DE2813075C2

DE2813075C2 -

Info

Publication number: DE2813075C2
Application number: DE2813075A
Authority: DE
Inventors: Alexander Dipl.-Chem. Dr. 6945 Hirschberg De Berg; Zdenek Dipl.-Chem. 6940 Weinheim De Eckmayer; Rolf Dr. Monsheimer; Ernst Dipl.-Chem. 6100 Darmstadt De Pfleiderer
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA; Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1978-03-25
Filing date: 1978-03-25
Publication date: 1989-10-05
Also published as: GB2023613B; FR2420551B1; US4220724A; CA1122550A; DE2813075A1; IT7967411A0; BR7901801A; FR2420551A1; JPS54163895A; ES477038A1; GB2023613A; AR222988A1

Description

Kollagenhaltiges Rohmaterial dient in der Technik als Basis zur Herstellung von verschiedenen Endprodukten, die zur Voraus setzung haben, daß das Kollagen nicht wesentlich über eine Mole külmasse von 1 × 10⁴ hinaus abgebaut wird. Beispiele für derartige technisch hergestellte Endprodukte sind Gelatine, Leim, Kollagen fäden und -folien (vgl. G. Reich in der Monographie "Kollagen", Seite 256 bis 262, Verlag Steinkopff, Dresden, 1966).

Die Methode der Gewinnung der obengenannten technischen Pro dukte aus Kollagen sei am Beispiel der Gelatine erläutert.

Die Ausgangssubstanz für die Herstellung von Gelatine ist bekanntlich das Kollagen, ein Faserprotein, das in Knochen und im Bindegewebe der Tiere enthalten ist und die Gerüstsubstanz der Lederhaut, zahlreicher innerer Membrane, der Sehnen, der Knorpel und der Fischschuppen bildet. Die Struktur des Kollagens ist weitgehend bekannt.

Technisch wird die Gelatine vorwiegend aus Knochen und aus Haut hergestellt (Knochen- bzw. Hautgelatine).

Als Rohmaterial für die Gewinnung von Gelatine dienen haupt sächlich Abfall- und Nebenprodukte der Gerbereien, der leder verarbeitenden Industrie, der Schlachthöfe und Metzgereien. Für die Herstellung von Hautgelatine verwendet man beispiels weise Kalbs- und Rindsköpfe, sowie Flanken- und Beinabschnitte, die frisch gekälkt oder gesalzen angeliefert werden, weiter Spaltleimleder in gekälktem, getrocknetem oder gesalzenem Zustand, ferner die Häute von jungen Schlachtschweinen u. ä. Für die Herstellung von Knochengelatine kommen als Rohmaterial Knochenschrot, Haut knochen, Abfälle aus Beindrehereien, ausgesuchte Kopfknochen, Schulterblätter usw. in Frage.

Bei der Überführung in die gewünschten Endprodukte wie Gelatine, Leim, Kollagenfäden und -folien bleibt die Struktur des Kolla gens zum Teil erhalten. Die technischen Prozesse zur Gewinnung der genannten Produkte haben dieser Voraussetzung Rechnung zu tragen.

Vom Aufschluß bzw. der Vorbehandlung des Rohmaterials her kann man zwei Typen von Gelatine unterscheiden: alkalisch geäscherte Gelatinen und sauer geäscherte Gelatinen. Die sauer geäscherten Gelatinen, die hauptsächlich aus der Haut junger Schweine hergestellt wird, bleiben für die vor liegende Erfindung außer Betracht.

Die Behandlung mit Alkali (das Kälken) bewirkt eine chemische Umwandlung des Kollagens (Sudreife), so daß es sich später beim Verkochen mit heißem Wasser löst. Die Gelatineherstellung umfaßt somit eine Reihe von Arbeitsschritten. Bei Verwendung von Knochen als Rohmaterial steht die Reinigung, Entfettung und Zerkleinerung am Anfang.

Dann löst man das ins Knochengewebe eingelagerte Tricalcium phosphat durch 8 bis 14tätige Behandlung mit verdünnter Säure heraus (man "mazeriert"), wäscht das Knochenmaterial (Ossein) und äschert anschließend mit einer 5 bis 15%igen Calciumhydroxid-Lösung etwa 3 bis 16 Wochen. Nach beendeter Äscherung werden die Knochen in mechanischen Waschanlagen von anhaftendem Kalk gereinigt und neutralisiert. Dieses Auswaschen und Reinigen des aus der Äscherung kommenden Rohmaterials er fordert große Wassermengen.

Aus dem neutral gewaschenen Knochenkollagen wird dann mit Wasser die Gelatine als kolloidale Lösung bei Temperaturen zwischen 40 bis 90°C in mehreren "Abzügen" extrahiert.

Bei Verwendung von Haut als Rohmaterial wird analog wie bei Knochen verfahren. Natives Hautmaterial wird zunächst unter Zusatz von Kalkmilch (zur Einleitung des Quellprozesses) vom konservierenden Salz befreit. Dann wird - bis zur einwand freien Haarlockerung - etwa 3 Wochen mit Kalkmilch von 6-7° B´ behandelt. Anschließend werden die Haare entfernt, das Haut material zerkleinert und erneut ca. 12-15 Wochen mit Kalkmilch geäschert. Dann wird das Hautkollagen, wie bei der Knochengelatine beschrieben, weiterverarbeitet.

Die Gewinnung der Gelatine aus Hautspalten folgt dem Verfahren für natives Hautmaterial. Die Häute werden zerkleinert und anschließend etwa 8-14 Wochen geäschert. Die weitere Auf arbeitung verläuft wie bei Knochengelatine.

Der Kollagengehalt der jeweils behandelten Rohmaterialien ist im allgemeinen bekannt.

Es ist klar, daß der Abbaugrad des Kollagens und damit zusammen hängend: die Qualität des Abbauprodukts vom Aufschluß und von der thermischen Hydrolyse abhängt. In wäßriger Lösung liegen z. B. die Gelatine-Moleküle mit relat. Molekülmassen von etwa 4000 bis etwa 4 × 10⁶ vor. In der Praxis rechnet man mit Molekülmassen von ca. 11 000 bis 100 000 für Gelatine.

Die verschiedenen Maßnahmen, insbesondere die Äscherung des kolla genhaltigen Materials, benötigen unverhältnismäßig lange Zeiten, und es hat nicht an Versuchen gefehlt, das Äschern zu verkürzen - und - nach Möglichkeit die Qualität der Produkte wie Gelatine zu verbessern.

In den US-PS 27 41 575 und 17 41 576 wird die Verwendung von Mikroorganismen, wie Saccharomyces, Mycoderma oder Torulopis zum Sudreifmachen von Hautleim- bzw. Gelatinerohmaterial gelehrt.

In der SU-PS 1 51 745 wird zur Beschleunigung der Äscherung von Lederabfällen ein Enzym-Extrakt aus Aspergillus flavus und zusätzlich Pankreatin empfohlen. In der JP-PS 70 06 274 wird die Behandlung kollagenhaltigen Materials mit sauren Proteasen bei saurem pH zur Gelatineherstellung empfohlen. Als Beispiel wird die Inkubierung einer Kalbshaut bei pH 2,9 mit Proctase aus A. niger var. macrosporus während 48 Stunden angegeben.

Eine Möglichkeit zur Herstellung von Gelatine besteht nach Bull. Soc. Sci., Photogr. Jap. No. 16, 30 (1966) darin, daß man Kollagenfasern mittels proteolytischer Enzyme in lösliche monomere Kollagen-Moleküle überführt. Empfohlen wird ein Enzym mit breiter Spezifität, z. B. die Pronase in Gegenwart von Calciumchlorid. Gemäß der DE-OS 26 29 594 verwendet man mit Vorteil zur "alkalischen oder neutralen Konditionierung" von Kollagen für die Katraktion von Gelatine die Lösung eines neutralen oder alkalischen proteolytischen Enzyms bei einem pH-Wert zwischen 7 und 13 innerhalb 4 bis 72 Stunden bei 20 bis 40 Grad C. Spezifisch genannt werden Trypsin, Bacillus-Proteasen und die im GB-PS 12 34 784 beschriebenen Alkalasen.

In der nicht vorveröffentlichten DE-OS 26 43 012 wird die Auflösung von Maschinenleimleder, Hautlappen, Falzspänen und dergleichen innerhalb von Stunden und bis zu einem hohen Hydrolysegrad beschrieben. Das Ziel der möglichst weitgehenden Auflösung der Substrate wird erreicht durch gleichzeitige Anwendung von alkalischen Proteasen und Harnstoff.

Aufgabe der vorliegenden Druckschrift ist es, bei möglichst geringem Zeitaufwand kollagenhaltiges Rohmaterial in einem Äscherverfahren zur Sudreife zu bringen, so daß es sich beim anschließenden Verkochen mit heißem Wasser zu Glutin löst.

Es wurde gefunden, daß überraschenderweise die Verfahrensdauer zum Äschern des Kollagens, wie es im Knochenmaterial nach dem Mazerieren und in den Rohmaterialien auf der Grundlage von Haut- bzw. Bindegewebe, gegebenenfalls nach Entfernung des konservierenden Salzes, der Haare usw. vorliegt, bis zur "Sudreife" auf einen Bruchteil der nach den Verfahren des Standes der Technik benötigten Zeit herabgesetzt werden kann, wenn man die genannten, alkalischen Proteasen in einer Lösung mit einem pH-Wert zwischen 6,5 und 13 bei einer Temperatur zwischen 18 und 40 Grad C in Gegenwart von Harnstoff und/oder Guanidin, und/oder dessen Säureadditions salzen inkubiert.

Als Rohmaterial für das erfindungsgemäße Äscherverfahren von Kollagen kommen demnach die bekannten, z. B. die vorstehend genannten Materialien, auf der Basis von Knochen und von Häuten, bzw. Fellen infrage. Insbesondere seien als Substrate des er findungsgemäßen Verfahrens das Ossein, sowie Felle, die frisch, gekälkt oder gesalzen angeliefert werden, sowie Spalt in ge kälktem, getrocknetem oder gesalzenem Zustand nach Durchführung der üblichen der Äscherung vorausgehenden Maßnahme, genannt.

Unter den erfindungsgemäß zu verwendenden neutralen und/oder alkalischen Proteasen seien sowohl aus Mikroorganismen wie aus höheren Organismen gewonnene Enzyme verstanden. Besonders genannt seien neutrale und/oder alkalische Proteasen bakterieller Her kunft, z. B. die aus Bacillus-Stämmen isolierten Proteasen. Zu erwähnen sind beispielsweise die neutralen und/oder alkalischen Proteasen aus B. licheniformis, B. firmus, B. pumilis, B. cereus, B. mycoides, B. alcalophilus und B. subtilis und B. parasiticus, sowie die neutrale Bakterienproteinase aus Streptomyces griseus. Weiter seien genannt die neutralen und/oder alkalischen Pilzproteasen, beispielsweise solche aus Aspergillus-Arten, wie A. oryzae, A. sojae, A. flavus, ferner aus Paec. varioti, Rhiz. chinensis, Mucor pusillus, sowie pflanzliche Proteasen, wie Papain, Bromelain und Fixin, eben falls die Pankreasproteasen, sowie Kombinationen der genannten Enzyme. Die Bezeichnung "neutrale" bzw. "alkalische" Proteasen bezieht sich auf den relativen pH-Wirkungsbereich (Ullmanns Enzyklopädie der Techn. Chemie, Hrsg. E. Bartholom´ u. a., Bd. 10, S. 517 bis 522, Verlag Chemie Weinheit, 1975). Unter neu tralen Proteasen seien solche mit einem pH-Wirkungsbereich zwischen 5,5 und 7,5, unter alkalischen Proteasen solche mit einem pH-Wirkungsbereich zwischen 7 und 12 verstanden.

Anzustreben ist beim Verfahren der vorliegenden Erfindung die Ein stellung eines pH-Werts nahe beim Wirkungsoptimum des bzw. der jeweils verwendeten Enzyme. Gegebenenfalls muß auch die Tempera tur den Wirkungsbedingungen der gewählten Enzyme angeglichen werden. Im allgemeinen liegen die Inkubations-Temperaturen zwischen 18 und 40°C. Als Richtwerte für die Konzentration der erfindungsgemäß zu verwendenden Enzyme kann 1 bis 10, speziell 2 bis 5 Löhlein-Volhard-Einheiten (L. V. E., wie im folgenden de finiert) pro g Kollagen, das im Rohmaterial enthalten ist, angesehen werden.

Zweckmäßigerweise werden die (bekannten) Kenndaten der einzelnen Enzyme, (Temperaturoptima, Stabilitätsbedingungen) soweit technisch vertretbar eingehalten.

Es muß als außerordentlich überraschend betrachtet werden, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Sudreife durch die Verwen dung von neutralen bzw. alkalischen Proteasen unter Zusatz von Harnstoff in technisch höchst erwünschter Weise gefördert wird. Der bevorzugte Bereich liegt bei Harnstoffzusätzen zum enzyma tischen Ansatz von 0,004 g bis 0,04 g, vorzugsweise 0,01 g bis 0,03 g pro g Kollagen im trockenen kollagenhaltigen Roh material.

Im übrigen können die aus den Äscherverfahren des Standes der Technik vorhandenen Erfahrungen bei der Ausübung des erfindungs gemäßen Verfahrens verwertet werden.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt es, die Äscherzei ten (Sudreife) auf ca. 4 bis 24 Stunden zu reduzieren. Der dadurch erreichte Fortschritt ist bedeutend.

Das enzymatische Äscherverfahren zur Gelatinegewinnung gemäß der vorliegenden Erfindung kann dann abgebrochen werden, wenn die Sudreife erreicht ist. Zur Definition der Sudreife vgl. G. Reich, loc. cit. S. 244; siehe auch Beispiel 1. Anschließend wird zweck mäßig das bzw. die Enzyme inaktiviert, beispielsweise durch Sauerstellen des Materials.

Die weitere Aufarbeitung zu Gelatine, Leim, Kollagenfäden und -fasern kann in bekannter Weise durchgeführt werden.

Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können an sich bekannte Zusätze zu der enzymatischen Reaktion, wie Akti vatoren, Stabilisatoren, u. ä. verwendet werden. Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird gebräuchlicherweise nach der Anson- Hämoglobin-Methode (M. L. Anson. J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939)) bzw. nach der Löhlein-Volhard-Methode (Die Löhlein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität, Gerberei- chem. Taschenbuch, Dresden-Leipzig 1955) als "LVE" (Löhlein-Vol hard-Einheit) bestimmt. Unter einer Löhlein-Volhard-Einheit ist die jenige Enzymmenge in Gramm zu verstehen, die unter den spezifischen Be dingungen der Methode 1,725 mg Casein verdaut.

Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Ver fahren, ohne daß der nachgesuchte Schutz auf eben diese Aus führungsform beschränkt sein soll.

Beispiel 1

Ausgangsmaterial für das Äscherverfahren ist mit Wasser geweichte und mit Kalk und Schwefelnatrium geäscherte Bullenblöße. Es wird 1 kg Bullenblöße mit 1,5 l Wasser, 40°C, versetzt. Die Temperatur wird im Wasserbad auf 40°C gehalten und ohne Bewegung mit

1 g alkalische Bakterienproteinase aus Bacillus licheniformis 9000 LVE
4 g Harnstoff
20 g Kalkhydrat

4 Stunden bei pH 10,0 behandelt. Nach dieser Zeit war die Sudreife erreicht, d. h. die Bullenblößen konnten mit dem Finger durchstoßen und die Fasern durch Zerreiben zwischen den Fingern isoliert werden. Das Gewicht der Blöße verminderte sich auf 635 g. Danach wurde das Blößenmaterial zunächst mehrmals mit entsalztem Wasser ge waschen. Zur Inhibierung der Enzymwirkung wurde es in eine Lösung mit

200% entsalztem Wasser, 20°C
4 g Schwefelsäure 98%ig

gebracht. Es wurde öfters aufgerührt. Der pH-Wert der Lösung betrug 3,0. Nach 3 Stunden wurde die Brühe verworfen. Danach mehrmals mit entsalztem Wasser gespült, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war. Anschließend wurde mit 150% entsalztem Wasser 4 Stunden bei 70°C ausgeschmolzen. Es wurde 150 g nicht ausschmelzbares Material erhalten. Der Umsatz beträgt 85%. Danach wird abfiltriert. Zur Desodorierung werden dem Filtrat 0,5 g Aktivkohle zugesetzt. Nach dem Abzentrifugieren wird erneut filtriert. Danach wird im Vakuumverdampfer bei 30°C eingedampft. Die vorstehenden und nach folgenden Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht in bezug auf das eingearbeitete, wasserhaltige Rohmaterial.

Beispiel 2

1000 g frisch geäscherter Rundsspalt wird in ein 2 l-Becherglas eingewogen und mit 1,5 l Wasser, 40°C, versetzt. Zur Aufbereitung werden

1 g Bakterienproteinase aus Bacillus subtilis mit 9000 LVE
8 g Harnstoff
10 g Natronlauge 33%ig zugegeben.

Der pH-Wert der Lösung betrug 11,5. Zur Konstanthaltung der Tempe ratur wird im Wasserbad 8 Stunden bei 40°C behandelt. Nach dieser Zeit waren die Blößen sudreif. Das Gewicht betrug in diesem Zustand 300 g. Die weitere Behandlung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach dem Ausschmelzen wurde kein Rückstand erhalten. Vollständiger Umsatz.

Beispiel 3

1000 g geäscherter Bullenspalt wird in ein 2 l-Becherglas einge wogen mit 1,5 l Wasser, 40°C, versetzt. Die Aufbereitung erfolgt ohne Bewegung und zur Einhaltung gleichbleibender Temperatur im Thermostat bei 40°C. Die Behandlungsdauer beträgt 10 Stunden. Zur Aufbereitung werden zugegeben:

1,5 g Bakterienproteinase aus Bacillus firmus mit 9000 LVE
6,0 g Harnstoff
20,0 g Kalkhydrat

Der pH-Wert der Lösung beträgt 10,2. Ausschmelzen, Waschen, Inhibierung der Enzymaktivität analog Beispiel 1. Nach dem Aus schmelzen wurde ein Rückstand von 50 g nicht ausschmelzbarem Mate rial erhalten. Umsatz 90%.

Beispiel 4

1000 g geäscherter Kuhspalt wird in ein 2 l-Becherglas einge wogen und mit 1,5 l Wasser, 40°C, versetzt. Die Aufbereitung erfolgt ohne Bewegung. Der Lösung wird zugesetzt:

1,5 g Pilzproteinase aus Aspergillus parasiticus mit 9000 LVE
6,0 g Guanidinhydrochlorid
20,0 g Kalkhydrat

Der pH-Wert der Lösung beträgt 10,2.

Waschen, Inhibierung der Enzymaktivität, Ausschmelzen analog Beispiel 1. Nach dem Ausschmelzen wurde ein Rückstand von 80 g nicht ausschmelzbaren Materials erhalten. Umsatz 80%.

Claims

1. Verfahren zur Äscherung von kollagenhaltigem Rohmaterial unter Verwendung von neutralen und/oder alkalischen Proteasen, dadurch gekennzeichnet, daß man das kollagenhaltige Rohmaterial nach der üblichen Vorbereitung in einer Lösung, die die neutralen und/oder alkalischen Proteasen bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 13 in Gegenwart von Harnstoff und/oder Guanidin und/oder dessen Säureadditionssalzen enthält, bis zur Sudreife inkubiert und anschließend die Enzyme desaktiviert.

2. Verfahren zur Äscherung von kollagenhaltigem Rohmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als kollagenhaltiges Rohmaterial Ossein sowie Felle in frischem, gekälktem oder gesalzenem Zustand und Spalt in gekälktem, getrocknetem oder gesalzenem Zustand, einsetzt.

3. Verfahren zur Äscherung von kollagenhaltigem Rohmaterial nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man pro Gramm Kollagen 0,004 g bis 0,04 g Harnstoff bzw. Guanidin und/oder die entsprechende Menge des Säureadditionssalzes verwendet.

4. Verfahren zur Äscherung von kollagenhaltigem Rohmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 3, unter Verwendung von alkalischer Bakterienproteinase aus Bacillus subtilis, und/oder Bacillus firmus, und/oder Pilzproteinase aus Aspergillus parasiticus.

5. Verfahren zur Äscherung von kollagenhaltigem Rohmaterial nach den Ansprüchen 1 bis 4 unter Verwendung von neutralen und/oder alkalischen Proteasen in einer Menge, die 1 bis 10, speziell 2 bis 5 LVE pro Gramm Kollagen im Rohmaterial entspricht.

6. Verfahren zur Äscherung von kollagenhaltigem Rohmaterial gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationszeit mit neutralen und/oder alkalischen Proteasen in Gegenwart von Harnstoff, Guanidin und/oder dessen Säureadditionssalzen 4 bis 24 Stunden beträgt.