigen, daß die 50%ige Hemmwirkung auf die zelluläre
Proteinsynthese bei TNP-Hela-Zellen mit sehr viel geringeren
Konzentrationen (IC₅₀ 11 · 10-9 mol/l bei der Lösung b
und 7,5 · 10-9 mol/l bei der Lösung e) als bei nicht markierten
Hela-Zellen (CI₅₀ 130 · 10-9 mol/l bei der Lösung b
und 1000 · 10-9 mol/l bei der Lösung e) erreicht werden
kann.
Wenn andererseits dem Inkubationsmilieu bovines DNP-Serumalbumin
zugesetzt wird (1 mg/ml), wird die Hemmwirkung
der konjugierten Verbindung völlig aufgehoben.
Fig. 3 zeigt die mit der konjugierten Verbindung aus der
Kette A des Ricins und dem Fragment F(ab)₂′ des Anti-DNP-IgM
erhalten wurden. Die Koordinaten sind die gleichen wie
bei den Fig. 1 und 2. Ergebnisse sind dargestellt für
(I) Ricin IC₅₀ (mit Kette A): 5,5 · 10-11 mol/l
(II) Kette A IC₅₀: 9 · 10-7 mol/l
(III) Konj. Verb. auf Hela IC₅₀: nicht bestimmbar, < 10-5 mol/l
(IV) Konj. Verb. auf Hela-TNP IC₅₀: 4,5 · 10⁹ mol/l
(II) Kette A IC₅₀: 9 · 10-7 mol/l
(III) Konj. Verb. auf Hela IC₅₀: nicht bestimmbar, < 10-5 mol/l
(IV) Konj. Verb. auf Hela-TNP IC₅₀: 4,5 · 10⁹ mol/l
Fig. 4 zeigt die Hemmung des Einbaus von ¹⁴C-Leucin in
WEHI-7-Zellen bei der Prüfung der konjugierten Verbindung
aus der Kette A und Anti-Thy-IgM. Die Koordinaten sind
die gleichen wie in den Fig. 1 und 2. Ergebnisse sind
dargestellt für
(I) Ricin (mit Kette A) IC₅₀: 2,4 · 10-11 mol/l
(II) Kette A IC₅₀: 8,1 · 10-7 mol/l
(III) Konjug. Verb. (mit Kette A) CI₅₀: 5,2 : 10-11 mol/l
(II) Kette A IC₅₀: 8,1 · 10-7 mol/l
(III) Konjug. Verb. (mit Kette A) CI₅₀: 5,2 : 10-11 mol/l
Schließlich läßt sich zeigen, daß die aus der Kette A des
Ricins und Anti-DNP-IgG mit 6-[3-(Pyridyl-disulfanyl-2)-
propionylamino]-hexansäure als Aktivator hergestellte konjugierte
Verbindung eine identische Toxicität und Spezifität
wie die nach dem Verfahren des Beispiels 6 erhaltene
konjugierte Verbindung hat.
Es kann somit gefolgert werden, daß die gemäß der Erfindung
hergestellten konjugierten Verbindungen eine spezifische
Wirkung haben. Bei Verabfolgung einer geeigneten Dosis der
konjugierten Verbindung ist es möglich, nur auf die Zellen
einzuwirken, die ein dem entsprechenden Antikörper entsprechendes
Antigen tragen.
Die Herstellung einer Disulfidbrücke zwischen der Kette A
und einem Antikörper, der für ein natürlicherweise auf
Krebszellen vorkommendes Antigen spezifisch ist, lassen
sich die Krebszellen mit sehr hoher Wirksamkeit und Wirkungsspezifität
zerstören.
1. Der vorstehend beschriebene Test 6 wurde mit TNP-Hela-Zellen
in einer Konzentration von 10⁵ Zellen/ml ausgeführt,
die 90 min bei 37°C mit der konjugierten Verbindung
(Lösung c) in einer Konzentration von 10-8 mol/l,
berechnet als Kette A, behandelt.
Nach dem Zentrifugieren (10 min mit 700 g) wurde der Rückstand
in PBS [isotonische Pufferlösung ohne Calcium und
Magnesium - J. Exp. Med. 08129 00070 552 001000280000000200012000285910801800040 0002002939165 00004 08010 99, S. 167 (1954)] suspendiert;
diese Suspension enthielt 10⁷ Zellen/ml. Von dieser Suspension
wurde den Tieren (Alter 14 Wochen) 0,1 ml mit
einem Gehalt von 10⁶ Zellen intracutan injiziert. Eine
Anzahl von Tieren erhielt eine Injektion von Zellen, die
nicht mit der konjugierten Verbindung behandelt worden
waren.
Die Tiere wurden täglich auf Tumorwachstum überprüft. Als
faßbar wird ein Tumor mit einer Oberfläche 10 mm² angesehen
(Empfindlichkeitsgrenze des Tests).
In Fig. 5 sind die Prozentsummen der erfaßten Tumoren mit
einer Oberfläche 10 mm² in Abhängigkeit von der Zeit nach
der Injektion der Hela-Zellen (ausgezogene Kurve), der mit
TNP markierten Hela-Zellen (gestrichelte Kurve) und der mit
TNP markierten und mit der konjugierten Verbindung vorbehandelten
Hela-Zellen (strichpunktierten Kurve) dargestellt.
Aus der Figur ist ersichtlich, daß die konjugierte Verbindung
wirksam ist und daß Auftreten faßbarer Tumoren
stark vermindert.
Eine Beobachtung bis zum 50. Tag ergab ein Auftreten faßbarer
Tumoren in 80% der Fälle bei der Injektion von unbehandelten
Hela-Zellen und in 70% der Fälle nach der Injektion
von unbehandelten TNP-Hela-Zellen.
Nach der Injektion von TNP-Hela-Zellen, die mit der konjugierten
Verbindung vorbehandelt worden waren, betrug dieser
Prozentsatz nur 20%.
Der Unterschied ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit
von 5% statistisch signifikant.
2. Der Test 7 wurde ausgeführt, indem den Tieren (Alter
10 Wochen) 2 · 10⁶ TNP-Hela-Zellen in 0,1 ml Kulturflüssigkeit
intraperitonal injiziert wurden.
Dann wurde 0,1 ml der konjugierten Verbindung, die 36 µg
der Kette A enthielt (Lösung d, durch Membranfiltration
auf 7,5fache konzentriert), injiziert.
Eine Anzahl von Vergleichstieren erhielt die gleiche Injektion
von TNP-Hela-Zellen, wurde aber nicht mit der konjugierten
Verbindung behandelt.
Am 25. Tag nach Beginn des Versuchs wurden die Tiere getötet
und die Tumoren gewogen.
In Fig. 6 sind für jedes Tier aus den zwei Gruppen - die
Vergleichstiere links, die behandelten Tiere rechts - die
Tumorgewichte in Milligramm in dekadisch-logarithmischer
Teilung aufgetragen. Die Erfassungsschwelle betrug 5 mm,
entsprechend einem dekadischen Logarithmus von 0,7.
Aus dieser Figur ist ersichtlich, daß in der Gruppe der
Vergleichstiere in 14 von 15 Fällen ein faßbarer Tumor
auftrat (14 Punkte oberhalb, 1 Punkt unterhalb der Er
fassungsschwelle auftrat. Umgekehrt trat bei den behandelten
Tieren nur 1 Fall eines faßbaren Tumors in 15 Fällen
(1 einziger Punkt oberhalb der Erfassungsschwellen) auf.
Bei diesen Untersuchungen wurden Krebszellen vom Stamm
WEHI 22.1 (erhalten vom SALK INSTITUTE, San Diego, Californien,
USA) verwendet, die aus Lymphomen der Balb/C-Maus
stammen. Sie wurden Balb/C-Mäusen injiziert, die von BOM-HOLTGAARD
(Dänemark) bezogen worden waren und von der Geburt
bis zum Ende des Tests in einer Zone gehalten wurden,
die frei von spezifischen pathogenen Organismen (SPF) war.
Zu der Prüfung wurden die in einer kontinuierlichen Kultur
gehaltenen WEHI 22.1-Zellen am 3. Tag nach dem Umsetzen
der Kultur entnommen, gewaschen, zentrifugiert und in
einem isotonischen Phosphatpuffer (PBS) in einer Konzentration
von 12 · 10⁶ Zellen/ml suspendiert.
0,2 ml dieser Suspension wurden zufällig ausgewählten und
individuell durch Pfotenmarkierungen gekennzeichneten Mäusen
intraperitoneal injiziert.
Bei den nicht mit der konjugierten Verbindung behandelten
Mäusen entwickelten sich nach der Injektion der Zellen
WEHI 22.1 im Peritoneum (Bauchfell) disseminierte Tumoren
unter Bildung eines Ascites. Die Entwicklung der Tumoren
war von einer Erhöhung des Körpergewichts begleitet. Der
Ascites wurde durch Beobachtung der Vergrößerung des Bauchvolumens
festgestellt.
Eine Stunde nach der Injektion der Zellen wurde den zur
Behandlung vorgesehenen Tieren 1 ml der Lösung der konju
gierten Verbindung (Lösung i, Gehalt an Kette A 23,7 µg/ml),
die zuvor intensiv gegen PBS-Puffer dialysiert und dann
durch Filtration sterilisiert worden war, intraperitoneal
injiziert. Den Tieren der Vergleichsgruppe wurde 1 ml der
PBS-Pufferlösung, die keine konjugierte Verbindung enthielt,
injiziert.
Am 7. Tag nach der Injektion der Zellen erhielten die behandelten
Tiere eine zweite Injektion der konjugierten
Verbindung unter den gleichen Bedingungen und Vergleichstiere
eine zweite Injektioin PBS-Pufferlösung.
Die Ergebnisse des Tests sind in den Fig. 7 und 8 wiedergegeben.
In Fig. 7 ist chronologisch das Auftreten
von Ascites bei den behandelten und den unbehandelten Tieren,
in Fig. 8 die Entwicklung des Körpergewichts bei den
behandelten und den unbehandelten Tieren dargestellt. Die
Entwicklung des Körpergewichtes ist als das Verhältnis der
Gewichtszunahme in Gramm zum Gewicht derselben Tieren drei
Tage vor der Injektion der Zellen angegeben.
Fig. 7 (Abszisse: Anzahl der Tage nach der Injektion der
Zellen WEHI 22,1; Ordinate: Prozent der Tiere mit einem
Ascites) zeigt die Hemmung der Ascitesbildung bei den mit
der konjugierten Verbindung behandelten Tieren; diese Hemmung
tritt als zeitliche Verschiebung der Ascitesbildung
in Erscheinung (ausgezogene Kurve: behandelte Tiere; gestrichelte
Kurve: unbehandelte Tiere).
Fig. 8 (Abszisse: Anzahl der Tage nach der Injektion der
WEHI 22.1.-Zellen; Ordinate: mittlere Gewichtszunahme in
Gramm) läßt ebenfalls eine Hemmung der Zunahme des Körpergewichts
bei den behandelten Tieren (ausgezogene Kurve)
im Vergleich zu den nicht behandelten Tieren (gestrichelte
Kurve) erkennen.
Die Gültigkeit dieser Beobachtungen wird durch eine statistische
Analyse der Versuchsergebnisse bestätigt:
Die Hemmung der Ascitesbildung durch die konjugierte
Verbindung ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit
von 1% signifikant (Test × 2).
Die Hemmung der Zunahme des Körpergewichts durch die konjugierte Verbindung ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% signifikant (Vergleich der Neigung der Ausgleichsgeraden).
Die Hemmung der Zunahme des Körpergewichts durch die konjugierte Verbindung ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% signifikant (Vergleich der Neigung der Ausgleichsgeraden).
Durch die Prüfung in vivo konnte die Antikrebswirkung der
konjugierten Verbindung aus der Kette A des Ricins und dem
IgM Anti-Thy 1.2 veranschaulicht werden. Sie wurde durch
die Hemmung der Entwicklung von Krebszellen des Stamms WEHI
22.1, die Balb/C-Mäusen injiziert wurden, nachgewiesen.
Die konjugierten Verbindungen gemäß der Erfindung bieten
eine derart spezifische Wirkung, daß ihre Verwendung zur
Behandlung des Krebses in der Humanmedizin in Betracht zu
ziehen ist. Sie werden zur Verwendung als Injektion
hergestellt und können mit anderen Krebsbehandlungsmethoden
kombiniert werden.
Claims (12)
1. Cytotoxische Produkte bestehend aus einer konjugierten
Verbindung aus einem Teil von Ricin mit einem Antikörper aus der
Gruppe der Immunoglobine, der selektiv spezifisch mit einem Antigen
zu reagieren vermag, das an der Oberfläche der Zellen
vorkommt, die man erreichen will,
dadurch gekennzeichnet, daß die Kette
A des Ricins über eine Disulfidbrücke mit einem Antikörper aus der Gruppe der Immunoglobine
oder Immunoglobinfragmente verbunden ist.
2. Cytotoxische Produkte nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der
Antikörper das Fragment F(ab)₂′ eines Immunglobulins
ist.
3. Cytotoxische Produkte nach Anspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet, daß der
Antikörper ein Anti-DNP-Antikörper ist.
4. Cytotoxische Produkte nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der
Antikörper IgM-Anti-Thy 1.2 ist.
5. Cytotoxische Produkte nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß die
Disulfidbrücke unter Beteiligung der SH-Gruppe des
einzigen Cystein-Restes der Kette A des Ricins gebildet
ist.
6. Verfahren zur Herstellung cytotoxischer Produkte nach
Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Verbindung der Formel P¹-SH mit einer anderen
Verbindung der Formel P²-S-S-X nach der Reaktion
P¹-SH + P²-S-S-X → P¹-S-S-P² + XSHumsetzt, worin P¹ entweder das mit einer freien Thiol-Gruppe
verbundene Radikal der Kette A des Ricins und P² ein
Immunoglobulin oder Immunoglobulinfragment oder umgekehrt P¹ ein
Immunoglobulin oder Immunoglobulinfragment und P² das Radikal der
Kette A des Ricins und X ein aktivierendes organisches Radikal
sind.
7. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem Fall, daß P¹ ein
Immunoglobulin oder ein Immunoglobulinfragment ist, in das eine
freie Thiol-Gruppe eingeführt werden soll, man vor dem Umsetzen des
Immunoglobulins mit S-Acetylmercaptobernsteinsäure-anhydrid und
Freisetzen der Thiol-Gruppe durch Einwirken von Hydroxylamin in an
sich bekannter Weise zuerst die Erkennungsstellen des Antikörpers
durch Behandeln mit dem Antigen oder einem anderen Antigen, das
eine Kreuzreaktion ergibt, oder auch einem geeigneten Hapten
blockiert und später die Erkennungsstellen wieder nach bekannten
Verfahren zum Entfernen des Antigens freilegt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem Fall, daß P²-SH die
Kette A des Ricins bedeutet, man diese durch die Austauschreaktion
P²-SH + X-S-S-X → P²-S-S-X + XSHin das Disulfid überführt, wobei in den vorstehenden Formeln X ein
aktivierendes Radikal ist, das aus einer Pyridyl-(2)- oder
-(4)-Gruppe, die mit einer oder mehreren Alkylgruppen, Halogen oder
Carboxylgruppen substituiert sein kann, oder aus einer Phenylgruppe
besteht, die durch eine oder mehrere Nitro- oder Carboxylgruppen
substituiert sein kann, und die Reaktion mit einem großen molaren
Überschuß des Reagenzes XSSX ausführt, der nach beendeter Reaktion
durch Dialyse oder Filtration durch ein Molekularsieb-Gel entfernt
wird.
9. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch
gekennzeichnet, daß man alle Reaktionen bei einem
pH-Wert von 7,0 in einem Phosphatpuffer bei Umgebungstemperatur
ausführt.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß in dem Fall, daß P¹-SH die
Kette A des Ricins und P₂ das Immunoglobulin oder ein Fragment
davon bedeutet, man P² nach der Reaktion
P² + Y-R-S-S-X → P²-Y′-R-S-S-Xin ein aktives Disulfid überführt, wobei in den vorstehenden
Formeln Y eine funktionelle Gruppe, die mit beliebigen
funktionellen Gruppen, insbesondere Aminogruppen in den
Seitenketten der das Immunoglobulin bildenden Aminosäuren eine
kovalente Bindung eingehen kann, R eine -(CH₂)n-Gruppe mit
n zwischen 2 und 10 oder eine Gruppe R³-CH-CH-R⁴, worin R⁴
Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen
und R³ ein gegenüber den anderen Reaktionsteilnehmern inerter
Substituent, nämlich eine Amidgruppe der Formel
in der R⁵ eine geradkettige oder verzweigte
Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, bezeichnet, und X
ein aktivierendes Radikal der im Anspruch 8 bezeichneten Art und
außerdem eine Alkoxycarbonylgruppe, bedeuten, und wobei man die
Reaktion in homogener flüssiger Phase bei Umgebungstemperatur
ausführt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß man nach Beendigung aller
Reaktionen die erhaltene "konjugierte" Verbindung zum Entfernen der
nicht umgesetzten Verbindung P²-S-S-X mit Hilfe eines an sich
bekannten Verfahrens reinigt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man das Fragment F(ab′)₂
eines Immunoglobulins als Antikörper verwendet.
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Owner name: SANOFI, 75008 PARIS, FR |
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8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition |