DE2915082C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis
einer Nukleinsäure-Sequenz oder
eines Nukleinsäure-Fragments gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Sie betrifft ferner die Verwendung eines Reagenzsatzes zur Durchführung
des Verfahrens und ein Reagenz zur Verwendung in dem Verfahren.
Jede biologische Probe, beispielweise Blut, das einem
Lebewesen entnommen werden kann, enthält verschiedene Nukleinsäuren
in außerordentlicher Reichhaltigkeit. Dies trifft
auch für verschiedene Sequenzen zu, beispielsweise zahlreiche
Gene, die jede einzelne Nukleinsäure in diesen Proben enthalten
kann. Daher kann der Genetiker auf große Schwierigkeiten
beim Aufspüren oder bei der Charakterisierung von bestimmten
Nukleinsäuren in einer Probe stoßen. Die Schwierigkeiten werden
noch größer, wenn es darum geht, die Anwesenheit bestimmter
Fragmente, beispielsweise der in diesen Nukleinsäuren enthaltenen
Gene, zu charakterisieren.
Um eine einzelne Nukleinsäure oder einzelne Gene - beispielsweise
im Hinblick auf Studien der Organisation genetischer
Sequenzen der DNA, in der sie enthalten sind - zu charakterisieren,
benötigt man zunächst eine mit dieser Nukleinsäure
angereicherte, aus der untersuchten Probe erhaltene Fraktion.
Zu diesem Zweck wurden bereits Anreicherungsmethoden vorgeschlagen,
die sich die Hybridisierungsreaktionen zwischen der
gesuchten Nukleinsäure bzw. dem Gen und einem Indikator zunutze
machen, sofern ein solcher Indikator verfügbar ist und
die erhaltenen Hybride sodann von der Probe abgetrennt werden
können, beispielsweise durch differentielle Sedimentation aus
einer Lösung mittels Ultrazentrifugieren.
Solche Indikatoren wurden bereits beschrieben: Es handelt
sich dabei im allgemeinen um Ribonukleinsäuren (RNA), beispielsweise
solche, die mittels genetischer Transkription von Strukturgenen erhalten
wurden. Die Strukturgene sind Bestandteile der DNA der einzelnen
Zellorganismen, aus denen sie stammen. Die DNA ist demnach geeignet,
ihrerseits in die Proteine, für welche die Strukturgene
codieren, "übersetzt" zu werden. Es ist bekannt, daß die
RNA-Nukleotid-Sequenzen zu der Sequenz der DNA, von der sie
abstammen, komplementär sind. Dies zeigt sich
in der Eigenschaft der RNA, gemischte Hybride mit den entsprechenden
Sequenzen der zugehörigen DNA zu bilden, die zuvor
denaturiert worden ist, soweit diese anfangs doppelsträngig
war, beispielsweise nach Inkubation bei hoher Ionenstärke und
erhöhter Temperatur oder in basischem Milieu.
Es wurde vorgeschlagen, den Nachweis von gebildeten Hybriden
mit Hilfe einer radioaktiven Markierung der Gene selbst oder
der RNA-Indikatoren vorzunehmen. Die Durchführung dieser Methoden
ist jedoch nicht einfach, und außerdem ist es dabei
nicht immer möglich, die Gene innerhalb der DNA ausreichend
zu lokalisieren.
Um die untersuchten Gene in der sie enthaltenen DNA besser
lokalisieren zu können und eine Methode zur Bildung von
mit bestimmten DNA-Segmenten angereicherten Fraktionen - ausgehend
von derselben DNA - zu entwickeln, haben Manning et al
eine Methode zum physiko-chemischen Nachweis dieser Gene vorgeschlagen.
Diese Methode besteht aus der chemischen Modifizierung
des RNA-Indikators durch Anheftung von Biotingruppen,
d. h. Derivaten des Cytochrom C. Diese Biotingruppen heften
sich durch Brückenbildung bei der Hybridisierung an die DNA an
und sind nun physikalisch im Elektronenmikroskop
als Staubteilchen, die aus submikroskopischen Kügelchen von
einem Durchmesser von 60 nm bestehen, insbesondere auf einem
Untergrund von Polymethacrylsäureester nachweisbar. Die Kügelchen wurden
zuvor chemisch modifiziert und kovalent an Avidin-Moleküle gebunden.
Diese Methode ist in "A New Method of in situ Hybridization",
Chromosoma, Springer Verlag (Berlin), Bd. 53 (1975), S. 107
bis 117 und in "A Method for Gene Enrichment Based on the
Avidin-Biotin Interaction, Application to the Drosophila
Ribosomal RNA Genes", Biochemistry, Bd. 16 (1977), Nr. 7,
S. 1364-1369 beschrieben.
Die Inkubation der Hybride, die durch Biotin und Avitin modifiziert
sind, macht es möglich, die Stelle der gesuchten Gene
in der sie enthaltenden DNA zu "markieren" und sie innerhalb
der globulären Struktur der DNA nachzuweisen. Diese ist ebenfalls
im Elektronenmikroskop sichtbar infolge der sehr starken
nicht kovalenten Interaktionen, die nach wie vor an den Stellen
herrschen, die frei von Biotin und Avidin geblieben sind.
Diese Methode ist jedoch kaum dazu geeignet,
rasch zu bestimmen, ob derartige Gene bzw. DNA in einer biologischen
Probe menschlicher oder tierischer Herkunft anwesend sind oder
nicht. So ist beispielweise eine rasche Diagnose einer Infektion,
von welcher der Wirt möglicherweise befallen ist, oder
der Tatsache, ob ein Gen oder beispielsweise eine DNA-Sequenz
in diesem Wirt unverändert geblieben ist oder nicht nach der
Methode schwer möglich.
Konjugate aus Enzymen und Makromolekülen und ihre Anwendung
für analytische Zwecke sind in US-A 40 02 532 beschrieben.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis
einer Nukleinsäure-Sequenz oder eines Nukleinsäure-Fragments sowie ein Reagenz
zur Verwendung in dem Verfahren
zur Verfügung zu stellen, die mit einfachen Mitteln
von Laboranten ohne besondere Ausbildung angewandt werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Gegenstand.
Natürlich darf die chemische Modifizierung die gegebenenfalls
zusätzlich stattfindene Hybridisierung des Indikators mit der gesuchten
DNA-Sequenz bzw. dem DNA-Fragment nicht behindern.
Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß mit dieser Methode
die Möglichkeit gegeben ist, rasch festzustellen, ob in einer
biologischen Probe das DNA-Gen bzw. DNA-Fragment, das dem verwendeten
Indikator entspricht, vorhanden ist oder nicht, und
dies sogar bei Anwesenheit einer großen Anzahl anderer Nukleinsäuren.
Dies ist insbesondere darauf zurückzuführen, daß
durch den Nachweis aufgrund der enzymatischen Aktivität, wobei das Enzym
durch das Substrat an das Hybrid gebunden ist, umfassende Anwendungsmöglichkeiten
gegeben sind.
Nach einer ausreichenden Reinigung des Hybrids ist es sogar
möglich, Angaben über die Konzentration der gesuchten DNA in
der untersuchten biologischen Probe bzw. über die Anzahl der
Kopien des gesuchten Gens in der gereinigten DNA zu erhalten,
und zwar durch Bestimmung der Enzymaktivität.
Bei einer zu untersuchenden Nukleinsäureprobe kann man zunächst
die Hybridisierung durchführen. Dann kann die Bindung zwischen
dem chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator und dem
Enzym stattfinden. Man kann vor Bestimmung der
Enzymaktivität den gegebenenfalls im Überschuß vorhandenen nicht
hybridisierten Indikator bzw. das überschüssige mit dem Indikator
nicht umgesetzte Enzym abtrennen oder abbauen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Abtrennung
oder der Abbau des überschüssigen nicht hybridisierten
Indikators gegebenenfalls vor der Bindung zwischen dem
chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator und dem
Enzym erfolgen.
Der spezifische Indikator kann aus RNA oder einzelsträngiger
DNA bestehen. Verwendet man eine ursprünglich doppelsträngige
DNA (oder RNA) als Indikator, so muß er vorher durch an sich
bekannte Methoden denaturiert worden sein.
Führt man eine chemische Modifizierung des Indikators mit Biotin
durch, so kann man die Methode nach Manning et al (a. a. O.)
mittels des Cytochrom C (durchschnittlich ein Molekül
Biotin pro etwa 100 Nukleotide) anwenden.
Vorzugsweise verwendet man zum Markieren des Hybrids durch
das Enzym den Komplex (Kupplungsprodukt), der sich nach der Methode von Avrameas
(beschrieben in Immunochemistry, Bd. 6 (1969), S. 43-52)
aus Avidin und den Enzym, insbesondere der β-Galactosidase, ergibt.
Man kann natürlich auch andere chemische Modifizierungsmethoden
für den Indikator und gegebenenfalls das Enzym im Hinblick auf deren
Bindung, vorzugsweise nach der Hybridisierungsreaktion, verwenden
und kann die modifizierenden Mittel für Indikator und
Enzym umgekehrt verwenden.
Es kommen noch andere Paare von modifizierenden Mitteln für
Indikator und Enzym in Frage, für die nachstehend einige Beispiele
angegeben sind. Das erste dieser Mittel wird vorzugsweise
jeweils zur chemischen Modifizierung des Indikators und
das zweite zur chemischen Modifizierung des Enzyms eingesetzt.
Der Indikator kann beispielsweise nach einer bekannten Methode
durch Metallionen, wie Quecksilberionen, modifiziert werden,
und der Nachweis wird mittels eines Enzyms durchgeführt, das
Sulfhydrylgruppen (-SH) aufweist oder an einen solche Gruppen
enthaltenden Träger gebunden ist.
Man kann beispielsweise folgendermaßen vorgehen, wenn die zu
untersuchende Probe nur aus wenigen Millilitern Blut besteht:
Die Erythrocyten werden lysiert, und die DNA wird nach üblichen
Methoden extrahiert. Sodann wird eine kleine Menge der erhaltenen
DNA, beispielsweise 1 bis 100 µg, mit 0,1-0,3 N NaOH denaturiert,
die Lösung anschließend neutralisiert und auf einen pH-Wert
von 7 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit dem der gesuchten DNA oder dem
DNA-Fragment entsprechenden Indikator versetzt, und zwar etwa
1 µg Indikator pro 100 µg denaturierte DNA (die Menge der gebrauchten
NaOH richtet sich nach dem Anteil der gesuchten DNA in der zu analysierenden
Probe). Die Lösung wird sodann mit Salzen versetzt, um ein
hohes Ionenmilieu zu erreichen, nämlich mit mindestens 0,3
in Gegenwart von 50% Formamid und eines Chelatbildners in geringer
Konzentration. Das Volumen soll vorzugsweise gering sein.
Die Hybridisierung kann sodann bei der hierfür üblichen Temperatur
1 bis 40 Stunden (normalerweise 16 Stunden) durchgeführt
werden. Man kann auch die Methode nach Manning (a. a. O.) oder
andere Hybridisierungsmethoden anwenden, beispielsweise die
Methode nach Kohne et al (Biochemistry, Bd. 16 (1977), S. 5329-5341),
die bei der hierfür üblichen Temperatur in einer phenolhaltigen
Emulsion durchgeführt wird.
Anschließend wird an ein Enzym, beispielsweise die β-Galactosidase,
gebundenes Avidin zugesetzt, und zwar unter Bedingungen,
welche die Bindung des Biotins am Indikator an die freien Gruppen
des Avidins des Komplexes ermöglichen.
Der nicht hybridisierte Indikator wird anschließend vom hybridisierten
Indikator nach üblichen Methoden abgetrennt, beispielsweise
durch Ausfällen mit Polyäthylenglykol, Gelchromatographie
beispielsweise mit Sepharose, oder Ultrazentrifugieren.
Andererseits kann der nicht hybridisierte Indikator vor der
Bindung des Avidins, welches das Enzym mit den an den hybridisierten
Indikator gebundenen Biotingruppen trägt, an die DNA
abgetrennt werden.
Man kann das gegebenenfalls fixierte Enzym und dementsprechend
die gegebenenfalls stattfindende effektive Hybridisierung des Indikators mit
der untersuchten DNA nachweisen, indem man ein Enzymsubstrat, insbesondere
Orthonitrophenolgalactosid (ONPG), mit der Lösung in Berührung bringt.
Sobald die Versuchsbedingungen festgelegt sind, ist es natürlich
möglich, eine meßbare Aktivitätsschwelle zu bestimmen, beispielsweise
durch eine kolorimetrische oder fluorographische Methode.
Oberhalb dieser Schwelle kann auf die Anwesenheit der gesuchten
DNA oder des DNA-Fragments in der behandelten Probe geschlossen
werden.
Das nachstehend beschriebene im Labor durchgeführte Versuchsbei
spiel dient zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Der Versuch dient dem Nachweis einer Maus-DNA durch Hybridisierung
dieser DNA mit ribosomaler Maus-RNA als Indikator.
100 µg Maus-DNA pro 100 µl wäßrige Lösung werden durch Versetzen
mit 10 µl 1 M NaOH denaturiert. Nach 10 Minuten wird
die Lösung mit 10 µl 1,5 M Natriumphosphorsäure (NaH₂PO₄) versetzt
und auf einen neutralen pH-Wert eingestellt. Die denaturierte
DNA-Lösung wird sodann mit 1 µg ribosomaler RNA, die
mit Biotin mittels Cytochrom C (hergestellt nach der Methode
von Manning et al.) markiert ist, versetzt. Das Volumen wird
mit Wasser auf 160 µl gebracht. Dann werden 40 µl einer Mineralsalzlösung
in einer Konzentration von 20×SSC (Standard
Saline Citrate) und 200 µl redistilliertes oder deionisiertes
Formamid zugegeben. Die Lösung 1×SSC ist eine wäßrige Lösung
von 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat, bei einem pH-Wert von
7,0. Das Gemisch wird 16 Stunden bei üblicher Temperatur inkubiert,
dann bei 4°C gegen 2×SSC dialysiert und anschließend
8 Stunden gegen 500 ml Pufferlösung, die 0,1 M Phosphat, 1 M
NaCl und 0,01 M Äthylendiamintetraessigsaures Natrium (EDTA) enthält,
bei einem pH-Wert von 7,0 dialysiert. Letztere Dialyse wird
zweimal wiederholt und je 8 Stunden durchgeführt. Die erhaltene
Lösung wird eine Stunde bei üblicher Temperatur mit pankreatischer
Ribonuclease inkubiert. Die Ribonuclease-Konzentration
beträgt 10 µg/ml. Durch diese Behandlung kann nicht
hybridisierte RNA abgebaut werden.
Sodann werden 1 mg/ml Cytochrom C-Lösung und 1 µl einer Lösung,
die in 1 mg/ml Avidin und 2 mg/ml β-Galactosidase enthält, zugegeben.
Dabei erweist sich, daß eines von 7 Molekülen β-Galactosidase
an Avidin gebunden ist. Die Lösung wird gerührt
und sodann 4 Stunden bei 4°C stehengelassen.
Anschließend wird mit Phosphat-Dialysepuffer auf 10 ml verdünnt,
und die erhaltene Lösung wird eine Stunde bei 35 000 U/Min.
zentrifugiert (im Beckman Rotor SW 41). DNA- und RNA-Hybride
finden sich im Niederschlag zusammen mit den an diese RNA gebundenen
Avidin-β-Galactosidase-Komplexen. Der Überstand enthält
nicht hybridisierte und durch Ribonuclease abgebaute RNA sowie
ungebundene Avidin und β-Galctosidase.
Der Niederschlag wird abgetrennt und erneut in 10 ml Pufferlösung
suspendiert und zentrifugiert. Anschließend wird der Niederschlag
in 0,5 ml Puffer aufgenommen (Tube Nr. 1). Sodann wird
die Aktivität der β-Galactosidase beim Umsetzen des Substrats
ONPG nach der Methode von Miller (Experiments in bacterial genetics
(1972), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York, USA) durch Messung der optischen Dichte der
Lösung bei 420 mµ bestimmt, und zwar nach mindestens 30minütiger
Inkubation bei 37°C. Es werden unter genauer Einhaltung
der vorgenannten Bedingungen Kontrollproben hergestellt, wobei
jedoch beim ersten Kontrollversuch die Zugabe der ribosomalen
RNA (Tube Nr. 2) und beim zweiten Kontrollversuch die Zugabe
der Maus-DNA (Tube Nr. 3) weggelassen wird. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle zusammengefaßt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die in der (das Hybrid
enthaltenden) Tube Nr. 1 gemessene optische Dichte signifikant
höher ist als bei den Kontrollproben.
Das Versuchsbeispiel erläutert also die Bedingungen, unter denen
die gegebenenfalls anwesende DNA bzw. das DNA-Fragment
nachgewiesen werden kann, sofern ein komplementärer Indikator
dieser DNA bzw. des DNA-Fragments verfügbar ist, und zwar
durch eine einfache Methode, die weder kompliziertes Labormaterial
noch besonders große fachmännische Erfahrung erfordert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei diagnostischen in vitro-Verfahren
zum Nachweis verschiedener Viren, wie Herpes,
Epstein Barr, Pox-Virus, Cytomegalo, in biologischen Proben
(wie Blutproben, Stuhlproben) besonders vorteilhaft angewandt
werden. Es kann ferner für die Diagnose bestimmter chromosomaler
Anomalien angewandt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin zur Feststellung
der bakteriellen Diagnose, insbesondere bei Trägern pathogener
Gene, seien sie exprimiert, nicht exprimiert oder latent, angewandt
werden.
Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß beim Suchen
einer infektiösen DNA rasch auf den Erkrankungsgrad einer erfindungsgemäß
behandelten biologischen Probe im Hinblick auf
die gesuchte Nukleinsäure bzw. deren Fragmente schließen kann,
wenn keine Induzierung oder zumindest keine Überschreitung der
Aktivitätsschwelle auf dem farbigen Substrat festgestellt wird,
sei es durch Versuche, sei es durch Vergleich mit den virusfreien
Kontrollproben.
Umgekehrt kann die festgestellte nicht vorhandene Aktivität
hinsichtlich des farbigen Substrats, insbesondere oberhalb der
vorgenannten Schwelle, in einem anderen bereits angesprochenen
Bereich Anwendung finden: Sie kann die Anwesenheit einer Anomalie
gesuchter chromosomaler Abnormität durch die festgestellte
nicht vorhandene gesamte oder partielle Hybridisierung zwischen
Indikator und untersuchter DNA anzeigen.
Beispielsweise kann man für medizinische Labors
Reagenzsätze ("Kit") mit allen zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Reagentien zur Verfügung
stellen. Solche Reagenzsätze können insbesondere
Muster für Indikatoren enthalten, die beispielsweise den DNA von
gut erforschten pathogenen Viren oder Bakterien entsprechen, und
sogar für Indikatoren, die den besonderen Genen entsprechen, die
normalerweise in biologischen zu untersuchenden Proben wie Blut
enthalten sind.
Wie bereits erwähnt, sollte der modifizierte Indikator vorzugsweise
ein Indikator sein, an den Biotin gebunden ist und wobei
das modifizierte Enzym, beispielsweise die β-Galactosidase,
selbst an das Avidin gebunden ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein neues Reagenz. Dieses
besteht aus einem Komplex aus einem Enzym (dessen Aktivität im Hinblick auf
insbesondere ein farbiges Substrat nachgewiesen werden kann)
und einem Indikator (RNA oder einzelsträngige DNA), sei es die
Bindung erfolgt direkt, sei es mit Hilfe eines komplexbildenden Mittels
zur industriellen Verwendung.
Dabei kann das Enzym, wie z. B. β-Galactosidase, über einen Komplex
aus Avidin und Biotin an den Indikator
gebunden sein (vgl. die Ansprüche 10 und 11).
Die Erfindung kann noch in anderen Bereichen Anwendung finden,
insbesondere bei der Markierung bestimmter DNA-Fragmente in
bekannten genetischen Versuchen zur Bestimmung des Genotyps
der in Frage stehenden DNA. Sie kann insbesondere Anwendung
finden bei der Bestimmung, ob ein besonderes DNA-Fragment in
genetischen Ausleseversuchen inkorporiert ist oder nicht. Bei
diesen Ausleseversuchen geht es beispielsweise um Transformationen
von Zellen mittels fremder DNA, die das betreffende DNA-Fragment
enthält, oder aber um Transduktionsversuche, bei denen
DNA-Fragmente, die normalerweise in der zellulären DNA enthalten
sind, in die virale DNA übergehen, mit der die Zellen
infiziert worden sind. Eine solche Anwendung ist natürlich nur
möglich, wenn man über einen Indikator verfügt, der das komplementäre
RNA- bzw. DNA-Fragment des Fragments der gesuchten
Nukleinsäure ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann man das Verfahren zum
Nachweis des Hybrids aus der gesuchten DNA und dem Indikator,
mittels eines an ein Enzym, beispielsweise die β-Galactosidase,
gebundenen Antihybrid-Antikörpers anwenden.
Claims (11)
1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure-Sequenz
oder eines Nukleinsäure-Fragments in einem
Gemisch unterschiedlicher Nukleinsäuren durch Hybridisierung
der Sequenz oder des Fragments
mit einem eine komplementäre Nukleinsäure (DNA oder RNA) enthaltenden
Indikator,
dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) einen chemisch modifizierten Indikator verwendet, der vor oder nach der Hybridisierungsreaktion an ein Enzym gekoppelt werden kann,
- b) daß die Hybridisierungsreaktion durch Zusammenbringen des chemisch modifizierten Indikators mit der vorgenannten Sequenz oder dem Fragment in Gegenwart anderer, in der Probe enthaltener Nukleinsäure, gegebenenfalls nach vorherigem Denaturieren der Nukleinsäuren, erfolgt, und
- c) daß nach dem Abbau oder der Abtrennung eines evtl. Überschusses des nicht-hybridisierten Indikators das Hybridisierungsprodukt mit einem Enzymsubstrat zum Nachweis der Nukleinsäure-Sequenz oder des Nukleinsäure-Fragments in Kontakt gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Enzym im Hinblick auf seine Fähigkeit auswählt,
auf ein farbiges Substrat einzuwirken, und daß man die Umwandlungsrate
des Substrats, die der Menge der nachzuweisenden
Nukleinsäure in der Ausgangsprobe korrelierbar
ist, durch optische oder analoge Analyse bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man den Indikator durch eine chemische Gruppe modifiziert,
die mit dem Enzym oder einem Molekül, das stabil
mit dem Enzym verbunden ist, einen stabilen Komplex bilden
kann.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man sowohl als chemische Gruppe als auch als Molekül
Biotin oder Abidin verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Enzym die β-Galactosidase verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß man zunächst die Hybridisierung, dann die Bindung
zwischen dem chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator
und dem Enzym durchführt und anschließend den gegebenenfalls
im Überschuß vorhandenen nicht hybridisierten
Indikator abtrennt bzw. abbaut.
7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß man zunächst die Hybridisierung und anschließend
nach Abtrennung bzw. Abbau des gegebenenfalls im Überschuß
vorhandenen nicht hybridisierten Indikators die Bindung
zwischen dem chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator
und dem Enzym durchführt.
8. Verwendung eines Reagenzsatzes zur Durchführung des
Verfahrens nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß er folgende Bestandteile aufweist:
- a) mindestens einen Indikator aus einer RNA oder einer einzelsträngigen oder denaturierbaren DNA, die charakteristisch ist für die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment, wobei dieser Indikator im Hinblick auf seine Bindung mit einem Enzym chemisch modifiziert ist,
- b) das gegebenenfalls modifizierte Enzym, das für die Bindung mit dem Indikator verwendet wird,
- c) ein insbesondere farbiges Substrat, das für das Enzym spezifisch ist,
- d) Reagentien, die für die Zellyse, insbesondere bei der Untersuchung von Blut, und für die Extraktion von Nukleinsäuren erforderlich sind.
9. Verwendung eines Reagenzsatzes nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß er eine an Biotin gebundene RNA oder
DNA als Indikator und ein Kupplungsprodukt von
Avidin und einem Enzym, wie β-Galactosidase, enthält.
10. Reagenz zur Verwendung im Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch einen Komplex aus
einem Enzym, das durch seine Fähigkeit mit einem Substrat
insbesondere einem farbigen Substrat zu reagieren, nachweisbar
ist, und einem Indikator aus einer RNA oder DNA, der
chemisch so modifiziert ist, daß er mit dem Enzym gekoppelt
werden kann, wobei der Indikator selbst mit einer Sequenz
oder einem Fragment einer komplementären Nukleinsäure in einem
Nukleinsäuregemisch durch eine Hybridisierungsreaktion
reaktionsfähig ist.
11. Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
das Enzym über einen Komplex aus Avidin und Biotin an den
Indikator gebunden ist.
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