DE2914822C2

DE2914822C2 -

Info

Publication number: DE2914822C2
Application number: DE2914822A
Authority: DE
Inventors: Ako Koube Hyogo Jp Sugitachi; Kunihiko Kyoto Jp Takagi; Yasunori Yamatotakada Nara Jp Yabushita
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1978-04-12
Filing date: 1979-04-11
Publication date: 1989-06-01
Also published as: US4265233A; FR2422407B1; GB2023614A; GB2023614B; FR2422407A1; DE2914822A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Material zum Heilen von Wunden.

Aus der JA-PS 41 111/70 ist ein Gelatineschwamm, an welchem Thrombin fixiert ist, als Heilmaterial bekannt, das auf eine Wundstelle, wie einen Schnitt, eine Schramme, einen Einschnitt von einer chirurgischen Operation oder einen Hohlraum, welcher nach der Zahnextraktion hinterbleibt, aufgebracht wird. Das Thrombin, das in der Gelatine enthalten ist, wirkt auf das Fibrinogen an der Wunde ein, bildet eine Fibrinmasse und stillt somit das Bluten. Das in dieser Weise gebildete Fibrin ist nichtstabilisiertes Fibrin, welches beispielsweise in Säuren oder Harnstoff löslich ist und durch Plasmin zersetzt wird. Eine Heilung findet somit häufig sehr langsam statt.

Die "Wiener klinische Wochenschrift" 88. Jahrgang, Supplementum 49 (1976), S. 3 bis 18 offenbart einen Fibrinkleber aus Fibrinogen, Thrombin und Blutgerinnungsfaktor XIII, wobei die Komponenten in situ verwendet werden.

Der Blutgerinnungsfaktor XIII ist ein bekannter Blutkoagulationsfaktor, der Fibrin stabilisieren kann (siehe C. G. Curtis, L. Lorand, Methods in Enzymology, 45, 177, Academic Press (1976)). Dieser Faktor wirkt direkt auf nichtstabilisiertes Fibrin und nimmt an der Bildung von Isopeptidbindungen unter den Fibrinmolekülen teil. Der Blutkoagulationsfaktor XIII befindet sich in der Rezeptur im Handel erhältlicher Zubereitungen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Material zum Heilen von Wunden zur Verfügung zu stellen, welches das Heilen durch die Bildung stabilisierten Fibrins fördert.

Diese Aufgabe wird durch ein Material zum Heilen von Wunden gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Blutkoagulationsfaktor XIII an einem Träger fixiert ist. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Materials wird stabilisiertes Fibrin gebildet, das für eine lange Zeitdauer wirksam ist, wodurch die Wunde geschützt und ihr Heilen gefördert wird.

Der Ausdruck "Träger" wie er hier unter Bezugnahme auf das erfindungsgemäße Material verwendet wird, bezieht sich auf alle herkömmlichen Materialien, welche beim Heilen einer Wundstelle gebraucht werden, welche verschiedene Formen aufweisen können, wie einzelne Fäden, faserige Zusammenstellungen, wie Baumwolle, Papier, nicht gewobenes Fasergut, gewobenes und gewirktes Gewebe, Filme oder Schwämme. Dazu gehören beispielsweise chirurgische Nähte (Einzelfäden, gezwirnte Garne oder Wirkgarne), absorbierende Polster, Bandagen, Brandverbände und Packungen für Zahnhohlräume in Form von Baumwolle, Papier, nicht gewobenes Fasergut, gewobenem Fasergut, gewirktem Fasergut, Filme und Schwämme. Ferner umfaßt der Ausdruck "Träger" absorbierbare Materialien, wie Gelatine und Schwämme.

Der Träger kann beispielsweise folgende Materialien umfassen:

(A) Natürliche Polymere
Cellulose, Viskosekunstseide, Kupferammoniumkunstseide, Celluloseacetat, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Agarose, Dextran, Pullulan, Pectin, Alginsäure, Chitin, Polysaccharide, wie Mucopolysaccharide und Proteine wie Wolle, Seide, Kollagen, Gelatine und Kasein.
(B) Synthetische Polymere
Polymere von Olefinen, wie Äthylen, Propylen, 1-Buten, 1-Penten und Isobutylen; Polymere von halogenierten Olefinen, wie Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Trifluoräthylen und Tetrafluoräthylen; Polymere von aromatischen Vinylverbindungen, wie Styrol, Divinylbenzol, α-Methylstyrol oder Vinylpyridin; Polymere von Dienen, wie Butadien oder Isopren; Polymere von N-Vinylverbindungen, wie N-Vinylamin oder N-Vinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und dessen Ester, wie Polyvinylalkoholacetat; Polymere von Vinyläthern, wie Vinylmethyläther und Tetramethylenglycoldivinyläther; Polymere von schwefelhaltigen Vinylverbindungen, wie Vinylsulfon oder Vinylsulfox d; Polymere von ungesättigten Aldehyden, wie Acrolein; Polymere von ungesättigten Ketonen, wie Methylvinylketon; Polymere von α,β-ungesättigten Carbonsäuren, wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäure oder Fumarsäure, Polymere von α,β-ungesättigten Carbonsäureestern, wie Methylacrylat, Äthylacrylat, Methylmethacrylat, Äthylmethacrylat oder Maleinsäuremonomethylester; Polymere von α,β-ungesättigten Carbonsäurechloriden, wie Acryloylchlorid oder Methacryloylchlorid; Polymere von α,β-ungesättigten Säureanhydriden, wie Acrylsäureanhydrid, Methacrylsäureanhydrid und Maleinsäureanhydrid; Polymere von α,β-ungesättigten Nitrilen, wie Acrylnitril oder Methacrylnitril; Polymere von α,β-ungesättigten Carbonsäureamiden, wie Acrylamid oder Methacrylamid; Polyalkylenimine, wie Polyäthylenimin; Polyäther, wie Polyphenylenoxid, Polymethylenoxid, Polyäthylenoxid oder Polytetramethylenoxid; Polypeptide, wie Polyglutaminsäure, Polyalanin, Polylysin, Polyasaparaginsäure oder Polyphenylalanin; Polyamide, wie Nylon-3, Nylon-4, Nylon-5, Nylon-6, Nylon-7, Nylon-11, Nylon-12, Nylon-6,6, Nylon-6,10, Poly(m-phenylenisophtalamid) oder Poly(p-phenylen Polyester, welche sich ableiten von mehrwertigen Carbonsäuren, wie Terephthalsäure, Isophthalsäure, Adipinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure oder Trimellithsäure, und mehrwertigen Alkoholen, wie Äthylenglycol, Propylenglycol, Butylenglycol, Pentaerythrit oder Bisphenol A; Polyester, welche sich ableiten von Hydroxycarbonsäuren, wie Glycolsäure, Milchsäure, Hydroxypivalinsäure, Siliconkautschuke, wie Dimethylpolysiloxan, Methylphenylpolysiloxan, Methylvinylpolysiloxan, Cyanoalkylmethylpolysiloxane und Fluoralkylmethylpolysiloxane; Polyurethane, welche sich ableiten von Polyisocyanaten, wie Toluoldiisocyanat, Xyloldiisocyanat, Phenylendiisocyanat, Äthylendiisocyanat, Diphenylmethandiisocyanat und Toluoltriisocyanat und Polyolen, wie Polyäthylenglycol, Polypropylenglycol oder Polyestern, welche eine Hydroxylgruppe an beiden Enden enthalten; Formaldehydharze, wie Phenol-Formaldehyd-Harze, Xylol- Formaldehyd-Harze, Harnstoff-Formaldehyd-Harze oder Melamin- Formaldehyd-Harze; Polymere, welche einen tetracyklischen Ring enthalten, wie Polyimide, Polybenzimidazole und Polythiazole; Polycarbonate, welche sich ableiten von Bisphenol A und Phosgen; Polysulfone, welche sich ableiten vom Bisphenol A und 4,4′-Dichlordiphenylsulfon.

Lineare Copolymere, vernetzte Copolymere, Pfropfcopolymere und Blockcopolymere, welche Einheiten der Monomerkomponenten der oben aufgeführten Polymeren enthalten, können ebenfalls als Trägermaterialien für das erfindungsgemäße Wundheilmaterial verwendet werden.

Ein geeignetes mittleres Molekulargewicht für Polymere mit ausreichender mechanischer Festigkeit beträgt 7000 bis 1 Million vorzugsweise 10 000 bis 500 000.

Von den vorgenannten Materialien sind Cellulose, Cellulosederivate, wie Viskosekunstseide, Kupferammoniumkunstseide und Celluloseacetat, Proteine, wie Kollagen und Gelatine, Polyvinylalkohol und seine Derivate, Polypeptide, wie Polyglutaminsäure, Polyalanin, Polylysin und Polyasparaginsäure, Polyamide, wie Nylon-6 und Nylon-6,6, und Polyester, wie Polyäthylenterephthalat, Polybutylenterephthalat und Polyglycolsäure und Polymilchsäure und Polyurethan bevorzugt.

Vorzugsweise wird Thrombin zusammen mit Blutkoagulationsfaktor VIII ("Faktor XIII") fixiert, weil es die Bildung von nichtstabilisiertem Fibrin an einer Wundstelle weiter fördert.

Der Faktor XIII, welcher erfindungsgemäß verwendet wird, ist ein fibrinstabilisierender Faktor, welcher direkt auf nichtstabilisiertes Fibrin wirkt und zwischen den Fibrinmolekülen Isopeptidbindungen bildet. Der Faktor XIII wird aus dem Blut bzw. der Plazenta des Menschen und des Rindes erhalten und steht im Handel zur Verfügung. Zur Aufbringung auf eine Wundstelle eines Menschen ist die Anwendung von Faktor XIII bevorzugt, welcher vom Menschen erhalten worden ist.

Das erfindungsgemäß verwendete Thrombin ist eine Protease, welche Fibrinogen in Fibrin umwandeln kann. Thrombin wird beispielsweise vom Blut des Menschen, des Rindes oder des Schweines abgetrennt, doch zur Anwendung beim Menschen ist der Gebrauch menschlichen Thrombins bevorzugt. Thrombin ist ebenfalls verfügbar.

Der Faktor XIII und Thrombin können an einem Träger durch kovalente Bindung, ionische Bindung, Adsorption oder Einschließen fixiert werden, wobei herkömmliche Techniken angewendet werden, wie diejenigen, die in O. Zaborsky, Immobilized Enzymes, CRC Press, 1973, beschrieben sind.

Wenn der vorgenannte Träger eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe enthält, die eine kovalente Bindung bilden kann (beispielsweise eine Carboxylgruppe, Chlortriazinylgruppe, Azidogruppe, Diazoniumgruppe, Epoxygruppe, Formylgruppe, Säureanhydridgruppe, Bromacetylgruppe, Isocyanatgruppe oder Iminocarbonatgruppe oder eine Ionenaustauschgruppe, wie eine Aminogruppe, ein Ammoniumion, eine Carboxylgruppe, Carboxylatgruppe, Sulfoxylgruppe oder Sulfonatgruppe), so kann Faktor XIII und gegebenenfalls Thrombin (obwohl Thrombin nicht zwingend zugesetzt wird) kovalent oder ionisch an den Träger gebunden sein, der mit einer Lösung von Faktor XIII und Thrombin behandelt worden ist. Wenn der Träger wenig oder keine funktionellen Gruppen enthält, welche eine kovalente Bindung oder eine Ionenaustauschgruppe bilden können, so kann Faktor XIII und Thrombin an den Träger gebunden werden, nachdem eine solche Gruppe in den Träger durch bekannte Polymerreaktionen eingeführt wird.

Einige Beispiele des Bindens von Faktor XIII und Thrombin an verschiedene Träger seien nachstehend beschrieben.

Proteine, wie Seide, Kollagen, Kasein oder Gelatine, enthalten eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe, welche funktionelle Gruppen sind, die eine kovalente Bindung und gleichzeitig Ionenaustauschgruppen bilden können. Träger aus diesen Proteinen können Faktor XIII und Thrombin ohne Vorbehandlung kovalent oder ionisch gebunden aufweisen. Im Falle der kovalenten Bindung ist es bevorzugt, ein Dehydrokondensationsmittel, wie Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfona-t, zu verwenden, um eine Peptidbindung mit der Aminogruppe und der Carboxylgruppe im Protein zu bilden. In diesem Falle wird das Dehydrokondensationsmittel in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%, in Wasser oder einem Gemisch von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Propylalkohol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd, aufgelöst. Ein Träger, welcher sich aus dem obigen Protein zusammensetzt, wird mit einer gemischten Lösung der Dehydrokondensationsmittellösung und der Lösung des Faktors XIII und des Thrombins behandelt oder zuerst mit der Dehydrokondensationsmittellösung und anschließend mit der Lösung des Faktors XIII und des Thrombins oder umgekehrt, behandelt bei einer Temperatur von 253 K (-20° C) bis 333 K (60° C), vorzugsweise 273 bnis 313 K (0 bis 40° C) für 10 min bis 72 h, vorzugsweise 30 min bis 24 h.

Es ist aber auch möglich, zuerst den proteinartigen Träger mit einem Polyaldehyd, wie Dialdehydstärke, Glutaraldehyd oder Glyoxal, oder einem Polycarbonsäureanhydrid, wie Maleinsäureanhydrid/Methylvinyläther-Copolymer, Maleinsäureanhydrid/Styrol-Copolymer oder Maleinsäureanhydrid/Äthylen-Copolymer, umzusetzen, um eine Formylgruppe bzw. Säureanhydridgruppe einzuführen und dann den Faktor XIII und das Thrombin kovalent zu fixieren.

Die Reaktion zwischen dem proteinhaltigen Träger und dem Polyaldehyd wird ausgeführt, indem der Polyaldehyd in einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 30 Gew.-%, aufgelöst und der proteinhaltige Träger mit der sich ergebenden Polyaldehydlösung behandelt wird. Die geeignete Behandlungstemperatur beträgt 253 K (-20° C) bis 343 K (70° C), vorzugsweise 273 bis 323 K (0 bis 50° C), und die Reaktionszeit beträgt im allgemeinen 5 min bis 24 h, vorzugsweise 20 min bis 8 h.

Die Reaktion zwischen dem proteinhaltigen Träger und dem Polycarbonsäureanhydrid wird ausgeführt, indem das Polycarbonsäureanhydrid in Aceton, Tetrahydrofuran, Benzol, Toluol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd oder einem Gemisch dieser Substanzen in einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew.-%, aufgelöst und der proteinhaltige Träger mit der sich ergebenden Lösung behandelt wird. Eine geeignete Behandlungstemperatur beträgt 253 bis 333 K (-20 bis +60° C), vorzugsweise 273 bis 313 K (0 bis 40° C) und die Behandlungszeit beträgt im allgemeinen 5 min bis 24 h, vorzugsweise 20 min bis 6 h.

Ein Träger aus hydroxylgruppenhaltigem Polymermaterial, wie Baumwolle, Viskosekunstseide, Kupferammoniumkunstseide, Cellulose und Cellulosederivate, wie Celluloseacetat oder Polyvinylalkohol, wird zuerst mit einem Polyaldehyd, wie Glutaraldehyd, Glyoxyl oder Dialdehydstärke, behandelt, um eine Formylgruppe in den Träger einzuführen. Dann wird der formylgruppenhaltige Träger mit Faktor XIII und Thrombin behandelt, wodurch Faktor XIII und Thrombin kovalent gebunden werden. Die Reaktion zwischen dem Träger, der sich aus dem hydroxylgruppenhaltigen Polymermaterial und dem Polyaldehyd zusammensetzt, wird durchgeführt, in dem der Polyaldehyd in einer sauren wäßrigen Lösung aufgelöst wird, welcher beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure in einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 20 Gew.-%, enthält und der Träger mit der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von 253 bis 333 K (-20 bis +60° C), vorzugsweise 273 bis 313 K (0 bis 40° C) 5 min bis 24 h, vorzugsweise 10 min bis 10 h, behandelt wird.

Es kann aber auch eine Iminocarbonatgruppe in den Träger durch Verwenden von Bromcyan eingeführt werden; eine Bromacetylgruppe kann eingeführt werden durch Verwenden von Bromacetylbromid; eine Säureanhydridgruppe kann eingeführt werden durch Verwenden eines Polycarbonsäureanhydrids, wie Maleinsäureanhydrid/Methylvinyläther-Copolymer, Maleinsäureanhydrid/Styrol-Copolymer oder Maleinsäureanhydrid/Äthylen-Copolymer; eine Isocyanatgruppe kann eingeführt werden durch Verwenden eines Polyisocyanats und eine Chlortriazinylgruppe kann eingeführt werden durch Verwenden von Cyanurchlorid und Faktor XIII und Thrombin werden an dem modifizierten Träger fixiert.

Die Reaktion des Trägers aus einem hydroxylgruppenhaltigen Polymermaterial mit Bromcyan kann gemäß dem Verfahren von R. Axen, J. Porath und S. Ernback, Nature, 214, 1302 (1967) durchgeführt werden. Die Reaktion des Trägers aus hydroxylgruppenhaltigem Polymermaterial mit Bromacetylbromid kann unter Bezugnahme auf das Verfahren der israelischen Patentschrift 18 207 (1965) durchgeführt werden.

Die Reaktion des Trägers aus hydroxylgruppenhaltigem Polymermaterial mit Polymaleinsäureanhydrid kann durchgeführt werden, in dem das Polymaleinsäureanhydrid in Aceton, Tetrahydrofuran, Benzol, Toluol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd oder einem Gemisch dieser Substanzen in einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew.-% aufgelöst, wahlweise ein Katalysator, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, zu der sich ergebenden Lösung in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,05 bis 2 Gew.-%, hinzugesetzt und der Träger mit der Lösung bei 273 bis 373 K (0 bis 100° C), vorzugsweise 293 bis 353 K (20 bis 80° C) für 10 min bis 24 h, vorzugsweise 30 min bis 10 h, behandelt wird.

Die Reaktion des Trägers aus dem hydroxylgruppenhaltigen Polymermaterial mit dem Polyisocyanat wird durchgeführt, indem das Polyisocyanat in Dimethylformamid, Methyläthylketon, Tetrahydrofuran oder einem Gemisch dieser Stoffe in einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 20 Gew.-%, aufgelöst, wahlweise ein Katalysator, wie N-Methylmorpholin oder Triäthylendiamin, in einer Konzentration von 0,001 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 1 Gew.-% hinzugesetzt, und der Träger mit der Lösung bei 293 bis 393 K (20 bis 120° C), vorzugsweise 313 bis 363 K (40 bis 90° C), für 5 min bis 24 h, vorzugsweise 20 min bis 10 h, behandelt wird.

Die Reaktion des Trägers aus dem hydroxylgruppenhaltigen Polymermaterial mit Cyanurchlorid kann unter Bezugnahme auf G. Kay, E. M. Crook, Nature, 216, 514 (1964), u. A. K. Sharp, G. Kay, M. D. Lilly, Biotechnology and Bioengineering, 11, 363 (1970) durchgeführt werden.

Eine Epoxygruppe kann in den aus dem hydroxylgruppenhaltigen Polymermaterial hergestellten Träger eingeführt werden, indem der Träger mit einem ungesättigten Säurechlorid, wie Crotonsäureanhydrid, Tetrahydrophthalsäureanhydrid oder 10-Undecenoylchlorid, umgesetzt und das Produkt mit Chlorperbenzoesäure oder Wasserstoffperoxyd epoxidiert wird.

Der Träger, in den eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe, wie eine Formylgruppe, eine Iminocarbonatgruppe, eine Bromacetylgruppe, eine Säureanhydridgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Chlortriazinylgruppe oder eine Epoxygruppe, eingeführt wurde, wird aminiert durch Behandlung mit einem Polyamin, wie Polyäthylenimin und carboxyliert durch Behandlung mit einer Aminocarbonsäure, wie Glycin oder epsilon-Aminocapronsäure. Die Behandlung mit dem Polyamin oder der Aminocarbonsäure wird durchgeführt durch Umsetzen des eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe enthaltenden Trägers mit einer wäßrigen Lösung des Polyamins oder der Aminocarbonsäure in einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew.-%, bei einer Temperatur von 273 bis 373 K (0 bis 100° C), vorzugsweise 283 bis 333 K (10 bis 60° C) für eine Zeit von 10 min bis 48 h, vorzugsweise 30 min bis 24 h. Der Träger, in den eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe, eine Ionenaustauschgruppe so eingeführt wurde, kann Faktor XIII und Thrombin ionisch an sich binden.

Im Falle eines Trägers, der aus einem Polymermaterial mit endständigem Carboxyl hergestellt wurde, wie Polyamid oder Polyester, kann eine Säureanhydridgruppe eingeführt werden durch Behandeln des Trägers mit einem Polyamin, wie Polyäthylenimin, in Anwesenheit eines Dehydrokondensationsmittels, wie Dicyclohexyl-Carbodiimid und nachfolgendes Behandeln des sich ergebenden Produktes mit einem Polycarbonsäureanhydrid, wie Maleinsäureanhydrid/Methylvinyläther-Copolymer, gemäß dem Verfahren der JA-OS 10 378/77. Durch Behandeln des Trägers, der eine Säureanhydridgruppe aufweist, mit Faktor XIII und Thrombin, kann der Faktor XIII und das Thrombin kovalent gebunden werden. Durch Umsetzen des Trägers, der eine Säureanhydridgruppe aufweist, mit Wasser bei 283 bis 373 K (10 bis 100° C), vorzugsweise 293 bis 333 K (20 bis 60° C) für eine Zeitdauer von 10 min bis 48 h, vorzugsweise 1 bis 24 h, wird eine Carboxylgruppe (welche eine Ionenaustauschgruppe ist) gebildet. In dieser Weise kann Faktor XIII und/oder Thrombin ionisch an den carboxylgruppenhaltigen Träger gebunden werden.

Wenn ein Träger aus polymerem Material mit endständigem Carboxyl, etwa Polyamid oder Polyester, zuerst mit Benzidin oder Hydrazin und dann mit salpetriger Säure nach der Methode von W. E. Hornby, H. Filippusson, Biochimica et Biophysica Acta, 220, 343 (1970) behandelt wird, kann eine Diazoniumgruppe oder eine Azidogruppe in den Träger eingeführt werden. Durch Behandeln des Trägers, der die Diazoniumgruppe oder Azidogruppe aufweist, mit Faktor XIII und Thrombin, kann der Faktor XIII und das Thrombin kovalent gebunden werden.

Beim Einführen einer reaktionsfähigen funktionellen Gruppe oder einer Ionenaustauschgruppe in dem Träger in der oben beschriebenen Weise ist es erforderlich, ein Lösungsmittel auszuwählen, welches den Träger nicht auflöst. Das Fixieren des Faktors XIII an den Träger mit einer funktionellen Gruppe oder einer Ionenaustauschgruppe unter kovalenter bzw. ionischer Bindung des Faktors XIII und des Thrombins, wird durchgeführt, indem der Träger mit einer Lösung des Faktors XIII behandelt wird. Das Fixieren von Faktor XIII und Thrombin wird durchgeführt, indem der Träger mit einer Lösung behandelt wird, welche den Faktor XIII und das Thrombin enthält oder indem er zuerst mit einer Lösung des Faktors XIII und anschließend mit einer Lösung von Thrombin oder in umgekehrter Reihenfolge, behandelt wird. Faktor XIII und Thrombin lösen sich in Wasser oder einem Gemisch von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylsulfoxyd oder Dimethylformamid, in einer Konzentration von 1 bis 2000 Einheiten/ml, vorzugsweise 5 bis 500 Einheiten/ml, auf. Eine Einheit des Faktors XIII entspricht der Faktor XIII-Wirksamkeit von 1 ml frischem, menschlichem Standardplasma. Eine Einheit Thrombin entspricht der Einheit, welche definiert ist durch das U.S. National Institute of Health (siehe Minimum Requirement for Dried Thrombin, 2. Revision, Division of Biologic Standards, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, 1946). Eine geeignete Temperatur für die Behandlung von Faktor XIII und Thrombin beträgt 253 bis 343 K (-20 bis +70° C). vorzugsweise 273 bis 313 K (0 bis 40° C) und die geeignete Behandlungszeit beträgt 1 min bis 48 h, vorzugsweise 2 min bis 24 h. Beim Fixieren des Faktors XIII und des Thrombins sollte der pH-Wert der Lösung auf 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 9, eingestellt sein. Zu diesem Zwecke wird ein Puffer, wie ein Phosphatpuffer oder ein Acetat, eine Säure wie Salzsäure oder ein Alkali, wie Natriumhydroxid verwendet. Nach Erfordernis wird als Stabilisator ein Protein (nicht mehr als 10 g/l), wie Albumin oder Gelatine oder ein Salz (nicht mehr als 2 Mol/l), wie Natriumchlorid, hinzugesetzt.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Wundheilmaterials kann Faktor XIII und Thrombin an den Träger beispielsweise in Form eines Einzelfadens, einer fasrigen Anordnung, eines Filmes oder eines Schwammes durch Adsorption in der folgenden Weise fixiert werden. Faktor XIII und Thrombin werden in einem Lösungsmittel aufgelöst, welches den Träger benetzen kann und der Träger wird mit der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von 253 bis 333 K (-20 bis +60° C), vorzugsweise 273 bis 313 K (0 bis 40° C) für eine Zeitdauer von 10 min bis 48 h, vorzugsweise 30 min bis 24 h behandelt, wodurch das Adsorbieren des Faktors XIII und des Thrombins an den Träger bewirkt wird. Geeignete Lösungsmittel sind Wasser und Gemische von Wasser mit mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylsulfoxyd und Dimethylformamid. Geeignete Konzentrationen von Faktor XIII und Thrombin sind 1 bis 2000 Einheiten/ml, vorzugsweise 5 bis 500 Einheiten/ml.

Das erfindungsgemäße Wundenheilmaterial kann auch hergestellt werden, indem Faktor XIII und Thrombin durch Einschließen fixiert werden. Das Einschließen beinhaltet das Einschließen von Faktor XIII und Thrombin in den feinen Gittern eines Gels oder in einem polymeren Film. Geeignete Materialien, welche bei diesem Verfahren verwendet werden, sind absorbierbare Materialien, wie Kollagen, Gelatine, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Glycolsäure/Milchsäure-Copolymer, Polyglutaminsäure und Amylose.

Das Einschließen von Faktor XIII und Thrombin in den Gelgittern wird bewirkt durch Auflösen, Emulgieren oder Suspendieren von Faktor XIII und Thrombin und einem absorbierbaren Material, wie Kollagen oder Gelatine und Einarbeiten der sich ergebenden Lösung, Emulsion oder Suspension in einen Träger, der die Form eines Filmes, eines Schwammes, eines Fadens oder eines nicht gewobenen Fasergutes besitzt, nach einer herkömmlichen Naß- oder Trockenmethode. Wenn erforderlich, kann das absorbierbare Polymer vernetzt werden durch Hinzusetzen eines Härtungsmittels, wie Glyoxal, Glutaraldehyd oder Trimethylolmelamin oder durch Anwenden von Ultraviolettstrahlung bzw. ionisierender Strahlung, um die mechanische Festigkeit des Polymeren zu steigern und um die Absorbierbarkeit des Polymeren einzustellen.

Beispiele von Lösungsmitteln, welche verwandt werden können, um das absorbierbare Polymer und den Faktor XIII und das Thrombin aufzulösen, zu emulgieren oder zu suspendieren, sind Wasser, Methanol, Propanol, Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Methylenchlorid und Gemische dieser Substanzen. Geeignete Konzentrationen des Faktors XIII und des Thrombins liegen bei 1 bis 2000 Einheiten/ml, vorzugsweise 5 bis 500 Einheiten/ml. Eine geeignete Konzentration des absorbierbaren Polymeren beträgt 0,1 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 30 Gew.-%.

Zum Verformen der sich ergebenden Lösung nach der Trockenmethode, sei auf die JA-PS 41 111/70 Bezug genommen. Die Methode der JA-PS 41 111/70 besteht in dem Hinzusetzen eines Schäumungsmittels, wie Myristylnatriumsulfat, zu einer Lösung, welche Gelatine enthält, nach dem Sterilisieren der Lösung, Schäumen, Hinzusetzen von Glyoxyl als Denaturierungsmittel in einer Menge von 0,003 bis 0,007 g je 1 g Gelatine zur Zeit des Schäumens, um die Gelatine zu verformen und zu verfestigen und Lyophilisieren des Produktes in der Form. Zum Verformen der Lösung nach der Naßmethode siehe Methods in Enzymology, Bd. 44, S. 169, herausgegeben von K. Mosbach, Academic Press, 1976.

Die Menge an Faktor XIII und Thrombin, welche an dem obigen Träger fixiert wird, variiert über einen weiten Bereich gemäß der Art der Wunde, der Zeit, für welche das Wundheilmaterial verwendet wird, und der Form des Wundheilmaterials. Im allgemeinen beträgt die Menge an fixiertem Faktor XIII und Thrombin 1 bis 100 000 Einheiten je Gramm, vorzugsweise 5 bis 20 000 Einheiten je Gramm des Wundheilmaterials.

Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Wundheilmaterials können an dem Träger, zusammen mit dem Faktor XIII und dem Thrombin, Calciumionen fixiert werden, welche sich an der Aktivierung des Faktors XIII beteiligen. Calciumionen werden gewöhnlich dem Träger als Calciumchlorid zugesetzt, zweckmäßigerweise in einer Menge von 0,1 µMol bis 1 mMol, vorzugsweise 0,5 µMol bis 200 µMol. Wenn erforderlich, können bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Wundheilmaterials, zusammen mit Faktor XIII und Thrombin, pharmazeutische Stoffe, wie Antiplasmine, Antibiotika, Antivirale, Sulfonamide und Antiinfektionsstoffe an dem Träger fixiert werden. Antiplasmin ist ein Inhibitor von Plasmin, welcher ein fibrinauflösendes Enzym ist und daher die fibrinolytische Aktivität durch Hemmen von Plasmin inhibiert. Demgemäß kann ein Wundheilmaterial, an welches Antiplasmin zusammen mit Faktor XIII und Thrombin fixiert ist, die Bildung von Fibrin durch Inhibieren der fibrinolytischen Aktivität fördern. Beispiele des Antiplasmins sind Aprotinin, welches aus den Lungen von Rindern extrahiert ist, natürliche Substanzen wie Pepstatin, Leupeptin, Antipain oder Chymostatin, abgetrennt aus den Kulturbrühen von Mikroorganismen, epsilon-Aminocapronsäure, Tranexamsäure und Gabexatmesilat. Epsilon-Aminocapronsäure und Tranexamsäure sind besonders bevorzugt. Beispiele von Antibiotika sind Penicillin, Tetracyclin, Chlortetracyclin, Bacitracin, Streptomycin, Neomycin, Polymycin, Gramicidin, Oxytetracyclin, Chloramphenicol und Erythromycin. Beispiele von Antiviralen sind Idoxuridin. Beispiele von Sulfanamid sind Sulfacetamid, Sulfamethazol, Sulfamethazin und Sulfisoxazol. Beispiele von Antiinfektionsstoffen sind Nitrofurazon und Natriumpropionat. Da die Menge an pharmazeutischer Substanz, welche an die obige Struktur zusammen mit Faktor XIII und Thrombin fixiert ist, gemäß der Art des pharmazeutischen Stoffes, der gewünschten Heilungswirkung und der Zeit, welche das Wundheilmaterial verwendet wird, in weitem Bereiche variiert, ist es nicht praktisch, den Mengenbereich des pharmazeutischen Stoffes zu bestimmen. Im allgemeinen beträgt die Menge fixierten pharmazeutischen Stoffes jedoch 1 µg bis 100 mg, vorzugsweise 10 µg bis 10 mg, je g des Wundmaterials.

Das erfindungsgemäße Wundheilmaterial kann verwendet werden, um eine Wundstelle zu schützen, beispielsweise eine durch Schneiden oder Schrammen verursachte Verletzung, eine Verbrennung, Geschwüre, welche auf der Körperoberfläche entstanden sind, Wundflächen bei chirurgischen Operationen oder Hohlräume, welche nach der Zahnextraktion verbleiben. Da es die Bildung stabilisierten Fibrins an der Wundstelle für lange Zeitdauer wirksam fördert, beschleunigt es das Heilen und besitzt gleichzeitig die Wirkung, örtliche Schmerzen zu lindern. Ein Wundheilmaterial, welches sowohl Faktor XIII als auch Thrombin fixiert aufweist, besitzt eine weit größere heilungsfördernde Wirkung als ein Material, das nur Faktor XIII fixiert aufweist, weil Thrombin die Bildung nichtstabilisierten Fibrins, einer Vorstufe des stabilisierten Fibrins, fördert.

Wenn ein absorbierbares Material, wie Kollagen, Gelatine, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, ein Glycolsäure/Milchsäure- Copolymer, Polyglutaminsäure oder Amylose, als Material für das erfindungsgemäße Wundheilmaterial verwendet wird, braucht der Träger nach vollendetem Heilen nicht entfernt zu werden. Es wird insbesondere vorzugsweise an Stellen verwendet, welche die Förderung der Bildung stabilisierten Fibrins im Körper erfordern, wie an anastomotischen Stellen. Hierbei sind Gelatine, Kollagen, Polyglycolsäure und Polymilchsäure besonders geeignet.

Das erfindungsgemäße Wundheilmaterial kann leicht sterilisiert werden unter Anwendung eines gasförmigen Germizids, wie Äthylenoxid. Es kann aber auch sterilisiert werden durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, Neutronen und Elektronen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Als Faktor XIII wird ein Faktor XIII-Konzentrat, welches von Plazenta abgeleitet ist, verwendet. Als Thrombin wird menschliches Plasmathrombin verwendet.

Die Bildung stabilisierten Fibrins wird in folgender Weise bestätigt. Im Falle eines Trägers, der nur Faktor XIII fixiert aufweist, wird der Träger mit einer wäßrigen Lösung behandelt, welche Thrombin (25 Einheiten/ml) und Ca-Ionen (0,025 Mol/l) enthält, um den Faktor XIII zu aktivieren und ein Film aus nichtstabilisiertem Fibrin wird auf der Oberfläche der Struktur unter Verwendung von Fibrinogen und Thrombin gebildet. Die Probe wird 1 h bei 310 K (37 °K) stehengelassen und auf die Bildung stabilisierten Fibrins getestet. Im Falle eines Trägers, der sowohl Faktor XIII und Thrombin fixiert aufweist, wird der Träger mit einer wäßrigen Lösung, welche Ca⁺⁺ enthält, behandelt, um Faktor XIII zu aktivieren, in eine 0,5%ige wäßrige Fibrinogenlösung gebracht und 1 h bei 310 K (37° C) stehengelassen. Dann wird getestet, um zu bestimmen, ob das auf der Oberfläche des Trägers gebildete Fibrin stabilisiertes Fibrin ist. Nichtstabilisiertes Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure auf, stabilisiertes Fibrin hingegen nicht Daher wird die Löslichkeit des in obiger Weise gebildeten Fibrinfilmes in 1%iger Monochloressigsäure getestet, um die Bildung stabilisierten Fibrins zu bestimmen.

Beispiel 1

Nach dem Verfahren von G. Kay und Mitarbeitern [G. Kay, E. M. Crook, Nature, 216, 514 (1967)] wird eine chirurgische Gaze (aus Baumwolle, 5 cm × 5 cm) in 20 ml einer 1-n wäßrigen Natriumhydroxydlösung eingetaucht. Unter Rühren wird eine Acetonlösung von Cyanurchlorid (gebildet durch Auflösen von 3,69 g Cyanurchlorid in 20 ml Aceton) hinzugefügt. Die Reaktion wird bei 293 K (20° C) 10 min durchgeführt. Die Gaze, welche eine Chlortriazinylgruppe aufweist, wird mit Aceton und dann mit Wasser gewaschen und bei 293 K (20° C) 3 min mit einer wäßrigen Lösung von Faktor XIII (63 Einheiten/ml) behandelt, woraufhin mit physiologischer Salzlösung gewaschen wird.

Der Fibrinfilm, welcher auf der Oberfläche der chirurgischen Gaze mit kovalent gebundenem Faktor XIII gebildet ist, löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Beispiel 2

Es wird eine chirurgische Gaze in der gleichen Weise behandelt wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß anstelle der Lösung des Faktors XIII ein Gemisch verwendet wird, welches aus 4 ml einer Lösung des Faktors XIII (125 Einheiten/ml) und 4 ml physiologischer Salzlösung von Thrombin (200 Einheiten/ml) zusammengesetzt ist.

Das auf der Oberfläche der chirurgischen Gaze mit kovalent gebundenem Faktor XIII und Thrombin gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Beispiel 3

Ein Polyäthylenterephthalattaft (10 cm × 10 cm) wird in ein Gemisch einer 10%igen wäßrigen Lösung von Polyäthylenimin und Methanol mit der fünffachen Volumenmenge der Polyäthyleniminlösung betaucht und 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird eine 4 Gew.-%ige methanolische Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in einer zweifachen Volumenmenge der wäßrigen Polyäthyleniminlösung hinzugesetzt und der Taft ferner für 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Taft wird entnommen, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Der mit Polyäthylenimin behandelte Taft wird in eine Acetonlösung, welche 3 Gew.-% eines Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid-Copolymer enthält, gebracht, 2 h bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit Aceton gewaschen. Der sich ergebende Taft wird gewaschen, 24 h bei 277 K (4° C) in einer Lösung des Faktors XIII (63 Einheiten/ml) stehengelassen und mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Der auf der Oberfläche des Taftes mit kovalent gebundenem Faktor XIII gebildete Fibrinfilm löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Beispiel 4

Es wird ein Polyäthylenterephthalattaft in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 behandelt mit der Ausnahme, daß anstelle der Lösung des Faktors XIII ein Gemisch verwendet wird, welches aus 4 ml einer Lösung des Faktors XIII (125 Einheiten/ml) und 4 ml physiologischer Salzlösung (200 Einheiten/ml) besteht.

Das auf der Oberfläche des Taftes mit kovalent gebundenem Faktor XIII und Thrombin gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Beispiel 5

Ein Gelatineschwamm (5 cm × 2,5 cm × 0,5 cm) wird für 10 min in 10 ml einer wäßrigen Lösung des Faktors XIII (63 Einheiten) getaucht und dann wird 20 h lyophilisiert. Das auf der Oberfläche des Gelatineschwammes mit ionisch gebundenem Faktor XIII gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Beispiel 6

Der gleiche Gelatineschwamm, wie er in Beispiel 5 verwendet wurde, wird in 10 ml der gemischten Lösung des Faktors XIII und Thrombins, welches in Beispiel 2 verwendet wurde, getaucht und dann wird 20 h lyophilisiert. Das Fibrin, welches auf der Oberfläche des Gelatineschwammes mit ionisch gebundenem Faktor XIII und Thrombin gebildet wurde, löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Beispiel 7

Ein im Handel erhältliches absorbierbares Nahtmaterial von Kollagen, ein im Handel erhältliches absorbierbares geflochtenes Nahtmaterial von Polyglycolsäure und ein absorbierbares geflochtenes Nahtmaterial von Polymilchsäure, welches gemäß der JA-PS 31 696/70 bereitet wurde, werden je in der gleichen Weise behandelt wie in Beispiel 5. Das auf jeder der Oberflächen jedes der Nahtmaterialien mit fixiertem Faktor XIII als Ergebnis gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Der Faktor XIII wird fixiert durch ionische Bindung im Falle des Nahtmaterials aus absorbierbarem Kollagen und durch Adsorption im Falle der Nahtmaterialien aus Polyglycolsäure und Polymilchsäure.

Beispiel 8

Die drei in Beispiel 7 verwendeten Nahtmaterialien werden in der gleichen Weise behandelt wie in Beispiel 6. Das auf der Oberfläche der Nahtmaterialien mit daran fixiertem Faktor XIII und Thrombin gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Faktor XIII und Thrombin werden an das Nahtmaterial aus absorbierbarem Kollagen durch ionische Bindung und an die Nahtmaterialien aus Polyglycolsäure und Polymilchsäure durch Adsorption fixiert.

Beispiel 9

Das gleiche im Handel erhältliche absorbierbare Nahtmaterial aus Kollagen, welches in Beispiel 7 verwendet wurde, wird in ein Gemisch aus 2 ml wäßriger Lösung des Faktors XIII (125 Einheiten/ml), 2 ml physiologischer Salzlösung von Thrombin (200 Einheiten/ml) und 4 ml einer wäßrigen Lösung von 1- Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl) carbodiimid-metho-p- toluolsulfonat (40 mg/ml) getaucht, 20 h bei 343 K (70° C) stehengelassen und dann mit physiologischer Salzlösung gewaschen.

Das auf der Oberfläche des absorbierbaren Nahtmaterials aus Kollagen mit kovalent gebundenem Faktor XIII und Thrombin gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Beispiel 10

Ein Testrohr wird mit 8 ml destilliertem Wasser, 2 g Gelatine und 50 mg Natriumlaurylsulfat beschickt und das Gemisch wird aufgelöst, indem es auf 303 bis 308 K (30 bis 35° C) erwärmt wird. Die Lösung wird stürmisch gerührt, während sie bei 303 bis 308 K gehalten wird, bis sie das Fünffache ihres ursprünglichen Volumens bildet. Zur Zeit des Schäumens werden 0,04 ml einer 40%igen wäßrigen Lösung von Glyoxyl und 1 ml einer wäßrigen Lösung von Faktor XIII (63 Einheiten/ml) hinzugesetzt. Der sich ergebende Schaum wird in Blattform gegossen und lyophilisiert. Das auf der Oberfläche des Gelatineschwammes gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Der Faktor XIII wird auf dem Gelatineschwamm durch Einschließen und ionische Bindung fixiert.

Beispiel 11

Es wird ein Gelatineschwamm in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß anstelle der wäßrigen Lösung des Faktors XIII die gemischte Lösung von Faktor XIII und Thrombin verwendet wird, welche in Beispiel 2 verwendet wurde. Das auf der Oberfläche des Gelatineschwammes gebildete Fibrin löst sich in 1%iger Monochloressigsäure nicht auf.

Faktor XIII und Thrombin werden am Gelatineschwamm fixiert durch Einschluß und ionische Bindung.

Claims

1. Material zum Heilen von Wunden, dadurch gekennzeichnet, daß der Blutkoagulationsfaktor XIII an einem Träger fixiert ist.

2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein absorbierbares Material ist.

3. Material nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das absorbierbare Material Gelatine ist.

4. Material nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das absorbierbare Material Kollagen ist.

5. Material nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das absorbierbare Material Polyglycolsäure ist.

6. Material nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das absorbierbare Material Polymilchsäure ist.

7. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Thrombin fixiert ist.

8. Material nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor XIII und Thrombin in einer Menge von 1 bis 100 000 Einheiten je Gramm des Wundmaterials vorliegt.

9. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Calciumionen zusätzlich an dem Träger fixiert sind.

10. Material nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine pharmazeutische Substanz zusätzlich an dem Träger fixiert ist.

11. Verwendung des Materials nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in Form einer chirurgischen Naht, eines Verbands, einer Bandage, eines Filmes, eines Schwammes oder einer Zahnfüllung.