DE2939165A1 - Cytotoxische produkte und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft cytotoxische Produkte und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Seit vielen Jahren hat die Krebsbehandlung zu zahlreichen Untersuchungen Anlaß gegeben. Insbesondere sind bereits zahlreiche Substanzen zur Chemotherapie des Krebses durch mehr oder weniger selektive Zerstörung der Krebszellen vorgeschlagen worden. Obwohl gewisse Fortschritte erzielt werden konnten, wird die Chemotherapie des Krebses durch die unspezifische Toxicität antineoplastischer Mittel gegenüber normalen Zellen mit hoher Teilungsrate, wie die Stammzellen der blutbildenden Organe, begrenzt. Wenn es der Behandlung nicht gelingt, auch die letzten Krebszellen zu vernichten, führen diese schließlich zu einem Rezidiv des Krebses.

Um die Toxicität von Cytostatica gegenüber normalen Zellen zu vermindern, ist schon eine Reihe von Versuchen ausgeführt worden [siehe insbesondere: Compte rend. Acad. des Sciences de Paris 246, S. 1626 (1956) > Brit. Med. J. 3. S. 495 (1972); Science 169, S. 68 (1970)» und Cancer Research 2JL» ^s· 1182 (1975)]. Bei diesen Versuchen zielte

030015/0848

man darauf ab, Moleküle mit cytotoxischer Aktivität mit Antokörpern zu koppeln, die gegen die Krebszellen gerichtet sind, um dadurch in einzigartiger Weise ihre Fixierung an den Zielzellen zu erreichen. Diese Versuche haben jedoch in der Praxis nicht die gewünschten Resultate erbracht, hauptsächlich, weil die von den Antikörpern getragenen cytotoxischen Substanzen bei der Einführung in den Organismus aktiv blieben und die Teilung der normalen Zellen hemmten, bevor sie die Krebszellen erreichten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung aktiver Substanzen für die Krebsbehandlung, die aus einem cytotoxischen Mittel bestehen, das mit einem spezifischen Immunglobulin der Krebszellen gekoppelt ist. Diese Substanzen haben die Eigenart, daß sie beim Einführen in den Organismus inaktiv bleiben und erst nach der Fixierung an und dem Eindringen in die Zielzellen aktiv werden. Das verwendete Immunglobulin kann ein spezifischer Antikörper für ein bestimmtes Antigen oder ein Fragment dieses Moleküls mit einem spezifischen Erkennungsvermögen für das Antigen sein, beispielsweise Fragmente, die üblicherweise mit Fab, F(ab)¹ oder F(ab')₂ bezeichnet werden. Als cytotoxische Substanz dürfte besonders die Kette A des Ricins interessant sein.

Es ist bekannt, daß Ricin, ein toxisches Lectin aus den Samen von Ricinus communis, aus zwei Polypeptidketten aufgebaut ist, die durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die Kette A oder "Wirkungskette" hat eine hohe cytotoxische Aktivität durch Hemmung der Proteinsynthese in der Zelle. Die Kette A vermag jedoch nicht wesentlich in die Zelle einzudringen und dort ihre biologische Aktivität zu entfalten. Dagegen hat die Kette B oder "Haptenkette" des Ricins die Eigenschaft, an der Oberfläche der Zelle Saccharidmotive zu erkennen und mit ihnen eine sehr feste Bindung einzugehen. Bestimmte Vorgänge ermöglichen dann das Eindringen des Ricin-Moleküls in das Innere der Zelle,

030015/0848

wo nun die Kette A ihre txische Wirkung ausüben kann. Die Toxicität des Ricins ist um so unspezifischer, je mehr Zellen der Gesamtheit der tierischen Zellen determinierende Saccharide tragen, die von der Kette B erkannt werden.

Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung sollen künstliche gemischte Moleküle, auch als "konjugierte" Moleküle bezeichnet, herzustellen, in denen die Kette A des Ricins durch eine geeignete kovalente Bindung, vorzugsweise vom Disulfid-Typ, nicht mit der Kette B, sondern eine Proteinstruktur verbunden ist, die selektiv ein Antigen an der Oberfläche von dieses Antigen tragenden Zellen zu erkennen vermag. Wie bereits vorstehend angegeben, kann diese Proteinstruktur ein spezifisches Immunglobulin des gewünschten Antigens oder ein Fragment dieses Immunglobulins sein, das das gleiche spezifische Erkennungsvermögen hat.

Für die Wahl der Kette A des Ricins als cytotoxischer Bestandteil der konjugierten Verbindung waren hauptsächlich folgende Gründe maßgebend:

— die außerordentlich hohe cytotoxische Aktivität, wenn und nur wenn die Kette A in das Innere der Zielzellen eindringt;

— ein Zellvergiftungsmechanismus, der auf der Störung einer vitalen Grundfunktion der Zelle, nämlich ihrer Fähigkeit zur Proteinsynthese, beruht;

— eine im Vergleich zur spezifischen Toxicität sehr geringe unspezifische Toxicität, da die Kette A selbst nicht fähig ist, in die Zelle einzudringen, sondern mit einem anderen Molekül verbunden sein muß, das eine Fixierung an der Zellmembran ermöglicht. Dieses Molekül ist im Falle des Ricins die Kette B und bei der Erfindung ein spezifisches Immunglobulin, das an der Oberfläche der Zielzelle einen spezifischen Rezeptor zu erkennen vermag

- 10 -

030015/0848

und mit diesem Rezeptor eine feste, dauerhafte Bindung eingeht.

Ein Versuch zur Herstellung konjugierter Verbindungen zwischen Inununglobulinen und den das Ricin aufbauenden Peptidketten ist schon beschrieben worden [Ann. New York Acad. of Sciences 277, S. 690 (1976)]. Die bei diesem Versuch in vitro erhaltene Spezifität war jedoch außerordentlich gering, und zwar aus folgenden Gründen:

Die Kette A war vor dem Konjugieren mit den Antikörpern nicht von der Kette B isoliert worden.

Die verwendeten Antikörper waren nicht rein, sondern enthielten noch wesentliche Mengen von Proteinen, die keine Antikörper waren, sowie andere Antikörper als diejenigen, die spezifisch gegen das Ziel-Antigen gerichtet waren.

Die Kopplung des Toxins mit den Antikörpern wurde mit Hilfe von Glutaraldehyd ausgeführt, eine Verbindung, die leicht zu einer Denaturierung der Antikörper oder des Toxins durch Bildung von Brücken führt, die nicht im Innern einer Peptidkette oder zwischen Peptidketten angeordnet sind, was zu einer vom Zufall bestimmten Polymerisation führt.

Mit Hilfe der Erfindung können diese Schwierigkeiten behoben und konjugierte Verbindungen mit ausgeprägter Spezifität für die Zielzellen erhalten werden, die zur Krebsbehandlung geeignet sind.

ISOLIERUNG UND REINIGUNG DES RICINS UND DER KETTE A

Die Samen von Ricinus communis (Wunderbaum) einhalten ein toxisches Lectin, das unter dem Namen Ricin bekannt ist. Sie enthalten außerdem noch ein anderes, weniger giftiges

- 11 -

030015/0848

Lectin, das wegen seiner agglutinierenden Wirkung auf Zellen und insbesondere die Erythrocyten als Agglutinin bezeichnet wird. Dieses Agglutinin ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, die — wie das Ricin — durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind und aus zwei Glykoproteinketten bestehen.

Darüber hinaus enthält das Ricin noch andere Proteine verschiedener Natur sowie eine große Menge von Lipiden, die das Rizinusöl bilden.

Die Gewinnung des Ricins beginnt mit dem Mahlen der Samen von Ricinus communis. Man erhält einen Brei, der von den Lipiden mit Hilfe eines Fettlösungsmittels befreit werden muß, beispielsweise durch wiederholtes Ausziehen mit Äthyläther. Nach dem Trocknen wird das erhaltene Pulver in der Kälte durch Verrühren mit einer schwach sauren NaCl-Lösung extrahiert, am besten bei einer Temperatur unterhalb 4 ⁰C. Nach dem Abtrennen der unlöslichen Bestandteile wird der Extrakt intensiv dialysiert, zuerst gegen Wasser, dann gegen eine Pufferlösung von geringer Ionenstärke (10-millimolare Tris-HCl-Lösung von pH 7,7). Im Laufe der Dialyse fällt ein geringer Niederschlag aus, der durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt wird..

Der so erhaltene Extrakt enthält die gesamten löslichen Proteine der Ricinussamen, nämlich Ricin, Agglutinin und verschiedene andere Proteine. Die Lösung kann bei -20 ⁰C eingefroren und bei dieser Temperatur mehrere Wochen aufbewahrt werden.

Die Reingewinnung des Ricins aus dem Rohextrakt ist schon in der Literatur beschrieben worden. Im allgemeinen werden chromatographische Methoden angewendet: Ionenaustauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie oder Affinitätschromatographie. Sehr oft werden diese verschiedenen

- 12 -

030015/0843

ORIGINAL INSPECTED

Methoden miteinander kombiniert, was zu langwierigen und empfindlichen Verfahren führt, mit denen nur schwer wesentliche Mengen Ricin zu gewinnen sind. Mit Hilfe des Verfahrens gemäß der Erfindung ist es möglich, reines Ricin durch einmalige Affinitätschromatographie zu erhalten, bei der zuerst die Fremdproteine und dann das Agglutinin abgetrennt werden. Hierzu wird der Rohextrakt auf eine Säule aus "Sepharose 4B" (Agarose-Gel in Form kugelförmiger Teilchen in einer Konzentration von 4%) gegeben, die dann eluiert wird. Zuerst werden mit einer 50-millimolaren Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,7 die Proteine des Ricinussamens eluiert, die keine Lectine sind; dann eluiert man mit einer 0,28- bis 0,56-millimolaren Galactoselösung das reine Ricin. Durch Eluieren mit einer 0,1-molaren Galactoselösung erhält man das Agglutinin. Die Trennung zwischen den beiden Bestandteilen durch eine einzige Chromatographie ist vollständig, wenn die Menge der "Sepharose 4B" so groß ist, daß die Gesamtbeladung der Säule mit Proteinen das Aufnahmevermögen der Säule nicht überschreitet.

Nach diesem Schritt läßt sich durch Konzentrieren mittels Ultrafiltration leicht eine Lösung von reinem Ricin in einem Puffer von schwacher Ionenstärke erhalten, die 5 bis 10 mg/ml Produkt und auch noch ein wenig (etwa 0,4 mmol/1) Galactose enthält. Nach dem Einfrieren bei -20 ⁰C kann diese Lösung mehrere Wochen aufbewahrt werden.

Die beiden das Ricin bildenden Ketten können durch selektive Spaltung der einzigen sie verbindenden Disulfidbrücke getrennt werden. Diese Spaltung wird mit Hilfe eines Reduktionsmittels, wie 2-Mercaptoäthanol oder Dithiothreitol, in einer Konzentration von mindestens 2% im Reaktionsmittel bewirkt.

Die Trennung der beiden Ketten mit Hilfe von Ionenaustauschern auf verschiedenen Trägern ist schon beschrieben wor-

- 13 -

030015/0848

den. Diesen Methoden beruhen im wesentlichen auf den verschiedenen isoelektrischen Punkten der beiden Ketten, Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wird bei der Trennung der beiden Ketten A und B des Ricins nicht nur der Unterschied in den isoelektrischen Punkten der beiden Ketten, sondern auch ihre verschiedene Affinität zu chromatographischen Polysaccharid-Trägern genutzt, die Galactosederivate enthalten, die Verwendung solcher Träger bietet auch den Vorteil, daß Spuren eventuell nicht gespaltenen Ricins, die in der Mischung noch vorkommen könnten, zurückgehalten werden.

In der Praxis wird die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Lösung des Ricins in einem Puffer mit schwacher Ionenstärke bei Umgebungstemperatur mit soviel Reduktionsmittel (z.B. 2-Mercaptoäthanol) versetzt, daß dessen Konzentration 2,5% beträgt, und auf eine Säule aus "DEAE CL Sepharose 6B" (ein zur Ionenaustauschchromatographie verwendetes Agarose-Gel, das durch Vernetzen von Agarose mit 2,3-Dibrompropanol, Entfernen von Sulfatgruppen durch alkalische Hydrolyse, Einführen von Diäthylaminoäthyl-Gruppen und Konzentrieren auf 6% im Gel hergestellt wird) in dem gleichen Puffer wie derjenige, der das Reduktionsmittel enthält, gegeben. Die beiden Ketten werden durch Ionenbindung an DEAE-Gruppen an dem Material gebunden, die Kette B außerdem noch durch Affinität zur Sepharose-Grundmasse.

Die Kette A wird mit einer Pufferlösung von höherer Ionenstärke und mit höherem pH-Wert in Gegenwart des Reduktionsmittels eluiert, um eine Rekombination der beiden Ketten zu verhindern (Pufferlösung: 0,1-molare Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 8,4, die 0,1 mol/1 NaCl und 2,5% 2-Mercaptoäthanol enthält). Unter diesen Bedingungen bleibt die Kette B völlig gebunden; sie kann mit einer Mischung aus der gleichen Pufferlösung, 0,2 mol/1 NaCl und 0,1 mol/1 Galactose eluiert werden.

- 14 -

030015/0848

Bei einem anderen Verfahren zum Trennen der Ketten A und B wird zur Chromatographie ein Träger verwendet, auf dem sich gleichzeitig Ionenaustausch- und Molekularsiebvorgänge abspielen. Benutzt wird "QAE Sephadex A 50" (stark basischer Ionenaustauscher, der durch Anlagerung quaternärer Ammoniumgruppen über Ätherbindungen an Sephadex oder ein Dextran-Gel erhalten wird), aus dem die reine Kette A mit 100-millimolaren Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 8,4, die 0,5% 2-Meracptoäthanol enthält, eluiert wird. Die Kette B läßt sich mit der gleichen Pufferlösung, die noch 75 mmol/1 NaCl enthält, eluieren.

In beiden Fällen die Wahl des chromatographischen Trägers sehr wichtig. Bei Versuchen mit anderen Trägern konnte keine gute Abtrennung der Kette A erzielt werden.

Die nach dem einen oder anderen beschriebenen Verfahren erhaltene Kette A hat sich bei verschiedenen analytischen Prüfungen als sehr rein erwiesen, so daß eine weitere Reinigung nicht notwendig ist. Für die Kopplung mit Antikörpern werden jedoch verhältnismäßig konzentrierte Lösungen benötigt, die kein Reduktionsmittel enthalten dürfen. Die nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Lösung der Kette A in Tris-Puffer wird daher gegen eine 10-millimolare Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 dialysiert, wodurch das Tris, das Natriumchlorid, das 2-Mercaptoäthanol und Spuren Galactose entfernt werden.

Die so erhaltene Lösung wird auf Säule aus Carboxymethylcellulose gegeben, aus der die Kette A mit einer 125-millimolaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, die 1 mmol/1 EDTA enthält, eluiert wird. Man erhält so eine verhältnismäßig konzentrierte Lösung, die etwa 5 mg/ml Kette A enthält und zur Kopplungsreaktion verwendet werden kann.

- 15 -

030015/0848

Man kann die verdünnte Lösung auch dadurch konzentrieren und reinigen, daß man sie auf einem Träger aus "CM. Sepharose" einer kombinierten Einwirkung von Ionenaustausch- und Affinitätsvorgängen unterwirft. Man kann so eine verhältnismäßig konzentrierte Lösung von sehr hoher Reinheit erhalten. Aus einer solchen Lösung fällt beim Abkühlen die Kette A in kristalliner Form aus.

Die so hergestellte Kette A (in Form einer konzentrierten Lösung oder in Kristallform) zeigt keine unspezifische Toxicität gegenüber Zellsystemen oder tierischen Organismen mehr und kann daher zur Herstellung konjugierter Verbindungen verwendet werden, deren Spezifität ausschließlich von den Antikörpern bestimmt wird.

HERSTELLUNG REINER ANTIKÖRPER

Erfindungsgemäß wird die Herstellung der Antikörper so ausgeführt, daß man reine Antikörper erhält, die keine Moleküle ohne Antikörperaktivität enthalten, so daß die Antikörper den konjugierten Endprodukten höchste Wirkungsspezifität verleihen, ein Merkmal, das bei den in der Literatur beschriebenen Präparaten nicht beobachtet wird.

Die Immunisierung wird nach einem klassischen Verfahren wiederholt über mehrere Monate ausgeführt, um bei den Tieren eine Hyperimmunisierung zu erzielen. Man erhält so mehrere Liter Immunserum, das man bis zur Reinigung bei -20 ⁰C aufbewahren kann.

Die Reinigung wird mit Hilfe der Immunadsorption an einem Sepharose-Gel 4B ausgeführt, das durch Behandeln mit Bromcyan aktiviert wird und an dem ein/zu reinigenden Antikörper entsprechendes Antigen angelagert wird. Nach dem Abtrennen der flüssigen Phase können alle nicht an das Gel gebundenen Proteine durch gründliches Waschen entfernt werden? dann setzt man die an das Gel gebundenen Antikör-

- 16 -

030015/0848

per durch ein geeignetes Eluierungsmittel frei. Diese Methode kann auf verschiedene Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten angewendet werden. Erfindungsgemäß kann auf diese Weise die Gesamtheit der Antikörper so fraktioniert werden, daß man Antikörper mit höchster Affinität für das Antigen erhält. Bei einem Überschuß von Antikörpern im Verhältnis zu der an dem Gel gebundenen Menge Antigen hält das Gel bevorzugt Antikörper von höchster Affinität zurück.

In der Praxis arbeitet man mit einem Überschuß an Antikörpern, so daß nur ein Teil der Antikörper des Immunserums von der Säule gebunden wird, während der Rest beim Waschen entfernt wird. Unter diesen Bedingungen ist die mittlere Affinität der durch das Waschen entfernten Antikörper geringer als diejenige der Antikörper, die an die Säule gebunden sind und später eluiert werden. Man erhält so eine Gesamtheit von Antikörpern mit einer homogeneren Affinität als diejenige der in dem Ausgangsimmunserum enthaltenen Antikörper.

Wenn man mit einer großen Menge Antikörper arbeiten will, zu deren Reinigung Säulen großer Abmessungen erforderlich sind, bestimmt man zuvor die Menge Immunserum, die auf einer vorgegebenen Menge antigenhaltigen Gels verarbeitet werden kann, indem man eine Reihe von Mikroimmunadsorptionen mit steigenden Mengen Immunserum ausführt. Durch Bestimmung des Antikörpergehalts in der ablaufenden Flüssigkeit mit Hilfe von Radioimmunmethoden läßt sich das Verhältnis von Antigen/Antikörper festlegen, bei dem die unerwünschte Fraktion der zu Beginn eingeführten Antikörper mit der Flüssigkeit abläuft.

- 17 -

030015/0848

HERSTELLUNG KONJUGIERTER VERBINDUNGEN AUS DER KETTE A DES RICINS UND ANTIKÖRPERN

Dieser Teil der Erfindung betrifft das Verbinden eines spezifischen Immunglobulins eines bestimmten Antigens oder eines Fragmentes dieses Moleküls mit der Fähigkeit zur spezifischen Erkennung des Antigens mit der Kette A des Ricins über eine kovalente Bindung vom Disulfid-Typ. Für die Wahl einer Disulfid-Bindung zwischen der Kette A und dem Immunglobulin sprachen folgende Argumente:

Diese Art der Bindung ist diejenige, die im natürlichen Ricinmolekül vorkommt, und man darf annehmen, daß sie besonders geeignet ist, die Kette A in einer Beschaffenheit darzubieten, die ihr Eindringen in die Zelle erleichtert und dabei die grundlegende biologische Eigenschaft, die Hemmung der Proteinsynthese, aufs beste erhält.

Diese Bindungsart ist biochemisch labil, so daß gewährleistet ir>t, dab die so gekoppelte Kette A sich im Innern der Zelle von dem Trägerprotein lösen kann.

Die Kette A des Ricins hat in ihrer Struktur nur einen einen einzigen Cysteinrest, so daß eine einzige SH-Gruppe zur Herstellung einer Disulfidbindung ausreicht. Infolgedessen sind die durch Umwandlung der SH-Gruppe in eine Disulfidbrücke gebildeten konjugierten Verbindungen chemisch gut definiert und modifizieren nicht die Struktur der Kette A, so daß die Erhaltung der biologischen Aktivität gewährleistet ist.

Kfj fj Ibt wirksame Methoden zur Herstellung einer solchen Di γ 11 j 1fidbindung unter verhältnismäßig milden Bedingungen, r.o dnß eine Unversehrtheit der biologischen Eigenschaften der rite konjugierten Verbindungen bildenden Komponenten gewährleistet ist.

- 18 -

03001S/0848

Zur Herstellung derartiger konjugierter Verbindungen müssen die zu koppelnden Proteine mindestens ein Schwefelatom enthalten, das natürlicherweise zur Bildung der gesuchten Disulfidbrücke befähigt ist oder künstlich dazu befähigt gemacht werden kann; diese Schwefelatome können in den Proteinen von vornherein enthalten sein oder chemisch in diese eingeführt werden. Wie vorstehend bereits erwähnt, enthält die Kette A des Ricins natürlicherweise ein einziges Schwefelatom, das die gewünschte Kopplung ermöglicht. Es ist das Schwefelatom der Thiolgruppe in dem einzigen Cysteinrest in der Kette A. Bei den Immunglobulinen oder ihrer Fragmenten sind mehrere Fälle in Betracht zu ziehen:

1.In den Proteinen der vollständigen Immunglobuline kommen natürlicherweise weder eine freie Thiojgruppe noch andere Schwefelatome vor, die zu einer Kopplung herangezogen werden können. In das Molekül des Immunglobulins muß man daher ein oder mehrere Schwefelatome künstlich in der Weise einführen, daß die biologischen Eigenschaften des Immunglobulins

nicht wesentlich verändert werden;

das Schwefelatom oder die Schwefelatome mit einem oder mehreren Molekülen der Kette A des Ricins eine

Disulfidbrücke bilden können.

2. Bei dem Fragment Fab sind die Verhältnisse die gleichen wie bei dem vorstehend beschriebenen Fall.

3. Bei Verwendung eines Fragmentes vom Typ Fab¹ kann man das in der freien Thiogruppe enthaltene Schwefelatom zum Ankoppeln der Kette A benutztn. Man kann aber auch künstlich ein oder mehrere Schwefelatome einführen; in diesem Falle ist es zweckmäßig, die freie Thidgruppe zuvor in stabiler Weise zu blockieren, beispielsweise durch Alkylierung.

- 19 -

030015/0848

4. Wenn man schließlich ein Inununglobulinfragment F(ab')₂ ankoppeln will, muß man wie bei einem vollständigen Immunglobulin künstlich eine oder mehrere Schwefelgruppen in das Fragment F(ab')₂ einführen.

In allen Fällen, in denen in das Immunglobulin oder seine Fragmente ein oder mehrere schwefelhaltigen Radikale eingeführt werden, ist jede Substitution an der Erkennungsstelle für das Antigen oder in seiner unmittelbaren Umgebung zu vermeiden, da dadurch die Erkennungseigenschaften des Antikörpers beeinträchtigt werden könnten. Um jedes Risiko auszuschließen, kann man die Erkennungsstelle für das Antigen während der Substitutionsreaktion vorübergehend blockieren, indem man den Antikörper zuvor mit dem spezifischen Antigen oder einem anderen Antigen, das eine Kreuzreaktion ergibt, oder auch einem geeigneten Hapten behandelt.

Die Behandlung zum zeitweiligen Schutz kann entweder in flüssiger Phase ausgeführt werden, wenn der Antigen- (oder Hapten-)Antikörper-Komplex in dem Reaktionsmittel löslich ist; sie kann in heterogener Phase vorgenommen werden, wenn dieser Komplex von Natur aus unlöslich oder mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens absichtlich unlöslich gemacht worden ist, insbesondere durch Fixieren des Antigens (oder Haptens) an einen unlöslichen Träger in der Weise, daß der so erhaltene modifizierte Träger eine ausreichende Affinität für den Antikörper hat.

Nach ausgeführter Substitution wird die Erkennungsstelle des Antikörpers für das Antigen mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens zum Entfernen des Antigens wieder deblockiert, um das spezifische Erkennungsvermögen des Antikörpers wiederherzustellen .

Zur Herstellung der Disulfidbrücke zwischen den beiden Proteinen kann man nicht einfach die beiden zu paarenden

- 20 -

030015/0848

Komponenten, die beide eine SH-Gruppe enthalten, zusammen- bringen und eine Oxydation vornehmen. Unter diesen Bedingungen ist die Kopplungsreaktion eine Gleichgewichtsreaktion, die nur schwer vollständig in eine Richtung verläuft. Darüber hinaus ist die erwünschte Reaktion von der Bildung von Polymeren begleitet, die die beiden Komponenten enthalten, so daß die Ausbeute an dem gewünschten Produkt sehr gering ist und dieses außerdem schwer zu entfernende Verunreinigungen enthält.

Erfindungsgemäß wird die Herstellung der konjugierten Verbindungen in der Weise vorgenommen, daß man eines der Proteine, das eine freie SH-Gruppe hat, mit dem anderen Protein umsetzt, nachdem dessen SH-Gruppe mit Hilfe eines geeigneten schwefelhaltigen Radikals in ein gemischtes Disulfid übergeführt und dadurch reaktionsfähiger gemacht worden ist. Die Herstellung der kojugierten Verbindung kann durch folgendes Schema wiedergegeben werden:

1 2
worin P und P die zu koppelnden beiden Proteine und X ein aktivierendes Radikal bedeuten. Aus diesem Schema wird sofort ersichtlich, daß die Kopplungsreaktion in jedem Falle stattfinden kann, ob nun P das Immunglobulin oder sein Fragment und P die Kette A des Ricins darstellen oder umgekehrt.

1 2

Fall, in dem P den Antikörper oder Fragment und P die

Kette A des Ricins darstellen.

Um die freie SH-Gruppe der Kette A des Ricins zu aktivieren, verwendet man eine Lösung der Kette A, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, und unterwirft die Kette A einer Austauschreaktion gemäß folgender Gleichung:

- 21 -

030015/0848

worin P -SH die Kette A des Ricins und X ein aktivierendes Radikal bedeuten.

Insbesondere bezeichnet X eine Pyridyl-(2)- oder -(4)-Gruppe die mit einem oder mehreren Alkylradikalen, Halogen oder Carboxylgruppen substituiert sein kann, oder eine Phenylgruppe, die mit einer oder mehreren Nitro- oder Carboxylgruppen substituiert sein kann. Die Reaktion (1) ist eine Gleichgewichtsreaktion, aber das Gleichgewicht kann dadurch nach rechts verschoben werden, daß man einen großen molaren Überschuß des Reagenzes XSSX einsetzt, das im allgemeinen nicht kostspielig und leicht erhältlich ist. Das Fortschreiten der Reaktion kann man durch Spektrophotome— trie im ultravioletten oder sichtbaren Bereich des Lichtes kontrollieren, da die sich bildende Verbindung XSH in diesen Bereichen das Licht stark absorbiert. Wenn die Reaktion den gewünschten Fortschritt erreicht hat, werden das Reagenz X-S-S-X und das Reaktionsprodukt X-SH durch Dialyse oder Filtration über ein Molekularsieb-Gel entfernt.

Auf diese Weise erhält man eine reine Lösung der Verbin-

2
dung P -S-S-X in dem gewählten Puffer. Falls notwendig, kann man diese Lösung durch Einfrieren für mehrere Wochen konservieren.

Ferner stellt man ein Immunglobulin her, das mit eine SH-Gruppe substituiert ist. Zu diesem Zweck verwendet man die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Immunglobulin-Lösung entweder als solche oder nach Blockierung der Erkennungsstelle für das Antigen mit einem entsprechenden Hapten und Entfernung des überschüssigen Haptens. Durch Einwirkung von S-Acetyl-mercaptobernsteinsäure auf das Protein kann man über die freien Aminogruppen eine oder mehrere S-Acetyl-mercaptosuccinyl-Gruppen je Mol Protein anlagern und dann durch Einwirkung von Hydroxylamin in beschriebener Weise [Arch. Biochem. Biophys. 119,

- 22 -

030015/0848

S. 41-49 (1967)] freie Thiol-Gruppen bilden. Mit Hilfe einer Dialyse kann man überschüssige Reagenzien und niedermolekulare Reaktionsprodukte entfernen.

Alle diese Operationen werden in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 und bei Temperaturen ausgeführt, die die Umgebungstemperatur nicht überschreiten. Die am Ende erhaltene Lösung wird von dem Hapten befreit, falls ein solches als zeitweiliges Blockierungsmittel verwendet worden ist. Wenn notwendig, kann die Lösung durch Ultrafiltration od. dgl. konzentriert werden. Die Kopplung zwischen den beiden Reaktionsteilnehmers kann durch einfaches Zusammenbringen der Komponenten in wäßriger Lösung bei Umgebungstemperatur für die Dauer von einigen Stunden bis zu einem Tag nach folgendem Schema vorgenommen werden:

Prot-NH-CO-CH-SH + P-S-S-X CH₂ COO ®

Prot-NHCO-CH-S-S-P' CH₂ COO ®

+ X-SH

Das Fortschreiten der Reaktion kann durch spektrophotometrische Bestimmung der gebildeten Verbindung X-SH verfolgt werden. Diese wird durch Dialyse entfernt, und man erhält eine Lösung der konjugierten Verbindung, die noch gereinigt werden muß. Dies ist unbedingt notwendig, um vor al-

lern P -S-S-X-Moleküle zu entfernen, die nicht reagiert haben und die beim Verbleiben in dem Präparat diesem eine unspezifische Toxicität verleihen könnten.

Das Reinigen kann nach verschiedenen bekannten Methoden ausgeführt werden, beispielsweise durch fraktioniertes Fällen mit einem mit Wasser oder Salzlösungen mischbaren organischen Lösungsmittel, durch Permeations-Gel-Chromatographie oder durch Affinitätschromatographie auf einer Säule, die aus einem unlöslichen Träger besteht, auf dem

- 23 -

030015/0848

ein Antigen (oder Hapten) fixiert ist, gegen das der bei der Herstellung der konjugierten Verbindung verwendete Atikörper gerichtet ist.

Diese Reinigungsverfahren können direkt auf die dialysierte Lösung aus der Kopplungsstufe angewendet werden. $lan erhält jedoch bessere Ergebnisse und vermeidet insbesondere von Polymeren der konjugierten Verbindung, wenn man die verbliebenen freien SH-Gruppen zuvor durch Umsetzung mit einem Blockierungsreagenz, wie N-Äthylmaleinsäureimid, schützt.

1 2

Fall, in dem P die Kette A des Ricins und P den Antikörper darstellen.

Die zum Koppeln benötigten Produkte sind hier die Kette A des Ricins und das Immunglobulin (oder sein Fragment), das durch eine Trägergruppe mit einem oder mehreren aktivierten Schwefelatomen substituiert ist. Als Kette A des Ricins wird das bei der beschriebenen Reinigung erhaltene Produkt verwendet. Das mit einem aktivierten Schwefelatom substituierte Immunglobulin wird aus dem Immunglobulin selbst durch Substituieren mit einem selbst ein aktiviertes Schwefelatom enthaltenden Reagenz gemäß folgender Gleichung hergestellt

Prot + Y-R-S-S-X ·» Prot-R-S-S-X,

worin bedeuten:

Prot das Immunglobulin,

Y eine Gruppe, die das Eingehen einer kovalenten Bindung zwischen dem Reagenz und dem Protein ermöglicht,

R eine Gruppe, die gleichzeitig die Substituenten Y und -S-S-X enthalten kann, und

X ein aktivierendes Radikal.

- 24 -

03 0015/0848

Die funktioneile Gruppe Y ist so beschaffen, daß sie mit beliebigen funktionellen Gruppen in den Seitenketten der das zu substituierende Protein aufbauenden Aminosäuren eine kovalente Bindung eingehen kann. Unter diesen sind endständige Aminogruppen der in dem Protein enthaltenen Lysylradikale besonders angezeigt. In diesem Fall kann Y insbesondere sein:

eine Carboxylgruppe, die sich mit Aminogruppen des Proteins in Gegenwart eines Kopplungsmittels, wie eines Carbodiimide, vor allem eines in Wasser löslichen Derivats, wie i-fithyl-3-(3-diäthylaminopropyl)-carbodiimid, verbindet;

ein Carbonsäurechlorid, das direkt mit den zu acylierenden Aminogruppen zu reagieren vermag;

ein sogenannter "aktiver" Ester, wie ein o- oder p-, Nitro- oder Dinitrophenyl-ester oder ein Ester des N-Hydroxysuccinimids, der direkt mit den zu acylierenden Aminogruppen reagiert;

ein inneres Anhydrid einer Dicarbonsäure, wie Bernsteinsäureanhydrid, das spontan mit Aminogruppen reagiert und Amide bildet;

eine Iminoester-Gruppe -C^__Ri, worin R eine Alkylgruppe ist, die mit Aminogruppen des Protein gemäß folgender Gleichung zu reagieren vermag:

Prot-NH-C^l* + R¹OH.

X ist eine funktioneile Gruppe, die mit einer freien Thiol-Gruppe zu reagieren vermag.

- 25 -

030015/0848

Insbesondere kann X eine Pyridyl-(2)- oder -(4)-Gruppe, die durch Alkylradikale, Halogen oder Carboxylgruppen substituiert sein kann, oder auch eine Phenylgruppe sein, die vorzugsweise durch eine oder mehrere Nitro- oder Carboxylgruppen substituiert ist. X kann ferner eine Alkoxycarbonylgruppe, wie Methoxycarbonyl, sein.

R bezeichnet ein Radikal, das gleichzeitig die Substituenten Y und S-S-X enthalten kann. Es wird so gewählt, daß es keine funktionellen Gruppen enthält, die bei den weiteren Reaktionen die verwendeten Reaktionsteilnehmer oder synthetisierten Produkte nachteilig beeinflussen. Insbesondere kann R eine Gruppe -(CH₂)- mit η zwischen 2 und 10 oder eine Gruppe R-CH-CH-R sein, worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und R ein gegenüber den später verwendeten Reaktionsteilnehmern inerter Substituent, wie eine Amidgruppe -NH-C-OR ,

5 "

worin R eine geradkettige oder verzweigte 0 Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere eine tert.-Butylgruppe, ist, bedeuten.

Die Reaktion der Verbindung Y-R-S-S-X mit dem Immunglobulin wird in homogener flüssiger Phase, meist in Wasser oder in einer Pufferlösung, vorgenommen. Wenn die Löslichkeit der Reaktionsteilnehmer es erfordert, kann man dem Reaktionsmittel bis zu 20 Vol.-% eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie einen Alkohol, insbesondere tert.-Butanol, zusetzen.

Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur ausgeführt; die Reaktionsdauer liegt zwischen einigen und 24 Stunden. Danach kann man durch Dialyse die Produkte mit verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht und insbesondere überschüssiges Reagenz entfernen. Mit Hilfe dieses Verfahrens können 1 bis 5 Substitutionsgruppen je Mol Protein eingeführt werden.

- 26 -

030015/0848

Unter Verwendung derartiger Verbindungen wird die Kopplung mit der Kette A des Ricins dadurch ausgeführt, daß man die beiden Proteine in wäßriger Lösung bei einer Temperatur, die 30 ⁰C nicht überschreiten darf, zusammenbringt. Die Reaktion dauert einige Stunden bis zu einem Tag und verläuft nach folgender Gleichung:

worin Prot-R-S-S-X das am Schwefelatom aktivierte substituierte Immunglobulin (oder sein Fragment) und P -SH die Kette A des Ricins bedeuten. Die erhaltene Lösung wird zum Entfernen verhältnismäßig niedermolekularer Produkte dialysiert; dann kann die konjugierte Verbindung nach bekannten Verfahren, wie sie bei der Beschreibung des ersten Ver fahrens zur Herstellung der konjugierten Verbindung angegeben sind, gereinigt werden.

An Hand nachstehender Beispiele wird die Erfindung veranschaulicht. In diesen Beispielen bedeutet TPE eine 0,125-m Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, die 1 mmol/1 Athylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält.

BEISPIEL 1: Herstellung des Ricins

1 kg ganze, nicht geschälte Samen von Ricinus communis wurden in einer Messermühle so zerkleinert, daß ein Brei entstand, der sorgfältig mit 2 1 auf 4 ⁰C abgekühltem Äthyläther ausgezogen wurde. Nach dem Entfernen des Äthers wurde die Entfettungsoperation noch zweimal mit jeweils

2 1 Äther wiederholt. Nach dem letzten Entfernen des Äthers wurde der Rückstand an der Luft getrocknet und bildete 400 g entfettetes Pulver. Dieses Pulver wurde in 3400 ml einer auf 4 ⁰C abgekühlten 0,14-m Natriumchlorid-Lösung suspendiert, und der pH-Wert der Suspension wurde durch

- 27 -

03001 5/08 48

Zusatz von Essigsäure auf 4 eingestellt. Die mit Eis gekühlte Suspension wurde durch 30 s dauerndes intensives Durchmischen in einem Messermixer homogenisiert und dann unter fortgesetzter Eiskühlung 30 min stehengelassen. Dieser Zyklus aus Homogenisieren und Stehenlassen wurde achtmal wiederholt.

Nach beendeter Extraktion wurde die Suspension zentrifugiert, und es wurden etwa 3400 ml einer klaren Lösung erhalten. Diese wurde in ein Dialysierrohr von 10 cm Breite übergeführt und zuerst gegen (kontinuierlich erneuertes) destilliertes Wasser 48 Stunden und danach 24 Stunden gegen 10-millimolare Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,7, die mit einem Durchsatz von 1 l/h kontinuierlich erneuert wurde, dialysiert. Auf diese Weise wurden 3400 ml einer Rohlösung erhalten, die 12 mg/1 Proteine enthielt. Diese Lösung konnte bei -20 ⁰C gelagert werden.

Eine Kolonne von 100 mm Innendurchmesser wurde mit 5 1 "Sepharose 4B" gefüllt und mit auf 4 ⁰C abgekühlter 10-millimolarer Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,7 ins Gleichgewicht gebracht.

Auf die Kolonne wurden 1700 ml — also die Hälfte — der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Rohlösung mit einem Durchsatz von 300 ml/h gegeben. Sodann wurde die Säule mit 3 1 10-millimolarem Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,7 unter Beibehaltung des gleichen Durchsatzes gewaschen. Das Filtrat, das die nicht an der Säule fixierten Proteine enthielt, wurde verworfen.

Danach wurde die Säule unter Anwendung des gleichen Durchsatzes mit 4 1 des gleichen Puffers, der 0,050 g/l (0,28 mmol/1) Galactose enthielt, eluiert und die Fraktion

- 28 -

030015/0848

aufgefangen. Anschließend wurde die Säule — ebenfalls unter Anwendung eines Durchsatzes von 300 ml/h — mit 4 1 der gleichen Pufferlösung, die 0,100 g/l (0,56 mmol/1) Galactose enthielt, eluiert und die erhaltene Fraktion mit der vorhergehenden vereinigt, so daß 8 1 Lösung erhalten wurden, die etwa 300 ug/ml Ricin enthielt.

Um die Säule für eine weitere Behandlung benutzen zu können, wurde sie mit 1 1 Tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,7, die 18 g/l (0,1 mol/1) Galactose enthielt, eluiert. Die dabei gewonnene Fraktion, die im wesentlichen das Agglutinin enthielt, wurde verworfen. Nach dem Waschen mit einem weiteren Liter der gleichen Pufferlösung, dann mit mehreren Litern reinem Tris-HCl-Puffer mit pH 7 war die Kolonne wieder betriebsbereit.

Die andere Hälfte der nach dem Verfahren des Abschnitts a) erhaltenen Rohlösung wurde in gleicher Weise aufgearbeitet. Die eluierten Fraktionen wurden vereinigt, so daß 16 1 einer Lösung des Ricins in 10-millimolarem Tris-HCl-Puffer von pH 7,7 mit einem mittleren Galactose-Gehalt von 0,075 g/l erhalten wurden.

Diese Lösung wurde durch Membranfiltration in einer Zelle von 150 mm Durchmesser unter Verwendung einer Membran, die kugelförmige Moleküle mit einem Molekulargewicht <30 000 passieren ließ, konzentriert. Es wurden schließlich 762 ml einer Lösung des Ricins in dem ursprünglichen Puffer erhalten, die 6,7 mg/1 Ricin enthielt. Diese Lösung konnte bei -20 ⁰C gelagert werden.

Das so erhaltene Ricin hatte folgende charakteristische Eigenschaften:

Molekulargewicht; 66 000 ± 5000, bestimmt durch Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat [J. Biol. Chem. 24_4, S. 4406-4412 (1969)];

- 29 -

030015/0848

Isoelektrischer Punkt: 7,1, bestimmt durch Elektrophorese in einem Flüssigkeitsfaden [Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 5, Teil II, Seite 501, hrsg. von T. S. und E. Work (Nordholland)].

Alle auf das Ricin angewandten klassischen analytischen Methoden lassen den Schluß zu, daß das nach vorstehend beschriebenem Verfahren erhaltene Ricin rein ist.

BEISPIEL 2: Herstellung der Kette A des Ricins

150 ml der nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltenen Ricin-Lösung, die etwa 1 g Ricin enthielt, wurden mit 3,75 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt und 2 h bei 20 ⁰C stehengelassen .

Diese Lösung wurde sodann auf eine Kolonne von 50 mm Innendurchmesser gegeben, die mit 1800 ml "DEAE CL Sepharose 6B" gefüllt war, die zuvor mit 0,1-m Tris-HCl-Puffer von pH 8,4, die 2,5 Vol.-% 2-Mercaptoäthanol enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war.

Die Säule wurde mit 300 ml 0,1-m Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 0,1 mol/1 NaCl und 2,5 Vol.-% 2-Mercaptoäthanol enthielt, eluiert. Es wurde eine einzige Fraktion (von etwa 4 50 ml) aufgefangen, die die durch Elektrophorese identifizierte Kette A in einer Konzentration von etwa 0,89 mg/ml enthielt.

Diese Fraktion wurde sorgfältig in einem Dialyserohr von 10 mm Breite gegen 10-millimolaren Phosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert. Danach wurde die Lösung auf eine Kolonne von 25 mm Innendurchmesser gegeben, die 300 ml Carboxymethylcellulose CM 52 (Whatman), die mit 10-millimolarem Phosphatpuffer, pH 6,5, konditioniert war, enthielt. Unter diesen pH- und Ionenstärke-Bedingungen wurde die Kette A

- 30 -

030015/0848

gebunden und konnte mit TPE eluiert werden. Es wurden so 67 ml einer Lösung der Kette A erhalten, die 5,72 mg/ml Kette A enthielt.

Die Kette A hatte folgende charakterischen Eigenschaften, die in der gleichen Weise wie diejenigen des Ricins (Beispiel 1) bestimmt wurden:

Molekulargewicht: 30 000 ± 3000; Isoelektrischer Punkt: 7,5.

Darüber hinaus wurde mit Hilfe der DTNB-Methode [Methods in Enzymology Z5, S. 457 (1972), Academic Press] festgestellt, daß die Kette A bei einem ungefähren Molekulargewicht von 30 000 0,96 val/mol SH-Gruppen enthält.

Die zur Trennung verwendete Säule aus "DEAE CL Sepharose 6B" kann zur erneuten Benutzung durch Waschen mit 0,1-m Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 0,1 mol/1 NaCl und 0,1 mol/1 Galactose enthält, regeneriert werden. Diese Lösung eluiert die an der Säule fixierte Kette B. Danach muß die Säule zur erneuten Gewinnung der Kette A wieder mit 0,1-m Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 2,5 Vol.-% 2-Mercaptoäthanol enthält, ins Gleichgewicht gebracht werden.

Konzentrierung der Kette A des Ricins

Die in verdünnter Lösung erhaltene Kette A wurde auf eine Chromatographie-Kolonne von 16 mm Innendurchmesser aufgegeben, die 10 ml "Carboxymethyl-Sepharose"enthielt, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Unter diesen Bedingunegn wurde die Kette A adsorbiert und konnte danach mit TPE-Puffer eluiert werden. Die Rückgewinnung war quantitativ.

Bei einer Aufgabe von 150 ml Lösung der Kette A wurden Fraktionen mit einer mittleren Konzentration der Kette A

- 31 -

030015/0848

von 10 mg/ml erhalten, die insgesamt 90% der auf die Säule gegebenen Menge entsprachen.

Die so erhaltene Lösung hatte eine sehr hohe Reinheit. Gewinnung der Kette A in kristallisierter Form

Eine Lösung der Kette A mit einer Konzentration von 10 mg/ml wurde auf 4 ⁰C abgekühlt. Nach einigen Tagen bildeten sich Kristalle, deren Analyse nach dem Wiederlösen ergab, daß sie die gleichen physikochemischen Eigenschaften (Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt) und biologischen Wirkungen (Hemmung der Proteinsynthese) wie die Kette A in der Lösung hatten, aus der sie entstanden waren.

BEISPIEL 3: Herstellung der Kette A des Ricins

70 ml einer nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltenen Ricin-Lösung, die 4 mg/ml Ricin enthielt, wurde mit 1,75 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt und 2 h bei 20 ⁰C stehengelassen.

Die Lösung wurde dann auf eine Kolonne gegeben, die 800 ml "QAE Sephadex A 50" enthielt, das mit 100-millimolarer Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 0,5 Vol.-% 2-Mercaptoäthanol enthielt, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das EIuieren wurde mit dem gleichen Puffer ausgeführt.

Aus der aufgegebenen Lösung wurde eine Fraktion von 170 ml erhalten, die 0,9 ml/mg Kette A enthielt und nach dem Verfahren des Beispiels 2 ab der Dialyse weiterbehandelt weiterbehandelt wurde. Die so erhaltene Kette A hatte die gleichen Eigenschaften wie die nach dem Verfahren des Beispiels 2 gewonnene Kette A. Um die Säule zu regenerieren, wurde die noch gebundene Kette B mit 100-millimolarem

- 32 -

030015/0848

Tris-HCl-Puffer, pH 8,4, der 0,15 mol/1 NaCl enthielt, eluiert und dann mit 10-millimolarem Tris-HCl-Puffer, pH 7,7, gewaschen.

BEISPIEL 4; Herstellung von reinen Antikörpern Anti-DNP

Mit "Antikörper Anti-DNP" bezeichnet man Antikörper, die gegen das Radikal 2,4-Dinitrophenyl gerichtet sind.

a) Immunisieren_der Tiere

Das gewünschte Immunogen wurde nach einem klassischen Verfahren durch Einwirkenlassen von 2,4-Dinitrobenzolsulfonat auf tierisches γ-Globulin hergestellt, wobei 52 2,4-Dinitrophenyl-Gruppen je Mol Protein (DNP₅₂-BGG) gebunden wurden. Durch Immunisieren mit diesem Produkt läßt sich eine Fraktion von Antikörpern bilden, die spezifisch gegen das Hapten 2,4-Dintrophenyl gerichtet sind.

Drei Ziegenböcke wurden durch Injektion von 5 mg DNP₅₂-BGG in einer Emulsion aus 2 Volumenteilen physiologischer Kochsalzlösung, gepuffert auf pH 7,4, und 1 Volumenteil kompletten Freuηd sehen Adjuvans immunisiert. Nach der ersten Immunisierung wurden 7 Folgeimpfungen im Laufe eines Jahres vorgommen. Gleichzeitig wurde von jedem Tier 12 mal venös 1 1 Blut entnommen. Daraus wurde Serum hergestellt und bei -20 ⁰C konserviert. Nach der Reinigung wurden 17 Entnahmen vereinigt und durch Erhitzen völlig inaktiviert. Sodann wurde das Serum 30 min mit 20 000 g zentrifugiert, um die denaturierten Proteine und Aggregate zu entfernen, und schließlich durch Papier filtriert, um suspendierte Fettstoffe abzutrennen. Das so erhaltene Serum wurde anschließend gereinigt.

- 33 -

030015/08^8

b) Reinigung

In diesem Verfahrensschritt sollen die Anti-DNP-Antikörper im Serum an ein Trägerprotein des 2,4-Dinitrophenyl-Haptens gebunden werden, das auf einem festen Träger fixiert ist.

Herstellung des Immunadsorptionsträgers

Das Immunadsorptionsgel wurde nach einem klassischen Verfahren aus 1630 mg Albumin aus menschlichem Serum, das 35 Dinitrophenylgruppen enthielt (DNP₃₅-HSA) und 100 g (Trockengewicht) "Sepharose 4B" hergestellt. Eine spektrophotometrische Analyse der Waschwässer nach dem Koppeln bei 280 nm und 360 nm ergab eine Bindung von 95% der DNP-Jc^-HSA. zwei Waschbehandlungen wurden ausgeführt: zuerst bei pH 3,0 mit einem Glycinhydrochlorid-Puffer, 0,8-molar, der 1 mol/1 NaCl enthielt, dann bei pH 10,0 mit einem 0,1-m Boratpuffer, der 1 mol/1 NaCl enthielt. Danach wurde das Gel mit einem Arbeitspuffer ins Gleichgewicht gebracht, der einem 0,1-m Phosphatpuffer, pH 7, bestand, der 0,01 g/ml Natriumazid enthielt.

Adsorption der Antikörper

Vor der Ausführung der Adsorption an das in vorstehend beschriebener Weise vorbereitete Gel erschien es zweckmäßig, das anzuwendende Volumenverhältnis Serum/Gel zu bestimmen, um an den Träger nur Anti-DNP-Antikörper von höchster Affinität zu binden. Um dieses Ergebnis zu erzielen, ist man schon in der Weise verfahren, daß man nur 50% der im Serum vorhandenen Gesamtantikörperaktivität an die Säule fixierte und die übrigen 50% in der überstehenden Flüssigkeit ließ.

Bei einem gegebenen Serum wird die Bestimmung der Menge des benötigten Gels durch Arbeiten mit kleinen Mengen unter analytischen Bedingungen ausgeführt. Aliquote Teile von 125 μΐ des Immunadsorptionsgels werden mit in geome-

- 34 030015/0848

trischer Reihe mit dem Faktor 2 steigenden Mengen von 0,5 bis 8 ml Serum in Berührung gebracht. Nach Inkubation wird die überstehende Flüssigkeit mit Hilfe eines klassischen Radioinununversuchs[Handbook of Experimental Immunology, Bd. 1, Kap. 15, S. 1-18, hrsg. von D. M. Weir, 2. Aufl. 1973] auf Anti-DNP-Antikörperaktivität untersucht, wobei man £^N-(2,4-Dinitrophenyl)-L-lysin auf den Phenylring in 3- und 5-Steilung titriert..

Man kann dann für jeden Test die in der überstehenden Flüssigkeit verbliebene Antikörperaktivität durch den prozentualen Anteil (A) der in dem Ausgangsimmunserum vor der Gel-Behandlung vorhandenen Aktivität ausdrücken und eine Kurve A (%) = f(Mengenverhältnis Serum/Gel) zeichnen. Aus diesem Diagramm kann man ablesen, bei welcher Serummenge nach Behandlung mit 125 μΐ Gel 50% der Antikörperaktivität in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben. Diese Menge betrug bei dem beschriebenen Versuch 4 ml oder 32 ml Serum je Milliliter Immunadsorptionsgel.

Nach der Bestimmung des Verhältnisses wurden in einem 10-1-Behälter 6150 ml Immunserum mit 193 ml Immunadsorptionsgel 1 h bei Umgebungstemperatur verrührt und dann über Nacht bei 4 ⁰C stehengelassen.

Nach Zentrifugieren (10 min bei 1000 g) wurde das Gel abgetrennt und das feste Sediment erneut in der überstehenden Flüssigkeit suspendiert. Diese Suspension wurde auf eine Chromatographiekolonne (26 mm 0, 4 00 mm Länge) gegeben, die mit einem Kühlmantel ausgerüstet war und auf 4 ⁰C gehalten wurde. Ferner war die Kolonne mit einem Gerät zur Messung und Registrierung der optischen Dichte bei 280 nm und einer Vorrichtung zum Auffangen der Fraktionen versehen. Nach beendeter Aufgabe der Suspension wurde die Säule mit 8 1 0,1-m Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,01 g/ml Natriumazid enthielt, gewaschen. Das Waschen wurde 40 h bei

- 35 -

030015/08^8

4 ⁰C und danach 24 h bei Umgebungstemperatur ausgeführt. Am Ende der Waschbehandlung war die optische Dichte bei 280 nm außerordentlich gering (OD <0,04).

Elution der Antikörper

Die an der Säule fixierten Anti-DNP-Antikörper wurden mit einem großen Überschuß einer Läsung des 2,4-Dinitrophenyl-Haptens eluiert.

Verwendet wurde eine 0,2-m Lösung von 2,4-Dinitrophenol in dem vorstehend beschriebenen Phosphatpuffer, dessen pH-Wert durch Zusatz von Soda auf 7,0 eingestellt worden war. Diese Lösung muß vor Licht geschützt aufbewahrt werden. Zum Eluieren wurden 2,8 1 dieser Lösung verwendet, die die Kolonne mit einem Durchsatz von 125 ml/h passierten. Um das 2,4-Dinitrophenol aus dem Eluat zu entfernen, wurde dieses sofort auf eine zweite Kolonne gegeben, die 300 ml Ionenaustauschharz "Dowex 1x10" (Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit quaternären Aminogruppen) enthielt, das mit dem zum Waschen verwendeten Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht worden war.

Die Antikörper wurden mit einem einzigen Proteingipfel, gefolgt von einem Nachlauf, eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden in eine Fraktion mit einer optischen Dichte £0,9 (Fraktion B , 700 ml) und in eine zweite Fraktion aus den anderen Fraktionen (Fraktion B₂, 2000 ml) eingeteilt. Die Proteinkonzentration der Fraktionen wurde nach einem im J. Immun. Meth. J_5, S. 101-109 (1977) beschriebenen Verfahren bestimmt.

Die Fraktion B enthielt 15,4 g oder 22 g/l Antikörper, die Fraktion B~ etwa 1 g oder 0,5 g/l Antikörper. Die Antikörper können in dem zum Waschen verwendeten 0,1-m Phosphatpuffer, pH 7, der 0,01% Natriumazid enthält, bei -20 ⁰C konserviert werden.

- 36 -

030015/0840

Verschiedene physikochemische Methoden, insbesondere die Dünnschicht-Elektrophorese in Agarose-Gel, die Immunelektrophorese und die Gel-Filtration durch eine Säule aus "Sephadex G 200" (Dextran-Gel in Perlenform, das durch Vernetzung von Dextran-Fraktionen mit Epichlorhydrin erhalten wird) lassen den Schluß zu, daß die erhaltenen Antikörper rein und insbesondere keine nachweisbaren Mengen Albumin (weniger als 1/500) der Antikörper und Immunglobuline M in den Präparaten zugegen sind.

Die immunologische Aktivität der gereinigten Antikörper wurde nach der NAHM-Methode [J. Immunol. 119, 1, S. 301 (1977)] bestimmt und mit derjenigen des Ausgangsimmunserums sowie der in der überstehenden Flüssigkeit bei der Immunadsorption enthaltenen Antikörper (Fraktion A₁) verglichen.

Mittlere Assozia- Streuungsindex tionskonstante der Affinitäten

lmmunserum	2	,0-	107	mol 1	0	,50
Fraktion A1		5-	105	mol"1	0	,22
1 Fraktion B,	2	,5-	107	mol	0	,75

Diese Ergebnisse zeigen, daß die gereinigten Antikörper (Fraktion B₁) bieten:

eine höhere mittlere Affinität als das Ausgangsimmunserum und eine viel höhere mittlere Affinials die Fraktion A₁;

eine größere Homogenität der Affinität als das Ausgangsimmunserum .

- 37 -

030015/0848

BEISPIEL 5: Herstellung einer konjugierten Verbindung aus Mercaptosuccinyl-Anti-DNP-Antikörpern und der aktivierten Kette A des Ricins

^a) 9§E§tellun2_der_aktivierten_Kette_A_des_Ricins

15 ml einer Lösung der Kette A in dem Phosphatpuffer (Beispiel 2), die 1,4 mg/ml Kette A enthielt, wurde mit 8 ml einer 1,425-millimolaren Lösung von Dipyridyl-disulfid-(2,2') in dem gleichen Puffer gemischt. Die Lösung wurde 1 1/2 h bei Umgebungstemperatur unter Lichtabschluß stehengelassen. Es wurde eine Lösung der an der Thiol-Gruppe aktivierten Kette A erhalten, die 0,9 mg/ml Protein enthielt. Nach der Reaktion ergab eine spektrophotometrische Prüfung bei 34 3 nm, daß das gebildete Produkt 0,9 aktivierte S-S-N-Pyr-Gruppen (Pyr = Rest des Pyridinringes) je Mol Kette A enthielt. Die Lösung wurde durch 18stündige kontinuierliche Dialyse bei einer Temperatur von 5 ⁰C gegen TPE gereinigt. Die gereinigte Lösung wurde bei -20 ⁰C aufbewahrt.

Zu 3,3 ml Anti-DNP-Antikörper-Lösung (Beispiel 4), die 25,8 mg/ml reine Antikörper enthielt, wurden 0,37 ml einer wäßrigen Lösung von 2,4-Dinitrophenol mit einer Konzentration von 0,57 mg/ml zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 min bei Umgebungstemperatur gerührt. Diese Lösung wurde quantitativ zu 3,06 mg S-Acetyl-mercaptobernsteinsäureanhydrid zugefügt [Arch. Biochem. Biophys. £j5, S. 605—612, (1969)], und das Gemisch wurde 2 h unter Rühren bei Umgebungstemperatur stehengelassen.

Danach wurde diese Lösung mit 0,47 ml 0,1-m wäßrigen Hydroxylamin-Lösung, pH 8,0, versetzt und 1 1/2 h bei Umgebungstemperatur stehengelassen. Das Präparat wurde gegen viermal 3 1 TPE 89 h bei 5 ⁰C dialysiert; dann wurde

- 38 -

030015/0849

die dialysierte Lösung 10 min bei 4 ⁰C mit 27 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule aus "Dowex 1x8" der Körnung 0,07 bis 0,037 mm in Phosphatform gegeben, um das an den Erkennungsstellen des Antigens fixierte 2,4-Dinitrophenol zu entfernen.

Die Säule wurde mit TPE bei Umgebungstemperatur eluiert und die Lösung durch Membranfiltration konzentriert. Es wurden 4,55 ml Lösung erhalten, die 17,0 mg/ml Mercaptosuccinyl-Antikörper enthielt.

Nach einer in "Arch. Biochem. Biophys." 119, S. 41-49 (1969) beschrieben Methode konnte festgestellt werden, daß das Antikörpermolekül mit 4 Mercaptosuccinyl-Gruppen je Mol Antikörper substituiert war.

12,4 ml der Lösung der aktivierten Kette A des Ricins (hergestellt nach dem Verfahren des Abschnitts a) mit einer Konzentration von 1 mg/ml oder 0,413 μΐηοΐ wurden mit 6,5 ml einer Lösung von 4 Mercaptosuccinyl-Gruppen enthaltenden Anti-DNP-Antikörpern (hergestellt nach dem Verfahren des Abschnitts b) mit einer Konzentration von 15 mg/ml oder 0,658 μΐηοΐ gemischt. Das Gemisch wurde 20 h bei Umgebungstemperatur und Lichtausschluß stehengelassen.

Die spektrophotometrische Bestimmung des freigesetzten Pyridinthiols-(2) im Reaktionsmittel ergab, daß 0,251 umol der Kette A mit 0,658 umol Antikörper gekoppelt worden waren. Das Präparat wurde dreimal gegen 51 TPE 75 h bei 5 ⁰C dialysiert; dann wurde die erhaltene Lösung (17 ml) durch eine Sterilisationsmembranfilter (0,45 μπι) filtriert und bei -20 ⁰C aufbewahrt. Zur Weiterbehandlung wurde das Produkt durch Gel-Filtration über "Sephadex G 200" gereinigt. Hierzu wurden 7 ml der Lösung 10 min mit 27 000 g zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit

03001^0848

0,6 ml einer Lösung von N-Äthylmaleinsäureimid einer Konzentration von 0,64 5 mg/ml in TPE 30 min in der Ruhe bei Umgebungstemperatur behandelt. Danach wurde die Lösung in absteigender Richtung durch eine Kolonne (von 26 mm 0) filtriert, die 473 ml "Sephadex-Gel G 200" enthielt. Das Produkt wurde mit TPE mit einem Durchsatz von 16 ml/h eluliert und der Ablauf in Fraktionen von 2 ml aufgefangen.

In jeder Fraktion wurde die Antikörperkonzentration durch Spektrophotometrie bei 280 nm und die Konzentration der Kette A durch Hemmung der Proteinsynthese bestimmt. So konnte die Existenz zweier Elutionsgipfel nachgewiesen werden, die beide die Antikörper und die Kette A enthielten und die in zwei den beiden Gipfeln entsprechenden Lösungen a und b eingeteilt wurden.

Der erste Gipfel (Lösung a) entsprach einer konjugierten Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht £ 800 Dieses Präparat enthielt eine konjugierte Verbindung aus polymerisierten Antikörpern, die sich über bei der Isolierung der Marcaptosuccinyl-Antikörper über intermolekular gebildete Schwefelbrücken polymerisiert hatten.

Der zweite Gipfel (Lösung b) enthielt Proteine mit einem mittleren Molekulargewicht von 190 000, das einer konjugierten Verbindung entspricht, in der die Antikörper nicht polymerisiert sind.

Mit Hilfe analytischer Bestimmungen konnte festgestellt werden, daß die Lösung a 423 ug/ml Antikörper und 20 μg/ml Kette A oder ungefähr im Mittel 0,2 mol Kette A je Mol Antikörper enthielt. Die Lösung b enthielt 171 ug/ml Antikörper und 13 ug/ml Kette A oder ungefähr im Mittel 0,4 mol Kette A je Mol Antikörper.

0300ΪΒ/08Α8

BEISPIEL 6: Herstellung einer konjugierten Verbindung

aus aktivierten, an den Schwefelatomen substituierten Anti-DNP-Antikörpern und der Kette Λ des Ricins

Diese Verbindung kann in zwei Stufen aus Dipyridyl-disulfid-(2, 2¹) ohne Reinigung des Zwischenproduktes gemäß folgender Gleichung hergestellt werden:

_clo ^₁ HS-CT₉-CH-COOH ^

s-s -*V —> ^V^sci

4 g Dipyridyl-disulfid-(2,2') wurden in 25 ml Methylenchlorid gelöst, und in die Lösung wurde 30 min Chlor eingeleitet. Im Laufe der Reaktion bildete sich ein Niederschlag, von dem die Flüssigkeit im Hochvakuum abgedampft wurde. Der trockene Rückstand wurde für den nachstehend beschriebenen Verfahrensschritt verwendet.

2,4 g des 2-Chlorsulfenyl-pyridins wurden in 40 ml Methylenchlorid gelöst, und unter Kühlen in einem Eisbad wurde langsam unter Rühren eine Lösung von 1,75 g 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Methylenchlorid zugesetzt. Nach beendetem Zusatz wurde die Lösung noch 15h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 50 ml Wasser zugesetzt und die Lösung durch Zusatz von 1-n Sodalösung auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum von dem Lösungsmittel befreit. Es wurde ein öliger Rückstand erhalten, der kristallisierte und 1,8 g Kristalle lieferte. Diese wurden durch Lösen in 16,8 ml einer 0,5-m wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Zusatz von Aktivkohle, Abfiltrieren und Ausfällen des Produktes durch Zusatz von

- 40 -

030015/0848

etwa 0,5 ml konzentrierter Essigsäure bis zu einem pH-Wert von 3 bis 3,5 gereinigt. Der Niederschlag wurde im Hochvakuum getrocknet und ergab 1,3 g eines festen Produktes mit einem Schmelzpunkt von 62—64 ⁰C.

Um alle Spuren von Thiol-Gruppen, die in dem verwendeten Produkt vorkommen könnten, zu alkylieren, wurden 13 ml einer Anti-DNP-Antikörper-Lösung mit einer Konzentration von

23.6 mg/ml in einem 0,1-m Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 1 ml einer 1,29 mg/ml N-Äthylmaleinimid enthaltenden TPE-Lösung gemischt. Das Gemisch wurde 5 h bei Umgebungstemperatur gerührt; dann wurde die Lösung bei b ⁰C 15h mit einem Durchsatz von 500 ml/h gegen TPE dialysiert.

Der Inhalt des Dialysesackes (12 ml mit einer Konzentration von 21,4 mg/ml) wurde mit 24 ml einer wäßrigen Lösung von 19,9 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid

55.7 mg 3-[Pyridyl-disulfanyl-(2)]-propionsäure und 14 mg 1-Hydroxy-benzotriazol gemischt. Die Mischung wurde 16h bei Umgebungstemperatur gerührt und dann 10 min mit 27 000 g zentrifugiert. Danach wurde die Lösung bei 5 ⁰C 23 h mit einem Durchsatz von 500 ml/h gegen TPE kontinuierlich dialysiert. Es wurde so 34 ml einer Lösung erhalten, die 7,2 mg/ml Proteine enthielt. Durch spektrophotometrische Bestimmung des durch den Austausch mit dem reduzierten Glutathion freigesetzten Pyridinthiols-(2) bei 343 nm wurde festgestellt, dall Antikörper gebildet worden waren, die 4 Aktivatorgruppen je Mol Antikörper enthielten.

16 ml der Lösung der aktivierten Antikörper mit einer Konzentration von 5,9 mg/ml wurden mit 20 ml mit einer Lösung der Kette A des Ricins in TPE mit einer Konzentra

- 41 -

030015/0849

- ιλ·

tion von 2,8 mg/ml gemischt. Das Gemisch wurde 24 h bei Umgebungstemperatur unter Lichtausschluß ruhig stehengelassen. Dann wurde es 10 min mit 27 000 g zentrifugiert. Die Bestimmung des im Laufe der Reaktion freigesetzten Pyridinthiols-(2) ergab, daß 1,123 μπιοί Kette A mit 0,638 μπιοί Antikörper oder im Mittel 1,76 Äquivalente der Kette A je Mol Antikörper gekoppelt worden waren.

Die Lösung wurde 21 h bei 5 ⁰C mit einem Durchsatz von 720 ml/h kontinuierlich gegen TPE dialysiert. Der Inhalt des Dialysesackes (34 ml) wurde mit 1 ml einer 12,5 mg/ml enthaltenden N-Äthylmaleinimid-Lösung versetzt, 5 h bei Umgebungstemperatur stehengelassen und dann bei -20 ⁰C konserviert.

Diese Lösung der konjugierten Verbindung wurde mit Hilfe einer Filtration durch eine Säule aus "Sephadex G 200" unter den im Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen fraktioniert. Es wurden so drei Lösungen erhalten:

die Lösung c, die eine konjugierte Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 300 000 enthielt;

die Lösung d, die eine konjugierte Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 190 000 enthielt; und

die Lösung e, die eine konjugierte Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von 160 000 enthielt.

Die Zusammensetzung der konjugierten Verbindungen in den verschiedenen Lösungen ist in nachstehender Tabelle wiedergegeben:

- 42 -

03Ü015/0SA8

	-Tt-	2939165
	μg der an die Antikörper	mol Kette A
	gekoppelten Kette A je ml Lösung	mol Antikörper
Lösung c	13	0,9
Lösung d	48	1,0
Lösung e	3	0,2

BEISPIEL 7: Herstellung einer konjugierten Verbindung aus aktiviertem, durch eine Disulfidgruppe substituiertem Anti-DNP-Antikörper und der Kette A des Ricins

Diese Säure wird in zwei Stufen aus 3-IPyridyl-disulfany1-(2)]-propionsäure ohne Reinigung des Zwischenproduktes gemäß folgender Reaktionen hergestellt:

0
S-S-CH₂CH₂C-OH

)₅COOH

OH-N

Il

-S-CH₂CH

CH₂

0,430 g der nach dem Verfahren des Beispiels 6 a) hergestellten 3-[Pyridyl-disulfanyl-(2)!-propionsäure wurden in 3 ml Pyridin gelöst, und die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 0,230 g pulverförmiges N-Hydroxy-succinimid, dann 0,453 g ebenfalls

- 43 -

030015/084B

pulverförmiges Dicyclohexyl-carbodiimid gegeben. Die Mischung wurde 20 h bei 4 ⁰C gerührt und dann zur Abtrennung des Niederschlages von dem gebildeten Dicyclohexylharnstoff filtriert. Der Niederschlag wurde mit Pyridin gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt. Dann wurde das Pyridin im Hochvakuum bis zur Trockene abgedampft. Der Rückstand wurde mit Äthylacetat aufgenommen. Es bildete sich erneut ein Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff, der abfiltriert wurde. Das Äthylacetat wurde im Hochvakuum bis zur Trockene verdampft und die Waschbehandlung mit Äthylacetat zweimal wiederholt. Es wurden so 0,610 g des erwarteten Esters erhalten.

Das gesamte Produkt wurde in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 0,288 g 6-Aminocapronsäure in 2,5 ml Wasser gegeben. Dann wurde eine der 6-Aminocapronsäure stöchiometrisch entsprechende Menge (0,222 g) Triäthylamin zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen. Unter fortgesetztem Rühren wurde das Gemisch 20 h bei 4 ⁰C reagieren gelassen. Danach wurde das Reaktionsmittel im Hochvakuum zur Trockene verdampft, und der Rückstand in 10 ml Wasser wieder aufgenommen. Die Lösung wurde durch Zusatz von Essigsäure bis pH 4,5 angesäuert. Es bildete sich ein Niederschlag, der durch Dekantieren abgetrennt und dann in Äthylacetat gelöst wurde. Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Hochvakuum zur Trockene gedampft.

Es wurden 0,6 00 g eines noch zu reinigenden Produktes erhalten. Die Reinigung wurde durch Verteilungschromatographie auf einer Siliciumdioxid-Säule unter Bedingungen ausgeführt, die durch eine Analyse des Produktes mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie in einem Chloroform-Aceton-Essigsäure-Gemisch (80:15:5) ermittelt wurden.

0,410 g des Produktes wurden auf eine Kolonne von 2 cm Innendurchmesser gegeben, die 160 ml Silicagel (Merck

O3OO"15/O8A8

Nr. 60, Korngröße 60-230 Maschen) gefüllt war, die mit Chloroform ins Gleichgewicht gebracht worden war. Eluiert wurde mit einem diskontinuierlichen Gradienten von Methanol in Chloroform. Das reine Produkt wurde mit einem 2%-igen Methanolgemisch. Die Lösungsmittel wurden im Hochvakuum zur Trockene verdampft.

Es wurde ein hellgelbes Produkt von pastöser Konsistenz erhalten , das durch sein MagnetkernresonanzSpektrum charakterisiert wurde.

Zu 9 ml der Anti-DNP-Antikörper-Lösung in der TPE-Puffer mit einer Konzentration von 11,4 mg/ml wurden 9 ml eines 2:I-Gemisches von Wasser und tert.-Butanol gegeben, das 5,3 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid und und 13,7 mg 6-[3-(Pyridyl-disulfanyl-2)-propionylamino]-hexansäure enthielt. Die Lösung wurde dann nach dem Verfahren des Beispiels 6 weiterbehandelt.

Die Bestimmung der aktivierten Antikörper ergab einen mittleren Substitutionsgrad von 0,6 Aktivatorgruppen je Mol Antikörper.

Die Antikörperlösung wurde durch Membranfiltration auf einen Gehalt von 11,1 mg/ml konzentriert.

^c) SSIii§IiH22_^§E_!S2Siü2ii£t§il_YfE^indung

48,8 mg der modifizierten Antikörper wurden mit 35,6 mg der Kette A des Ricins in einer Konzentration von 7,9 mg/ml in TPE-Puffer zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde dann im wesentlichen nach dem Verfahren des Beispiels 6 weiterbehandelt. Der mittlere Kopplungsgrad betrug 0,5 Kette A je Mol Antikörper. Die Reinigung der

- 45 -

030015/0848

konjugierten Verbindung durch Filtration wurde nach dem Verfahren des Beispiels 6 ausgeführt.

BEISPIEL 8; Herstellung der konjugierten Verbindung

aus dem Fragment FUbK₂ der Anti-DNP-Antikörper und der Kette A des Ricins

iHi22__2_ ^ der_Anti-DNP-Anti körger

Die nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhaltene Antikörper-Lösung wurde gegen einen 0,12-m Acetatpuffer, pH 4,7, dialysiert. Zu 45 ml dieser Lösung, die 500 mg Antikörper enthielt, wurden 3 ml einer Lösung von Pepsin (Schweinepepsin E.C. 3.4.1, zweimal kristallisiert, 3200 μ/mg) mit einer Konzentration von 10 mg/ml zugesetzt, und das Gemisch wurde 20 h bei 37 ⁰C bebrütet. Das Fortschreiten der Hydrolyse wurde mit Hilfe der Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat [J. Biol. Chem. 244, S. 4406 bis 4412 (1969)] durch Verschwinden der Bande bei 150 000 D (Dalton), die dem nichthydrolysierten Antikörper entspricht.

Die Hydrolyse wurde durch Einstellen des Reaktionsmittels auf pH 7,0 mit Hilfe 1-n Sodalösung unterbrochen; dann wurde die Lösung zentrifugiert und das Unlösliche entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Kolonne von 50 mm Innendurchmesser gegeben, die mit 1800 ml "Sephadex G 150" gefüllt war, das mit 0,1-m Phosphatpuffer, pH 7,0, ins Gleichgewicht gebracht worden war.

Das Eluieren wurde mit dem gleichen Puffer ausgeführt. Der erste Gipfel wurde in zwei Fraktionen aufgefangen; die erste (200 ml) enthielt 70 mg Fragment F(ab)'₂ des Antikörpers, die zweite (100 ml) enthielt 70 mg einer

- 46 -

030015/0848

Mischung von Fragment F(ab)'_a und einem Verunreinigungsfragment mit einem Molekulargewicht von 50 000 D. Der
zweite Gipfel enthielt Proteinfragmente mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 000 D; dieses Eluat wurde verworfen. .

Das in der ersten Fraktion des ersten Gipfels enthaltene reine Fragment F(ab)J wurde durch Membranfiltration auf einen Gehalt von 16 mg/ml konzentriert und bei -20 ⁰C
konserviert.

Molekulargewicht: 95 000 D (bestimmt nach Eichung des Gels

"Sephadex G 150";
Isoelektrischer Punkt: zwischen pH 7,7 und 8,8 (bestimmt

nach Elektrofokussierung auf einer LKB-

Platte).

Zu 15 ml der F (ab)'₂ -Lösung mit einer Konzentration von
15,6 mg/ml wurden 15,3 ml eines 2:1-Wasser/tert.-Butanol-Gemisches gegeben, das 17,3 mg 1-Äthyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid und 50,4 mg 3-[Pyridyl-disulfanyl-(2)] propionsäure enthielt. Das Gemisch wurde 20 h auf 30 ⁰C gehalten; dann wurde die Lösung 23 h bei 4 ⁰C gegen den TPE-Puffer kontinuierlich dialysiert. Die spektrophotometrische Bestimmung bei 343 nm des durch Austausch mit dem reduzierten Glutathion freigesetzten Pyridinthiols-(2) ergab, daß die Aktivierung des Fragments F(ab)'₂ zu einem mittleren Substitutionsgrad 1,5 Aktivatorgruppen je Mol F(ab)'₂ geführt hatte.

Die so erhaltene Lösung des aktivierten F(ab)'₂ wurde durch Ultrafiltration auf 10 mg/ml konzentriert.

- 47 -

030015/08A8

c) Herstellung der kongugierten Verbindung

Zu 13,8 ml der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Lösung des aktivierten F(ab)'₂ mit einer Konzentration von 10 mg/ml wurden 13,8 ml einer Lösung der Kette A des Ricins in TPE-Puffer mit einer Konzentration von 8 mg/ml gegeben. Die Mischung wurde 24 h unter Stickstoffatmosphäre und Lichtausschluß bei Umgebungstemperatur stehengelassen, dann bei 4 ⁰C 10 min mit 27 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen. Die Bestimmung des im Laufe der Reaktion freigesetzten Pyridinthiols-(2) ergab, daß der mittlere Kopplungsgrad 1,2 Äquivalente der Kette A je Mol F(ab)'₂ betrug.

Die Lösung wurde auf eine Kolonne von 50 mm Innendurchmesser gegeben, die 1730 ml "Sephadex G 200" enthielt. Das Eluieren wurde mit TPE-Puffer ausgeführt. Es wurden Fraktionen mit einem Volumen von weniger als 8,4 ml aufgefangen und nach dem Verfahren der Beispiele 5 und 6 analysiert. Das Produkt der Konjugierung erschien in einem Gipfel.

Die den Gipfel der konjugierten Verbindung bildenden Verbindung wurden in drei Gruppen von Lösungen eingeteilt:

Lösung f: Vorderfront des Gipfels; Lösung g: mittlerer Bereich des Gipfels; und Lösung h: Rückfront des Gipfel.

Die Analyse der Lösung g durch Bestimmung ihrer Hemmwirkung auf die Proteinsynthese (Test 1) und ihres Proteingehaltes erbrachte folgende Ergebnisse:

\xq der an F(ab)'₂ gekop- Äquivalente pelten Kette A je ml Kette A je Lösung mol F(ab)'₂

Lösung g 148 1,4

- 48 -

030015 /08Λ8

d) Konzentrieren_der_konju2ierten_Verbindun2

In einer ersten Stufe wurde durch Ultrafiltration konzentriert: 255 ml der Lösung g der konjugierten Verbindung (mit einem Kette A-Gehalt von 148 μg/ml) wurden so auf eine Konzentration von 381 ug/ml gebracht. Die Lösung wurde dann auf das 1Ofache mit destilliertem Wasser verdünnt, um die Ionenstärke des Mediums herabzusetzen.

Die Lösung (400 ml mit einer Konzentration von 38 ug/ml Kette A) wurde auf eine Kolonne von 9 mm Innendurchmesser gegeben, die 5,7 ml "CM. Sepharose" enthielt, die mit 10-millimolarem Phosphatpuffer, pH 6,5, dem 1 mmol/1 Dinatrium-äthylendiaminotetraacetat zugesetzt worden war, ins Gleichgewicht gebracht worden war.

Die Lösung wurde mit einem Durchsatz von 80 ml/h aufgegeben. Unter diesen Bedingungen wurde die gesamte konjugierte Verbindung an der Säule fixiert. Nach beendeter Aufgabe wurden noch 4,5 ml der Pufferlösung durchlaufen gelassen; dann wurde die konjugierte Verbindung mit TPE-Puffer unter Anwendung des gleichen Durchsatzes eluiert.

Die konjugierte Verbindung erschien in einem einzigen Gipfel. Der Endteil des Gipfel enthielt wenig Proteine und wurde verworfen. Die übrigen Fraktionen wurden in Gruppen eingeteilt, und es wurde die Konzentration der Kette A bestimmt.

Diese Bestimmung ergab, daß durch das Konzentrieren an "CM. Sepharose" die Konzentration der Kette A der konjugierten Verbindung auf 3,6 mg/ml erhöht werden kann. Der Vorgang verläuft quantitativ, und die Fraktionen, die eine Lösung mit einer Konzentration von 3,6 mg/ml enthalten, stellen insgesamt 76% der auf die Kolonne gegebenen Menge der konjugierten Verbindung dar.

_ 49 _

030015/0SAd

BEISPIEL 9: Herstellung der konjugierten Verbindung aus dem IgM-Anti-Thy-1.2-Antikörper und der Kette A des Ricins

Reines IgM wurde aus Ascitesflüssigkeit hergestellt, die von der OLAC Ltd. erhältlich ist (monocloner, cytotoxischer Antikörper Thy-1.2 F7 D5).

Zu 50 ml der den Antikörper enthaltenden Ascitesflüssigkeit wurden 15g Ammoniumsulfat-Pulver zugesetzt. Nach dem Lösen wurde die Mischung 1 h bei 4 ⁰C stehengelassen und dann 20 min mit 17 000 g zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Der Rückstand wurde in 20 ml 0,1-m Phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst und die Lösung gegen 10 1 des gleichen Puffers dialysiert. Die so erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne mit einem Innendurchmesser von 50 mm gegeben, die 1800 ml "Sepharose 6B" enthielt, die mit dem 0,1-m Phosphatpuffer von pH 7,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Eluieren wurde mit dem gleichen Phosphatpuffer vorgommen. Der erste Gipfel enthielt Aggregate des IgM. Der zweite Gipfel wurde in zwei Fraktionen aufgefangen: die erste Fraktion (die Vorderfront bis zur Spitze des Gipfels) bestand aus reinem IgM; die zweite Fraktion enthielt eine Mischung aus IgM und einem verunreinigenden Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 660 000 D. Diese zweite Fraktion wurde erneut mit Ammoniumsulfat behandelt, der gebildete Niederschlag abzentrifugiert und in dem 0,1-m Phosphatpuffer von pH 7,0 gelöst. Die Lösung wurde auf die "Sepharose 6B"-Säule gegeben, die zuvor gewaschen worden war. Bei der Elution, die wie beim ersten Mal mit 0,1-m Phosphatpuffer von pH 7,0 ausgeführt wurde, erschienen wiederum zwei Gipfel. Der zweite Gipfel enthielt reines IgM. Bei den beiden Filtrationen über "Sepharose 6B" konnte somit jeweils eine

- 50 -

030015/0848

Fraktion gewonnen werden, die reines IgM enthielt. Diese
beiden Fraktionen wurden vereinigt, und das Ganze wurde
bei 4 ⁰C mit Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 300 mg/ml behandelt. Das Präparat wurde sodann 20 min mit 17 000 g zentrifugiert und der Rückstand in einem
100-millimolaren Phosphatpuffer, pH 7,4, der 400 mmol/1
NaCl enthielt, gelöst.

Dieses Verfahren ergab 8 ml einer Lösung, die 6,4 mg/ml
reines IgM enthielt. Zur Charakterisierung der beiden
Fraktionen wurde eine analytische Elektrophorese in Gegen wart von Natriumdodecylsulfat ausgeführt. Das erhaltene
reine IgM ergab bei der Analyse zwei nahe beieinanderliegende Bande, die einem Molekulargewicht von sehr nahe bei 900 000 D entsprachen.

Zu 7,6 ml der IgM-Lösung mit einer Konzentration von
7,0 mg/ml wurden 0,46 ml eines 1:5-Wasser/tert.-Butanol-Gemisches gegeben, das 2,9 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimid und 7,7 mg 3-Pyridylsulfanyl-(2)-propionsäure enthielt. Die Mischung wurde 20 h auf 30 ⁰C gehalten und dann kontinuierlich gegen den 0,1-m Phosphatpuffer von pH 7,4, dem 400 mmol/1 NaCl und 1 mmol/1 Dinatrium-äthylendiamintetrarcetat zugesetzt worden waren, dialysiert. Die Dialyse wurde 23 h bei 4 ⁰C mit einem Durchsatz von 500 ml/h fortgesetzt. Danach wurde die Lösung
bei 4 ⁰C 10 min mit 27 000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gewonnen. Die spektrophotometrische
Bestimmung bei 343 nm des durch mit dem reduzierten Glutathion freigesetzten Pyridinthiols-(2) ergab, daß die Aktivierung des Antikörpers zu einem mittleren Substitutionsgrad von 13 Aktivatorgruppen je Mol IgM geführt hatte.

- 51 -

030015/ΟΟΛΟ

Die nach dem Verfahren des Beispiels 2 erhaltene Lösung der Kette A wurde kontinuierlich gegen 0,1-m Phosphatpuffer, pH 7,4, dem 400 mmol/1 NaCl und 1 mmol/1 Dinatrium-äthylendiamintetraacetat zugesetzt worden waren, dialysiert. Die Dialyse wurde mit 20 h bei 4 ⁰C mit einem Durchsatz von 500 ml/h ausgeführt.

Zu 6,8 ml der nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten IgM-Lösung wurden 3,9 ml der dialysierten Lösung der Kette A mit einer Konzentration von 7,4 mg/ml zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 h bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre und Lichtausschluß stehengelassen. Eine Bestimmung des bei der Reaktion freigesetzten Pyridinthiols-(2) ergab einen mittleren Kopplungsgrad von 9,7 Äquivalenten der Kette A je Mol IgM.

Die Lösung wurde auf eine Kolonne mit einem Innendurchmesser von 50 mm gegeben, die 1727 ml "Sepharose 6B" enthielt, die mit dem beim Koppeln verwendeten Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das Eluieren wurde mit dem gleichen Puffer vorgenommen. Es wurden Fraktionen mit einem Volumen bis 3,7 ml aufgefangen und analysiert. Das konjugierte Produkt erschien in zwei Gipfeln: der erste entsprach einer konjugierten Verbindung mit einem höheren Molekulargewicht als das des IgM, der zweite einer konjugierten Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht, das etwa demjenigen des IgM gleich war. Der mittlere Teil dieses Gipfels (Lösung i) wurde aufbewahrt.

Die konjugierte Verbindung der Lösung i hatte folgende Merkmale:

pg der mit dem IgM

gekoppelten Kette A Äquivalente der je ml Lösung Kette A je Mol

Lösung i 23,7 3,2

0 3 0 0 Ϊ ff 1 0~8 U 8

Die konjugierten Verbindungen und die bei ihrer Herstellung verwendeten Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer biologischen Eigenschaften, insbesondere ihrer anticancerogenen Wirkung, untersucht. Die Grundlagen der verschiedenen Prüfverfahren werden nachstehend beschrieben.

PRÜFUNG IN VITRO

1. Hemmung der Proteinsynthese

Die grundlegende biologische Eigenschaft der Kette A des Ricins ist die Hemmung der mikrosomalen Proteinsynthese durch Veränderung der Ribosomen-Untereinheit 60S.

Bei der Prüfung in vitro wird ein Modell der zellfreien Proteinsynthese unter Verwendung subzellulärer Fraktionen von Rattenleber verwendet, die in geeigneter Weise ergänzt sind und in Gegenwart einer künstlichen Botschafter-RNS ken.

1 4
RNS — der Polyuridylsäure — C-Phenylalanin einbauen kön-

Zur Herstellung der subzellulären Fraktionen und zur Mes-

14
sung des C-Phenylalanin-Einbaues wurde eine Abänderung des in "Biochem. Biophys. Acta" 2V2, S. 608-615 (1973) beschriebenen Verfahrens benutzt, bei dem einmal eine mikrosomale Fraktion und eine Cytosol-Fraktion der Rattenhepatocyten verwendet wurde. Die die Kette A enthaltene Probe wird in Form einer in geeigneter Weise mit 50-millimolarer Tris-HCl-Pufferlösung, pH 6,7, die 0,2% 2-Mercaptoäthanol und 15 ug/ml bovines Serumalbumin enthält, verdünnten Lösung eingeführt.

Aus der Anzahl der gezählten Impulse im Vergleich zu einer markierten Probe ohne Hemmer wird die prozentuale Hemmung

14
des Einbaus von C-Phenylalanin in die Proteine einer

03 0 01 S/0848

jeden die Kette A des Ricins enthaltenden Probe berechnet. Aus diesen Ergebnissen läßt sich die Konzentration der Kette A in dem Reaktionsmedium berechnen, die den Einbau von Radioaktivität in die Proteine um 50% hemmt. Mit Hilfe dieser Inhibitorkonzentration IC-50 kann jedes die Kette A enthaltendes Präparat charakterisiert werden.

Mit Hilfe dieses Verfahrens kann auch die Menge der Kette A bestimmt werden, die in einer Probe enthalten ist. Man braucht nur die durch die Probe verursachte prozentuale Hemmung mit derjenigen einer Standardprobe unter identischen Versuchsbedingungen zu vergleichen.

Bei diesem Verfahren wird die Wirkung der untersuchten Substanz auf den Einb,
Krebszellen bestimmt.

ι 4
Substanz auf den Einbau von C-Leucin in eine Kultur von

Hierzu werden Heia-Zellen verwendet, die durch Biopsie eines menschlichen cervicalen Adenocarcinoms gewonnen und durch Monoschichtkultur in einer Reihe gehalten werden.

Die Zellen werden in Gegenwart der zu untersuchenden Substanz bebrütet; danach wird ihr Gehalt an eingebautem

C-Leucin bestimmt. Diese Messung wird nach einer modifizierten Methode ausgeführt, die in "J. Biol. Chem." 249 (11), S. 3557-3562 (1974) beschrieben ist. Zur Bestimmung

1 4 des Grades der Proteinsynthese wird ein C-Leucin-Radioindikator verwendet. Die eingebaute Radioaktivität wird an durch Filtration isolierten Zellen bestimmt.

Aus diesen Messungen lassen sich Dosis/Wirkung-Graphen zeichnen, auf deren Abszisse die Konzentration der untersuchten Substanz und auf deren Ordinate das eingebaute

C-Leucin in Prozent der Menge aufgetragen ist, die in

unbehandelte markierte Zellen eingebaut worden ist.

030016/0~8

Man kann so für jede untersuchte Substanz die Konzentra-

1 4 tion bestimmen, bei der der Einbau von C-Leucin zu 50% gehemmt wird — die Inhibitorkonzentration IC-50. Es hat

14 sich bestätigt, daß die Bestimmung des C-Leucin-Einbaus in die Gesamtzellen Werte für die IC-50 ergibt, die mit den nach der klassischen Methode zur Messung der Proteinsynthese gefundenen Werten übereinstimmen.

Wenn man die mit den Anti-DNP-Antikörpern hergestellten konjugierten Verbindungen untersuchen will, müssen die Heia-Zellen von den Antikörpern erkannt werden und daher an ihrer Oberfläche Haptenmotive aufweisen. Die Heia-Zellen müssen deshalb durch Markieren mit einem geeigneten Hapten in Zielzellen umgewandelt werden. In der Praxis wählt man hierzu als Hapten die 2,4,6-Trinitrophenyl-Gruppe (TNP). Das Fixieren der TNP-Gruppe auf den Heia-Zellen wird nach einem in "Biochem. Biophys. Acta" 255, S, 79—90 (1972) und ¹¹J. Immunol." VU_, S. 930-937 (1973) beschriebenen, modifizierten Verfahren durch Einwirkenlassen von 2,4,6-Trinitrobenzol-sulfonat (TNBS) vorgenommen.

Die Abänderung der Methode besteht im wesentlichen in der Wahl der Reaktionsparameter: Temperatur 4 ⁰C und Abbruch durch einen Überschuß von Lysin nach 15s Reaktionsdauer.

Diese Markierung kann aus mehreren Gründen beibehalten werden:

geringe toxische Wirkung des TNBS auf die Heia-Zellen; hochgradige Kreuzreaktion zwischen DNP und TNP; vergleichbarer Einbau von
und nicht markierte Zellen.

1 4
vergleichbarer Einbau von C-Leucin in markierte

Eine Konzentration von 10 mg/ml TNBS im Reaktionsmedium bewirkt eine Fixierung von 7*10 den Antikörpern zugänglichen Haptenmotiven auf jeder Zelle. Die Assoziations-

- 55 -

030015/0848

2939Ί65

konstante zwischen Anti-DNP-Antikörpern und den Haptenmotiven beträgt 1,2-10 .

Für konjugierte Verbindungen mit Anti-Thy-1.2-Spezifität werden Zellen vom Stamm WEHI-7 (Lymphome von Balb/C-Mäusen) verwendet, die vom SALK INSTITUTE, San Diego, Californien (USA) bezogen werden können. Diese Zellen bedürfen keiner Markierungsbehandlung, da sie von Natur aus an der Oberfläche das Antigen Thy-1.2 tragen. Die Bebrütung mit der kojugierten Verbindung und die Messung des Grades der Proteinsynthese wird nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren vorgenommen.

2. Hamagglutination

Der Hämagglutinationstest [J. Biol. Chem. ^4_9, S. 803 (1974)] dient zum Vergleich der Fähigkeit verschiedener Präparate, sich an die Membran meanschlicher Erythrocyten der Gruppe 0 rh negativ anzulagern.

Der Test kann wie folgt ausgeführt werden:

entweder direkt (Test 3) durch Zusammenbringen der zu untersuchenden Substanz mit den Erythrocyten, wobei man je nach der Dosis der Substanz eine negative oder positive Reaktion erhält; oder

indirekt(Test 4). In diesem Falle erhöht man nach der Ausführung des direkten Testes die Empfindlichkeit der Feststellung der eventuell an den Erythrocyten fixierten Substanz durch den Zusatz von Erythrocyten, die durch Dekantieren aus dem Reaktionsmedium eines die zu untersuchende Substanz erkennende Antikörper enthaltenden Immunserums abgetrennt worden sind und deren eigene hämagglutinierende Wirkung durch Absorption an Erythrocyten der gleichen Gruppe beseitigt worden ist.

- 56 -

030015/0848

- ⁵^ - 2939Ί65 * ο *

PRÜFUNG IN VIVO

1. Akute Toxicität (Test 5)

Zur Prüfung der akuten Toxicität wird die zu untersuchende Substanz in isotonischer Lösung einer Anzahl von Tieren intraperitoneal oder intravenös eingespritzt. Die Tiere werden 7 Tage beobachtet, und es wird die Mortalität für jede Dosis festgestellt. Sodann wird die Dosis bestimmt, bei der 50% der Tiere nicht überleben

2. Einfluß der konjugierten Verbindungen auf die Entwicklung von Krebszellen

Das gewählte Modell besteht in einer Untersuchung des Ein flusses der zu prüfenden Substanz auf die Entwicklung fester Tumoren bei dem Versuchstier nach dem Einspritzen von Krebszellen.

Bei der experimentellen Ausführung werden "nude"-Mäusen (kong. nu/nu Bolmholtgaard), von denen bekannt ist, daß sie allogene oder xenogene Transplantate nicht abstoßen, Heia-Zellen mit dem Hapten TNP eingespritzt und durch gleichtiges oder späteres Injizieren der zu prüfenden Suvstanz behandelt.

Es wurden verschiedene Versuchsmethoden entwickelt:

a) Test_6: Vorbehandeln der Hela-TNP-Zellen mit der konjugierten Verbindung und subcutane Injektion.

Bestimmt wird der Umfang des sich eventuell entwickelnden Tumors durch Messen zweier zueinander senkrechter Durchmesser nach der in "Ann. d'Immunol." (Institut Pasteuer) 124 C, S. 567-572 (1973) beschriebenen Methode.

- 57 -

030015/0848

b) Test_7: Intraperitonale Injektion der Hela-TNP-Zellen und anschließende Injektion der zu prüfenden Substanz ebenfalls in die Bauchhöhle.

Am Ende des Versuchs wird das Tier getötet und der Umfang des Tumors durch Bestimmung des Gewichts der gesammelten Tumoren gemessen.

Die vorstehend beschriebenen Methoden wurden zur Untersuchung der Eigenschaften der konjugierten Verbindungen und der zu ihrer Herstellung verwendeten Substanzen angewendet .

Ricin und Kette A

Das Ricin und die Kette A wurden in vitro und auf Toxicität auch in vivo geprüft. Darüber hinaus wurde auch die gereinigte Kette A nach dem Konzentrieren an "CM Sepharose", in der Tabelle als Kette (A) bezeichnet, diesen Prüfungen unterworfen.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I wiedergegeben .

Diese Ergebnisse zeigen, daß Ricin in einem zellfreien System eine erheblich stärke Hemmwirkung als in einem Zellsystem ausübt. Im zellfreien System hemmt die Kette A die Proteinsynthese ebenfalls stark; dagegen kann sie in einem zellhaltigen Milieu keine Wirkung ausüben, da sie von der Kette B getrennt ist.

Das Gleiche ist bei den Hämagglutinationstests und dem Test auf akute Toxicität zu beobachten, bei denen Ricin viel aktiver als die Kette A ist.

Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß durch das Konzentrieren an "CM Sepharose" die unspezifische Toxicität der

- 58 -

030015/08/18

Kette A durch Erhöhen der Reinheit des Präparates noch weiter vermindert werden kann. Die hochreine Kette A zeigt auch in einem Zellsystem eine sehr geringe unspezifische Toxicität; dies geht klar aus dem Aktivitätsverhältnis zwischen dem Ricin und der Kette (A) bei diesem Test her-

P vor, das über 10 000 beträgt.

Erschöpfungsabsorptionsversuche mit der Kette A unter Verwendung zunehmender Überschüsse an Heia-Zellen und Erythrocyten, die mit der Kette A in Berührung gebracht wurden, und Messung der Zelltoxicität der Kette A in der überstehenden Flüssigkeit nach der Absorption (Test 2) ergaben:

Die Zelltoxicität der nicht an "CM Sepharose" konzentrierten Kette A wird durch Absorption verringert und auf das Niveau der Toxicität der Lösung der Kette A abgesenkt, die an "CM Sepharose" konzentriert und nicht absorbiert worden ist.

Dagegen wird die Toxicität des an "CM Sepharose) konzentrierten Präparates durch Absorption nicht mehr verringert; dies wird durch das völlige Fehler einer Affinität der so hergestellten Kette (A) zu den Plasmamembranen der Zellen bestätigt und läßt andererseits den außerordentlich hohen Reinheitsgrad des Produktes erkennen.

Anti-DNP-Antikörper

Die Anti-DNP-Antikörper zeigten bei dem Test auf Hemmung der Proteinsynthese im Zellsystem selbst bei der höchsten geprüften Konzentration von 10~ mol/1 keine Wirkung.

Auch bei der Prüfung auf akute Toxicität wurden bei den höchsten geprüften Dosen von 1,6 mg Antikörper je Tier keine Anzeichen von Toxicität beobachtet.

03 0 0~1 5 / 08 A8

- se - 2939Ί65 -60-

Konjugierte Verbindungen

Eine erste Versuchsreihe war dazu bestimmt, die Unversehrtheit der Eigenschaften der Kette A einerseits und der Antikörper andererseits in den konjugierten Präparaten festzustellen.

Zuerst konnte durch einen Radioimmuntest (Handbook of Experimental Immunology, hrsg. von D. M. Weir , 2. Aufl., Bd. 1, Kap. 15, S. 1-18, 1973) ermittelt werden, daß die Aktivität der Anti-DNP-Antikörper in der konjugierten Verbindung der Aktivität der freien Antikörper gleich ist.

Die hemmende Wirkung der Kette A in der konjugierten Verbindung auf die Proteinsynthese außerhalb der Zelle wurde einmal mit einer Probe der konjugierten Verbindung (Lösung a des Beispiels 5) und ein andermal mit einer identischen Probe bestimmt, die im Hinblick auf die Spaltung der Disulfidbrücke 30 min mit einer 0,2%igen 2-Mercaptoäthanol-Lösung versetzt worden war.

Im ersten Fall wurde eine IC-50 von 59,4 ng/ml Kette A, im zweiten Fall eine solche von 9,2 ng/ml erhalten, was einem Aktivitätsverhältnis von 1:6,6 entspricht.

Dies zeigt, daß der größte Teil der Hemmwirkung auf die Proteinsynthese erst auftrat, nachdem die konjugierte Verbindung zum Sprengen der Disulfidbindung mit 2-Mercaptoäthanol behandelt worden war.

Die Tatsache, daß eine Hemmwirkung auch ohne Behandlung mit 2-Mercaptoäthanol nachweisbar sein kann, steht dieser Schlußfolgerung nicht entgegen, da das Versuchsmilieu Thiole enthalten kann, die zum Teil eine Freisetzung der mit dem Antikörper gekoppelten Kette hervorrufen können.

- 60 -

030015/0848

-f - 2939)65

Abschließend kann festgestellt werden, daß die konjugierten Verbindungen die Eigenschaften ihrer Bestandteile unverändert lassen.

Mit einer anderen Versuchsreihe wurde die therapeutische Wirksamkeit der konjugierten Verbindungen bestimmt.

a) Wirkun2en_beim_Zellmodell (Test 2)

Die Figuren 1 und 2 sind Graphen, aus denen die prozen-

1 4

tuale Hemmung des Einbaus von C-Leucin in mit TNP markierten Heia-Zellen in Abhängigkeit von der angewendeten Dosis der konjugierten Verbindung (ausgedrückt durch die Konzentration in nmol/ml). Die diesen Figuren zugrunde liegende konjugierte Verbindung war die in den Beispielen 5 und 6 beschriebene Verbindung aus Anti-DNP-Antikörper und Kette A. Zu Vergleichszwecken ist auch die Wirkung dieser Verbindung auf nicht markierte Heia-Zellen (gestrichelte Linien) dargestellt.

Die Graphen der Figuren 1 und 2 wurden mit der konjugierten Verbindung des Beispiels 5 (Lösung b) und der konjugierten Verbindung des Beispiels 6 (Lösung e) erhalten. Sie zeigen, daß die 50%ige Hemmwirkung auf die zelluläre Proteinsynthese bei TNP-Hela-Zellen mit sehr viel geringe-

— 9
ren Konzentrationen (IC,.- 11-10 mol/1 bei der Lösung b

-9

und 7,5-10 mol/1 bei der Lösung e) als bei nicht markierten Heia-Zellen (CI₁,., 130·10~⁹ mol/1 bei der Lösung b

— 9
und 1000-10 mol/1 bei der Lösung e) erreicht werden

kann.

Wenn andererseits dem Inkubationsmilieu bovines DNP-Serumalbumin zugesetzt wird (1 mg/ml), wird die Hemmwirkung der konjugierten Verbindung völlig aufgehoben.

Figur 3 zeigt die mit der konjugierten Verbindung aus der Kette A des Ricins und dem Fragment F(ab)'₂ des Anti-DNP-IgM

- 61 -

030015/0848

2939Ί65

erhalten wurden. Die Koordinaten sind die gleichen wie bei den Figuren 1 und 2. Ergebnisse sind dargestellt für

(I) Ricin IC₅₀ (mit Kette A): 5,5-10~¹¹ mol/1

(II) Kette A IC,,_n: 9·10~⁷ mol/1

(III) Konj. Verb, auf Heia ICc_n: nicht bestimmbar, >10

(IV) Konj. Verb, auf HeIa-TNP IC_5n: 4,5-1O⁹ mol/1. L ^mol/1

ι 4 Figur 4 zeigt die Hemmung des Einbaus von C-Leucin in WEHI-7-Zellen bei der Prüfung der konjugierten Verbindung aus der Kette A und Anti-Thy-IgM. Die Koordinaten sind die gleichen wie in den Figuren 1 und 2. Ergebnisse sind dargestellt für

(I) Ricin (mit Kette A) IC_5n: 2,4-10~¹¹ mol/1 (II) Kette A IC_5n: 8,1-10~⁷ mol/1 (III) Konjug. Verb, (mit Kette A) CI_5n: 5,2·10~¹¹ mol/1.

Schließlich läßt sich zeigen, daß die aus der Kette A des Ricins und Anti-DNP-IgG mit 6-[3-(Pyridyl-disulfanyl-2)-propionylamino]-hexansäure als Aktivator hergestellte konjugierte Verbindung eine identische Toxicität und Spezifität wie die nach dem Verfahren des Beispiels 6 erhaltene konjugierte Verbindung hat.

Es kann somit gefolgert werden, daß die gemäß der Erfindung hergestellten konjugierten Verbindungen eine spezifische Wirkung haben. Bei Verabfolgung einer geeigneten Dosis der konjugierten Verbindung ist es möglich, nur auf die Zellen einzuwirken, die ein dem entsprechenden Antikörper entsprechendes Antigen tragen.

Die Herstellung einer Disulfidbrücke zwischen der Kette A und einem Antikörper, der für ein natürlicherweise auf Krebszellen vorkommendes Antigen spezifisch ist, lassen sich die Krebszellen mit sehr hoher Wirksamkeit und Wirkungsspezifität zerstören.

- 62 -

030015/0848

2939Ί65

α) Prüfungen mit der konjugierten Verbindung aus der Kette A und Anti-DNP-Antikörper (Lösungen c und d des Beispiels 6.

1. Der vorstehend beschriebene Test_6 wurde mit TNP-HeIa-Zellen in einer Konzentration von 10 Zellen/ml ausgeführt, die 90 min bei 37 ⁰C mit der konjugierten Verbin-

—8 dung (Lösung c) in einer Konzentration von 10 mol/1,

berechnet als Kette A, behandelt.

Nach dem Zentrifugieren (10 min mit 700 g) wurde der Rückstand in PBS [isotonische Pufferlösung ohne Calcium und Magnesium - J. Exp. Med. 9J3, S. 167 (1954)] suspendiert; diese Suspension enthielt 10 Zellen/ml. Von dieser Suspension wurde den Tieren (Alter 14 Wochen) 0,1 ml mit einem Gehalt von 10 Zellen intracutan injiziert. Eine Anzahl von Tieren erhielt eine Injektion von Zellen, die die nicht mit der konjugierten Verbindung behandelt worden waren.

Die Tiere wurden täglich auf Tumorwachstum überprüft. Als faßbar wird ein Tumor mit einer Oberfläche >10 mm² angesehen (Empfindlichkeitsgrenze des Tests).

In Figur 5 sind die Prozentsummen der erfaßten Tumoren mit einer Oberfläche ^10 mm² in Abhängigkeit von der Zeit nach der Injektion der Heia-Zellen (ausgezogene Kurve), der mit TNP markierten Heia-Zellen (gestrichelte Kurve) und der mit TNP markierten und mit der konjugierten Verbindung vorbehandelten Heia-Zellen (strichpunktierte Kurve) dargestellt. Aus der Figur ist ersichtlich, daß die konjugierte Verbindung wirksam ist und daß Auftreten faßbarer Tumoren stark vermindert.

- 63 -

030015/0848

-*?- 2939Ί65

Eine Beobachtung bis zum 50. Tag ergab ein Auftreten faßbarer Tumoren in 80% der Fälle bei der Injektion von unbehandelten Heia-Zellen und in 70% der Fälle nach der Injektion von unbehandelten TNP-Hela-Zellen.

Nach der Injektion von TNP-Hela-Zellen, die mit der konjugierten Verbindung vorbehandelt worden waren, betrug dieser Prozentsatz nur 20%.

Der Unterschied ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% statistisch signifikant.

2. Der Test_7 wurde ausgeführt, indem den Tieren (Alter 10 Wochen) 2Ί0⁶ TNP-Hela-Zellen in 0 keit intraperitonal injiziert wurden.

10 Wochen) 2Ί0⁶ TNP-Hela-Zellen in 0,1 ml Kulturflüssig-

Dann wurde 0,1 ml der konjugierten Verbindung, die 36 μg der Kette A enthielt (Lösung d, durch Membranfiltration auf 7,5fache konzentriert), injiziert.

Eine Anzahl von Vergleichstieren erhielt die gleiche Injektion von TNP-Hela-Zellen, wurde aber nicht mit der konjugierten Verbindung behandelt.

Am 25. Tag nach Beginn des Versuchs wurden die Tiere getötet und die Tumoren gewogen.

In Figur 6 sind für jedes Tier aus den zwei Gruppen — die Vergleichstiere links, die behandelten Tiere rechts — die Tumorgewichte in Milligramm in dekadisch-logarithmischer Teilung aufgetragen. Die Erfassungsschwelle betrug 5 mm, entsprechend einem dekadischen Logarithmus von 0,7.

Aus dieser Figur ist ersichtlich, daß in der Gruppe der Vergleichstiere in 14 von 15 Fällen ein faßbarer Tumor auftrat (14 Punkte oberhalb, 1 Punkt unterhalb der Er-

- 64 -

030015/0848

fassungsschwelle auftrat. Umgekehrt trat bei den behandelten Tieren nur 1 Fall eines faßbaren Tumors in 15 Fällen (1 einziger Punkt oberhalb der Erfassungsschwellen) auf.

ß) Prüfung der konjugierten Verbindung aus der Kette A und dem IgM-Antikörper Anti-Thy-1.2 (Lösung i des Beispiels 9) .

Bei diesen Untersuchungen wurden Krebszellen vom Stamm WEHI 22.1 (erhalten vom SALK INSTITUTE, San Diego, CaIifornien, USA) verwendet, die aus Lymphomen der Balb/C-Maus stammen. Sie wurden Balb/C-Mäusen injiziert, die von BOM-HOLTGAARD (Dänemark) bezogen worden waren und von der Geburt bis zum Ende des Tests in einer Zone gehalten wurden, die frei von spezifischen pathogenen Organismen (SPF) war.

Zu der Prüfung wurden die in einer kontinuierlichen Kultur gehaltenen WEHI 22.1-Zellen am 3. Tag nach dem Umsetzen der Kultur entnommen, gewaschen, zentrifugiert und in einem isotonischen Phosphatpuffer (PBS) in einer Konzentration von 12*10 Zellen/ml suspendiert.

0,2 ml dieser Suspension wurden zufällig ausgewählten und individuell durch Pfotenmarkierungen gekennzeichneten Mäusen intraperitoneal injiziert.

Bei den nicht mit der konjugierten Verbindung behandelten Mäusen entwickelten sich nach der Injektion der Zellen WEHI 22.1 im Peritoneum (Bauchfell) disseminierte Tumoren unter Bildung eines Ascites. Die Entwicklung der Tumoren war von einer Erhöhung des Körpergewichts begleitet. Der Ascites wurde durch Beobachtung der Vergößerung des Bauchvolumens festgestellt.

Eine Stunde nach der Injektion der Zellen wurde den zur Behandlung vorgesehenen Tieren 1 ml der Lösung der konju-

- 65 -

030015/0848

2939 ί 65

gierten Verbindung (Lösung i, Gehalt an Kette A 23,7 ug/ml), die zuvor intensiv gegen PBS-Puffer dialysiert und dann durch Filtration sterilisiert worden war, intraperitoneal injiziert. Den Tieren der Vergleichsgruppe wurde 1 ml der PBS-Pufferlösung, die keine konjugierte Verbindung enthielt, injiziert.

Am 7. Tag nach der Injektion der Zellen erhielten die behandelten Tiere eine zweite Injektion der konjugierten Verbindung unter den gleichen Bedingungen und Vergleichstiere eine zweite Injektion PBS-Pufferlösung.

Die Ergebnisse des Tests sind in den Figuren 7 und 8 wiedergegeben. In Figur 7 ist chronologisch das Auftreten von Ascites bei den behandelten und den unbehandelten Tieren, in Figur 8 die Entwicklung des Körpergewichts bei den behandelten und den unbehandelten Tieren dargestellt. Die Entwicklung des Körpergewichts ist als das Verhältnis der Gewichtszunahme in Gramm zum Gewicht derselben Tieren drei Tage vor der Injektion der Zellen angegeben.

Figur 7 (Abszisse: Anzahl der Tage nach der Injektion der Zellen WEHI 22,1; Ordinate: Prozent der Tiere mit einem Ascites) zeigt die Hemmung der Ascitesbildung bei den mit der konjugierten Verbindung behandelten Tieren; diese Hemmung tritt als zeitliche Verschiebung der Ascitesbildung in Erscheinung (ausgezogene Kurve: behandelte Tiere; gestrichelte Kurve: unbehandelte Tiere).

Figur 8 (Abszisse: Anzahl der Tage nach der Injektion der WEHI 22.1.-Zellen; Ordinate: mittlere Gewichtszunahme in Gramm) läßt ebenfalls eine Hemmung der Zunahme des Körpergewichts bei den behandelten Tieren (ausgezogene Kurve) im Vergleich zu den nicht behandelten Tieren (getstrichelte Kurve) erkennen.

- 66 -

030015/0848

-Oil·-

Die Gültigkeit dieser Beobachtungen wird durch eine statistische Analyse der Versuchsergebnisse bestätigt:

Die Hemmung der Ascitesbildung durch die konjugierte Verbindung ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 1% signifikant (Test χ 2).

Die Hemmung der Zunahme des Körpergewichts durch die konjugierte Verbindung ist mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% signifikant (Vergleich der Neigung der Ausgleichsgeraden) .

Durch die Prüfung in vivo konnte die Antikrebswirkung der konjugierten Verbindung aus der Kette A des Ricins und dem IgM Anti-Thy 1.2 veranschaulicht werden. Sie wurde durch die Hemmung der Entwicklung von Krebszellen des Stamms WEHI 22.1, die Balb/C-Mäusen injiziert wurden, nachgewiesen.

Die konjugierten Verbindungen gemäß der Erfindung bieten eine derart spezifische Wirkung, daß ihr Verwendung zur Behandlung des Krebses in der Humanmedizin in Betracht zu zu ziehen ist. Sie werden zur Verwendung als Injektion hergestellt und können mit anderen Krebsbehandlungsmethoden kombiniert werden.

- 67 -

030015/0848

	Aktivität	Ricin	Tabelle 1	<A)p	Aktivitäts verhältnis Ricin/Kette A
Test bezeichnung	IC50 . mol/1	3.10"10	v . Kette Kette A	,Cf10	0,43
Test 1		1,3-10 1,3·

Aktivitätsverhältnis Ricin/Kette (A)

Test 2*

Test 3

Test 4

Test 5**

¹So

mol/1

4-10

-11

5·10"⁸ 68,6-10 ⁸

Mindest-

Hämagglu-

tinie-

rungs-

konz.

mol/1

4,2·10~⁸ 8,4-10 ⁵

3,3-10 ⁹ 1,3-10 ⁶

^DL50 mol/1

0,25

17 150

* Diese Ergebnisse wurden mit Heia-Zellen und TNP-Hela-Zellen erhalten.

** Intraperitoneale Injektion von 0,5 ml isotonischer Lösung bei Mäusen des Stammes CD-1 von Charles River, Frankreich (Durchschnittsgewicht 20,3 g).

Claims (16)

Patentansprüche

1. Cytotoxische Produkte, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus sogenannten "konjugierten" Verbindungen bestehen, bei denen die Kette A des Ricins über eine Disulfidbrücke mit einem Proteingebilde, wie einem Antikörper, einem Immunglobulin oder einem Immunglobulinfragment, verbunden ist, das selektiv spezifisch mit einem Antigen zu reagieren vermag, das an der Oberfläche der Zellen vorkommt, die man erreichen will.

2. Cytotoxische Produkte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Antikörper ein Anti-DNP-Antikörper ist.

3. Cytotoxische Produkte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Antikörper das Fragment F(ab)'₂ des Anti-DNP-Antikörpers ist.

4. Cytotoxische Produkte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der Antikörper IgM-Anti-Thy 1.2 ist.

5. Verfahren zur Herstellung cytotoxischer Produkte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Hilfe einer Disulfidbrücke eine kovalente Bindung zwischen einer cytotoxischen Verbin-

33 349
U/-

030015/0848

dung — der Kette A des Ricins — und einem Antikörper, einem Inununglobulin oder einem Immunglobulinfragment eines bestimmten Antikörpers herstellt, der sich an den Zellen befindet, die man zerstören will.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Verbindung der Formel P -SH mit einer anderen Verbindung der Formel

2
P -S-S-X nach der Reaktion

umsetzt, worin P entweder das mit einer freien Thiol-Gruppe verbundene Radikal der Kette A des Ricins und P ein Immunglobulin oder Immunglobulinfragment oder umgekehrt P ein Inununglobulin oder Immunglobulinfrag-

2
ment und P das Radikal der Kette A des Ricins und X ein aktivierendes organisches Radikal sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß in dem Fall, daß P ein Immunglobulin oder ein Immunglobulinfragment ist, in das eine freie Thiol-Gruppe eingeführt werden soll, man vor dem Umsetzen des Immunglobulins mit ö-Acetylmercaptobernsteinsäure-anhydrid und Freisetzen der Thiol-Gruppe durch Einwirken von Hydroxylamin in an sich bekannter Weise zuerst die Erkennungsstellen des Antikörpers durch Behandeln mit dem Antigen oder einem anderen Antigen, das eine Kreuzreaktion ergibt, oder auch einem geeigneten Hapten blockiert und später die Erkennungsstellen wieder nach bekannten Verfahren zum Entfernen des Antigens freilegt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß in dem Fall, daß

2
P -SH die Kette A des Ricins bedeutet, man diese durch

0015/084

die Austauschreaktion

P²-S-S-X + XSH

in das Disulfid überführt, wobei in den vorstehenden Formeln X ein aktivierendes Radikal ist, das aus einer Pyridyl-(2)- oder -(4)-Gruppe, die mit einer oder mehreren Alkylgruppen, Halogen oder Carboxylgruppen substituiert sein kann, oder aus einer Phenylgruppe besteht, die durch eine oder mehrere Nitro- oder Carboxylgruppen substituiert sein kann, und die Reaktion mit einem großen molaren Überschuß des Reagenzes XSSX ausführt, der nach beendeter Reaktion durch Dialyse oder Filtration durch ein Molekularsieb-Gel entfernt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch

gekennzeichnet , daß man alle Reaktionen bei einem pH-Wert von 7,0 in einem Phosphatpuffer bei Umgebungstemperatur ausführt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß in dem Fall, daß P -SH

2
die Kette A des Ricins und P das Immunglobulin oder

2 ein Fragment davon bedeutet, man P nach der Reaktion

P² + Y-R-S-S-X » P²-R-S-S-X

in ein aktives Disulfid überführt, wobei in den vorstehenden Formeln Y eine funktioneile Gruppe, die mit beliebigen funktionellen Gruppen, insbesondere Aminogruppen in den Seitenketten der das Immunglobulin bildenden Aminosäuren, eine kovalente Bindung eingehen kann, R eine -(CH₂) -Gruppe mit η zwischen 2 und 10

ⁿ 4 4 oder eine Gruppe R³-CH-CH-R , worin R Wasserstoff oder

¹ ' 3

eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und R ein gegenüber den anderen Reaktionsteilnehmern inerter

0 3 0 0 1 5 / 0 8 A 0

Substituent, wie eine Amidgruppe der Formel -NH-C-OR ,

5 "

in der R eine geradkettige oder verzweigte 0

Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, bezeichnet, und X ein aktivierendes Radikal, z.B. der im Anspruch 8 bezeichneten Art und außerdem eine Alkoxycarbonylgruppe, .-bedeuten, und wobei man die Reaktion in homogener flüssiger Phase bei Umgebungstemperatur ausführt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Beendigung aller Reaktionen die erhaltene "konjugierte" Verbindung zum Entfernen der nicht umgesetzten Verbin-

dung P -S-S-X mit Hilfe eines an sich bekannten Verfahrens reinigt, beispielsweise durch fraktionierte Fällung mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, durch Permeations-Gel-Chromatographie, insbesondere Filtration über das Gel "Sephadex G 200", oder Affinitätschromatographie über eine Säule aus einem unlöslichen Träger, auf dem ein dem Antikörper entsprechendes Antigen fixiert ist.

12. Verfahren zur Herstellung der Kette A des Ricins in reinem Zustand als Ausgangsstoff für die Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man zu einer Lösung von reinem Ricin in einem Puffer von geringer Ionenstärke bei Umgebungstemperatur ein Reduktionsmittel, wie 2-Mercaptoäthanol, zusetzt, um in bekannter Weise selektiv die Disulfidbrücke zu trennen, die Lösung dann über eine Säule aus "DE-AE CL Sepharose 6B" oder "QAE Sephadex A 50" in dem gleichen Puffer in Gegenwart des Reduktionsmittels chromatographlert und danach die Kette A des Ricins mit einer Pufferlösung von höherem pH-Wert und höherer Ionenstärke in Gegenwart des Reduktionsmittels selektiv eluiert.

030015/0848

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die beim Eluieren der Kette A des Ricins erhaltene konzentrierte Lösung abgekühlt und die Kette A in kristallisiertem Zustand gewonnen wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet , daß man als Elutionslösung für die Kette A bei einer Adsorption der Kette A an einer Säule aus "DE-AE CL Sepharose 6B" eine 0,1-m Tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,4, die 0,1 mol/1 NaCl und 2,5% 2-Mercaptoäthanol enthält, und als Elutionslösung für Kette A bei einer Adsorption der Kette A an einer Säule aus "QAE Sephadex A 50" eine 100-millimolare Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 8,4, die 0,5% 2-Mercaptoäthanol enthält, verwendet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die die Kette A enthaltende Elutionslösung gegen eine 10-millimolare Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 dialysiert, die erhaltene Lösung auf eine Säule aus Carboxymethylcellulose gibt und die reine Kette A mit einer 125-millimolaren Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0, die 1 mmol/1 EDTA enthält, eluiert.

16. Verfahren zur Herstellung von reinem Ricin als Ausgangsstoff für die Herstellung der Kette A nach dem Verfahren eines der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß man den in bekannter Weise aus den Samen von Ricinus communis erhaltenen Rohextrakt durch einmalige Chromatographie über einer Säule aus "Sepharose 4B" reinigt, wobei die Gesamtbeladung der Säule mit Proteinen das Aufnahmevermögen der Säule nicht überschreiten darf, und das Eluieren nacheinander mit einer 50-millimolaren Tris-HCl-Puffer-

030015/0848

lösung mit einem pH-Wert von 7,7, die nur Proteine eluiert, die keine Lectine sind, und dann mit einer 0,25- bis 0,56-millimolaren Galactoselösung ausführt, die das reine Ricin eluiert.

030015/0848