DE2818841C2 - Fluorometer-Mikroskop - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Fluoromcier-Mikroskop für die Untersuchung von Gcwcbe/.ellen (Zytofluorometrie) auf Krebsbefall gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs.

Es ist allgemein üblich, möglicherweise von Krebs befallene Zellen unter dem Mikroskop hinsichtlich Größe und Form des Zytoplasinas und des Zellkerns zu untersuchen. Auf diese Weise vermögen nur sehr erfahrene Fachleute krebsbefallene Zeilen zu erkennen, da hierbei objektive Standardwerte nicht zur Verfügung stehen.

Zur Objektivierung der Beobachtung ist ein FIuorometer-Mikroskop gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 bekannt (US-PS 34 97 WO), mit welchem eine vorzugsweise mit einem fluoreszierenden Farbstoff eingefärbte Gewebeprobe mit einer Xenon-Lampe zur Abgabe von Fluoreszenzsirahlung angeregt wird. Der Meßstrahl wird mit dichroitischen Spiegeln in drei Anteile aufgeteilt. Das Licht mit Wellenlängen unter nm dient zur Bestimmung der Zcllgrößc. Die DNS-Fluoreszenzdes Zellkerns wird im Wellenlängcnbcreieh von 505 bis 555 nm und die RNS-Fluoreszenz des Zyloplasmas und des Zellkerns wird im Wellenlängcnbcreieh von %0 bis 670 nm photoelektrisch bestimmt. Diesen Messungen liegt die Beobachtung zugrunde, daß zwischen dem Desoxiribonukleinsäure (DNS) Gehalt und dem Ribonukleinsäure (RNS)-Gchali der /".eile und der Zellcngröße bei den gesunden und krebsbefallenen Fällen ein bestimmtes Verhallen vorliegt. Die Meßergcbnisse werden daher mit den an gesunden Zellen als Standard gewonnenen verglichea Wenn auch dieses Mikroskop schon sehr verläßliche Aussagen über den Krebsbefall von Zellen zuläßt, ist sein Aufbau und Betrieb aufwendig. Es besteht daher Bedarf an einem Mikroskop, das bequemer in der Handhabung ist und eine noch größere Zuverlässigkeit bietet In seinem Aufbau sollte es weniger aufwendig sein als das bekannte Mikroskop.

ίο Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde, das eingangs genannte FIuorometer-Mikroskop für die Untersuchung von Gewebezellen auf Krebsbefall dahingehend zu verbessern, daß es auf bequemere Weise und mit größerer Sicherheit eine Aussage über den Krebsbefall von Zellen zu gewinnen erlaubt und daß es mit einer geringeren Anzahl an Bauteilen auskommt

Die Lösung dieser Aufgabe gelingt mit den Merkmalen des kennzeichnenden Teils des Patentanspruchs.
Die durch das Zytoplasma hervorgerufene Fluoreszenz hat eine Wellenlänge, die sich von der Wellenlänge der durch den ZelJkern hervorgerufenen Fluoreszenz unterscheidet. Es gilt als allgemein anerkannt, daß sich zwischen gesunden und krebsbcfallenen Zellen bezüglich der Größe und der Fluoreszenz des Zytoplasmas kein größerer Unterschied zeigt, daß jedoch der Kern einer krebsbefallenen Zelle größer ist als derjenige einer gesunden Zelle und daß der Kern einer krebsbefallenen Zel'e stärker als der einer gesunden Zelle fluoresziert. Somit ist es möglich, über die Fluoreszenz und die Größe sowohl des Zytoplasmas als auch des Zellkerns zu erkennen, ob es sich um eine Krebszelle handelt oder nicht. Ferner ist es möglich, festzustellen, ob eine Zelle vom Krebs befallen ist oder nicht. Erfindungsgemäß wird das Verhältnis zwischen der Größe des Kerns N und der Größe des Zytoplasmas Cermittelt, denn dieses Verhältnis hat bei bösartigen Zellen nahezu den Wert 1. Diese Nachweise lassen sich mit Hilfe der arithmetischen Einrichtung auf zweckmäßige und einfache Weise durchführen. Um Größe und Fluoreszenzmenge vom Zytoplasma und Zellkern getrennt und vollständig voneinander messen zu können, erfolgt, wie beim bekannten Mikroskop die Unterteilung des Meßlichtstrahls hinsichtlich der Wellenlänge derart, daß die vom Zytoplasma ausgehende Fluoreszenz getrennt von der vom Zellkern ausgehenden gemessen wird. Durch die unmittelbare punktweise Abtastung der Zellen und durch die Summicrung der Meßwerte in der arithmetischen Einrichtung werden mit hoher Genauigkeit Größe von Zytoplasma und Zellkern sowie der jeweiligen Fluoreszen/.menge ermittelt. Der erforderliche apparative Aufwand ist vergleichsweise gering.

Ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Fluorometer-Mikroskops ist anhand einer schematischen Zeichnung näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 den Aufbau eines Fluorometer-Mikroskops zur Untersuchung von Gewebezellen auf Krebsbefall,

F i g. 2 eine Darstellung zur Veranschaulichung der Abtastung einer Zelle,

F i g. 3a und 3b eine graphische Darstellung der Menno ge der Fluoreszenz, die im Verlauf der Abtastung gemäß F i g. 2 erzeugt wird.

Gemäß F i g. 1 wird kohärentes Licht, das durch einen Laser I erzeugt wird, durch Galvanometerspiegel 2a und 2b sowie durch einen ersten dichroitischen Spiegel

h^r> 3 reflektiert, um eine Gewebeprobe 5 durch ein Objektiv 4 des Mikroskops das außerdem als Kondcnsorlinsc wirkt, zu bestrahlen. Da als Lichtquelle ein Laser verwendet wird, kann die Strahlung leicht auf eine kleine

Fläche der Gewebeprobe konzentriert werden. Das Laserlicht ist monochromatisch und hat eine zur Anregung der Zellen zur Fluoreszenzstrahlung geeignete Wellenlänge. Erhält man kein monochromatisches Licht, kann man ein Erregungsfilter 11 beispielsweise im Strahlengang hinter den Galvanometerspiegeln, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist, vorsehen. Obwohl die Gewebeprobe durch das Erregungslicht nur punktweise beleuchtet wird, siehe den Lichtpunkt Sin F: g. 2, läßt sich eine Abtastung in der X- und in der V-Richtung gegenüber der Gewebeprobe durchführen, indem man die Galvanospiegel 2a und 2b in entsprechenden Richtungen orthogonal zueinander schwenkt Wird die Gewebeprobe in der beschriebenen Weise bestrahlt, wird Fluoreszenzstrahlung erzeugt die den dichtroitischen Spiegel 3 durchsetzt Dieser hat eine solche Spektralcmpfindlichkeit daß er das Erregungslicht reflektiert, jedoch den Fluoreszenz-Meßstrahl hindt rchläßt. Nach Durchtritt durch den ersten dichroitischen Spiegel 3 wird die durch das Zytoplasma erzeugte Fluoreszenz, deren Wellenlänge 630 nm beträgt durch einen weiteren dichroitischen Spiegel 6 reflektiert, während die durch den Zellkern erzeugte Fluoreszenzstrahlung mit einer Wellenlänge von 530 nm vom weiteren dichroitischen Spiegel durchgelassen wird. Auf diese Weise ist es möglich, die beiden Komponenten des Fluoreszenz-Meßstrahls mit Hilfe von zwei getrennten optoelektrischen Detektoren 7a und Tb nachzuweisen, an die jeweils ein Verstärker 8a und Sb angeschlossen ist. Die Ausgangssignale der beiden Verstärker werden einer arithmetrischen Einrichtung 9 zugeführt, die unter Verwendung der Eingangsdaten eine bestimmte Berechnung durchführt und die Ergebnisse an eine Darstellungseinrichtung 10 abgibt.

Fig.2 zeigt den Erregungslichtpunkt 5, mittels dessen eine Gewebezelle in Richtung des Pfeils abgetastet wird. Hierbei wird jeweils durch den bestrahlten Teil der Zelle Fluoreszenz erzeugt. Da sich, wie erwähnt, die Wellenlänge der durch das Zytoplasma erzeugten Fluoreszenzstrahlung von der Wellenlänge der vom Zellkern erzeugten Fluoreszenzstrahlung unterscheidet, ist es möglich, die beiden Komponenten mit Hilfe der detektoren 7a und Tb getrennt nachzuweisen und den Gesamtbetrag gesondert zu ermitteln. Die jeweilige Größe ergibt sich aus dem Abstand zwischen dem Punkt, an dem die Fluoreszenz erstmalig nachgewiesen wird, und dem Punkt, an dem keine Fluoreszenz mehr erzeugt wird; hierbei ist angenommen, daß die Abtastung in der aus Fig.2 ersichtlichen Weise erfolgt. Beispielsweise wird Fluoreszenz durch das Zytoplasma erzeugt, wenn das Erregungslicht S das Ende A 1 des Zytoplasmas A erreicht, so daß die durch den Detektor Ta nachgewiesene Lichtmenge allmählich von Null aus zunimmt, jedoch wieder auf Null zurückgeht, wenn gemäß F i g. 3a das andere Ende A 2 des Zytoplasmas erreicht wird. Auf entsprechende Weise wirkt der weitere Detektor Tb zum Nachweisen der Fluoreszenz, wenn das Erregungslicht, das Ende B1 des Zellkerns B erreicht, und gemäß Fig.3b geht die Fluoreszenz wieder auf Null zurück, wenn der Punkt B2 nach Fig.2 erreicht wird. Es ist möglich, die Länge der Strecken Z, 1 und L 2 in der Bewegungsrichtung des Abtastlichtpunktes zwischen den genannten Enden zu ermitteln.

Gemäß Fig. 1 kann man ein Filter 12a, welches Licht durchläßt, dessen Wellenlänge der durch das Zytoplasma erzeugten Fluoreszenz entspricht, vor dem Detektor 7a anordnen und auf entsprechende Weise kann man vor dem weiteren Detektor Tb ein Filter 126 vorsehen.

das Licht durchläßt dessen Wellenlänge derjenigen der durch den Zellkern erzeugten Fluoreszenz entspricht.

Bei dem Mikroskop ist es möglich, die Abtastung mn einem Lichtstrahl von kleinem Querschnitt zur Erzeugung eines Lichtpunktes durchzuführen, wobei der Lichtstrahl jedoch eine hohe Helligkeit besitzt, und es ist eine Bestrahlung mit hochgradig monochromatischem Licht möglich. Außerdem wird die Durchführung der Prüfung der Zelle dadurch beschleunigt, daß gleichzeitig

ίο die Lichtmengen bei den unterschiedlichen Wellenlängen gemessen werden, um die gesamte Lichtmenge, die vom Zytoplasma und vom Zellkern ausgesandt wird, sowie die Durchmesser des Zytoplasmas und des Zellkerns zu bestimmen.

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30

35

40

50

55

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Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   FIuorometer-Mikroskop für die Untersuchung von Gewebezellen, (Zytofluorometrie) auf Krebsbefall mit

   einer einen dünnen Beleuchtungs-Lichtsirahl abgebenden Lichtquelle.

   einer Abtasteinrichtung für die Objektabtastung,
   einem ersten dichroitischen Spiegel im Strahlengang des Mikroskops, der den Beleuchtungs-Lichtstrahl auf die abzutastende Probe zur Auflichlanregung umlenkt,

   einem weiteren dichroitischen Spiegel als Meßstrahlteiler, der den von der Probe ausgehenden und durch den ersten dichroitischen Spiegel hindurchgelassenen Fluoreszenz-Meßstrahl in einen solchen mit Strahlen der Wellenlänge 530 mn und einen solchen mit Strahlen der Wellenlänge 630 nm aufteilt,
   optoelektrischen Detektoren zur Bestimmung der Intensität der aufgeicilien Sirahlen, sowie
   einer an diese angeschlossene arithmetische Einrichtung zum Vergleich und zur Auswertung der Ausgangssignale der Detektoren, dadurch gekennzeichnet,

   daß die Lichtquelle als Laserstrahlungs-Lichtquelle (1) ausgebildet ist, die einen weitestgehend monochromatischen Beleuchtungs-Lichtsirahl aussendet, der kleiner als der Kern der Zelle der zu untersuchenden Gewebeprobe ist. und
   daß die Abtasteinrichtung au:, zwei den Belcuchtungs-Lichtstrahl vor dem ersten dichtroitischen Spiegel (3) umlenkenden, in zueinander orthogonalen Richtungen schwenkbaren Galvanometerspiegeln (2«i. 2b) besteht.