DE2915082A1 - Verfahren und reagenzsatz zum nachweis und zur charakterisierung von nukleinsaeuren und ihren sequenzen - Google Patents

Verfahren und reagenzsatz zum nachweis und zur charakterisierung von nukleinsaeuren und ihren sequenzen

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DE2915082A1 DE19792915082 DE2915082A DE2915082A1 DE 2915082 A1 DE2915082 A1 DE 2915082A1 DE 19792915082 DE19792915082 DE 19792915082 DE 2915082 A DE2915082 A DE 2915082A DE 2915082 A1 DE2915082 A1 DE 2915082A1
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und gegebenenfalls zur Charakterisierung einer Nukleinsäure oder einer Sequenz derselben, in einer diese möglicherweise enthaltenden Probe. Sie betrifft ferner die zur Durchführung des Verfahrens erforderlichen Reagenzien und schließlich die Verwendung eines solchen Verfahrens, beispielsweise zur raschen Diagnostizierung in vitro, ob in einer biologischen Probe menschlicher oder tierischer Herkunft bestimmte Nukleinsäurepartikel etwa infektiösen Charakters vorhanden sind oder ob ein bestimmtes Gen aus dem normalen Erbgut des Wirts unverändert ist oder nicht.
Jede biologische Probe, beispielsweise Blut, das jedem Lebewesen entnommen werden kann, enthält verschiedene Nukleinsäuren in außerordentlicher Reichhaltigkeit. . Dies trifft auch für verschiedene Sequenzen zu, beispielsweise zahlreiche Gene, die jede einzelne Nukleinsäure in diesen Proben enthalten kann. Daher kann der Genetiker auf große Schwierigkeiten beim Aufspüren oder bei der Charakterisierung von bestimmten Nukleinsäuren in einer Probe stoßen. Die Schwierigkeiten werden noch größer, wenn es darum geht, die Anwesenheit bestimmter Fragmente, beispielsweise der in diesen Nukleinsäuren enthaltenen Gene, zu charakterisieren.
Um eine einzelne Nukleinsäure oder einzelne Gene - beispielsweise im Hinblick auf Studien der Organisation genetischer Sequenzen der DNA, in der sie enthalten sind - zu charakterisieren, benötigt man zunächst eine mit dieser Nukleinsäure angereicherte,aus der untersuchten Probe erhaltene Fraktion.
Zu diesem Zweck wurden bereits Anreicherungsmethoden vorgeschlagen, die sich die Hybridisierungsreaktionen zwischen der gesuchten Nukleinsäure bzw. dem Gen und einem Indikator zunutze machen, sofern ein solcher Indikator verfügbar ist und
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die erhaltenen Hybride sodann von der Probe abgetrennt werden können, beispielsweise durch differentielle Sedimentation aus einer Lösung mittels Ultrazentrifugieren..
Solche Indikatoren wurden bereits beschrieben: es handelt sich dabei im allgemeinen um Ribonukleinsäuren (RNA),beispielsweise solche, die mittels genetischer Transkription von Strukturgenen erhalten wurden. Die Strukturgene sind Bestandteile der DNA der einzelligen Zellorganismen, aus denen sie stammen. Die DNA. ist demnach ge- eignet, ihrerseits in die Proteine, für welche die Strukturgene codieren, "übersetzt" zu werden. Es ist bekannt, daß die RNA-Nukleotid-Sequenzen zu der Sequenz der DNA, von der sie abstammen, komplementär sind. Dies · . zeigt sich in der Eigenschaft der RNA, gemischte Hybride mit den entsprechenden Sequenzen der zugehörigen DNA zu bilden, die zuvor denaturiert worden ist, soweit diese anfangs doppelsträngig war, beispielsweise nach Inkubation bei hoher lonenstärke und' erhöhter Temperatur oder in basischem Milieu.
Es wurde vorgeschlagen, den Nachweis von gebildeten Hybriden mit Hilfe einer radioaktiven Markierung der Gene selbst oder der RNA-Indikatoren vorzunehmen.Die Durchführung dieser Methoden ist jedoch nicht einfach, und außerdem ist es dabei nicht immer möglich, die Gene innerhalb der DNA ausreichend zu lokalisieren.
Um die untersuchten Gene in der sie enthaltenden DNA besser
lokalisieren zu können und eine Methode zur Bildung von mit bestimmten DNA-Segmenten angereicherten Fraktionen - ausgehend von derselben DNA - zu entwickeln, haben Manning et al eine Methode zum physiko-chemischen Nachweis dieser Gene vorgeschlagen. Diese Methode besteht aus der chemischen Modifizierung des RNA-Indikators durch Anheftung von Biotingruppen, d.h. Derivaten des Cytochrom C. Diese Biotingruppen heften sich durch Brückenbildung bei der Hybridisierung an die DNA an und sind nun physikalisch im Elektronenmikroskop als Staubteilchen/die aus submikroskopischen Kügelchen von
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einem Durchmesser von 6θ nm bestehen, insbesondere auf einem Untergrund von Polymethacrylsäureester nachweisbar.Die Kügelchen wurden zuvor chemisch modifiziert und kovälent an Avidin-Moleküle gebunden. Diese Methode ist in "A New Method of in situ Hybridization", Chromosoms, Springer Verlag (Berlin), Bd. 53 (1975), S. 107 bis 117 und in "A Method for Gene Enrichment Based on the Avidin-Biotin Interaction, Application to the Drosophila Ribosomal RNA Genes", Biochemistry, Bd. 16 (1977), Nr. 7, S. 1364 - 1369 beschrieben.
Die Inkubation der Hybride, die durch Biotin und Avidin modifiziert sind, macht es möglich, die Stelle der gesuchten Gene in der sie enthaltenden DNA zu "markieren" und sie innerhalb der globulären Struktur der DNA nachzuweisen,Diese ist ebenfalls im Elektronenmikroskop sichtbar ' infolge der sehr starken nicht kovalenten Interaktionen, die nach wie vor an den Stellen herrschen, die frei von Biotin und Avidin geblieben sind.
Diese Methode ist jedoch kaum dazu geeignet, rasch zu bestimmen, ob derartige Gene bzw. ENA in einer biologischen Probe menschlicher oder tierischer Herkunft anwesend sind oder nicht. So ist beispielsweise eine rasche Diagnose einer Infektion, von welcher der Wirt möglicherweise befallen ist, oder der Tatsache, ob ein Gen oder beispielsweise eine DNA-Sequenz in diesem Wirt unverändert geblieben ist oder nicht nach der Methode schwer möglich
Aufgabe der Erfindung ist es Nachweis- und sogar Charakterisierungsmethoden zur Verfügung zu stellen, die mit einfachen Mitteln von Laboranten ohne besondere Ausbildung angewandt werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekenn-rzeichneten Gegenstand.
Natürlich darf die chemische Modifizierung die gegebenenfalls zusätzlich stattfindende Hybridisierung des Indikators mit der gesuchten DNA-Sequenz bzw. dem DNA-Fragment nicht behindern.
L _
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Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß mit dieser Methode die Möglichkeit gegeben ist, rasch festzustellen, ob in einer biologischen Probe das DNA-Gen bzw. DNA-Fragment, das dem verwendeten Indikator entspricht, vorhanden ist oder nicht, und dies sogar bei Anwesenheit einer großen Anzahl anderer Nukleinsäuren. Dies ist insbesondere darauf zurückzuführen, daß durch den Nachweis auf grund der enzymatischen Aktivität, wobei das Enzym durch das Substrat an das Hybrid gebunden ist, umfassende Anwendungsmoglich-1· keiten gegeben sind.
Nach einer ausreichenden Reinigung des Hybrids ist es sogar möglich, Angaben über die Konzentration der gesuchten DNA in der untersuchten biologischen Probe bzw. über die Anzahl der Kopien des gesuchten Gens in der gereinigten DNA zu erhalten, und zwar durch Bestimmung der Enzymaktivität.
Bei einer zu untersuchenden Nukleinsäureprobe kann man zunächst die Hybridisierung durchführen. Dann kann die Bindung zwischen dem chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator und dem Enzym stattfinden. Man kann vor Bestimmung der Enzymaktivität den gegebenenfalls im Überschuß vorhandenen nicht hybridisierten Indikator bzw. das überschüssige mit dem Indikator nicht umgesetzte Enzym abtrennen oder abbauen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Abtrennung oder der Abbau des überschüssigen nicht hybridisierten Indikators gegebenenfalls vor der Bindung zwischen dem chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator und dem Enzym erfolgen.
Der spezifische Indikator kann aus RNA oder einzelsträngiger DNA bestehen. Verwendet man eine ursprünglich doppelsträngige DNA (oder RNA) als Indikator, so muß er vorher durch an sich bekannte Methoden denaturiert worden sein.
Führt man eine chemische Modifizierung des Indikators mit Biotin durch, so kann man die Methode nach Manning et al (a.a.O.)
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Ι mittels des Cytoehrom C (durchschnittlich ein Molekül Biotin pro etwa 100 Nukleotide ). anwenden.
Vorzugsweise verwendet man zum Markieren des Hybrids durch
(Kupp lungsPEodukt)
das Enzym den Komplex/ tier sich nach der Methode von Avrameas (beschrieben in Immuno ehe mis try, Bd. 6 (Ι9β9), S. kj> - 52) aus Avidin und den Enzym, insbesondere der ß-Galactosidase, ergibt,
Man kann natürlich auch andere chemische Modifizierungsmethoden für den Indikator undgegebenenfalls das Enzym im Hinblick auf deren Bindung, vorzugsweise nach der Hybridisierungsreaktion, verwenden und kann die modifizierenden Mittel für Indikator und Enzym umgekehrt verwenden.
Es kommen noch andere Paare von modifizierenden Mitteln für Indikator und Enzym in Frage, für die nachstehend einige Beispiele angegeben sind. Das erste dieser Mittel wird vorzugsweise jeweils zur chemischen Modifizierung des Indikators und das zweite zur chemischen Modifizierung des Enzyms eingesetzt.
Der Indikator kann beispielsweise nach einer bekannten Methode durch Metallionen/ wie Que cks über ionen , modifiziert werden, und der Nachweis wird mittels eines Enzyms durchgeführt, das Sulfhydrylgruppen (-SH) aufweist oder an einen solche Gruppen enthaltenden Träger gebunden ist.
Man kann beispielsweise folgendermaßen vorgehen, wenn die zu untersuchende Probe nur aus wenigen Millilitern Blut besteht: Die Erythrocyten werden lysiert, und die DNA wird nach üblichen Methoden extrahiert. Sodann wird eine kleine Menge der er~~ haltenen DNA,beispielsweise 1 bis lOO^ig, mit 0,1 - 0,3 N NaOH denaturiert, die Lösung anschließend neutralisiert und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird mit dem der gesuchten DNA oder dem DNA-Fragment entsprechenden Indikator versetzt, und zwar etwa 1 ug Indikator pro 100 Ug denaturierte DNA (die Menge der gebrauchten NaOH richtet sich' nach dem Anteil der gesuchten DNA in der zu analysierenden'
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Probe). . Die Lösung wird sodann mit Salzen versetzt, um ein hohes Ionenmilieu zu erreichen, nämlich mit mindestens 0,3 in Gegenwärt von 50 % Formamid und eines Chelatbildner in geringer Konzentration. Das Volumen soll vorzugsweise gering sein.
Die Hybridisierung kann sodann bei der hierfür üblichen Temperatur 1 bis 40 Stunden (normalerweise 16 Stunden) durchgeführt, werden. Man kann auch die Methode nach Manning (a.a.O.) oder andere Hybridisierungsmethoden anwenden, beispielsweise die Methode nach Kohne et al (Biochemistry, Bd. l6 (1977), S. 5329 - 532U), die bei der hierfür üblichen Temperatur in einer phenol halt igen Emulsion durchgeführt wird. .
Anschließend wird an ein Enzym, beispielsweise die ß-Galactosidase, gebundenes Avidin zugesetzt, und zwar unter Bedingungen, welche die Bindung des Biotins am Indikator an die freien Gruppen des Avidins des Komplexes ermöglichen.
Der nicht hybridisierte Indikator wird anschließend vom hybridisierten Indikator nach üblichen Methoden abgetrennt, beispielsweise durch Ausfällen mit Polyäthylenglykol, Gelchromatographie beispielsweise mit Sepharose, oder Ultrazentrifugieren.
Andererseits kann der nicht hybridisierte Indikator vor der Bindung des Avidins, welches das Enzym mit den an den hybridisierten Indikator gebundenen Biotingruppen trägt, an die DNA abgetrennt werden.
Man kann das gegebenenfalls fixierte Enzym und dementsprechend die gegebenenfalls stattfindende effektive. Hybridisierung des Indikators mit der untersuchten DNA nachweisen, indem man ein Enzymsubstrat, insbesondere Qrthonitrophenolgalactosid (OtJPG), mit der Lösung in Berührung bringt:.
Sobald die Versuchsbedingungen festgelegt sind, ist es natürlich möglich, eine meßbare Aktivitätsschwelle zu bestimmen, beispiels weise durch eine kolorimetrieehe oder fluorographische Methode. Oberhalb dieser Schwelle kann auf die Anwesenheit der gesuchten DNA-oder des DNA-Fragments in der behandelten Probe geschlossen
werden.
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Das nachstehend beschriebene im Labor durchgeführte Versuchsbei-
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spiel dient zur Erläuterung des erfindungsgemäßen "Verfahrens. Es liegt im Rahmen des handwerklichen Könnens, die Methoden im Hinblick auf die untersuchte biologische Probe und die gesuchte DNA oder das DNA-Fragment entsprechend abzuwandeln.
Versuchsbeispiel
Der Versuch dient dem Nachweis. einer Maus-DNA durch Hybridisierung dieser DNA mit ribosomaler Maus-RNA als Indikator. 100 /üg Maus-DNA pro 100 /il wäßrige Lösung werden durch Versetzen mit 10/ul 1 M NaOH denaturiert. Nach 10 Minuten wird die Lösung mit 10/Ul 1,5 M Natriumphosphorsäure (NaH2POn) versetzt und auf einen neutralen pH-Wer-t eingestellt. Die denaturierte DNA-Lösung wird sodann mit 1 ^ug. ribosomaler RNA, die mit Biotin mittels Cytochrom C (hergestellt nach der Methode von Manning et al.) markiert ist, versetzt. Das Volumen wird mit Wasser auf ΐβο/ul gebracht. Dann werden 2K)/ul einer Mineralsalzlösung in einer Konzentration von 20 χ SSC (Standard Saline Citrate) und 200/ul redestilliertes oder deionisiertes Formamid zugegeben. Die Lösung 1 χ SSC ist eine wäßrige Lösung
von 0,15 MNaCl und O,015M Natriumeitrat, bei einem pH-Wert von 7,0. Das Gemisch wird l6 Stunden bei üblicher Temperatur inkubiert, dann bei 2I-0C gegen 2 χ SSC dialysiert und anschließend 8 Stunden gegen 500 ml Pufferlösung, die 0,1 M Phosphat, 1 M NaCl und 0,01 M Äthylendiamintetraessigsaures Natrium (EDTA) enthält,
bei einem ph-wert von 7,0 dialysiert. Letztere Dialyse wird zweimal wiederholt und je 8 Stunden durchgeführt. Die erhaltene Lösung wird eine Stunde bei üblicher Temperatur mit pankreatischer Ribonuclease inkubiert. Die Ribonuclease-Konzentration beträgt 10 /ug/ml. Durch diese Behandlung kann nicht
hybridisierte RNA abgebaut werden.
Sodann werden 1 mg/ml Cytochrom C-Lösung und 1 /ul einer Lösung, die in 1 mg/ml Avidin und 2 mg/ml ß-Galactosidase enthält, zugegeben. Dabei erweist sich, daß eines von 7 Molekülen ß-Galactosidase an Avidin gebunden ist. Die Lösung wird gerührt und sodann 4 Stunden bei 4°C stehengelassen. Anschließend wird mit Phosphat-Dialysepuffer auf 10 ml verdünnt, und die erhaltene Lösung wird eine Stunde bei 55 000
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U/Min, zentrifugiert (im Beokman Rotor SW 4l). ENA-und RNA-Hybride finden sich im Niederschlag zusammen mit den an diese BNA gebundenen Ävidin-ß-Galactosidase-Komplexen. Der Überstand enthält nicht hybridisierte und durch Ribonuclease abgebaute KNA sowie ungebundene Avidin und ß-Galactosidase.
Der Niederschlag wird abgetrennt und erneut in 10 ml Pufferlösung suspendiert und zentrifugiert. Anschließend wird der Niederschlag in 0,5 ml Puffer aufgenommen (Tube Nr. 1). Sodann wird die Aktivität der ß-Galactosidase beim Umsetzen des Substrats ONPG nach der Methode von Miller (Experiments in bacterial genetics (1972) ,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) durch Messung der optischen Dichte der Lösung bei 420 nju bestimmt, und zwar nach mindestens 30-minütiger Inkubation bei 37°C. Es werden unter genauer Einhaltung der vorgenannten Bedingungen Kontrollproben herge.stellt,wobei Jedoch beim ersten Kontrollversuch die Zugabe der ribosomalen RNA (Tube Nr. 2) und beim zweiten Kontrollversuch die Zugabe der Maus-DNA (Tube Nr. 3) weggelassen wird. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefaßt.
Tabelle
Inhalt
Tube Nr. DNA RNA optische
9ς Dichte bei 420 rau, nach
30 Min., bei 37 C
1 + "_+'■■ 0,45
2 + - 0,14
3 - + 0,15
+ und - in der DNA- und RNA-Spalte deuten Jeweils an, ob die DNA bzw. RNA in der ursprünglichen Lösung vorhanden war oder nicht.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die in der (das Hybrid enthaltenden) Tube Nr. 1 gemessene optische Dichte signifikant höher ist als bei den Kontrollproben.
L _|
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Das Versuchsbeispiel erläutert also die Bedingungen, unter denen die gegebenenfalls anwesende DNA bzw. das DNA-Fragment nachgewiesen werden kann, sofern ein komplementärer Indikator dieser DNA bzw. des DNA-Fragments verfügbar ist, und zwar durch eine einfache Methode,.die weder kompliziertes Labormaterial noch besonders große fachmännische Erfahrung erfordert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei diagnostischen in vitro-Verfahren zum Nachweis verschiedener Viren, wie Herpes, Epstein Barr, Pox-Virus, Cytomegalo, in biologischen Proben (wie Blutproben, Stuhlproben) besonders vorteilhaft angewandt werden. Es kann ferner für die Diagnose bestimmter chromosomaler Anomalien angewandt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann \%reiterhin zur Feststellung der bakteriellen Diagnose, insbesondere bei Trägern pathogener Gene, seien sie exprimiert, nicht exprimiert oder latent , angewandt werden.
Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß man beim Suchen einer infektiösen DNA rasch auf den Erkrankungsgrad einer erfindungsgemäß behandelten biologischen Probe im Hinblick auf die gesuchte Nukleinsäure bzw. deren Fragmente schließen kann, wenn keine Induzierung oder zumindest keine Überschreitung der Aktivitätsschwelle auf dem farbigen Substrat festgestellt wird, sei es durch Versuche sei es durch Vergleich mit den virusfreien Kontrollproben.
Umgekehrt kann die festgestellte nicht vorhandene Aktivität hinsichtlich des farbigen Substrats, insbesonder oberhalb der vorgenannten Schwelle, in einem anderen bereits angesprochenen Bereich Anwendung finden: Sie kann die Anwesenheit einer Anomalie gesuchter chromosomaler Abnormität-durch die festgestellte nicht vorhandene gesamte oder partielle Hybridisierung zwischen Indikator und untersuchter DNA anzeigen.
Beispielsweise kann man für medizinische Labors L J
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· Reagenzsätze ("Kit") mit allen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Reagentien zur Verfügung stellen. ,-..-. , Solche Reagenzsätze können insbesondere Muster für Indikatoren enthalten, die beispielsweise den DNA von gut erforschten pathogenen Viren oder Bakterien entsprechen, und sogar für Indikatoren, die den besonderen Genen entsprechen, die normalerweise in biologischen zu untersuchenden Proben wie Blut enthalten sind.
Wie bereits erwähnt, sollte der modifizierte Indikator vorzugsweise ein Indikator sein, an den Biotin gebunden ist und wobei das modifizierte Enzym, beispielsweise die ß-Galactosidase, selbst an das Avidin gebunden ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin neue
Komplexe aus einem Enzym (dessen Aktivität im Hinblick auf insbesondere ein farbiges Substrat nachgewiesen werden kann) und einem Indikator (RNA oder einzelsträngige DNA), sei es die Bindung erfolgt direkt, sei es mit Hilfe eines komplexbildenden Mittels zur industriellen Verwendung. ■ Sie betrifft auch den Kanplex aus Enzym und mindestens einem chemischen Molekül, wobei der ganze" Komplex an einen gegebenenfalls modifizierten Indikator (RNA oder DNA) gebunden werden kann, der selbst mit einer DNA bzw. einem DNA-Fragment hybridisierbar ist. Solche neue industrielle Produkte sind beispielsweise die Komplexe aus Indikator (RNA oder DNA) und einem Enzym, wie die ß-Galactosidase, oder die Komplexe aus Avidin bzw. Biotin und einem solchen Enzym.
Die Erfindung kann noch in anderen Bereichen Anwendung finden, insbesondere bei der Markierung bestimmter DNA-Fragmente in bekannten genetischen Versuchen zur Bestimmung des Genotyps der in Frage stehenden DNA. Sie kann insbesondere Anwendung finden bei der Bestimmung, ob ein besonderes DNA-Fragment in genetischen Ausleseversuchen inkorporiert ist oder nicht. Bei diesen Ausleseversuchen geht es beispielsweise um Transformationen von Zellen mittels fremder DNA, die das betreffende DNA-Fragment enthält, oder aber um Transduktionsversuche, bei denen
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DNA-Fragmente, die normalerweise in der zellulären DNA enthalten sind, in die virale DNA übergehen, mit der die Zellen infiziert worden sind. Eine solche Anwendung ist natürlich nur möglich, wenn man über einen Indikator verfügt, der das komplementäre RNA- bzw. DNA-Fragment des Fragments der gesuchten Nukleinsäure ist.
Die vorliegende Erfindung erschöpft sich keineswegs in den erläuterten Anwendungs- und Durchführungsmöglichkeiten. Sie umfaßt vielmehr alle Varianten, insbesondere hinsichtlich Modifizierungen des Indikators, die eine enzymatische Dosierung des Hybrids ermöglichen, sowie die Modifizierungen hinsichtlich der Bildung und/oder Reinigung des Hybrids, der Markierung oder chemischen Modifizierung der untersuchten DNA selbst, und zwar unter den vorgenannten Bedingungen, wobei beim RNA-Indikator keine besondere Markierung vorgenommen wird. Eine Umkehrung der Reagentien kann beispielsweise im Falle einer DNA in Betracht gezogen werden, die zahlreiche repetitive Gene enthält, welche aus der gesamten DNA in Form des Hybrids mit dem Indikator isoliert werden sollen. Vorher wird die DNA durch übliche Methoden fragmentiert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann man das Verfahren zum Nachweis des Hybrids aus der gesuchten DNA und dem Indikator,
mittels eines an ein Enzym, beispielsweise die ß-Galactosidase, gebundenen Antihybrid-Antikörpers anwenden.
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Claims (1)

  1. VOSSIUS . VOSSIUS-i, WlLTl-. .TAUCHNER . HEUNEMANN
    PATENTANWÄLTE
    SIEBERTSTRASSE 4- · 8OOO MÜNCHEN 86 - PHONE: (O89) 474075 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN · TELEX 5-29 453 VOPAT D
    u.Z.: P 108 (DV/nk/ke) . 12. ^ *g
    Case: PL-0053 79 05
    Institut Pasteur
    Paris, Prankreich
    Verfahren und Reagenzsatz zum Nachweis und zur Charakterisierung
    von Nukleinsäuren und ihren Sequenzen 15
    Priorität: 13. April 1978, Prankreich, Nr. 78 10975
    P a t e η t a η s ρ r ü c h e
    IJ Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung· einer ""bestimmten Nukleinsäure-Sequenz oder eines bestimmten Nukleinsäure-Fragments, insbesondere eines Gens, auch der gesamten Nukleinsäure in einer Probe eines Nukleinsäurekomplexes durch Zusammenbringen der Probe, gegebenenfalls nach vorherigen Denaturieren der untersuchten Nukleinsäure, mit einem eine komplementäre Nukleinsäure enthaltenden Indikator, der hybridisierbar mit der gesuchten Nukleinsäure oder deren Sequenz ist, dadurch gekennzeichnet, daß man als Indikator einen durch Bindung an ein Enzym vor oder nach der Hybridisierungsreaktion chemisch modfizierten Indikator verwendet wobei die gegebenenfalls anwesende Nukleinsäure oder deren Sequenz durch die Aktivität ..des so umgewandelten Hybridisierungsprodukts aus Indikator und Nukleinsäure oder deren Sequenz als Substrat für ein Enzym nachgewiesen werden kann.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
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    Γ 2 Π
    man das Enzym im Hinblick auf seine Fähigkeit, auf ein farbiges Substrat einzuwirken, auswählt, und daß man die Umwandlungsrate des Substrats, die dem Anteil der gesuchten Nukleinsäure oder deren Sequenz in der Ausgangsprobe korrelierbar ist, durch optische oder analoge Analyse bestimmt.
    j5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Indikator durch eine chemische Gruppe modifiziert, die mit dem Enzym oder einem Molekül, das stabil mit dem Enzym verbunden ist, einen stabilen Komplex bilden kann.
    4. Verfahren nach Anspruch j5> dadurch gekennzeichnet, daß man sowohl als chemische Gruppe als auch als Molekül Biotin oder Avidin verwendet.
    5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym die ß-Galactosidase verwendet.
    6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst die Hybridisierung, dann die Bindung zwischen
    dem chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator und dem Enzym durchführt und anschließend den gegebenenfalls im Überschuß vorhandenen nicht hybridisierten Indikator abtrennt bzw. abbaut.
    25
    7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5> dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst die Hybridisierung und anschließend nach Abtrennung bzw. Abbau des gegebenenfalls im Überschuß vorhandenen nicht hybridisierten Indikators die Bindung zwischen dem chemisch modifizierten und hybridisierten Indikator und dem Enzym durchführt.
    8. Reagenzsatz zur Durchführung des Verfahrens gemäß Ansprüche 1 bis I1 dadurch gekennzeichnet, daß er folgende Bestandteile aufweist:
    a) mindestens einen bestimmten Indikator aus einer RNA oder einer einzelsträngigen DNA, die charakteristisch ist für eine gesuchte Nukleinsäure oder deren Sequenz, wobei dieser Indikator im Hinblick auf seine Bindung mit einem
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    Γ _ 5 -
    Enzym chemisch modifiziert ist,
    b) das gegebenenfalls modifizierte Enzym, das für die Bindung mit dem Indikator verwendet wird, ·
    c) ein insbesondere farbiges Substrat, das für das Enzym spezifisch ist,
    d) Reagentien, die für die Zellyse, insbesondere bei der Untersuchung von Blut, und für die Extraktion von Nukleinsäuren erforderlich sind.
    9. Reagenzsatz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator aus einer RNA an Biotin gebunden ist und daß das Kupplungsproäukt aus Ävidin und einem Enzym die ß-Galactosidase als Enzym enthält.
    10. Komplex aus einem Enzym, das insbesondere durch
    seine Fähigkeit mit einem farbigen Substrat zu reagieren nachweisbar ist, und einem RNA- oder DNA-Indikator, wobei die Bindung direkt oder mittels eines komplexbildenden Mittels erfolgt.
    11. Komplex aus einem Enzym, das insbesondere durch seine Fähigkeit mit einem farbigen Substrat zu reagieren nachweisbar ist, und mindestens einem chemischen Molekül, wobei der ganze Komplex an einen gegebenenfalls modifizierten RNA- oder DNA-Indikator gebunden werden kann.
    12. Komplex nach Anspruch 11 enthaltend ß-Galactosidase als Enzym und Ävidin-oder Biotin als chemische Substanz.
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DE2915082A 1978-04-13 1979-04-12 Verfahren und Verwendung eines Reagenzsatzes zum Nachweis und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren und ihren Sequenzen Expired - Lifetime DE2915082C3 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
FR7810975A FR2422956A1 (fr) 1978-04-13 1978-04-13 Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede

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DE2915082A1 true DE2915082A1 (de) 1979-10-31
DE2915082C2 DE2915082C2 (de) 1989-07-13
DE2915082C3 DE2915082C3 (de) 1995-04-20

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