DE2833741C2

DE2833741C2 -

Info

Publication number: DE2833741C2
Application number: DE2833741A
Authority: DE
Inventors: Glen Marshall Webster N.Y. Us Dappen
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1977-08-01
Filing date: 1978-08-01
Publication date: 1988-01-14
Also published as: CA1114723A; GB2001758B; US4098574A; FR2399662A1; DE2833741A1; GB2001758A; FR2399662B1; JPS5426793A; JPS5728277B2

Description

Die Erfindung betrifft ein einstückiges Mehrschichtelement zur Bestimmung von Glucose in wäßrigen Flüssigkeiten mit einer Ausbreitschicht und einer Reagensschicht, die sich unter Gebrauchsbedingungen mit der Ausbreitschicht in fluidem Kontakt befindet, wobei die Reagensschicht als Glucosebestimmungs-Reagenszusammensetzung eine Reagenszusammensetzung aus Glucoseoxidase, Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und 7-Hydroxy-1-naphthol enthält.

Die von Trinder entwickelte Glucoseoxidasemethode zur Bestimmung von Glucose in flüssigen Medien und die hierzu benötigten Reagenzien werden ausführlich in Ann. Clin. Biochem. 6 (1969) 24 und J. Clin. Pathol. 22 (1969) 246 beschrieben. Die Methode beruht auf der folgenden Reaktionsfolge:

Glucose + Glucoseoxidase + O₂ → Gluconsäure + H₂O₂
H₂O₂ + Peroxidase + Sauerstoffacceptor → H₂O + farbiger Acceptor,

wobei das Verdienst von Trinder darin besteht, als Sauerstoffacceptor 4-Aminoantripyrin in Verbindung mit Phenol vorgeschlagen zu haben.

Üblicherweise erfolgt die Bestimmung von Glucose unter Verwendung von Trinder'schem Reagens bei einem pH von 7,0 oder höher.

Werden Blut- oder Blutserumproben über längere Zeit, d. h. bis zu 10 Tage lang, aufbewahrt, so verwendet man Natriumfluorid als Konservierungsmittel (Henry, Clinical Chemistry, 2. Auflage, Seite 385). Dieses Konservierungsmittel wird routinemäßig in einer Menge von 250 mg/dl Blut oder Blutserum verwendet. Es hat sich jedoch gezeigt, daß der Zusatz von 250 mg/dl Natriumfluorid zum Blutserum zu einer Abnahme der augenscheinlichen Glucosekonzentration führt, wenn man diese unter Verwendung von Mehrschichtelementen der in der US-Patentschrift 39 92 158 beschriebenen Art mißt. Bei einer Konzentration von 200 mg Glucose/dl beträgt die Abnahme 20 bis 30 mg/dl. Dieses Problem wird durch zwei weitere Faktoren, die ebenfalls von Bedeutung sind, vergrößert: 1) Das Konservierungsmittel wird nicht immer verwendet und 2) wenn das Konservierungsmittel in üblichen Blutentnahmevorrichtungen eingesetzt wird, ist die Konzentration an Konservierungsmittel nur dann bekannt, wenn der Behälter vollständig aufgefüllt ist. Da die Behälter häufig nicht vollständig gefüllt sind (aufgrund von Vakuumverlusten), kann die Natriumfluoridkonzentration bis auf das 2- bis 3fache der Menge von 250 mg/dl ansteigen.

Die für den genannten Zweck eingesetzten Fluoridionenkonzentrationen führen offensichtlich nicht zu merklichen Störungen bei den Methoden des Standes der Technik zur Analyse des Glucosegehalts. Dies beruht vermutlich auf den Verdünnungstechniken, die üblicherweise bei den in Lösung durchgeführten quantitativen Tests des Standes der Technik angewandt werden, sowie auf dem halbquantitativen Charakter der "trockenen" Methoden zum Nachweis von Glucose nach dem Stand der Technik. Es hat sich jedoch gezeigt, daß bei der Verwendung eines Trinder'schen Reagenssystems in einem Mehrschichtelement des in der US-PS 39 92 158 beschriebenen Typs, die als Konservierungsmittel verwendeten Fluoridionen zu einer beträchtlichen negativen Abweichung, also einem systematischen Fehler, führen.

Aus der US-PS 39 92 158 sind einstückige Mehrschichtelemente zum Nachweis verschiedener biologischer Materialien, einschließlich Glucose, bekannt.

In Beispiel 3 der US-PS 39 92 158 wird ein Element zum Nachweis von Glucose unter Verwendung von Glucoseoxidase, Peroxidase und eines Indikatorsystems beschrieben. Dieses Element entspricht vom Aufbau her einem erfindungsgemäßen Element. Jedoch findet sich dort für die Reagensschicht keine pH-Wertangabe. Eine nach diesem Beispiel hergestellte Schicht würde einen pH oberhalb ungefähr 7,0 aufweisen.

In Beispiel 3 der US-PS 39 83 005 wird die Verwendung von 4-Aminoantipyrin und eines Naphtholkupplers beschrieben, um Wasserstoffperoxid nachzuweisen, das in einem Element der hier beschriebenen Art beim Kontakt mit Cholesterinoxidase gebildet wird. Nach diesem Beispiel wird die Indikatorreaktion bei einem pH-Wert von 7,0 durchgeführt.

Aus der US-PS 38 86 045 ist ferner eine Reagenszusammensetzung für einen Glucosetest bekannt, die aus Glucoseoxidase, Peroxidase, Natrium- oder Kaliumhexacyanoferrat-II, einem Aminoantipyrin und einem phenolischen Kuppler, besteht. Es wird angegeben, daß derartige Zusammensetzungen, die stets das Hexacyanoferrat-II enthalten, geeignet sind, wenn sie auf einen pH-Wert zwischen ungefähr 5,5 und 8,0 abgepuffert sind. Es findet sich keine Offenbarung dergestalt, daß Zusammensetzungen ohne das Hexacyanoferrat-II in diesem pH-Bereich brauchbar sein könnten.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einstückiges Mehrschichtelement des eingangs beschriebenen Typs anzugeben, bei dessen Verwendung die beschriebenen, durch Fluoridionen hervorgerufenen Störungen ausgeschaltet oder zumindest weitestgehend vermieden werden können.

Es wurde gefunden, daß die beschriebene Störung der mit einstückigen Mehrschichtelementen nach der US-PS 39 92 158 durchgeführten Glucoseanalysen durch Fluoridionen dadurch vermindert oder vermieden werden kann, wenn das Element einen Puffer enthält, der unter Gebrauchsbedingungen den pH der Reagenszusammensetzung zwischen 4,5 und 6,0 hält. Obgleich der Mechanismus der Verminderung oder Vermeidung der Störung durch Fluoridionen bei diesem pH noch nicht vollständig erklärbar ist, ergibt die Durchführung der Testreaktionen in diesem pH-Bereich die gewünschte Verminderung oder Vermeidung der Störung. Als Beispiele für engere erfindungsgemäß geeignete pH-Bereiche sind Bereiche von 4,8 bis 5,8, und insbesondere von 5,0 bis 5,6, zu nennen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein einstückiges Mehrschichtelement zur Bestimmung von Glucose, wie es in den Ansprüchen gekennzeichnet ist.

Mehrschichtelemente des in der US-PS 39 92 158 beschriebenen Typs entsprechen vom Aufbau her den Mehrschichtelementen gemäß der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Einzelheiten zur Herstellung derartiger Elemente lassen sich der Druckschrift ohne weiteres entnehmen.

Glucoseoxidase, die Quellen, aus denen es gewonnen wird, und seine Herstellung sind bekannt, so daß eine weitere Erörterung nicht erforderlich ist.

Bei dem 4-Aminoantipyrin, das oftmals auch als Aminophenazon bezeichnet wird, handelt es sich um einen Sauerstoffacceptor, der in oxidiertem Zustand mit 7-Hydroxy-1-naphthol kuppelt. In dem erfindungsgemäßen Mehrschichtelement liegt das 4-Aminoantipyrin im allgemeinen in Form eines Säuresalzes, beispielsweise in Form des Hydrochloridsalzes, vor. Eine Diskussion des 4-Aminoantipyrins ist in der US-PS 38 86 045 enthalten.

Das als Kuppler verwendete 7-Hydroxy-1-naphthol besitzt eine außergewöhnliche Stabilität und Reaktivität und ergibt einen Indikatorfarbstoff, der bei einer Wellenlänge absorbiert, die für spektrophotometrische Messungen der angegebenen Art besonders günstig ist.

Um für die durchzuführende Reaktion einen geeigneten pH zu schaffen, muß in der Reagensmischung ein geeigneter Puffer enthalten sein. Jeder Puffer ist zur Durchführung der erfindungsgemäßen Lehre brauchbar, wenn er drei Voraussetzungen erfüllt: (1) Er puffert bei einem pH zwischen ungefähr 4,5 und 6,0; (2) er ist mit der Reagenszusammensetzung verträglich und (3) er ist zum Einarbeiten in die hier beschriebenen Elemente nach den in der US-PS 39 92 158 beschriebenen Methoden geeignet. Derartige Puffer werden in Biochemistry 5, 467 (1966) beschrieben. Zu Puffern, die sich als besonders geeignet erwiesen haben, gehören Dimethylglutarsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, saures Kaliumphthalat und gemischte Phosphat-Citratpuffer.

Besonders bevorzugt ist die 3,3-Dimethylglutarsäure.

Der hier verwendete Begriff "einstückiges Element" betrifft Elemente mit mindestens zwei übereinander angeordneten, vorzugsweise getrennten Schichten, die sich miteinander in engem Kontakt befinden. Vorzugsweise werden derartige Elemente zusammengesetzt, bevor eine flüssige Probe zur Analyse aufgebracht wird. Ihre Anwendung erfordert keine besondere Erfahrung. Mit ihrer Hilfe lassen sich quantitative analytische Ergebnisse erzielen, ohne daß spezielle Spotting-Methoden oder andere Prozeduren, wie beispielsweise Eingrenzung der Probe, Abwaschen oder Entfernen von Probenüberschuß, erforderlich wären, die oftmals bei Analysen unter Verwendung bekannter Elemente erforderlich sind. Ferner sind die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Elemente erzielten Ergebnisse praktisch gleichbleibend und frei von inneren Abweichungen, so daß man automatisierte Einrichtungen zur Messung der elektromagnetischen Strahlung (radiometrische Techniken) einsetzen kann, um die erhaltenen Ergebnisse bei minimalen Abweichungen zu messen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Mehrschichtelement eine Probenausbreit- oder Verteilungsschicht auf, die sich in fluidem Kontakt mit einer Reagensschicht befindet. Die Probenausbreitschicht ist zur Verteilung der in einer flüssigen Probe, welche auf das Element aufgebracht wurde, enthaltenen Glucose in der Schicht befähigt. Hierdurch wird zu jeder Zeit eine gleichmäßige Glucosekonzentration an derjenigen Oberfläche der Ausbreitschicht geschaffen, die an die Reagensschicht angrenzt. Bei verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Ausbreitschicht isotrop porös. Dies bedeutet, daß sie innerhalb der Schicht in jeder Richtung porös ist. Wenn hier von isotroper Porosität gesprochen wird, so ist damit die Erscheinung einer nennenswerten Porosität in allen Richtungen in der Ausbreitschicht gemeint. Das Ausmaß dieser Porosität kann selbstverständlich verschieden sein, und zwar beispielsweise hinsichtlich Porengröße, prozentualem Hohlvolumen, oder in anderer Hinsicht. Der Begriff "isotrope Porosität" (oder "isotrop porös") sollte, so wie er hier verwendet wird, nicht mit den Begriffen "isoporös" oder "ionotrop" verwechselt werden, die häufig in Verbindung mit Filtermembranen gebraucht werden, um Membranen zu bezeichnen, deren Poren zwischen den Membranoberflächen durchgängig sind. In gleicher Weise sollte der Begriff "isotrope Porosität" nicht mit dem Begriff "isotrop" verwechselt werden, der als Gegensatz zum Begriff "anisotrop" gebraucht wird, wobei hiermit Filtermembranen bezeichnet werden, die entlang mindestens einer Membranoberfläche eine dünne "Haut" aufweisen.

Die Reagensschicht ist eine Schicht unter der Ausbreitschicht und enthält die Reagenszusammensetzung, nämlich Glucoseoxidase, Peroxidase, 4-Aminoantipyrin, 7-Hydroxy-1-naphthol und einen Puffer, um den pH der Schicht zwischen ungefähr 4,5 und 6,0 zu halten, wenn sie mit einer Testprobe in Berührung gebracht wird. Vorzugsweise besitzt die Reagensschicht eine im wesentlichen gleichmäßige Permeabilität für die Glucose, die in der wäßrigen Flüssigkeit enthalten ist, welche auf die Ausbreitschicht aufgebracht wird. Eine gleichmäßige Permeabilität der Schicht ist eine Permeabilität derart, daß beim gleichmäßigen Aufbringen einer homogenen Glucoselösung auf eine Oberfläche der Schicht identische Messungen der Glucosekonzentration in der Lösung in der Schicht, die jedoch in verschiedenen Bereichen einer Oberfläche der Schicht durchgeführt werden, praktisch gleiche Ergebnisse liefern.

Der hier verwendete Begriff eines fluiden Kontakts zwischen der Ausbreitschicht und der Reagensschicht bei einem einstückigen Mehrschichtelement bezeichnet die Fähigkeit eines Fluids, sei es flüssig oder gasförmig, in ein derartiges Element zwischen übereinander gelagerte Bereiche der Ausbreitschicht und der Reagensschicht einzudringen. Mit anderen Worten bedeutet fluider Kontakt die Fähigkeit, Komponenten eines Fluids zwischen den in fluidem Kontakt befindlichen Schichten zu transportieren. Obgleich solche in fluidem Kontakt befindliche Schichten aneinander angrenzend sein können, können sie auch durch Zwischenschichten voneinander getrennt sein. Soweit jedoch Schichten im Element in physikalischer Hinsicht zwischen die in gegenseitigem fluidem Kontakt befindliche Ausbreit- und Reagensschicht treten, befinden sie sich ebenfalls in fluidem Kontakt und hindern nicht den Durchgang von Fluid zwischen der mit Fluid in Kontakt befindlichen Ausbreitschicht und der Reagensschicht.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiele 1 bis 4 Verringerte Störung durch Fluorid bei niedrigerem pH

Evakuierte Blutbehälter, die entweder Natriumfluorid/Oxalat oder Natriumfluorid/ÄDTA als Konservierungsmittel enthielten, wurden teilweise oder vollständig mit Blutproben gefüllt. Auf diese Weise variierte die tatsächliche Konzentration an Fluoridionen in jeder Probe. Wurde der Behälter vollständig mit einer Blutprobe gefüllt (d. h. mit 7 ccm), betrug die Menge an F^- 250 mg/dl, bei halber Füllung lag sie bei 500 mg/dl. Der Glucosegehalt einer jeden Probe wurde durch Verschneiden auf ungefähr 350 mg/dl gebracht. Dann wurden die Proben (in 10 µl aliquoten Anteilen) auf Testelemente mit der folgenden Zusammensetzung, die nach den in der US-PS 39 92 158 beschriebenen Methoden hergestellt wurden, aufgetüpfelt.

Polyäthylenterephthalatträger wurden mit Reagensschichten, die entionisierte Gelatine (21,5 g/m²), Peroxidase (10.000 U/m²), Glucoseoxidase (24.400 U/m²), 4-Aminoantipyrin-HCl (0,86 g/m²), 7-Hydroxy-1-naphthol (0,66 g/m²) und 3,3-Dimethylglutarsäure (1,96 g/m²) enthielten, beschichtet, (wie in Tabelle 1 dargestellt, war der pH-Wert bei jedem Element verschieden). Dann wurde eine Zwischenschicht aus Poly-n-isopropylacrylamid und eine Ausbreitschicht aus Celluloseacetat (6,6 g/m²) und TiO₂ (46 g/m²) aufgebracht.

Nach 7 Minuten bei 37°C wurden die hervorgerufenen Reflexionsschichten gemessen. Für jedes Element wurde eine Kalibrierungskurve von Reflexionsdichte zu Glucosekonzentration aufgestellt. Die erhaltenen Reflexionsdichten wurden dann in die abgeleiteten Kalibrierungskurven eingesetzt und es wurden die erhaltenen augenscheinlichen Glucosekonzentrationen ermittelt. Der Unterschied zwischen der Glucosekonzentration der Kalibrierungskurven und der Glucosekonzentration, die nach einer üblichen Vergleichsmethode bestimmt wurde, ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Untersuchung der Störung durch Fluoridionen bei verschiedenen pH-Werten

Beispiel 5 Einfluß des pH und der Störung durch Fluoridionen auf die Entwicklungsgeschwindigkeit

Es wurden Elemente, die auf dieselbe Weise wie in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben hergestellt worden waren, und deren pH ebenfalls variierte (5,0 und 7,0) auf die in den Beispielen 1 bis 4 beschriebene Weise untersucht. Verwendet wurde ein Serum, das keine Fluoridionen enthielt, Plasma, das 2,5 mg/dl Fluorid/ÄDTA enthielt, sowie Plasma, das ungefähr 5,0 mg/dl Fluorid/ÄDTA enthielt.

Die Geschwindigkeiten der Farbstoffentwicklung (D _R ) bezogen auf die Zeit ist für die Elemente in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Die Geschwindigkeit bei einer jeden Probe erwies sich bei einem pH-Wert von 7,0 als wesentlich geringer, während sie sich bei einem pH-Wert von 5,0 nur in den Anfangsstadien der Farbstoffentwicklung unterschied.

Beispiele 6 bis 11 Einfluß des pH des Serums auf das Ansprechen des Elements

Es wurde wie in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben, eine Reihe von Elementen hergestellt, wobei man jedoch drei verschiedene Puffersysteme verwendete: Dimethylglutarat (1,96 g/m²), Bernsteinsäure (1,40 g/m²) oder Apfelsäure (1,58 g/m²) (der pH ist in Tabelle 2 angegeben).

Es wurden ferner jeweils zwei Serumproben mit 100 mg/dl bzw. 400 mg/dl Glucose auf einen pH von 7,7 bzw. 8,6 eingestellt. Dann wurden die Proben auf die Testelemente getüpfelt und wie in Beispiel 1 beschrieben ausgewertet. Die in Tabelle 2 aufgezeigten Ergebnisse zeigen, daß die auf die genannte Weise hergestellten Elemente eine ausreichende Pufferkapazität besaßen und daher Schwankungen vertragen, die im Serum-pH auftreten können.

Tabelle 2

Einfluß des Serum-pH auf das Ansprechen der Testelemente

Claims

1. Einstückiges Mehrschichtelement zur Bestimmung von Glucose in wäßrigen Flüssigkeiten mit einer Ausbreitschicht und einer Reagensschicht, die sich unter Gebrauchsbedingungen mit der Ausbreitschicht in fluidem Kontakt befindet, wobei die Reagensschicht als Glucosebestimmungs-Reagenszusammensetzung eine Reagenszusammensetzung aus Glucoseoxidase, Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und 7-Hydroxy-1-naphthol enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Puffer enthält, der unter Gebrauchsbedingungen den pH der Reagenszusammensetzung zwischen 4,5 und 6,0 hält.

2. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Puffer um Dimethylglutarsäure, Bernsteinsäure, saures Kaliumphthalat, Apfelsäure und gemischten Phosphat-Citratpuffer, handelt.