DE2918098A1

DE2918098A1 - Haemostatisches mittel, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur kontrolle doer stillung einer blutung

Info

Publication number: DE2918098A1
Application number: DE19792918098
Authority: DE
Inventors: Philip Nicholas Dr Sawyer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-05-19
Filing date: 1979-05-04
Publication date: 1979-11-22
Also published as: GB2051074A; SE7903617L; IT1115218B; CH646607A5; FR2425860B1; CA1124177A; GB2051074B; FR2425860A1; US4238480A; IT7922635A0

Description

Die Erfindung betrifft ein neues verbessertes hümostatisches Mittel, ein Verfahren zu seiner Herstellung und dessen Verwendung zum Kontrollieren bzw. Bekämpfen oder Stillen einer Blutung; sie betrifft insbesondere ein verbessertes Hämostatikum, das durch Behandeln von Kollagen oder einer kollagenartigen Substanz, um dessen Überflächenladung auf wirksame Weise positiver zu machen, hergestellt worden ist,und dessen Verwendung zur Kontrolle bzw. Bekämpfung oder zum Stillen einer Blutung.

In verschiedenen Patentschriften wird die Modifizierung der Überflächenladung von Gefäßsystemen oder von Substanzen, die in Verbindung damit verwendet werden sollen, diskutiert. Generell wurde vorgeschlagen, solche Systeme zu behandeln, um ihre Oberflächenladung negativer zu machen, um das Auftreten einer Thrombose und dgl· zu vermeiden.

Es sind bereits die verschiedensten hämostatischen Mittel (Hämostatika) bekannt, wie z.B. Gelfoam , hergestellt von der Firma Up-John und beschrieben in der US-Patentschrift 2 465 351,

TM
Avitene , hergestellt von der Firma Acecon und beschrieben in

TM der US-Patentschrift 3 742 955, und Surgicell , hergestellt von der Firma Johnson und Johnson und beschrieben in der US-Patentschrift 3 364 200.

In der US-Patentschrift 3 742 955 ist angegeben, daß Kollagen in verschiedenen behandelten oder präparierten Formen in der Chirurgie und für die Versorgung von Wunden verwendet werden kann und aus

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"Ann. Surg.", U>\_, 23ί!-2Ί/, I «br. Ι96ί>, ist zu entnehmen, daß Kollagen hämostatische Eigenschaften besitzt, wenn es als Wundverbandmaterial verwendet wird. In der US-Patentschrift 3 742 ist ferner angegeben, daß faserförmiges Kollagen und aus Kollagen hergestellte Faserprodukto, wenn sie in geeigneter Weise hergestellt werden und mit Blut benetzt werden, nicht nur eine hämostatische Wirkung besitzen, sondern auch eine unerwartete Haftung an durch Einschnitt voneinander getrennten biologischen Oberflächen bei Warmblütern besitzen. Darin ist auch ein Verfahren zur Herstellung von feinteiligem faserförmigem Kollagen und von Kollagen abgeleiteten Faserprodukten beschrieben, die wertvolle hämostatische Mittel (Hämostatika) darstellen und einzigartige Itaftungseigenschaften im Kontakt mit einer eingeschnittenen oder eingerissenen biologischen Oberfläche bei einem Warmblüter besitzen, wenn sie mit Blut benetzt sind.

In der US-Patentschrift 3 364 200 ist angegeben, daß seit vielen Jahren zum Stillen von Blutungen chirurgische Hämostatika verwendet werden, die aus konventionellen Gaze-Kompressen oder ähnlichen Artikeln bestehen, die mit einem hämostatischen Material, wie Eisen(lll)chlorid, Thrombin oder dgl. imprägniert worden sind. Diese bekannten Hämostatika haben jedoch den Nachteil, daß sie in einer geschlossenen Wunde nicht in situ verbleiben dürfen, da dies eine Fremdkörper-Gewebereaktion zur Folge hätte, was ein schwerwiegender Nachteil insofern ist, als bei der Entfernung des Hämostatikums von der blutenden Stelle ein Blutgerinnsel, das sich gebildet hat, wieder aufgerissen wird und das Bluten erneut beginnt. In der oben genannten Patentschrift wird darauf

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liingowiüson, daß des ho Jb oin vitales KcdUrlnis nacli einem hüniostatischen Material besteht, das in einer geschlossenen Wunde an Ort und Stelle belassen werden kann, ohne daß eine ernste lokale Gewebereaktion dadurch hervorgerufen wird. Darin ist auch angegeben, daß eine Verbesserung dadurch erzielt werden konnte, daß gefunden wurde, daß oxydierte Cellulose nicht nur hümostatische Eigenschaften besitzt, sondern auch von tierischem Gev/ebe absorbiert werden kann. In dieser Patentschrift sind absorbierbare hümostatische oxydierte Cellulose-Mittel beschrieben, die eine verbesserte Beständigkeit gegen Beeinträchtigung bzw. Verschlechterung (Abbau) bei der Lagerung aufweisen. Die oxydierte Cellulose stammt aus Holzpulpe, Baumwolle, Baumwoll-Lintern, Ramie, Jute, Papier und ähnlichen Materialien und aus Regeneratcellulose oder Rayon, hergestellt nach dem Viskose- oder Bemberg-Verfahren. Die US-Patentschrift 2 405 357 bezieht sich auf einen für Flüssigkeiten durchlässigen, in Wasser unlöslichen Gelatineschwamm, der die allgemeinen physikalischen Eigenschaften eines Schwammes besitzt, jedoch von Tierkörpern absorbierbar ist. Bei dem Schwamm handelt es sich um eine poröse Substanz, die nach den Angaben in dieser Patentschrift genügend weich sein sollte, wenn sie feucht ist, und die viele feine Zwischenräume aufweist, um eine bestimmte flenge eines therapeutischen Mittels zurückzuhalten und dieses langsam abzugeben oder als wirksames Absorptionsmaterial für freifließende Flüssigkeiten in einer Wundfläche, wie z.D. Blut und Exsudate, zu fungieren. Darin ist auch die Herstellung einer Gelatine enthaltenden wäßrigen Lösung und die Zugabe einer geringen teerige Formalin und das anschließende Erhitzen des Materials für einen längeren Zeitraum zur Herstellung eines festen Schaums mit einem wesentlich größeren Volumen als die ursprüngliche

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Lösung beschrieben.

Die in den vorgenannten Patentschriften beschriebenen Erfindungen beziehen sich alle auf das Gebiet der Hämostase, keine betrifft jedoch die Kontrolle bzw. Steuerung der Elektronen- oder eJektrostatischen Oberflächenladung der beteiligten Materialien und keine dieser Erfindungen befaßt sich somit mit der Grundlage des liümostase-Problems gemäß der vorliegenden Erfindung.

Eine Diskussion über einen Kollagenschwamm ist ferner zu finden in "Collagen Sponge: Theory and Practice of Medical Applications" im "J. Biomedical Materials Research", John Wiley & Sons, New York, Band 11, Nr. 5, Sept. 1977. In diesem Artikel sind die Anwendungen von Kollagen als biologisch abbaubares Material einschließlich der Resorptions- und Antigenbildungsrate zusammenfassend dargestellt.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein verbessertes hämostatisehes Mittel (Hämostatikum) zu entwickeln. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung dieses hämostatischen Mittels (Hämostatikums) anzugeben. Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein verbessertes Verfahren zur Verwendung dieser hämostatischen Mittel (Hämostatika) zu entwickeln.

Die oben genannten und weitere Ziele der Erfindung werden erreicht mit einem Verfahren, das darin besteht, daß man eine Kollagensubstanz und/oder eine kollagenartige Substanz modifiziert, um ihre Oberflächcnladung auf wirksame Weise positiver zu machen,

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und die dabei erhaltene modifizierte Substanz zur Kontrolle bzw. Bekämpfung oder Stillung einer Dlutung verwendet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Substanz durch nicht-kovajente Modifizierung modifiziert worden und außerdem kann diese Substanz lyophilisiert werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Substanz durch kovalente Modifizierung modifiziert werden und
diese Substanz wird gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auch lyophilisiert.

Gegenstand der Erfindung ist ein hümostatisches Mittel (llciinostatikum), das wie vorstehend angegeben hergestellt worden ist. Dei der Kollagen- und/oder kollagenartigen Substanz, die dabei verwendet wird,
kann es sich vorzugsweise um Gelatine handeln, die vorzugsv/eise mit Chlorwasserstoffsäure (HCl) behandelt wird. Gemäß einer bevorzugten

Ausgestaltung der Erfindung kann die Gelatine mit Äthylendiamin oder Äthyl lid ion behände? It v.^Tcrd.~n.

Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen hervor. Dabei zeigen:

Fig. 1 bis 3 Diagramme, welche die Ultraviolettabsorptionsspektren von verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung
darstellen/

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-■9 -

Fig.. 4 ein Diagramm, welches den pH-Wert von Lösungen für die erfindungsgemäßen Verbindungen bzw. Mischungen angibt; und

Fig. 5 und 6 Diagrammo dor I nfrcirotspoktron von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.

Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein chemisch modifiziertes Kollagen oder eine chemisch modifizierte kollagenartige Substanz als hämostatisches Mittel (llämostatikum) zur Verfugung zu stellen, das mit handelsüblichen Produkten konkurrenzfähig ist und diesen in bestimmten Belangen überlegen ist.

Bei der erfindungsgemäßen Substanz, d.h. dem erfindungsgemäßen Hämostatikum, handelt es sich um eine Kollagen- oder kollagenartige Verbindung, die mit positiven Resten modifiziert worden ist, die klinisch verwendet werden kann zur Kontrolle bzv/. Bekämpfung bzw. Stillung von Blutungen, insbesondere in nicht näh-bzw. klebbaren Bereichen. Bei dieser Substanz handelt es sich um ein Hilfsmittel für und nicht um einen Ersatz der konventionellen chirurgischen Verfahren.

Viele Faktoren tragen zu dem Gerinnungsmechanismus der hämostatischen Mittel (Hämostatika) bei. Einige davon sind folgende: (i) die Überflächenchemie (einschließlich der biochemischen Wechselwirkungen), (2) die elektrischen oder elektrostatischen Ladungseigenschaften und (3) die MikroStruktur. In den Vorstufen der Synthese und Bewertung (Beurteilung) von hämostatischen Mitteln wurde bereits versucht, die Bedeutung jedes der oben genannten Kriterien zu erkennen.

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Die verschiedenen I ormen des or I indungsgoniüßon hümosta tischen Mittels sind Modifikationen von Kollagen oder einer kollagenartigen Verbindung. Kollagen selbst weist hämostatische Eigenschaften auf. Die Modifikationen, die durchgeführt worden sind, haben das Ziel, diese Phänomene sowohl durch Manipulieren der Oberflächenladung als auch der MikroStruktur zu verstärken.

Die Modifizierung der Ladungsdichte einer Verbindung kann nach zwei verschiedenen Verfahren erzielt werden: (l) durch nicht-kovalente Modifizierung von gelöster KnochengelatineCuaker U.S.P.) unter Verwendung von positiven Gruppen, beispielsweise durch HCl, und (2) die kovalente Bindung der verschiedensten Liganden an die Peptidkette von Gelatine.

Multiple Formen eines positiv geladenen hämostatischen Mittels werden wie nachfolgend angegeben hergestellt, beispielsweise aus dem nachfolgend angegebenen Ausgangspräparat einer Kollagen- oder kollagenartigen Substanz oder Verbindung: 1 1 einer 1 /aigen (oder 0,1 bis 15 /Ügen) Ausgangslösung von Gelatine (Daker U.5.P., Rohmaterial) wird beispielsweise in destilliertem und entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren gelöst. Aus dieser Ausgangslösung werden 200 ml-Portionen (aliquote Anteile) entnommen und in den nachfolgend angegebenen verschiedenen Verfahren verwendet.

A) Nicht-kovalente Modifizierung

Di0 /00 mi-Portion dor Protoinlösung wird mit oinem 1 ".'-CoI (geringer Dichte) HCl (LDHCl) auf den gewünschten pH-Wert (beispielsweise pH ?, 5) eingestellt. Zur Einstellung von pii 3,0 wird

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ein 5 /»-Gel (hoher Uichte)-llCl (lIDIICl) verwendet. Zu der Lösung wird 1 η HCl zugegeben, die durch Verdünnen aus einer konzentrierten HCl (Fisher-Reagensqualität) hergestellt wird. Dies wird durchgeführt unter konstantem Rühren, um die Homogenität zu gewährleisten und jede Denaturierung minimal zu halten.

Die Gelatine-HCl-Lösung wird dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, durch ein Whatman-Filter Nr. 4 in einen 600 ml-Virtus-Kolben filtriert. Der Kolben wird dann in ein Trockeneis/Aceton-Bad (~40°C) eingetaucht und unter konstantem Schütteln des Kolbens gefriert die Proteinlösung im Innern desselben schalenförmig aus. Dieses Material wird dann auf eine Virtus-Lyophilisier-cinrichtung (Research Equipment, N.Y., USA) aufgebracht und getrocknet, bis die Lösung einen schaumartigen Charakter hat. Das Material wird dann aus dem Virtus—Kolben entnommen und in Glas- oder Kunststoff-Trockenflaschen eingeführt. Es können auch Shelf-Gefriermethoden angewendet werden. Eine zweite Modifikation ist die Zugabe von CaCl„.2rL0 (von Fisher-Reagensqualität) zu der gereinigten Gelatine in Ca^-Endkonzentrationen von 0,001 M, 0,01 M, 0,10 M oder 0,25 M (vgl. die weiter unten folgende Tabelle i).

B) Kovalente Modifizierung

Die kovalente Gindung wurde erhalten unter Verwendung der Struktur von Kollagen oder Gelatine als Trägermedium (wobei berücksichtigt wurde, daß diese beispielsweise einer Sephrose -Matrix ähnelt mit ihren frcienCarbonsäureendgruppen ) und durch Binden des Liganden an diese Matrix über eine Peptid-Bindung, die zwischen den -COOH-Endgruppen der Gelatine und den freien Aminogruppen der

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verschiedenen Liganden erzeugt wird. Diese l'eptidbindungsbiJdung tritt leicht bei einem pH-Wert von 4,75 auf bei Verwendung des Kondensationsmittels 1-Äthyl-3-(3-diniethylaminopropyl)caib odiimid 1!Cl (E.D.C, vertrieben von der Firma Sigma Corp.).

Die Cildung dieser Dindung ist erklärlich, du die verwendete Knochengelatine, wie angenommen wird, in ihrer Aminosäurezusammensetzung dem Rinderknochenkollagen ähnelt. Rinderknochenkollagen weist 44 Asparaginsäuregruppen und 77 Glutairdnsäuregruppen oder mit anderen Worten 121 CÜÜH-Gruppen pro 1000 Resten auf. Bezogen auf die obige Analyse kann angenommen werden, daß die Gelatine in diesem Experiment lOO/lOOO freie Carbonsäuregruppen enthält. Daraus ergibt sich, dais 100 mg/1 g Gelatine modifiziert v/erden sollten, wenn der tiodif izierungsligand in großem Überschuß vorliegt. Alle anderen Modifizierungen wurden auf analoge Weise durchgeführt.

Beispiel: Zu einer 200 ml-Portion der Protein lösung wurde genügend Ligand (i-molar) zugegeben, so daß er im 5-fachen Überschuß gegenüber den möglichen L'indunciszontren vorJng. i>io Lösung wurde unter Verwendung einer geeigneten Säure (HCl) oder Case (NaOIi) auf einen pH-Wert von 4,75 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 5 g festes LDC (die minimale Carbodiimid-Menge, die zur Lrzielung einer Lndkonzentration von 0,1 Ii erforderlich war) zugegeben. Die Lösung wurde dann 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Messungen mit einem Leeds-Northrop~pH-!1eter verfolgt. Es trat eine Änderung des pH-Wertes (d.h. auf pH 3) auf, die durch Zugabe von Dase kompensiert wurde. Die Probe wurde dann 24 Stunden lang gerührt, um eine vollständige Reaktion aller möglichen Lindungszentren sicherzustellen.

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Das Protein wurdo dünn untor Vorwondung von Nioßondoin Wcissor 6 Stunden lang und erneut gegen 4 1 destilliertes Wasser und 2 Stunden lang gegen entionisiertes Wasser, 4 mal wiederholt, dialysiert. Dies wurde durchgeführt, um eine" Entfernung des nicht-umgesetzten Liganden und Kondensationsmittels sicherzustellen. Das Material wurde dann filtriert und auf identische Weise behandelt wie das nicht-kovalent modifizierte Material (schalenförmig gefroren und lyophilisiert).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiele

Code-Nr.	Gelatine	Ligand	EDC	Bindung
1.	I /"	- -		-
2.	1 "^r	HCl	-	nicht-kovalent
3.	*Λ of* I /<·	NH₄Cl	5 g	kovalent
4.	1 "f I /°	-	5 g	intern
5.	I /o	/Ethylendiamin	5 g	kovalent
6. 8.	λ % ς 0,2) O /ο	AlCl₃	—	kovalent kovalent
9.	5 ^	HCl	-	nicht-kovalent
10.		AlCl +Harnstoff O	5 g	kovalent

die kovalente Natur dieser Cindung muß noch quantitativ bestimmt

werden;

die Änderung zu 5 % (hohe Dichte) war indiziert bei der Beurteilung der 1 /u-Schüunie, da diese Beispiele extrem hygroskopisch waren und sich beim starken Bluten schnell auflösten.

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In dem Bestreben, quuntitativ zu bestimmen, welche chcmisclicn Modifikationen des Kollagens tatsächlich auftraten, wurden die folgenden analytischen Verfahren angewendet:

1.) Polyacrylamid-Scheiben-Llektrophorese (F.A.G.E.) 2.) Uindungsuntersuchungcn

3.) Circulardichroisinus -Untersuchungen

Bei der P.A.G.E. handelt es sich um eine häufig angewendete Technik zur Sichtbarmachung der Reinheit, der Hasse und der Ladung eines Proteins. Proteine wandern durch ein Medium auf der Basis der Verhältnisse Ladung/Masse (e/m). Da die Wanderung des Proteins auf dieses Verhältnis zurückzuführen ist, ist es möglich, diese Methode zur Bewertung der Kriterien anzuwenden.

Das nach dieser Methode bewertete Kriterium ist üblicherweise die Masse (S.D.S. Üenaturiorung-Gelelektrophorese), obgleich mit einigen geringfügigen Modifikationen auch das L'andenmuster eines Proteins zur Unterscheidung zwischen Proteinen mit identischer flasse mit modifizierten Ladungseigenschaften verwendet werden kann. Diese Methode kann auch zum Nachweis der Menge irgendeiner Ladungsänderung durch Modifizierung des Kollagens angewendet werden, ohne daß man auf die schwierigere, teurere durchweg konventionelle isoelektrische Fokussierung zurückgreifen muß.

Bezüglich der Bindungsuntersuchungen ist klar, daß Bindungsuntersuchungen angewendet werden müssen zur Bestimmung des Typs und der Menge der durchgeführten Modifikationen. Die in diesem Verfahren angewendete kovalente Modifizierung erzeugt im Prinzip Pseudolysinreste. Jede Methode, die freie NfL-Gruppt^ an einem intakten

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Pro Loin ciil I oronziorrn kann, kann zur Üos Linimung dor M<-ng(> dor Hindung durch Vergleich dor Anzahl dor NIL-Gruppen vor und nach dor Behandlung angewendet worden. Solche Methoden umfassen den Ninhydrin-Test und/oder den Fluorescamin-Test (Purcel.1 ot al).

Schließlich bestimint die Konformotion eines Proteins bis zu einem gewissen Grade seine chemischen Ligonschaften. Ls ist daher hilfreich, jede Änderung der chemischen Konformation, die durch eine Modifizierung hervorgerufen worden ist, durch Zirculardichroismus-Untersuchungen sowohl vor als auch nach der Behandlung zu überwachen. Schließlich sollte eine Korrelation zwischen den Konformationsünderungen und den Gcrinnungseigenschaften bestimmt v/erden.

Zur Beurteilung der synthetisierten Materialien wurden akute in vivo-Tierexperimente (Hund) und eine in vitro-TRT (Thrombinrecalcifizierungszeit)-Analyse angev/endet. Die Beurteilung der erfindungsgemäßen hämostatischen Mittel und ihr Vergleich bestanden aus:

1.) einer subkutanen Implantation der verschiedensten Agentien in ein bestimmtes Tier für eine Zeitspanne innerhalb des Bereiches von 1 Tag, 2 Tagen, / Tagen und 2 'Wochen, 2.) in der Dlutungszeit und der halbquantitativen Analyse des Gewichtes des Blutverlustes an zwei getrennten anatomischen Orten (!laut und Milz); aus diesen Tests wurden Informationen bezüglich (i) des relativen Gerinnungsvermögens (Wirkungsgrades) jedes der Agentien, (2) Informationen über die physikalische Strukturintegrität dieser Materialien sowohl vor als auch nach dem Kontakt mit dem Blut, (.3) starke Anzeichen für eine Toxizität

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J.Viiv'■■■■■ -ftf
BADORKUNAi

und dio HisioJogio, {Aj verschiedene lypen von geb-iJdeLein Fibrin bei der Einwirkung von Blut aus verschiedenen Bereichen, was sowohl von den Eigenschaften des Agens als auch von den Eigenschaften des beteiligten [Jlutes abhängt, (5) über die llandhabungseigencchaften jedes Agens unter Raum-Arbeitsbedingungen und (6) klinische subjektive Meinungen über jedes Agens bezüglich seiner Handhabung, seines Gerinnungsverrnögens und seiner Wechselwirkung mit dem umgebenden Gewebe erhalten.

Es wurden Implantationsuntersuchungen durchgeführt durch Herstellung einer Tasche in dem Drustmuskel (Hund) und Einführen jedes Agens in einzelne Taschen und Zunähen derselben mit Seide. Die Proben wurden vor der leitung des Versuchstieres herausgeschnitten, in Formalin-ülutaraldchyd fixiert und für die histologische und mikroskopische Untersuchung markiert. Dabei erhielt man die folgenden Proben:

Datum Anzahl der
Hunde

Neihenfolge Bemerkungen

2/1/77 1*5:45 Nr. 0,1,111,11,1,2,3,5,4 Nr. 5 = feucht und glitschig

Mr. A = kristallin

2/1/77 D6:53 Nr. 0,1,111,11,1,2,

3,5,4

Nr. 3 = feucht und kristallin

Nr. 4 = führte zu einem Abszei3

Nr. ό = wurde braun wie Blut

2/1/77 45:131 Nr. 4,0,1,111,11,1,2, Nr. 10^ auf der rechten

2/23/78 Co:18 Nr. 8,11,12,13,14

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Lrlüutcrunrjcn:

Ü = Kontrolle, kein Agens

I = Gel Foam

II = Surgicell

III = Avitene

I = Gelatiηeschaum 1 %

? = Gelatineschaum 1 % + HCl

3 = Gelatineschaum 1 % + NII₄Cl + EDC

4 = Gelatineschaum 1 % + EDC

5 = Gelatineschaum 1 % + EDA + EDC

6 = Gelatineschaum 1 /° + A1C1_

7*= Gelatineschaum 1 % (2 Wochen-Implantation im Nacken)

8 = Gelatineschaum 5 %

9 = Gelatineschaum 5 % + HCl

10 = Gelatineschaum 1 % + AlCl₃ + Harnstoff + EDC

II = Gelatineschaum 5 % + 0,001 N CaCl₀

12 = Gelatineschaum 5 % + 0,01OM

13 = Gelatineschaum 5 % + 0,10M

H = Gelatineschaum 5 % + 0,25M ₂

Fußnote:

Nr. 7 und Nr. 1 stellen identische Verbindungen dar.

Außerdem wurden photographische Bewertungen aller Stellen in einem Zeitintervall von 1,2 und 7 Tagen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Implantationsuntersuchungen und Strukturuntersuchungen sind in den folgenden Tabellen I und II zusammengefaßt.

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i luu ts elm itt-l lei Jungs zeit

Links oder rechts im Rumpf des Hundes wurde ein 3 cm-Einschnitt vorgenommen, der in den Muskel eindrang. Dann wurde das thermostatische Mittel zugegeben und der Einschnitt wurde gerinnen gelassen. Ls wurde kein Druck au Γ eines der Agontien ausgeübt. Die Gerinnungszeit wurde mittels einer Stoppuhr ermittelt.

Bei einer Versuchsreihe v/urde in jeden Einschnitt eine vorher gewogene 4 χ 4-Bandage oder ein Schwamm eingelegt und das Blut wurde gesammelt und gewogen. Das Gewicht des Blutes wurde erhalten durch Subtrahieren des Gewichtes des sauberen trockenen 4x4-Schwammes von dem Gewicht des Blutes, das von der 4 χ 4-Dandage oder dem Schwamm aufgesaugt worden war. Die Ergebnisse sind in der weiter unten folgenden Tabelle III angegeben.

Organblutungszeit

Um Informationen über das relative hämostatische Vermögen jedes der Agentien auf einem nicht-nähbaren Organ, wie z.D. der Milz oder der Leber, zu erhalten, wurden auf der MiIz Einschnitte durchgeführt und die ulutungszeiten wurden bestimmt. Das Verfahren war im wesentlichen analog zu dem oben genannten üauttest. In den seitlichen Aspekt der Milz wurden 3 cm-Einschnitte durchgeführt, die hämostatischen Mittel wurden auf die Verletzung aufgelegt und die Clutungszeit und das Gev/icht des Dlutes wurden bestimmt. Dei der Beurteilung dieser Daten trat eine gev/isse Schwierigkeit auf, da mit verschiedenen Verletzungsgraden (d.h. eingeschnittenen Arterien und dgl.) verschiedene Clutungsraten auftraten. Dies ist erforderlichenfalls bei den Ergebnissen angegeben,

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- v>

Dio ΠΙ J ζ wurde d« η η hcrausgotUMiiniüM/ fixiert und I Ur die liistoJogisclic Untersuchung markiert.

In vitro-Analyse

Ls wurde eine in vitro-Analyse durchgeführt, die aus der Standard-TR T (Thrombinrecalcifizierungszeit) bestand, bei der eine normale Kochsalzlösung durch gelöste hämostatische Mittel in der gleichen Konzentration ersetzt wurde.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, daß eine Reihe von Variationen des erfindungsgemäßen hämostatischen Mittels brauchbare Alternativen zu den handelsüblichen thermostatischen Mitteln (Avitene, Surgicell und Gelfoam) sowohl in bezug auf ihre hämostatischen Eigenschaften als auch in bezug auf ihre histologische Beurteilung darstellen. Dabei handelt es sich um Ü.D.-ÜC1 (hohe Dichte, mit 5 % HCl behandelt), L.D.—HCl (niedrige Dichte, mit 1 % HCl behandelt) und LD 0(niedrige Dichte, 1 Ά Gelatine). Außerdem wurde von den Experimentatoren und Klinikärzten, die diese vorläufige Untersuchung durchführten, die Reihenfolge der Bevorzugung von hämostatischen Mitteln als H.D.'HCl, L.D.-HC1, Avitene, L.D.O., Surgicell und Gelfoam angegeben. Die oben genannten Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen I und II zusammengefaßt.

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Tabelle I

03	co
	ο
O	co
O	OO
U	£«»
O	-«J
•ζ

cn

Pro- Modifikation

efukt-

Code-

Nr.

Struk-physika- anatomi- Glut- Haftung Handha- Gewebe- Gerinn- Histolccisc'ne loten

tür lische Ul- scher Test- ver- an der bungs- heilung sei- 2 3 7 2

10

I Gelfoam

II Surgicell

III Avitene

1 1 % FG

2 1 55 FG + HCl

3 1 % FG+NH Xl+
EDC

4 1 ;■-: FG + EDC

5 1 y. FG + EuA +
EDC

6 1 ¹A FG + AlCl,
8 5 ;= FG

9 5 % FG + HCl

3
4
1

2
2

3
2

3
3

FG + AlCl +

vJ

Harnstoff +EDC 3

trastruktur ort Sp bei d.Einwir- (Milz) kunc; v.Slut Sk(Haut)

lust Wunde

3 4 2 1 3

2 2

3 2

A 4

Sp - Sk

Sk

eigenschaften

3 3 2 1 2

3 2

4 4

4 1 1 2

3 3

3 3 3

bildung

Tage icge ι a ge Woe her

3 3 2 ο

3 3

1 3 3

2 1 1 2 1

1 2

2 2 2 4.

2 3

4 3

CO

OO C=) (Si OO

Tabelle I _ Fortsetzung

Pro- Modifikation Struk-physika- anatomi- Blut- Haftung Handha- Gewebe- Gerinn- Histologische Daten dukt- tür lische Ul- scher Test- ver- an der bungs- heilung sei- 2 Wochen

Code- trastruktur ort Sp lust Wunde eigen- bil-

	Nr.	5 /ο Gelatine	1	4	bei d.Einwir- (Milz)	: Sk(Haut)	1	4	schäften	4	dung	4
		schaum + 0,001 f·		kung v.BIuI
	11	CaCl₂
		5 % Gelatine	4		Sp - Sk	1	4		4
		schaum + 0,01 M		4				4		4	3
(O	12	CaCl₀
O		2			Sp - Sk
«ß		5 % Gelatine-	2	4		2	4	4	2	r\ O
09		schaum + 0,1 M
-P-	13	CaCl₉
»4		i. 5 % Gelatine	2		Sp - Sk	2	3		1
O		schaum + 0,23 M	3			3
O) cn	14	CaCl_n
-·				Sp - Sk
			3			2

FG = geschäumte Gelatine

0 = nichts/nichts

1 = schlecht/minimal

2 = gut/mittel

3 = sehr gut/stark

4 = ausgezeichnet/maximal

CD

OO O CD OO

Tabelle II Dlutungsdauer und Glutverlust bei Haut- und iiilzeinschnitten

% Änderung d. % Änderung d. % Änderung d. % Änderung Dlutungsdauer Gesamtblutver- Dlutungsdauer Gesamtblutgegenüber Kon-lustes gegen- gegenüber Kon- Verlustes trolle(llin.)* über Kontrolle trolle (nin.)**gegenüber (g)* Kontrolle

Kontrolle Gel foam	\%	0 -24,8	0 -73,0	0 -65,9	0 -70,0
Surgicell		-26,0	-78,8	-78,5	-68,7
Avitene		-21,7	+15,3	-79,5	-48,7
Gelatineschaum		-42,6	-80,3	-87,7	-62,5
Gelatineschaum 1 % + HCl		-61,5	-86, 5	-85,7	-67,5
Gelatineschaum IJi + NH.C1+EDC 4		+01,0	-P5,3	-78,2	-68,0
Gelatineschaum 1 % + EDC	%	-03.0	-82,3	-61,9	-64,0
Gelatineschaum 1 % + EDA+EDC		-16,6	-78,0	-72,1	-60,7
Gelatineschaum 1 % + AlCl	Gelatineschaum I/o + AlCl₃+Harnstoff+EDC	+73,0	+93,8	-42,1	-35,5
Gelatineschaum	-39,1	-75,0	-90,4	-65,5
Gelatineschaum 5 % + HCl	-56,4	-81,0	-91,1	-69,5
	+98,7	-56,9

Gelatineschaum 5/S +

0,001 M CaCl₂ -50,0 -88,5

Gelatineschaum 5% +

0,01OM CaCl -56,2 -94,6

Gelatineschaum 5% +

0,10M CaCl₂ -57,5 -72,3

Gelatineschaum 5% +

0,25M CaCl₂ -56,2 -92,1

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91,	1	-90,7
93,	8	-12,5
93,	8	-0,4
94,	5	-0,1

I ußnoton zur IciboJlc: - = Abnahme + = Zunahme "^:: Haut ** Milz

Die Fig. 1 bis 3 der beiliegenden Zeichnungen zeigen UV-Absorptionsspektren von verschiedenen erfindungsgemäßen Formulierungen. Die Grundverbindung (Grundmischung) allein oder mit zugesetztem CaCl₁-, absorbiert bei 280 ηιμ nicht, was anzeigt, daß keine Proteinverunreinigung vorliegt. Die Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA) führt jedoch zu einem Absorptionsmaximum bei 280 πιμ. Die Abnahme der Absorption mit zunehmenden ilengenanteilcn CaCl,-,, bezogen auf das Protein, geht aus der Fig. 3 hervor, wahrscheinlich als Folge der Verdünnung des Proteins. Alle Proben wurden hergestellt aus 1 Xiigen Lösungen, die dann vor der Messung auf das 10-fache verdünnt wurden. Die in den Fig. 1 bis 3 angegebenen Proz entsätze beziehen sich auf die Konzentrationen vor der Lyophilisierung.

Die Fig. 4 zeigt den p'l-Wert von 10 ml 0,1 /iigen Super Stat-Lösungen bei Zugabe von 100 μ-Portionen 0,01 η NaOIi oder 0,01 η HCl. Die pH-Wertkurve für destilliertes V/asser, das fast keine Pufferkapazität besitzt, ist ebenfalls angegeben.Mit zunehmendem Mengenantcil an CaCl.-,, bezogen auf das Protein, tritt eine Abnahme der Pufferkapazität auf, wahrscheinlich als Folge der Verdünnung des Proteins. Auch die Zugabe einer Base führt zu einer größeren

Änderung des pH-Wertes als die Zugabe einer Säure. Dieser Unterschied war zu erwarten, da:

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I.) der plMvciL dor neuen Verbindung in do:. I. i J I i er Lein Wusr.er (pll :: 5,5) sauer ist, etwa 5,9, und (?) die negative GesamtJadung an den Go]ino.loküJon dahingehend wirkt, daß r.io Il wirksamer neutralisiert als ülf.

Die Fig. 5 und 6 zeigen die Infrarotspektren der neuen Verbindungen (Mischungen). Es sind Absorptionsmaxima für N-Ii und C=O angegeben. Die Erhöhung des Mengonanteils an CaCl,-,, bezogen auf das Protein, führt zu einer Abnahme der beiden Absorptions-Maxima, was zu erwarten war, dadurch wird jedoch die Ccstalt der Maxima nicht beeinflußt.

Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß durch die vorliegende Erfindung ein verbessertes hämostatisches Mittel (uamostntikum) sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung geschaffen werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein verbessertes Verfahren zur Kontrolle bzw. Bekämpfung bzw. Stillung des Blutens zur Verfugung.

Obgleich Lyophilisierungsverfahren bekannt sind, können die nachfolgend angegebenen Stufen, bezogen auf die obigen Angaben, angewendet werden:

1.) 50 ml-Mcngen werden in 100 mm-Petrischalen verteilt, ?.) in einer Lyophilisiereinrichtung (z.D. einem Virtus-Üodell 100 SRC-7) wird bei -30 bis -50 C 3 bis 5 Stunden lang oder bis zum Erreichen des eutektischen Punktes in einem Schrank eingefroren, 3.) der Kondensator wird 1/2 Stunde lang aufgesetzt und es wird mit dem Vakuum begonnen ohne Anwendung von Wärme für einen Zeitraum von 3 Stunden,

4.) Die Schrankwärme wird auf +30 C festgesetzt und 48 Stunden lang beibehalten.

909847/0651 BAD ORIGINAL-* ^r'^:

Die nachfolgend angegebenen Stufen .können fur die Storilisiorung angev/endet werden:

1. I¹ !an führt in ein Gassterilisicrungsgefäß ein und verschließt es mit einem Indikator darin,

2. es wird eine Gussterilisierung mit Athylenoxid über einen normalen Cyclus durchgeführt,

3. nach der Einwirkung von Athylenoxid wird gründlich belüftet.

Die Erfindung v/urde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß die Erfindung keineswegs
darauf beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht
abgeändert und modifiziert v/erden können, ohne daß dadurch der
Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

909847/0651 BAD ORIGINAL .

Claims

Anmelder: fir. Philip N. Srv.yor
.7600 RiApc BonJ^vard
Brooklyn, New York USA

Hämostatisches Mittel, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Kontrolle oder Stillung einer Blutung

Patentansprüche

1 . Hämostatisches Mittel, dadurch gekennzeichnet , daß es hergestellt worden ist durch Modifizieren einer Kollagen- und/oder kollagenartigen Substanz, um ihre Oberflächenladung positiver zu machen.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Modifizierung um eine nicht-kovalente oder kovalente Modifizierung handelt.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kollagen- und/oder kollagenartige Substanz lyophilisiert worden ist.

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4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Kollagen- und/oder kollagenartigen Substanz

um Gelatine handelt, die mit Chlorwasserstoffsüure behandelt worden ist.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Kollagen- und/oder kollagenartigen Substanz um Gelatine handelt, die mit Λ thy J. rndinmin oder Äthyl cuidicm behandelt word-η ist.
6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Kollagen- und/oder kollagenartigen Substanz

um Gelatine handelt, die mit NK.Cl behandelt worden ist.
7. ■ Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Kollagen- und/oder kollagenartigen Substanz

um Gelatine handelt, die mit Calcium behandelt worden ist.
8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Kollagen- und/oder kollagenartigen Substanz um Gelatine handelt, die mit Calcium in Form von Calciumchlorid behandelt worden ist.
9. Verfahren zur Herstellung des hämostatischen Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kollagen- und/oder kollagenartige Substanz modifiziert, um ihre Oberflächenladung positiver zu machen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchfuhrung der Modifizierung eine nicht-kovalente oder kovalente Modifizierung anwendet.

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11. Vorldliron iuicli Aiispiucli 9 oder ld, cludurc;li ycktninziu clincL,

daß man die Kollagen- und/oder kollagenartigo Substanz lydphilisiert.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kollagen- und/oder koJlayenartigo Substanz Gelatine verwendet, die mit Chlorwasserstoffsäure behandelt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kollagen- und/oder kollagenartige Substanz Gelatine verwendet, die mit itby! endi.-uiiin odor Älhylondion boll mid el t xvird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kollagen- und/oder kollagenartige Substanz Gelatine verwendet, die mit NH-Cl behandelt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kollagen- und/oder kollagenartige Substanz Gelatine verwendet, die mit Calcium behandelt wird.
}6. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kollagen- und/oder kollagenartige Substanz Gelatine verwendet, die mit Calcium in Form von Calciumchlorid behandelt wird.
17. Verwendung des hämostatischen Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Kontrolle oder zum Stillen einer Blutung.

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