DE2831580B1

DE2831580B1 - Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin

Info

Publication number: DE2831580B1
Application number: DE2831580A
Authority: DE
Inventors: Siegfried Dr Rer Nat Looser; Hans Moellering
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1978-07-18
Filing date: 1978-07-18
Publication date: 1980-01-24
Also published as: US4273870A; JPS5638199B2; EP0007058A1; EP0007058B1; DE2961682D1; DE2831580C2; AT362533B; ATA440179A; JPS5519095A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagens zur Bestimmung von Glycerin.

Bekannt ist ein Verfahren zur Bestimmung von Glycerin mit Glycerindehydrogenase, Diaphorase als Elektronenüberträger, Nicotinamid-adenosin-dinucleotid (NAD) und Tetrazoliumsalz. Dabei wird ein Farbstoff gebildet, der sich je nach dem verwendeten Tetrazoliumsalz im sichtbaren oder im ultravioletten Licht leicht bestimmen läßt.

Ein Nachteil dieses Tests ist ein verzögertes Anlaufen der Reaktion. Dies ist auf die Glycerindehydrogenase zurückzuführen, die längere Zeit braucht, bis sie ihre maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht. Außerdem zeigt es sich, daß auch bei Verwendung des gleichen Ausgangsmaterials für die Gewinnung der Glycerindehydrogenase diese hinsichtlich ihrer Reaktionsgeschwindigkeit noch erheblichen Schwankungen unterliegt. Bei der Standardisierung dieses Tests muß daher aus Sicherheitsgründen eine relativ lange Meßdauer vorgeschrieben werden, um sicherzugehen, daß die maximale Reaktionsgeschwindigkeit auch erreicht wird. Aufgabe der Erfindung ist es, diesen Nachteil zu beseitigen.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Glycerin mit Glycerindehydrogenase, einen Elektronenüberträger, NAD und Tetrazoliumsalz, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man wenigstens 1 μg Zink in Form eines Zinksalzes je 50 U Glycerindehydrogenase zusetzt.

Der Erfindung liegt die überraschende Feststellung zugrunde, daß Zinkionen in ganz bestimmten Konzentrationen die Glycerindehydrogenase derart zu aktivieren vermögen, daß ihre maximale Reaktionsgeschwindigkeit sehr rasch erreicht wird. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit selbst wird nicht verändert. Der erfindungsgemäße Befund ist überraschend, da es aus J. Biol. Chem. 235, Nr. 6, 1820 (1960) bekannt war, daß Zinkionen die Glycerindehydrogenase inhibieren.

So wurde für eine Zinkkonzentration von 2,IxIO-⁵M bereits eine 50%ige Inhibierung beschrieben.

Als Zinksalz wird vorzugsweise ZnCb verwendet. Es lassen sich jedoch andere Zinksalze, die gut wasserlöslich sind und deren Anion keinen schädlichen Einfluß auf die Reaktion ausübt, in gleicher Weise verwenden. Typische Beispiele für andere geeignete Zinksalze sind Zinksulfat, Zinkacetat, und ähnliche.

Die besten Ergebnisse erhält man bei einer Konzentration zwischen 0,01 und I₁OmMoI/! Zinksalz im Testansatz. Bei Überschreiten dieser oberen Konzentrationsgrenze tritt zwar immer noch die Aktivierung ein, es macht sich jedoch zunehmend eine Proteindenaturierung und damit Auftreten einer Trübung bemerkbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl zur Bestimmung von Glycerin in biologischen Flüssigkeiten oder anderem Material als auch zum Einsatz im Rahmen von Bestimmungen von Glycerinderivaten, in deren Verlauf Glycerin freigesetzt wird. Insbesondere ist das Verfahren wichtig für die Bestimmung von Triglyceriden, wobei die Triglyceridverseifung vorzugsweise enzymatisch erfolgt, aber auch alkalisch durchgeführt werden kann. Ein anderes Beispiel für eine kombinierte Bestimmung, in deren Rahmen das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden kann, ist die Fhospholipidbestimmung.

Weitere Einsatzmöglichkeiten für das Verfahren sind die Bestimmung von Glycerinäthern und Glycerinestern, z. B. Apfelsäureglycerinester und Zitronensäureglycerinester, die als Geschmacks- und Geruchssubstanzen Verwendung finden; weiterhin Glycerindiester und Glycerintriester, die in Form von Acetin (Glycerintriacetat) und Butyrin (Glycerintributyrat) ebenfalls als Geruchsstoffe Verwendung finden.

Die genannte Umsetzung beruht auf folgende Reaktionsgleichungen:

Glycerin-DH

1. Glycerin + NAD⁺ > Dihydroxyaceton + NADH+ H ⁺

Diaphorase

2. NADH + H⁺ + Tetrazoliumsalz > Formazan (gefärbt) + NAD ⁺

Als Elektronenüberträger wird Diaphorase bevorzugt. Beispiele für andere geeignete Elektronenüberträger sind

Phenazinmethosulf at (PMS),
8-Dimethylamino-2,3-benzophenoxazin
(Meldolablau) und

l-Methoxy-5-methyIphenazinium-methylsulfat.

Andere Elektronenüberträger für Tetrazoliumsalze sind dem Fachmann bekannt.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich zahlreiche Tetrazoliumsalze verwenden. Diese sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier

ORIGINAL INSPECTED

nicht weiter beschrieben zu werden. Typische Beispiele für geeignete Tetrazoliumsalze sind

Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT),
3-(4',5'-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,4-diphenyl-

tetrazoliumbromid (MTT),
2-(p-Jodophenyl)-3-(p-nitrophenyI)-5-phenyl-

tetrazoliumchlorid (INT),
2,2',5,5'-Tetra-(p-nitrophenyl)-3,3'-(3-di-

methoxy-4-diphenylen)-ditetrazoIium-Chlorid (TNBT),

2,3,5-TriphenyltetrazoliumchIorid (TT) und
Neotetrazoliumchlorid (NT).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein r> Reagens zur Bestimmung von Glycerin auf Basis von Glycerindehydrogenase, einem Elektronenüberträger, NAD, Tetrazoliumsalz und Puffer, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es wenigstens 1 μg Zink in Form eines Zinksalzes je 50 U Glycerindehydrogenase ent- >» hält.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein derartiges Reagens

5 bis 20 U/ml Glycerindehydrogenase, 2 '->

0,2 bis 1,5 U/ml Diaphorase,

0,5 bis 5 mMol/1 NAD,

0,1 bis 0,5 mMol/1 Tetrazoliumsalz,

0,05 bis 0,2 Mol/l Puffer, pH 7,5 bis 9,0,

0 bis 0,5% Detergenz und a>

0,01 bis 1,0 mMol/1 Zinksalz.

Das obige Reagens kann in Form einer fertigen wäßrigen Lösung oder in Form einer trockenen Vormischung vorliegen, die zum Auflösen in Wasser j-, bzw. Pufferlösung bestimmt ist und dann die obigen Konzentrationen ergibt. Außer den aufgeführten Substanzen kann das Reagens zusätzlich noch Stabilisatoren, wie Ammoniumsulfat, Cholsäure und ähnliche Zusätze, die dem Fachmann bekannt sind, enthalten. Als Puffer wird Glycylglycinpuffer bevorzugt, besonders bevorzugt ist 0,1 molarer Glycylglycin-puffer, pH 8,0 bis 8,2. Die Diaphorase kann durch eine entsprechende Menge eines anderen Elektronenüberträgers ersetzt werden. ₄-,

Bei Verwendung von Nitroblau-tetrazoliumchlorid (NBT) als Tetrazoliumsalz erfolgt die Messung zweckmäßig bei 546 nm.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielte Verkürzung der für die Glycerinbestimmung erforderlichen Zeit geht aus der Zeichnung hervor. Sie zeigt den Reaktionsverlauf, dargestellt in gemessener Extinktion bei 546 nm gegen die Zeit aufgetragen. Die Kurven 1,2 und 3 geben den Reaktionsverlauf ohne Zinkzusatz wieder, die Kurven 4, 5 und 6 den Reaktionsverlauf bei Zusatz von 10" Mol/l ZnCl₂.

Die Testbedingungen waren wie folgt:

0,1 Mol/l Glycylglycin-puffer, pH 8,1,
1,0 mMol/1 Natriumcholat,
0,1% Detergenz,
0,12 mMol/1 NBT,

1,5 mMol/1 NAD,

200U/1 Diaphorase,

5000 U/l Glycerindehydrogenase.

Der Start der Reaktion erfolgte nach 2 Minuten durch den Zusatz der Glycerindehydrogenase. Man erkennt, daß die maximale und konstante Reaktionsgeschwindig keit nach 4 bis 5 Minuten erreicht wird, während ohne den Zinkzusatz erst nach etwa 14 Minuten konstante Werte erreicht werden. Durch die Erfindung wird daher die erforderliche Reaktionszeit auf etwa '/3 gesenkt, was insbesondere beim Einsatz auf Analysenautomaten einer Verdreifachung der Analysenkapazität gleichkommt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Kombinierte Bestimmung der Triglyceride durch
Spaltung und Messung des freigesetzten Glycerins

Es wird ein Reagens folgender Zusammensetzung

verwendet:

Glycylglycin	0,1 Mol/l
pH	8,1
Ammonsulfat	100 mMol/1
Cholsäure	1,0 mMol/1
Zinkchlorid	0,1 mMol/1
Detergenz	0,1%
NAD	1,5 mMol/1
Tetrazoliumsalz	0,12 mMol/1
Lipase	1,0 U/ml
Glycerindehydro
genase	15 U/ml
Diaphorase	0,5 U/ml

Die Durchführung der Bestimmung geschieht wie

folgt:

In Reagenzgläser pipettieren:

Leerwert

Standard

Probe

Reagenslösung

Standard

Serum

2,0 ml

2,0 ml 0,02 ml

2,0 ml

0,02 ml

mischen, 15 Minuten bei 20 bis 25° C inkubieren. Danach innerhalb weiterer 15 Minuten Extinktion der Probe und Extinktion des Standes gegen Leerwert messen. Inkubationstemperatur: 20 bis 25° C; Meflwellenlänge : Hg 546 nm.

Die Berechnung des Ergebnisses erfolgt nach folgender Formel:

IE,,

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Glycerin mit Glycerindehydrogenase, Elektronenüberträger, NAD und Tetrazoliumsalz, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens 1 μg Zink in Form eines Zinksalzes je 50 U Glycerindehydrogenase zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zinksalz ZnCl₂ verwendet.

3. Reagens zur Bestimmung von Glycerin auf Basis von Glycerindehydrogenase, Elektronenüberträger, NAD, Tetrazoliumsalz und Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens 1 μg Zink in Form eines Zinksalzes je 50 U Glycerindehydrogenase enthält.

4. Reagens nach Anspruch 3, enthaltend
5 bis 20 U/ml Glycerindehydrogenase,
0,2 bis 1,5 U/ml Diaphorase,
0,5bis5mMol/lNAD,

0,1 bis 0,5 mMoI/1 Tetrazoliumsalz,
0,05 bis 0,2 Mol/l Puffer, pH 7,5 bis 9,5,
0 bis 0,5% Detergenz und
0,01 bis 1,0 mMol/1 Zinksalz.