DE2911481C2

DE2911481C2 - Verfahren zur Herstellung einer Pyruvatoxidase

Info

Publication number: DE2911481C2
Application number: DE2911481A
Authority: DE
Inventors: Saburo Harada; Yoshifumi Horiuchi; Kazuo Matsuura; Hideo Misaki; Satoshi Shizuoka Takenaka
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-03-25
Filing date: 1979-03-22
Publication date: 1985-01-24
Also published as: US4246342A; FR2436182B1; IT7967627A0; FR2436182A1; GB2020018B; SE445928B; DK156253C; DE2911481A1; FR2420760A1; SE7902648L; IT1165650B; FR2420760B1; GB2020018A; CA1143640A; GB2043650A; GB2043650B; DK156253B; DK119679A; DE2954385C2

Description

A. Beobachtungen auf vsrschiedenen Nährmedien, gezüchtet 2 Tage bei 30⁰C

Stamm B-0667

Stamm B-0668

Sojaprotein-Nährbouillon Sojaprotein-Schrägagar

Sojaprotein-Agarplatte Gelatinestich

BCP-Milch (14 Tage)

schwaches Wachstum, gleichförmig trübe, später wollartiges Sediment schwaches Wachstum, fahl gelblich grau, kein Glanz, keine Produktion löslicher Pigmente

Kolonie, schmal und flach

Wachstum entlang des Stichkanals keine Gelatineverflüssigung keine Veränderung

schwaches Wachstum, gleichförmig trübe, später wollartiti» Sediment schwaches Wachstum, fahl gelblich grau, kein Glanz, keine Produktion löslicher Pigmente
Kolonie, schmal und flach Wachstum entlang des Stichkanals. keine Gelatineverflüssigung keine Veränderung

B. Mikroskopische Beobachtung

Stamm B-0667

Stamm B-0668

55 Gestalt

Größe Motilität 60 Sporen Gram-Färbung Säurefestigkeits-Färbung

sphärisch, ovoid, paarweise, tetraformig oder kurze Ketten

0,5-1,0 X 0,5-1,0 μΐη

sphärisch, ovoid, paarweise, tetraförmig oder kurze Ketten 0,8-l,0x 1,0-1,2 μΐη

C. Physiologische Eigenschaften

	r	Wachstumstemperatur:	45° C	Stamm B 0667	Stamm B-0668
if			37° C
			30° C	+	+
			26° C	+
	t		10°C	+	+
	j.'.		5° C	+	+
		Halotoleranz: NaCl	10%	± oder(+)	± oder(+)
		6,5%	+	-
i		5,0%	+	-
;-.		1,0%	+	+
tv		0%	+	+
	OF-Test		+	-
	Verhalten in Sauerstoff		fermentativ	fermentativ
ti			fakultativ	fakultativ
■is H	Nitratreduktion		anaerob	anaerob
	Indolbildung		-	-
IT'! fl	Schwefelwasserstoffbildung		-	-
	Gelatinehydrolyse		-	-
*'j;*	Stärkehydrolyse		-	-
Ii	Äskulinhydrolyse		-	-
f]	Acetoinbildung		+	+
■5 Γ J	MR-Reaktion		-	-
L.'	Katalase		-	-
f	Oxidase		-	-
	Urease (SSR)		-	-
	Urease (Christensen)		-	-
K	Verbrauch an Citronensäure		-	-
	(Christensen)		_	_
	Säurebildung aus Zuckern:
	Adonit
	L(+)-Arabinose			—
	Cellobiose		-	-
	Dulcit		+	+
	meso-Erythrit		_	-
	Fructose		-	-
	Fucose		+	+
	Galactose		-	-
	Glucose		+	+
	Glycerin		+	+
	Inosit		-	-
	Inulin		—	-
	Lactose		-	-
	Maltose		+	4-
	Mannit		+
	Mannose		+	-
	Melezitose		+	+
	Melibiose		-	-
	Raffinose		-1_	-
	L(+)-Rhamnose		+	—
	Salicin		-	-
	L-Sorbose		(+)	-
Sorbit			=
Stärke		-	_
Saccharose		-	-
Treh'slose		+	+
Xylose		+	+
	-	-

Toleranz 30 Min. bei 60°C

	Stamm B-0667	Stamm B-0668	Genus Pediococcus	Genus Streptococcus
			+	d
Toleranz 30 Min. bei 60°C Glycerin (Säurebildung) Arabinose (Säurebildung) Halotoleranz (NaCl 10%)	+ 111	+ 111	+ +Il	d d d

Entsprechend der Einordnung gemäß »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., 1974« und »Cowan, S. T. und Steel, K. J., Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge. Press, 1974« werden die Stämme B-0667 und B-0668 aufgrund der zuvor beschriebenen taxonomischen Eigenschaften, speziell der grampositiven Kokken, der Katalase- und Oxidasenegativen Eigenschaften, der fermentativen Säurebildung aus S Glucose, ohne Gasbildung aus Zucker (Glucose) dem Genus Pediococcus bzw. dem Genus Streptococcus zugeordnet.

Folgender Vergleich läßt sich anhand des oben genannten Identifikations Manual mit diesen Spezies angeben:

In der Tabelle bedeuten

IP + = mehr als 85% positiv

- = mehr als 85% negativ
d = zwischen den Arten oder Spezies unterschiedlich

Es wird demzufolge der Stamm B-0667 dem Genus Pediococcus oder Streptococcus zuzuordnen sein. Die Eigenschaften des Stammes B-0667 sind, wenn man das zuvor gesinnte »Manual for the Identification of Medical Bacteria« und »J. Gen. Microbiol., 26,185-197 (1961)« zugrunde legt, fast vollständig gleich mit denen von Pediococcus uria-equi, jedoch sind die in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., 1974« beschriebenen Charakteristika etwas verschieden davon. Aus diesem Grand wird der Stamm B-0667 dem Genus Pediococcus zugeordnet und Pediococcus sp. B-0667 benannt.

Der Stamm B-0668 ähnelt eher dem Genus Streptococcus als dem Genus Pediococcus. Der Stamm B-0668 hat, wenn man das »Manual for the Identification of Medical Bacteria« zugrunde legt, Ähnlichkeit mit dem Streptococcus faecium var. durans, für den jedoch in dem »Bergey's Manual« keine taxonomischen Eigenschaften beschrieben sind, so daß eine detaillierte Vergleichsbestimmung nicht möglich ist. Der Stamm B-0668 wird daher als Streptococcus sp. B-0668 bezeichnet.

Die Stämme B-0667 und B-0668 wurden beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technologie, Japan, hinterlegt unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-465 bzw. FERM BP-466.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die Stämme Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, Aerococcus viridans IFO 12219 und Aerococcus viridans IFO 12317 in für die Enzymherstellung üblichen Nährmedien gezüchtet. Man kann die Züchtung auf konventionellen verflüssigten Nährböden oder bedient sich der vorzugsweise für die industrielle Produktion bekannten Submersverfahren.
Man kann übliche Nährmediun für Mikroorganismen verwenden.

Als Kohlenstoffquellen lassen sich assimilierbare Kohlenstoffverbindungen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fruktose, Melasse, Brenztraubensäure oder dergleichen einsetzen. Als Quellen für assimilierbaren Stickstoff können Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat oder dergleichen dienen. Es lassei! sich die verschiedensten anorganischen Salze, wie Phosphat, Carbonat, Sulfat, in Form von Magnesium-, Calcium-, Kalium-, Eisen-, Mangan- und/oder Zinksalzen verwenden.

Die Züchtung kann bei beliebigen Temperaturen innerhalb des das Wachstum der Mikrobakterienzellen und die Produktion von Pyruvatoxidase erlaubenden Temperaturbereichs durchgeführt werden und erfolgt voimgsweise bei 25-37°C. Die Züchtungsdauer hängt von den jeweiligen Bedingungen ab: die Züchtung ist beendet, wenn die Pyruvatoxidase-Produktion im wesentlichen vollständig abgelaufen ist, gewöhnlich nach 18-48 Stunden.

Die Pyruvatoxidase befindet sich in den Zellen der Mikroorganismen.

Zur Abtrennung der Pyruvatoxidase aus den Zellkulturen wird die gezüchtete Zellmasse abfiltriert oder abzentrifugiert, die Zellen werden gesammelt und entweder mechanisch oder enzymatisch, beispielsweise durch Behandlung mit Lysozymen, zerstört. Erforderlichenfalls wird die Pyruvatoxidase durch Zusatz von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und einemTensid (beispielsweise Triton X-100 oder Adecatol SO-120) solubilisiert, um das Enzym abzutrennen. Die so erhaltene Lösung von Pyruvatoxidase wird dann gegebenenfalls konzentriert, und danach wird das Enzym durch Zugabe eines löslichen Salzes, wie beispielsweise Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, durch Aussalzen abgeschieden. Die Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht werden durch Dialyse entfernt. Darüber hinaus werden Verunreinigungen in der Pyruvatoxidase-Lösung vorzugsweise durch Adsorptionschromatografie, Ionenaustauscherchromatografie oder Gelfiltration abgetrennt. Eine so erhaltene Enzymlösung wird anschließend im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, und man gewinnt pulverförmige Pyruvatoxidase. Man kann diese nach für Proteine und Enzyme gebräuchlichen Reinigungsmethoden, beispielsweise durch Adsorptionschromatografie, Ionenaustauscherchromatografie oder Gelfiltration noch weiter reinigen.

Im nachfolgenden sind die physikochemischen Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Pyruvatoxidase beschrieben, und dabei sind folgende Abkürzungen verwendet worden:

Pediococcus sp. B-0667 abgekürzt B-0667

Streptococcus sp. B-0668 abgekürzt B-0668

Aerococcus viridans IFO 12219 abgekürzt IFO 12219

Aerococcus viridans IFO 12317 abgekürzt IFO 12317.

(1) Enzym-Wirkung

Das Enzym katalysiert die oxidative Reaktion von Brenztraubensäure, anorganischem Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid

CH₁COCOOH + Η0Ρ0Γ +O₂- CHjCOOPOr + CO₂ + H₂O₂

(2) pH-Optimum

Es wurde die Wirkung des pH-Wertes aufdie Pyruvatoxidase-Aktivität gemessen. Für die Untersuchung wurden Phosphatpufferlösungen im pH-Bereich 6-8 verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die Absorption bei 565 nm abgetragen. Das Optimum des pH-Wertes lag wie folgt

25

B-0667	pH 6,3-7,5
B-0668	pH 7,5-8,5
IFO 12219	pH 7,0-8,0
IFO 12317	pH 6,8-7,5

Je nach Phosphatkonzentration und Art des Metallions wurde eine geringe Variation beobachtet.

(3) Wärmebeständigkeit

Die Wärmebeständigkeit des Enzyms wurde nach Inkubation in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), der 10 μΜ FAD enthielt, bei 0,40,50,60 und 70⁰C 10 Minuten lang gemäß der Enzymprüfungsmethode untersucht. Die ET—-.v—:—— .U/l ;_n el» I »amno^KnnlioKt Do fin ict auf Aar Λ Kc-7icci» Hio TpmnAratiir iirvrl auf Hat OriHi nut a HtA

L·! gtUllI33^ 311IU 111 1 tg. Λ. Τ V/l ttllJVIIUUIIVIIl. l/Ulli. lot UUI _UVi * mvifb*.***-' —«— .—.. .f*—.—,.—. ...,_ *.—- — —. . —...-_.— U. %.

Aktivität abgetragen. Man erkennt, daß die aus B-0667, IFO 12219 und IFO 12317 gewonnenen Enzyme bei 40⁰C etwas aktiviert und bei mehr als 60⁰C denaturiert sind. Das aus B-0668 gewonnene Enzym ist bei 4O⁰C nicht aktiviert und bei mehr als 60⁰C im wesentlichen denaturiert.

(4) pH-Stabilität

Jeder Enzymlösung (0,1 ml) wurden 0,2 M Phosphatpuffer (0,9 ml) für pH-Werte 6-8 oder 0,2 M Tris-HCl-Puffer (0,9 ml) für pH-Werte 7-9, die je 10 μΜ FAD enthielten, zugegeben, und dann ließ man 10 Minuten lang bei 40⁰C stehen. Es wurden 20 μΐ Enzymlösung abgenommen und die Enzym-Aktivität bestimmt. Wie aus Fig. 3 ersichtlich, sind die aus B-0667, IFO 12219 und IFO 12317 gewonnenen Enzyme bei pH 7 am besten stebü, und das von B-0668 stammende Enzym ist bei einem sauren pH-Wert stabil. In F i g. 3 ist auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die Aktivität abgetragen.

(5) Wirkung verschiedener Substanzen

1) Zur Untersuchung der Wirkung verschiedener Substanzen auf die Enzym-Aktivität wurden 5 mM der unten angegebenen Substanzen dem Untersuchungssystem zugesetzt.

60

65

Zugegebene	Relative	Aktivität (%)	IFO 12219	IFO 12317
Substanz	B-066"7	B-0668	42,0	50,3
Ohne	25,4	72,0	0	0
EDTA	0	0	100	100
MgCI₂	100	100	83,4	78,7
CaCl₂	69,4	75,0	116,2	111,0
MnCl,	!29,1	!02 7	85,0	84,0
CoCl₂	81.3	*8U	23,9	28,8
BaCl₂	20,6	58,8	14,9	22,8
ZnCl₂	16,0	38,2

Man erkennt, daß das Enzym durch EDTA inhibiert und durch Mg⁺^, Ca¹⁴, Mn" und Co⁴' aktiviert wird. 2) Die Wirkung der Eliminierung der folgenden Substanzen aus dem l'nlersuchungssystem auf die Enzym-Aktivität wird nachstehend veranschaulicht.

Eliminierte	Relative	Aktivität (%)	IFÜ 12219	IFO 12317
Substanz	B-0667	B-0668	100	100
Ohne	100	100	0	0
Thiamin-	0	0
pyrophosphat			32,7	41,7
FAD	33,9	100	0	0
Thiaminpyro-	0	0
phosphat und
FAD			0	0
Phosphat	0	0

Im Fall der Eliminierung von Phosphat wurde dabei als Puffersubstanz 0,1 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer verwendet.

Das Ergebnis zeigt, daß das System Thiaminpyrophosphat und FAD als Cofaktor und Phosphat als Substrat erfordert.

Weiterhin wurde der Sauerstoffverbrauch bei der Enzymreaktion durch Sauerstoff-Elektrode gemessen, und der Sauerstoff wurde im Verhältnis zu einer Enzym-Aklivität (Bildung von Wasserstofiperoxid) proportional verbraucht. Die Ergehnisse sind nachfolgend veranschaulicht.

Die Prüfungen wurden wie folgt durchgeführt:

Sauerstoffverbrauch:

Mittels eines handelsüblichen Gerätes zum Messen von gelöstem Sauerstoff; Acetylphosphat:

Gemäß der Methode nach F. Lipmann u. Mitarb. J. Biol. Chem., 134, 463-464 (1940) Wasserstoffperoxid:

Mittels der unter Verwendung von N,N-Dimethylani!in, 4-Aminoantipyrin und Meerrettich-Peroxidase arbeitenden Methode.

Eine Einheit (1 U) der Enzym-Aktivität wurde definiert als diejenige Aktivität, mit der je Minute 1 μΜοΙ Wasserstoffperoxid gebildet wurde.

Beispiel 1

Ein Medium (je 100 ml, pH 7) aus Glucose (1%), Pepton (1%), Hefeextrakt (0,5%), NaCl (0,2%), KH₂PO₄ (0,1%), K₂HPO₄ (0,1%), MgSO₄ (0,05%) und CaCO₃ (0,3%) wurde in einem 500 ml Erlenmeyerkolben 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Es wurde je eine Mediumprobe mit einem Keim von Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, Aerococcus viridans IFO 12219 oder Aerococcus viridans IFO 12317 beimpft und 24 Stunden lang unter Schütteln mit 300 UpM bei 30° gezüchtet. Danach wurden die gezüchteten Zellen zentrifugiert, gesammelt, mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen und erneut zentrifugiert, und die Bakterienzellen wurden gesammelt. Die so erhaltenen Zellen wurden in 10 mM Phosphatpuffer (10 ml, pH 7,0) suspendiert, in dem 0,02% Lysozym und 0,1% an Tensid enthalten waren, und es wurde 60 Minuten lang bei 37° C bebrütet. Die überstehende Flüssigkeit, die durch Zentrifugieren erhalten worden war, und in der sich die Pyruvatoxidase befand, wurde gesammelt. Die Enzym-Aktivität der Flüssigkeit war die folgende:

	SauerstofTverb rauch	Reaktionsprodukt	(μΜοΙ/Min.)
	(μΜοΙ/Min.)	H₂O₂	Acetylphosphat
B-0667	0,042	0,042	0,038
B-0668	0,022	0,0213	0,020
IFO 12219	0,040	0,038	0,037
IFO 12317	0,035	Λ Λ1Χ	0,034

Spezies Enzym-Aktivität (U/ml)

B-0667 0,60

B-0668 0,38

IFO 12219 0,52

IFO 12317 0,46

Beispiel 2

Es wurde ein aus den gleichen Bestandteilen wie in Beispiel 1 beschrieben bestehendes Medium (20 1) in einem 30 1 Rüttel-Fermenter mit Dampf sterilisiert. Die in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrisben gezüchtete Kuiturbrühe (200 ml) von Pediococcus sp. B-0667 wurde in diesen Rüttel-Fermenter übergeführt und darin 24 Stunden lang bei 30⁰C gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden abzentrifugiert und gesammelt (etwa 100g)undindieLysozym-Lösung(0,2 mg/ml,4 1) suspendiert. Es wurde ein Tensid (4 g), EDTA (3 g)und 1 M Phosphatpuffer (pH 6,5,40 ml) hinzugegeben und 60 Minuten lang bei 37° C gerührt. Zu der überstehenden Flüssigkeit, rlie. nach Abzentrifugieren erhalten worden war. wurde Ammoniumsulfat gegeben, und das bei 0,54-0,73 Sättigung gebildete Präzipitat wurde abzentrifugiert und gesammelt. Das Präzipitat wurde gelöst in 10 mM Phoüi batpuffer (pH 6,5,1000 ml) (5 !60 U, Rückgewinnung 86%), dann wurde kaltes Aceton (0,65 Volumen) hinzugefügt und das Verunreinigungen noch enthaltende Präzipitat wurde abgetrennt. Es wurde erneut Aceton (0,3 Volumen) zugesetzt, und das durch Abzentrifugieren gesammelte Präzipitat wurde gelöst in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5, 70 ml) (4750 U, Rückgewinnung 79,2%).

Der Lösung wurde Ammoniumsulfat zugesetzt und die bei 0,54-0,70 Sättigung gewonnene Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gesammelt.

Die Ausfällung wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gelöst, und die Lösung wurde einer mit Ionenaustauscherharz gefüllten Säule (6,0 x 70 cm) aufgegeben. Es wurden die Fraktionen gesammelt, die eine Absorption bei 280 nra zeigten. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben und gefriergetrocknet, und es wurde puiverförmige Pyruvatoxidase (J940 U, 758 mg, Rückgewinnung 65,7%) erhalten.

Die Parameter in den grafischen Darstellungen der Fig. 1 bis 3 sind die folgenden:

In den Fig. 1 und 2 bedeuten

O-O
Δ-Δ

Pediococcus sp. B-0667

Streptococcus sp. B-0668 Aerococcus viridans IFO 12219

Aerococcus viridans IFO 12317

C-D
In Fig. 3 bedeuten

O - O : Pediococcus sp. B-0667 (Phosphatpuffer)

• - · : Pediococcus sp. B-0667 (Tris-HC'-Puffer)
D - D : Streptococcus sp. B-0668 (Phosphatpuffer)
■ - ■ : Streptococcus sp. B-0668 (Tris-HCl-Puffer)

Δ - Δ : Aerococcus viridans IFO 12219 (Phosphatpuffer)

▲ - ▲ : Aerococcus viridans IFO 12219 (Tris-HCl-Puffer)

£?-■&: Aerococcus viridans IFO 12317 (Phosphatpuffer)

* -* : Aerococcus viridans IFC 12317 (Tris-HCl-Puffer)

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung einer Pyruvatoxidase für ein Reagenz für analytische Zwecke durch Züchten eines Mikroorganismus und Isolieren der Pyruvatoxidase aus den gezüchteten Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aerococcus viridans IFO 12219, Aerococcus viridans IFO 12317, Pediococcus sp. FERM BP-465 oder Streptococcus sp. FERM BP-466 züchtet .

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Pyruvatoxidase.

Pyruvatoxidase ist ein schon bekanntes Enzym, das die Umsetzung von Brenztraubensäure in Anwesenheit von Phosphat und Sauerstoff zu Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert und das aus einer Spezies von Lactobacillus delbrücki gewonnen werden konnte.

Es wurde nun gefunden, daß ein Enzym Pyruvatoxidase produziert wird von einem Stamm, der zum Genus Pediococcus gehört und hinterlegt ist beim FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-465 und von einem Stamm, der zum Genus Streptococcus gehört und hinterlegt ist beim FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-466, isoliert aus einer Bodenprobe, die an dem Rettichfeld in Ohito-cho, Tagatagun, Shizuoka-ken, Japan, gesammelt wurde, sowie aus den Bakterienstämmen IFO12219 und IFO 12317, die zum Genus Aerococcus gehörec

Ge-gen-stad der vorliegenden Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung einer Pyruvatoxidase durch Züchten eines Mikroorganismus und Isolieren der Pyruvatoxidase aus den gezüchteten Zellen, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Aerococcus viridans IFO 12219, Aerococcus viridans IFO 12317, Pediococcus sp. FERM BP-465 oder Streptococcus sp. FERM BP-466 züchtet. Die erfindungsgemäß gewonnene Pyruvatoxidase ist brauchbar als Reagenz für analytische Zwecke; sie ist insbesondere für diagnostische Analysen gut geeignet.

Für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbare Organismenstämme Efdiococcus sp. B-0667 (= FERM BP-465) und Streptococcus sp. B-0668 (= FERM BP-466) haben die folgenden taxonomischen Eigenschaften.

In der Zeichnung zeigt

Fig. 1 in grafischer Darstellung das Optimum des pH-Wertes für Pyruvatoxidase,

Fig. 2 in p.rafischer Darstellung die Wärmestabilität von Pyruvatoxidase, und

Fig. 3 in grafischer Darstellung die pH-Stabilität von Pyruvatoxidase.