DE2823916C2

DE2823916C2 -

Info

Publication number: DE2823916C2
Application number: DE2823916A
Authority: DE
Inventors: Seppo Zolder Be Kolehmainen; Veikko Wylre Nl Tarkkanen
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: LUMAC INTERNATIONAL N.V., WILLEMSTAD, CURACAO, NL
Priority date: 1977-05-31
Filing date: 1978-05-31
Publication date: 1990-12-06
Also published as: CA1125152A; SE448100B; US4303752A; DE2823916A1; JPS624120B2; FR2401423A1; SE7806164L; FR2401423B1; GB1604249A; JPS5991900A

Description

Die Erfindung betrifft die Bestimmung der ATP-Konzentration in Mikrobenzellen, die in einer aus einer Mischung aus Soma- und Mikrobenzellen bestehenden Probe enthalten sind.

Die Bestimmung von lebensfähigen (lebenden) Mikroben- und Soma-Zellen (Nicht-Mikroben-Zellen) ist in medizinischen Laboratorien, in der Veterinärwissenschaft, in der Nahrungsmittelhygiene, in der Fermentationsindustrie und bei Umweltuntersuchungen von großer Bedeutung. Bakterien, Hefen und Pilze werden bestimmt entweder durch Auszählung der Kolonien in einem Wachstumsmedium oder unter Verwendung von Instrumenten, wie z. B. eines Mikroskops, eines Turbidometers, eines Refraktometers und dergleichen.

Bei den konventionellen Verfahren war es bisher schwierig oder zeitraubend, verschiedene Typen von Zellen, wie z. B. Soma-Zellen und Bakterien, in einer beide Zell-Typen enthaltenden Probe selektiv zu bestimmen. Außerdem sind die konventionellen Verfahren, insbesondere in der Mikrobiologie, langsam, da die Ergebnisse erst nach einem oder mehreren Tagen erhalten werden. Die Ergebnisse in klinischen Tests sollten jedoch so schnell wie möglich vorliegen, um den Patienten richtig behandeln zu können, und in der Lebensmittelhygiene ist es ebenfalls wichtig, die bakterielle Verunreinigung von Produkten so schnell wie möglich zu bestimmen, so daß das Verderben von Rohmaterialien und von behandelten Lebensmitteln vermieden werden kann. Deshalb ist man seit langem auf der Suche nach schnellen Alternativverfahren zu der konventionellen Auszählung der Kolonien und der Auszählung von Soma-Zellen.

Die Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Bestimmung von Adenosintriphosphat (ATP) (US-A-37 45 090) ist ein schnelles und empfindliches Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Soma- und Bakterienzellen in einer Probe. Bei diesem Verfahren wird aus der Menge des gemessenen ATP die Anzahl der Zellen berechnet, da der ATP-Gehalt eines spezifischen Zellentyps relativ konstant ist. In entsprechender Weise kann eine andere Biolumineszenz- Bestimmung, z. B. die Photobakterium-Biolumineszenz-Reaktion, zur Bestimmung der Anzahl von lebensfähigen (lebenden) Zellen mit Hilfe von Flavinmononucleotid (FMN) und der reduzierten Form von Nikotinamindinucliotid (NADH) verwendet werden.

Zur Bestimmung der Anzahl von Bakterien in einem Nahrungsmittel und in Körperflüssigkeiten, wie Milch, Urin, Blut, der zentralen Rückenmarksflüssigkeit, Speichel, müssen das ATP, FMN und NADH in Soma-Zellen, wie Blut-, Muskel- und Epithel-Zellen, eliminiert werden. Nach dem Verfahren der US-A-37 45 090 geschieht dies in aufwendiger Weise durch Aufbrechen der Soma-Zellen mit einem oberflächenaktiven Mittel, enzymatische Hydrolyse des nicht-bakteriellen ATP und anschließendes Denaturieren des verwendeten Enzyms, sowie der aus den aufgebrochenen Zellen freigesetzten Enzyme.

Die Anwendung von Biolumineszenzverfahren zur Bestimmung von verschiedenen Typen von Zellen war daher bisher wegen des Mangels an geeigneten Probenvorbehandlungsverfahren, welche die getrennte Bestimmung von ATP aus Soma-Zellen und Mikroben-Zellen ermöglichen, begrenzt.

Die selektive Bestimmung von Soma- oder Mikroben-Zellen ist auf vielen Gebieten der Wissenschaft, der Medizin, der Hygienekontrolle und der industriellen Qualitätskontrolle erforderlich. Auf diesen Gebieten müssen häufig Mikroben-Zellen in Gegenwart von Soma-Zellen bestimmt werden.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens, das die Bestimmung der ATP-Konzentration in Mikroben-Zellen, die in einer Mischung aus Soma- und Mikroben-Zellen bestehenden biologischen Probe enthalten sind, schnell, einfach und genau ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren des eingangs erwähnten Gattungsbegriffs gelöst, das laut Patentansprüchen den Gegenstand der Erfindung bildet.

Wie vorstehend bei der Diskussion der US-A-37 45 090 beschrieben, war es bekannt, oberflächenaktive Mittel zum Auflösen von einzelnen Zellen zu verwenden, um ATP von Soma-Zellen zu eliminieren. Erfindungsgemäß ist es nun aber gelungen, ein Verfahren zur selektiven Freisetzung von ATP durch die Zellwand von verschiedenen Typen von Zellen mit spezifischen oberflächenaktiven Mitteln zu entwickeln, um ATP aus lebenden Soma- und Mikroben-Zellen getrennt freizusetzen und so die Konzentration von ATP aus Mikroben-Zellen bestimmen zu können, die sich im Gemisch mit Soma-Zellen befinden.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht es sich zunutze, daß ATP aus einzelnen Zellen oder einer Einzelschicht von Zellen durch die Wände freigesetzt wird, indem man die Zellwände mit oberflächenaktiven Mitteln durchlässig macht. ATP kann mit seiner geringen Molekülgröße nach einer Behandlung mit den oberflächenaktiven Mitteln die Zellwand durchdringen, Enzyme mit einer großen Molekülgröße durchdringen jedoch nicht die Zellwand und bleiben im Innern der Zelle. Dadurch ist es möglich, ATP in die extrazelluläre Flüssigkeit freizusetzen, ohne es durch zelleigene Enzyme zu zerstören. Rote Blutkörperchen (Erythrocyten) werden durch die oberflächenaktiven Mittel aufgebrochen, das freigesetzte ATP kann jedoch noch innerhalb einer Minute, vorzugsweise innerhalb von 15 Sekunden nach der Zugabe des oberflächenaktiven Mittels genau bestimmt werden. Die oberflächenaktiven Chemikalien können an Hand ihrer spezifischen Eigenschaften, beispielsweise an Hand der Alkylkettenlänge der Verbindung, des nicht-ionischen und ionischen Charakters, des Alkoxylierungsgrades (des Grades der Lipophilie oder Hydrophilie) und der Anwesenheit von speziellen Resten, wie z. B. quaternären Ammoniumsalzen, ausgewählt werden, wodurch die Freisetzung von Nucleotiden aus verschiedenen Typen von Zellen selektiv erfolgen kann. Die Folge davon ist, daß ATP selektiv aus Soma-Zellen (Nicht-Mikroben-Zellen) mit Hilfe von nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln freigesetzt werden kann, während ionische oberflächenaktive Mittel zur Freisetzung von ATP aus allen Typen von Zellen, beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Freisetzung von ATP aus den Mikroben-Zellen, verwendet werden. Diese selektive Freisetzung von ATP ist ein Vorteil gegenüber den bisher angewendeten Verfahren, bei denen keine selektive Extraktion zwischen verschiedenen Typen von Zellen durchgeführt werden kann. Ein weiterer wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Freisetzung von ATP aus Einzelzellen schnell, innerhalb von 10 Sekunden, erfolgt. Außerdem wird nur eine Konzentration des oberflächenaktiven Mittels von 0,02 bis 0,1% benötigt, um die Zellwand durchlässig zu machen und ATP freizusetzen, so daß die Probe nicht durch die Zugabe des ATP-Freisetzungsreagens verdünnt wird. Die oberflächenaktiven Mittel können so gewählt werden, daß ihre Anwesenheit die Analyse des ATP nicht stört.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden zunächst zur Freisetzung von ATP nur aus den Soma-Zellen nicht-ionische oberflächenaktive Mittel verwendet. Beispiele für solche nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, die zudem den Vorteil haben, daß sie die Biolumineszenz-Reaktion nicht inhibieren, sind äthoxylierte Alkylphenole, Octylphenole, Verbindungen der allgemeinen Formel

und Fettsäurepolyglykoläther mit der allgemeinen Formel

-C-C-O-(CH₂CH₂O)_xH

worin R eine Alkylgruppe oder eine Fettsäure und x 2 bis 30 bedeuten. Die selektive Freisetzung von ATP aus Soma-Zellen wird durchgeführt durch Zugabe des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels zu der Probe in einer Konzentration von 0,01 bis 2%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2% des Problemvolumens. Diese Konzentration an nicht-ionischem oberflächenaktivem Mittel, wie äthoxylierten Alkoholen und Phenolen, welche die Biolumineszenz-Reaktion nicht stört, setzt aus Soma-Zellen ATP in die extrazelluläre Flüssigkeit, wie z. B. Wasser, einen Puffer oder eine Salzlösung frei, innerhalb von 10 Sekunden nach dem Mischen des oberflächenaktiven Mittels mit der Probe. Nachdem die Zellwand mit dem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel durchlässig gemacht worden ist, wandern die kleinen Moleküle in Richtung des niedrigeren Konzentrationsgradienten, ATP und andere Substrate diffundieren aus den Zellen heraus, bis die Konzentration innerhalb und außerhalb der Zellen gleich ist, was zu einer praktisch vollständigen Freisetzung von ATP (<99%) führt, wenn das Zellvolumen weniger als 1% des Gesamtvolumens der Probe beträgt. Nachdem die kleinen Moleküle freigesetzt worden sind, beginnen die zelleigenen Enzyme die Substrate, die im Innern der Zellen verblieben sind, zu verbrauchen. Wenn man die Proben mehr als 5 Minuten lang vor der Messung stehen läßt, beginnt die Konzentration der Substrate, wie ATP, im Innern der Zellen abzunehmen und die Substrate, die aus den Zellen freigesetzt worden sind, beginnen wieder in die Zellen zurückzudiffundieren (in Richtung des niedrigeren Konzenztrationsgradienten). Dadurch kann die Gesamtkonzentration innerhalb von 30 Minuten um 10 bis 40% verringert werden. Deshalb sollte innerhalb von 5 Minuten nach Anwendung des oberflächenaktiven Mittels weiter gearbeitet werden. Die Konzentration der Zellen darf nicht mehr als 10 Millionen, vorzugsweise nicht weniger als 1 Million Zellen pro ml betragen, um eine vollständige und sofortige Freisetzung der Substrate aus den Soma-Zellen zu gewährleisten.

Um die günstige Wirkung nicht-ionischer oberflächenaktiver Mittel auf Soma-Zellen zu zeigen, wurde bei einer Untersuchung von verschiedenen Extraktionsverfahren für ATP aus Blutzellen (P. Tarkkanen, R. Driesch und H. Greiling, "A rapid enzymatic micromethod for the determination of intracellular and extracellular ATP and its clinical-chemical applications" in "Analytische Chemie", 290 (2), 180, 1978, ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (NRS*, ein Nucleotid-Freisetzungsreagens für Soma-Zellen) mit einem Verfahren unter Verwendung von siedendem Trishydroxymethylaminomethan und einer Äthanol-EDTA (0,1 M) (9 : 1)-Mischung verglichen. Die Extraktion von ATP mit NRS war schnell, quantitativ (96,8 bis 102,2%) und ergab ATP-Werte, die mit denjenigen der konventionellen Verfahren (r=0,92 bis 0,93) gut übereinstimmten. NRS war einfacher, schneller und reproduzierbarer. Das dabei erhaltene Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt.

Anschließend an die Freisetzung von somatischem ATP durch die Zellwände der Soma-Zellen, wird dieses aus der Probe entfernt, worauf ATP durch die Zellwände der Mikroben-Zellen unter Verwendung eines ionischen oberflächenaktiven Mittels freigesetzt wird. Die Zellwand der Bakterien enthält ein Polymeres, Peptidoglycan genannt, welches die Zellwand gegen äußere Chemikalien und physikalische Störungen sehr beständig macht. Deshalb ist es schwieriger, die Bakterienzellwand durchlässig zu machen, als bei Soma-Zellen. Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Zellwand von Bakterien so zu beeinflussen, daß sie für Substanzen mit einer verhältnismäßig kleinen Molekülgröße, wie ATP durchlässig wird. Diese Durchlässigkeit wird erzielt durch Behandlung der Bakterien mit ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wobei die besten Typen solche sind, die quaternäre Ammoniumsalze und eine Fettsäure mit einer Kettenlänge von 12 Kohlenstoffatomen enthalten, es kann aber auch jede beliebige Kettenlänge von Kohlenstoffatomen zwischen 4 und 22 verwendet werden.

Beispiele für ionische oberflächenaktive Mittel sind äthoxylierte Amine, äthoxylierte Diamine, Polyäthylenglykolester von Fettsäuren, äthoxylierte Alkohole mit der folgenden chemischen Struktur

oder

worin R eine von Fettsäuren mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen abgeleitete Fettalkylgruppe und x, y und z die Anzahl der Äthylenoxidgruppen innerhalb des Bereiches von 2 bis 50 bedeuten, und quaternäre Salze von äthoxylierten Aminen mit der chemischen Formel

worin R, R₁ und R₂ Alkyl-, äthoxylierte Alkohol-, Alkyl- aryl-, äthoxylierte Amin-, Alkylarylalkyl-, Äthoxylalkyl- oder Hydroxyalkylgruppen und R₃ eine Methyl- oder Äthylgruppe x eine Zahl von 2 bis 15 und y beispielsweise Halogen, Sulfat, Sulfit oder Phosphat bedeuten.

Ein solches oberflächenaktives Mittel kann auch ein fluorierter Kohlenwasserstoff oder Hyaminchlorid sein.

Ein quaternäres Ammoniumsalz ist nicht erforderlich, da kationische äthoxylierte Amine auch aus Bakterienzellen Nucleotide freisetzen, quaternäre Ammoniumsalze von äthoxylierten Aminen mit einer Kohlenstoffkettenlänge von 12 arbeiten jedoch schneller und werden durch Puffer, den pH-Wert und anderen Agentien, die möglicherweise in den Mikroben-Proben vorliegen, weniger beeinflußt. Eine Mischung aus 5 bis 95% eines kationischen äthoxylierten Amins und 5 bis 95% eines quaternären polyäthoxylierten Amins kann zur Erzielung einer schnellen Nucleotid-Freisetzung aus Zellen verwendet werden, ohne daß dadurch die in den Biolumineszenzsystem verwendeten Luciferase-Enzyme gestört oder inaktiviert werden.

Die Geschwindigkeit der Lumineszenz-Lichtreaktion kann bei Verwendung von Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagentien geändert werden durch Änderung des Verhältnisses zwischen dem äthoxylierten Amin mit einer Kettenlänge von 12 Kohlenstoffatomen und dem quaternären äthoxylierten Amin mit einer Kettenlänge von 12 Kohlenstoffatomen. Die Freisetzung von ATP und die Biolumineszenz-Reaktion mit äthoxyliertem Amin allein laufen langsam ab. Bei Verwendung einer Mischung aus quaternärem äthoxyliertem Amin und äthoxyliertem Amin ist die Freisetzung mäßig langsam oder mäßig schnell, je nach dem Mengenanteil der beiden oberflächenaktiven Mittel in der Mischung (Fig. 1). Je mehr quaternäres äthoxyliertes Amin vorhanden ist, um so schneller erfolgt die Freisetzung, um so höher ist die Enzym-Kinetik und um so schneller läuft die Lichtreaktion ab. Eine Mischung aus 70% äthoxyliertem Amin und 30% quaternärem äthoxyliertem Amin ergibt eine mittlere Reaktionsgeschwindigkeit und eine um das 1,2- bis 2,0fach erhöhte relative Lichtablesung in der Leuchtkäfer- Biolumineszenz-Reaktion im Vergleich zu der gleichen Konzentration an ATP in Wasser ohne das oberflächenaktive Mittel-Gemisch bei der Messung mit einer 10-Sekunden-Integration. Es scheint, daß durch diese Mischung die Umsatzrate des Luciferase-Enzyms erhöht wird, wodurch möglicherweise die hydrophilen Zentren des Enzyms beeinflußt werden. Mehr als 50% quaternäres Salz von äthoxyliertem Amin verringern die Aktivität des Luciferase-Enzyms, so daß sein Mengenanteil in Relation zu dem äthoxylierten Amin gesteuert (kontrolliert) werden muß.

Nach der Freisetzung aus den Mikroben-Zellen kann das ATP erfindungsgemäß in bekannter Weise unter Ausnutzung der Biolumineszenz bestimmt werden. Mit Hilfe der Biolumineszenz kann eine extrem niedrige Konzentration, z. B. von 10^-15 M ATP bestimmt werden (vergleiche die US-A-37 45 090). Diese hohe Empfindlichkeit ermöglicht die Messung der Konzentration von ATP, in einer einzelnen lebenden Zelle.

Erfindungsgemäß erfolgt die Messung des mikroben ATP durch einfache Zugabe von 0,01 bis 2%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,2% an ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie äthoxylierten Aminen, vorzugsweise mit einem quaternären Ammoniumsalz als Teil davon, durch Mischen derselben mit der Probe zur Freisetzung von Nucleotiden durch die Zellwand. Dann kann die Probe in ein Instrument zur Messung der Nucleotid-Konzentration mit beispielsweise ATP unter Anwendung der Leucht käfer-Biolumineszenz-Reaktion eingesetzt werden. Die durch die Reaktion in der Probe erzeugte Lichtintensität steht in direkter Beziehung zu der ATP-Konzentration oder der Anzahl der lebensfähigen (lebenden) Bakterien der Probe, wie die folgende Tabelle I zeigt.

den in 0,5 ml einer physiologischen NaCl-Lösung (0,9%) suspendiert und unter Anwendung des Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Verfahrens bestimmt (gemessen)
Anzahl der Bakterien in der Probe
Relative Lichteinheiten, gemessen mit einem Photometer
150 000
1 480
500 000	4 800
1 000 000	9 500
2 000 000	18 900

Der Extraktionswirkungsgrad der Mischung aus äthoxyliertem Amin und quaternärem Salz von äthoxyliertem Amin in einem Verhältnis von 70 : 30 in einer Konzentration von 0,1% des Volumens der Probe wurde verglichen mit dem Tris (0,02 M)-EDTA (0,002 M) pH 7,75-Siedeverfahren und mit der konventionellen Extraktion mit Perchlorsäure. Die Ergebnisse von drei wiederholten Tests sind nachfolgend angegeben.

Die Freisetzung von ATP aus Hefezellen und Pilzen mit der Mischung aus äthoxyliertem Amin und seinem quaternären Salz erfolgte langsamer als die Freisetzung von ATP aus Bakterien. Aus Bakterien war die Freisetzung innerhalb von weniger als 15 Sekunden beendet, während aus Hefe- und Pilzzellen die quantitative Freisetzung innerhalb von 30 bis 60 Sekunden erfolgte. Für die quantitative Freisetzung darf das Volumen der Zellen nicht mehr als 1% des Gesamtvolumens der Probe ausmachen. Die Freisetzung war bei dicken Gewebeabschnitten und dicken Ausflockungen von Proben (über 1 mm³) nicht vollständig, da das Reagens die Mikroben-Zellen nicht zerbrach, sondern kleine Moleküle durch die Zellwand freisetzte.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt zwischen der Freisetzung von ATP aus den Soma-Zellen und der Freisetzung von ATP aus den Mikroben-Zellen eine Entfernung des somatischen ATP. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen, beispielsweise wie bei den im folgenden beschriebenen vier Verfahrensweisen:

Das erste Verfahren ist das folgende: Nicht-bakterielles ATP wird durch ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, welches die Durchlässigkeit der Bakterien-Zellwand nicht beeinflußt, freigesetzt und die Probe (50 µl bis 100 ml, vorzugsweise 50 bis 1000 µl) wird durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,1 bis 2 µm, vorzugsweise von 0,2 bis 0,45 µm, filtriert. Das nicht-bakterielle ATP passiert das Filter und wird so eliminiert, während die intakten Bakterien auf dem Filter zurückbleiben. Das Filter wird anschließend mit dem Puffer, einer physiologischen Salzlösung oder destilliertem Wasser gespült und in eine transparente Meßphiole eingeführt und ein ionisches oberflächenaktives Mittel, wie z. B. eine Mischung aus äthoxyliertem Amin und quaternärem äthoxylierten Amin, wird in einer Konzentration von 0,05 bis 2% zugegeben, um das bakterielle ATP freizusetzen, und anschließend wird es unter Anwendung der Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Reaktion bestimmt (gemessen). Bei diesem Verfahren sind die Manipulationen einfach und schnell und es werden auch mögliche störende Substanzen neben dem nicht-bakteriellen ATP, wie z. B. Salze, gefärbte Substanzen, Enzyminhibitoren und dergleichen, entfernt. Außerdem wird die Probe nicht verdünnt, sondern sogar konzentriert, wodurch die Empfindlichkeit der Analysen erhöht wird. Wenn eine Meßphiole mit einem ebenen Boden und ein Filter mit einem kleineren Durchmesser als der Innendurchmesser der Phiole verwendet wird, kann die Filtermembran auf den Boden der Phiole gelegt werden und die Folge davon ist, daß der Filter das Licht zwischen der flüssigen Probe und dem Lichtdetektor nicht abfängt.

Das zweite Verfahren ist das folgende: Die Probe 0,1 bis 100 ml, vorzugsweise 0,5 bis 10 ml, wird durch ein 0,1 bis 0,45 µm Membranfilter so lange filtriert, bis ein dünner Film der Flüssigkeit auf der Oberseite des Filters zurückbleibt. Das Filter sollte nicht trocken werden, da dies die Mikroben belastet und ihren ATP-Gehalt gegenüber dem Normalwert vermindert. Ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, z. B. eine 0,01 bis 1%ige, vorzugsweise 0,1 bis 0,2%ige Lösung von äthoxylierten Phenolen wird in einem Volumen von 0,01 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 ml, auf das Filter gegeben. Nach 10 bis 60 Sekunden wird die Flüssigkeit filtriert, jedoch ohne daß das Filter trocken wird. Das Filter wird 1- bis 3mal mit 0,1 bis 10 ml sterilem Wasser, einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem geeigneten Puffer gespült, um das gesamte nicht-bakterielle ATP von dem Filter, dem Zellenrückstand und den Wänden des Filterhalters zu entfernen, während des Filtrierens der Spüllösung darf das Filter jedoch nicht trocken werden. Nach dem Spülen wird das Filter mit 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 10 ml einer 0,01 bis 1%igen, vorzugsweise 0,05 bis 0,2%igen Lösung von ionischen oberflächenaktiven Mitteln, vorzugsweise mit einer Mischung aus einem äthoxylierten Amin und einem quaternären Ammoniumsalz des äthoxylierten Amins in einem Verhältnis von 95 : 5 bis 5 : 95, vorzugsweise von 70 : 30, bedeckt. Eine Kettenlänge von 12 Kohlenstoffatomen ist in dem äthoxylierten Amin bevorzugt. Man läßt dieses Reagens 10 bis 30 Sekunden lang auf die Mikroben-Zellen auf dem Filter einwirken und man filtriert die das aus den Mikroben-Zellen freigesetzte ATP enthaltende Lösung in ein Teströhrchen oder direkt in eine Meßküvette. Das Filter und der Filterhalter werden mit 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise mit 0,1 bis 0,5 ml destilliertem Wasser in den gleichen Behälter wie die Lösung des ionischen oberflächenaktiven Mittels mit ATP gespült. Nun ist die Probe fertig für die Messung.

Ein drittes Verfahren zum Eliminieren von nicht-bakteriellem ATP ist die Zentrifugierung. ATP aus Soma-Zellen wird durch ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, wie z. B. äthoxylierte Phenole, freigesetzt und die Bakterien werden durch 1- bis 20minütiges Zentrifugieren mit 3000 bis 20 000 g sedimentiert. Die überstehende Flüssigkeit mit dem freigesetzten nicht-bakteriellen ATP wird verworfen und die Bakterien werden wieder in einem geringen Volumen Wasser, Kochsalzlösung oder Puffer suspendiert und mikrobielles ATB durch Zugabe von ionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie äthoxylierten Aminen, in einer Konzentration von 0,05 bis 2% des Gesamtvolumens freigesetzt. Unmittelbar nach dem Konzentrieren kann mikrobielles ATP unter Anwendung eines Biolumineszenz-Verfahrens gemessen (bestimmt) werden. Hohe Blindwerte (nicht-bakterielles ATP) können durch zusätzliches Waschen mit Wasser, Puffern oder einer Kochsalzlösung und anschließendes Zentrifugieren vor der Zugabe des ionischen oberflächenaktiven Mittels und Messung des mikrobiellen ATP gesenkt werden.

In dem vierten Verfahren wird ein ATP-ase-Enzym, z. B. Apyrase in immobilisierter Form verwendet. Das angewendete Verfahren ist das folgende: Eine Probe von 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 1 ml, oder eine Filtermembran, die sowohl Soma- als auch Mikroben-Zellen enthält, wird mit 0,05 bis 10 ml, vorzugsweise 0,1 bis 1 ml, eines 0,01- bis 2%igen, vorzugsweise 0,05- bis 2%igen nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, wie äthoxylierten Phenolen, welche die Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Reaktion nicht stören, behandelt. Bei dieser Behandlung wird das ATP innerhalb von wenigen Sekunden aus der Soma-Zelle freigesetzt.

Immobilisiertes ATP in einer Menge von 0,1 bis 10 Einheiten, vorzugsweise von 1 bis 5 Einheiten, wird in Form von Glasperlen, eines Kunststoffstabes, in Form von Cellulose- oder anderen Fasern, Metallperlen, Latex- oder anderen makromolekularen Perlen zugegeben, oder Apyrase kann auf den Wänden des Protonröhrchens immobilisiert werden. Die Probe wird 0,5 bis 30 Minuten, vorzugsweise 1 bis 10 Minuten lang bei Temperaturen von 20 bis 37°C mit oder ohne Rühren inkubiert, um die Apyrase das somatische ATP aufbrechen zu lassen. Nach dem Inkubieren wird ein Anteil von 0,01 bis 10 ml, vorzugsweise von 0,05 bis 1 ml der Probe mit 0,1 bis 10 ml, vorzugsweise mit 0,05 bis 1 ml, eines 0,01- bis 1%igen, vorzugsweise 0,05- bis 0,2%igen ionischen oberflächenaktiven Mittels, wie äthoxyliertem Amin, vorzugsweise einer Mischung aus äthoxyliertem Amin und äthoxyliertem Amin mit einem quaternären Ammoniumsalz in einem Verhältnis von 5 : 95% bis 95 : 5%, vorzugsweise in einem Verhältnis von 70 : 30%, behandelt. Dadurch wird innerhalb von wenigen Sekunden Mikroben-ATP freigesetzt, und zwar aus Bakterien innerhalb von 10 bis 15 Sekunden und aus Hefen und Pilzen innerhalb von 20 bis 60 Sekunden, und zwar quantitativ bei Bakterien, wenn die Anzahl der Zellen weniger als 10⁸ pro ml beträgt, und bei Hefen und Pilzen, wenn sie weniger als 10⁶ pro ml beträgt. Die Konzentration von mikrobiellem ATP kann dann unter Anwendung des Leuchtkäfer- Biolumineszenz-Reagens bestimmt (gemessen) werden. Die ATP- Konzentration wird in die Anzahl von Bakterienzellen umgewandelt unter Verwendung von vorgegebenen ATP-Werten pro Zelle für bekannte Arten oder 0,3 bis 2 Femtogramm (0,4×10^-15 g) pro Zelle bei einer unbekannten gemischten Population von Bakterien, von 130 bis 170 Femtogramm pro Zelle bei Brauereihefe, wie in der Literatur angegeben (vgl. A. J. D'Eustachio, D. R. Johnson und G. V. Levin, "Rapid assay of bacteria populations" in "Bacteriol. Proc.", 21, 23 ff., 1968 und A. Thore, S. Ansehn, A. Lundin und S. Bergmann, "Detection of bacteriuria by luciferase assay of adenesine triphosphate" in "J. Clin. Microbiol" 1, 1-8, 1975, und US-Patentschrift 37 45 090).

Dieses zuletzt genannte Alternativverfahren ist mit den bereits vorhandenen Probenentnahme- und Abgabeeinheiten leicht automatisierbar. Die Verwendung des Apyraseenzyms ist in der Literatur und in der US-A- 37 45 090 angegeben, es war bisher jedoch nicht bekannt, es in der immobilisierten Form zu verwenden. Durch die Verwendung von immobilisierter Apyrase ist es nicht mehr erforderlich, Apyrase durch Erhitzen oder auf chemischem Wege zu inaktivieren und dadurch ist es möglich, ionische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. äthoxylierte Amine, für die Freisetzung von ATP aus Bakterien zu verwenden. Dieses Verfahren ist leicht automatisierbar sowohl unter Anwendung von Durchflußverfahren als auch von Einzelprobenröhrchensystemen. Die immobilisierte Apyrase kann mehrere Wochen lang immer wieder verwendet werden, wenn sie mit einem Puffer gewaschen und in einem Puffer bei +4°C aufbewahrt wird.

Zusammenfassend kann man sagen, daß das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu konventionellen Verfahren der Extraktion von ATP für biochemische Nachweise (Assays), insbesondere für den Biolumineszenz-Assay von ATP mit dem Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-System Einsparungen an Zeit bei der Bestimmung bzw. Messung von ATP selektiv für Mikroben-Zellen in Soma-Zellen enthaltenden Proben erlaubt. Die Herstellung bzw. Vorbehandlung der Probe erfolgt schnell, wirksam und reproduzierbar und die oberflächenaktiven Mittel können so gewählt werden, daß sie die Luciferin-Luciferase-Biolumineszenzreaktion nicht stören und auch die Stabilität von ATP nicht beeinflussen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der ATP-Konzentration Mikrobenzellen, die in einer aus einer Mischung aus Soma- und Mikrobenzellen bestehenden biologischen Probe enthalten sind, worin man

a) in der Probe mit einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel ATP selektiv aus im wesentlichen nur den Somazellen freisetzt,
b) das hierdurch freigesetzte somatische ATP entfernt,
c) weiterhin in der Probe ATP aus den Mikrobenzellen freisetzt und
d) danach mit einer Biolumineszenz-Analysentechnik die Konzentration des aus den Mikrobenzellen in der Probe selektiv freigesetzt ATP′s mißt,

dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe c) das ATP aus den Mikrobenzellen mit einem ionischen oberflächenaktiven Mittel freigesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an oberflächenaktivem Mittel jeweils 0,01 bis 2,0% beträgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als ionisches oberflächenaktives Mittel ethoxylierte Amine, ethoxylierte Diamine, quaternäre Ammoniumsalze eines ethoxylierten Amins sowie Mischungen davon und/oder Fettsäure- Polyethylenglykolester verwandt werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine ein ethoxyliertes Amin und ein quaternäres Ammoniumsalz eines ethoxylierten Amins mit 12 Kohlenstoffatomen in der Kette enthaltende Mischung von ionischen oberflächenaktiven Mitteln verwandt wird und die Konzentration des selektiv aus den Mikrobenzellen freigesetzten ATP′s mit der Leuchtkäfer- Biolumineszenz-Analyse bestimmt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur selektiven Bestimmung von ATP mit Hilfe des Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagens aus Mikrobenzellen in Gegenwart von Nicht-Mikrobenzellen, wobei man

(a) die Probe mit nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln, in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5% behandelt, um nicht-mikrobielles ATP selektiv freizusetzen und
(b) mit Hilfe von ATPase-Enzym das nicht-mikrobielle ATP hydrolysiert und

dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe

(b) 1 bis 5 Einheiten immobilisierte ATPase der Probe zugibt, und
(c) die Probe 1 bis 10 Minuten lang bei 20 bis 37°C inkubiert, und
(d) die immobilisierte ATPase aus der Probe entfernt oder einen aliquoten Anteil der Probe entnimmt und
(e) mit ionischen oberflächenaktiven Mitteln, in Konzentration von 0,01 bis 1% behandelt, um bakterielles ATP aus Mikrobenzellen freizusetzen, und
(f) ATP bestimmt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur selektiven Bestimmung von ATP mit Hilfe des Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagens aus Mikroben-Zellen in Gegenwart von Nicht-Mikroben-Zellen, wobei man

(a) die Probe mit nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln, in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5% behandelt, um nicht-mikrobielles ATP selektiv freizusetzen,

dadurch gekennzeichnet, daß man

(b) die Probe nach einer Wartezeit von 10 bis 60 Sekunden filtriert, um das freigesetzte nicht-mikrobielle ATP zu eliminieren, und
(c) die Probe und die Filtereinheit mit sterilem Wasser, einem Puffer oder einer Kochsalzlösung wäscht zur Entfernung von Spuren von nicht-bakteriellem ATP, und
(d₁) die Filtermembran auf den Boden einer Meßküvette legt und ionisches oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5% zugibt zur Freisetzung von ATP aus Mikroben-Zellen, oder
(d₂) alternativ die Filtermembran nach dem Waschen des nicht-mikrobiellen ATP mit ionischem oberflächenaktivem Mittel, in einer Konzentration von 0,02 bis 0,5% bedeckt, um das mikrobielle ATP freizusetzen, und nach einer Wartezeit von 10 bis 60 Sekunden die Lösung auf dem Filter in die Meßküvette oder in einen anderen Behälter filtriert, aus dem sie in eine Küvette pipettiert werden kann, und anschließend
(e) in der in der Stufe d₁ oder d₂ behandelten Probe ATP bestimmt.