DE2754351C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Haltern gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie auf eine entsprechende Vorrichtung. Aus der US-PS 38 91 327 ist ein derartiges Verfah­ ren bekannt. Bevor dieser Stand der Technik näher erläutert wird, sei zum besseren Verständnis der Erfindung folgendes vorausgeschickt.

Es ist auf dem Gebiet der Medizin allgemein üb­ lich, dünne Schnitte biologischer Proben zur mikrosko­ pischen Untersuchung auf Glasplättchen anzubringen. Diese Schnitte sind zur Erleichterung der Untersuchung gefärbt und entwässert und wurden einem Einbettungs- oder Halterungsvorgang ausgesetzt. Bei diesem Halterungs­ vorgang wird im allgemeinen jede einzelne Probe von einem Medium umschlossen, das von dem mikroskopischen Objekt­ träger getragen wird. In diesem Einbettungsmedium ist die Probe für eine praktisch unendlich lange Zeit konserviert. Es besteht derzeit die Neigung, als Einbettungsmedium oder Halterungsmittel eine Lösungsmittellösung aus harten Kunstharzen zu verwenden. Diese Kunstharze sind derart ge­ wählt, daß sie (1) keine Verblassung der Farben bewirken, mit denen die Proben behandelt sind, (2) im Laufe der Zeit möglichst wenig vergilben und (3) nach dem Trocknen einen Brechungsindex haben, der sehr dicht bei dem durch­ schnittlichen Brechungsindex (1,530 bis 1,570) der Gewebe liegt. Bei der Verwendung eines Halterungsmittels mit einem Brechungsindex, der nahe bei demjenigen des Gewebes liegt, wird eine nahezu vollkommene Durchsichtigkeit er­ reicht. Sehr oft wird ein Pinenharz als Halterungsmittel verwendet. Andere verfügbare Halterungsmittel sind in der Tabelle 5-1 auf der Seite 98 der Druckschrift "Histopathic Technique and Practical Histo-chemistry" zusammengestellt.

Im allgemeinen wird das Halterungsmittel in einer Lösungsmittelmenge aufgelöst, um zum bequemen Auftragen eines gesteuerten Volumens auf die Probe eine geeignete Viskosität einzustellen. Um eine für die mikroskopische Untersuchung erforderliche planare obere Oberfläche zu erhalten, ist es im allgemeinen üblich, über das aufge­ tragene Halterungsmittel ein Deckgläschen zu schieben, solange das Halterungsmittel noch in flüssiger Form vor­ liegt. Um das gesamte Lösungsmittel zu entfernen, dessen Gegenwart die mikroskopische Untersuchung stören kann, werden die Objektträger einem langwierigen Trockenvor­ gang unterzogen, der einige Tage oder noch länger dauern kann. Während dieses Vorganges werden die Objektträger in eine horizontale Lage gebracht und manchmal in einer warmen Umgebung gehalten, um die Verdampfung des Lö­ sungsmittels zu erleichtern. Die Verdampfung des Lö­ sungsmittels ist wesentlich, und zwar (1) um das Halte­ rungsmittel zu härten, (2) um das Deckgläschen abzu­ dichten, so daß man den Objektträger leicht und bequem handhaben kann, und (3) um während der mikroskopischen Untersuchung eine optische Störung durch restliches Lö­ sungsmittel zu vermeiden, das einen niedrigen Brechungs­ index hat.

Zur Zeit werden der Einbettungs- oder Halterungs­ vorgang sowie der Trockenvorgang von Hand im Labor aus­ geführt. Nach der Entfernung des Objektträgers aus der sog. Klärlösung und dem schnellen Abtrocknen der Klär­ lösung werden im allgemeinen von einem Techniker einige Tropfen des Halterungsmittels auf die Probe aufgebracht. Die Menge des Halterungsmittels sollte gerade hinreichend sein, um den Raum zwischen dem anschließend aufgebrach­ ten Deckgläschen und der Probe auszufüllen. Unmittelbar nach dem Aufbringen des Halterungsmittels legt der Tech­ niker das Deckgläschen sehr sanft auf das Halterungsmit­ tel auf. Diese Technik sieht vor, daß zunächst die eine Seite des Deckgläschens mit dem Halterungsmittel in Be­ rührung gebracht wird. Das Deckgläschen wird dann nach unten in seine richtige Lage geschoben, wobei es einen Teil des Halterungsmittels vor sich herschiebt. Oft ist es notwendig, daß die Lage des Deckgläschens durch den Techniker korrigiert werden muß, um das Halterungsmittel als dünne gleichförmige Schicht auszubilden und unter dem Deckgläschen eingefangene Luftblasen zu entfernen sowie das Deckgläschen über der Probe richtig zu zen­ trieren. Irgendwelche überschüssigen Mengen des Halte­ rungsmittels, die über das Deckgläschen hinaus heraus­ gedrückt werden, müssen schnell und sorgfältig ent­ fernt werden, beispielsweise mit Hilfe eines absorp­ tionsfähigen Papiers.

Die größten Schwierigkeiten bei der Einbettung oder Halterung der Proben sind: (1) Nachdem die Probe aus dem Klärmittel entfernt worden ist, führt eine ver­ zögerte Anwendung des Halterungsmittels zu einer Aus­ trocknung der Probe, womit eine Verschlechterung der Gewebestruktur verbunden ist. (2) Die Menge des Halte­ rungsmittels ist nicht richtig ausgewählt, so daß der resultierende Film unter dem Deckgläschen entweder zu dick oder zu dünn ist oder die Ebene des Deckgläschens nicht parallel zu dem mikroskopischen Objektträger ver­ läuft. (3) Bei einem zu schnellen oder flüchtigen Auf­ legen des Deckgläschens können Luftblasen eingefangen werden, deren Freigabe oder Entfernung zunehmend schwie­ riger wird, je mehr das Halterungsmittel trocknet.

Die herkömmlichen Verfahren, die nur kurz erläu­ tert worden sind, sind mit an sich gut bekannten Nach­ teilen behaftet:

• 1. Das die Probe, wenn man eine Trocknung zu­ läßt, Schaden nehmen kann, muß der Techniker das Halte­ rungsmittel sorgfältig und schnell auftragen.
• 2. Da das Lösungsmittel in dem Einbettungs- oder Halterungsmittel einen niedrigen Brechungsindex hat und während des Trockenvorganges nur langsam unter dem Deck­ gläschen herausdiffundiert, wird das Halterungsmittel im allgemeinen mit einer minimalen Menge an Lösungsmittel angesetzt, die gewöhnlich gerade ausreicht, um das Halte­ rungsmittel bequem aufzutragen. Wenn dann aber das Auf­ schieben des Deckgläschens verzögert wird, kann die Trock­ nung der Oberfläche des Halterungsmittels einsetzen, wo­ durch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, daß Luftblasen unter dem Deckgläschen eingefangen werden. Das Deckgläs­ chen muß folglich sowohl sorgfältig als auch schnell auf dem Halterungsmittel angeordnet werden.
• 3. Falls ein Überschuß des Halterungsmittels auf­ getragen worden ist, muß dieser Überschuß über die Kanten des Deckgläschens hinaus gedrückt werden. Die Entfernung der überschüssigen Menge kann die Anwendung eines geeig­ neten Lösungsmittels erforderlich machen, das unter das Deckgläschen fließen und dann auch darunter befindliches Halterungsmittel entfernen kann. Es treten dann wieder Lufträume auf, die die Untersuchung stören können.
• 4. Während des Trockenvorganges muß man den Ob­ jektträger für eine beachtlich lange Zeitspanne auf eine ebene horizontale Oberfläche setzen. Eine Neigung des Ob­ jektträgers während dieses Vorganges veranlaßt nämlich oft, daß das Deckgläschen von dem Gewebeschnitt herunter­ rutscht. Da die Ränder des Halterungsmittels geringfügig über den Rand des Deckgläschens hinausragen und die Dif­ fusion des Lösungsmittels unter dem Deckgläschen heraus die Ränder des Deckgläschens in einem klebrigen Zustand hält, ist es nicht möglich, die Objektträger bis zur vollständigen Beendigung des Trockenvorganges in einer effizienten Weise zu speichern bzw. zu lagern.
• 5. Selbst nach einem sehr langen Trockenvorgang bleibt eine minimale Menge des Lösungsmittels unter dem Mittenabschnitt des Deckgläschens. Da das Lösungsmittel einen verhältnismäßig niedrigen Brechungsindex hat, sind die optischen Eigenschaften des Objektträgers für eine relativ lange Zeit nicht optimal.
• 6. Falls die Gewebeprobe eine erhöhte Stelle aufweist, ist unter dem Deckgläschen eine dicke Halte­ rungsmittelschicht erforderlich. Dadurch wird der Trocken­ vorgang verzögert, und als Ergebnis der Verdampfung des Lösungsmittels kommt es zu einer beachtlichen Schrumpfung des Halterungsmittels. Diese Schrumpfung tritt oft un­ gleichmäßig und nur an bestimmten Stellen auf, so daß es unter dem Deckgläschen zur Ausbildung von Lufträumen kommt, die Gewebeeinzelheiten abdecken.

Bei dem Verfahren, das aus der bereits genannten US-PS 38 91 327 bekannt ist, wird auf der die Probe tragenden Oberfläche eines Objektträgers aus Glas ein durch Bestrahlung mit UV-Licht polymerisierbares Klebe­ mittel aufgetragen, das anschließend mit einem Deckglas abgedeckt wird. Danach wird das Klebemittel zur Herstel­ lung einer festen Verbindung zwischen dem Objektträger und dem Deckglas ausgehärtet. Bei diesem bekannten Verfah­ ren zum Haltern von Schnitten einer biologischen Probe wird zwar die Gesamtbearbeitungszeit bis zum Fertigstellen des Objektträgers beträchtlich herabgesetzt, jedoch ist die Verwendung des dort benutzten Klebemittels problematisch.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, trotz be­ trächtlich herabgesetzter Gesamtbearbeitungszeit eine zuverlässige Einkapselung der Probe zu erzielen.

Diese Aufgabe wird jeweils durch die Gegenstände der Patentansprüche 1, 10 und 19 gelöst. Diese Lösungen zeichnen sich durch den besonderen Vorteil aus, daß das planare Bau­ teil von dem die Probe tragenden Substrat im Anschluß an die Polymerisation abgenommen werden kann. Die Probe ist voll­ ständig in dem polymerisierten Material eingebettet.

Bei den nach der Erfindung hergestellten Schnitten handelt es sich um mechanisch stabile und trocken einge­ bettete Proben, die sofort zur Untersuchung zur Verfügung stehen. Lange Trockenvorgänge sind nicht erforderlich. Darüber hinaus sind die Präparate der Proben optisch klar und stabil. Der Brechungsindex der Präparate liegt vorzugs­ weise sehr dicht bei demjenigen der Probe selbst.

Nach der Erfindung wird ein Halterungsmittel ver­ wendet, das ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrig­ viskosen, flüssigen Acryl-Reaktomeren und ein gegenüber Ultraviolettlicht empfindliches Katalysatorsystem ent­ hält. Dieses Halterungsmittel wird für die endgültige Einkapselung benutzt. Das Halterungsmittel bleibt in einem frei fließenden Zustand, bis es polymerisiert ist. Nach der Polymerisation wird daraus ein gehärtetes, op­ tisch klares Medium, das gegenüber Lösungsmitteln un­ durchlässig und beständig ist und die Probe vollständig einkapselt. Dieses Halterungsmittel veranlaßt weder ein Verblassen noch eine Schwächung der Farben und bleibt klar und farblos. Die Acryl-Reaktomeren sind so gewählt, daß sie nach der Polymerisation einen endgültigen Bre­ chungsindex zwischen 1,530 bis 1,570 (im allgemeinen 1,550) haben, der demjenigen der Probe angepaßt ist. Der Brechungsindex kann bekanntlich durch Beimengen von zwei Komponenten mit einem niedrigeren bzw. höheren Brechungsindex und durch entsprechendes Verändern der Anteile gesteuert werden. Man kann auf diese Weise ir­ gendeinen passenden Zwischenwert einstellen.

Da dem enthydratisierten Schnitt eine Trocknung nicht gestattet sein soll, wird der die Probe tragende Objektträger anfangs in einer niedrigviskosen, hoch­ flüchtigen Lösungsmittellösung einer niedrigen Konzen­ tration eines Einbettungs- oder Halterungsmittels ge­ badet. Bei diesem Halterungsmittel kann es sich um das gleiche Material wie bei dem Halterungsmittel handeln, das für die endgültige Einkapselung verwendet wird. Man kann aber auch ein äquivalentes kompatibles Material ver­ wenden, das nach der Polymerisation den gleichen Bre­ chungsindex hat. Im Anschluß an das Bad findet eine Trockenlegung statt. Im Gegensatz zu den üblichen Ver­ fahren wird dabei das Lösungsmittel vollständig ver­ dampft, so daß die Probe mit einer lösungsmittelfreien, jedoch flüssigen, sehr dünnen Schutzschicht aus dem Hal­ terungsmittel überzogen bleibt, wodurch ein Austrocknen verhindert wird. Da die Komponenten dieses Halterungs­ mittels eine äußerst schwache Flüchtigkeit haben, findet keine beachtliche Verdampfung statt. Das Gewebe bleibt somit von dem Halterungsmittel benetzt und durchdrungen. Wenn das Lösungsmittel verdampft ist, was im allgemeinen 1 min lang dauert, wird eine geeignete endgültige Volu­ menmenge oder Schicht des endgültigen einkapselnden Hal­ terungsmittels auf den benetzten Schnitt gebracht, und das Deckgläschen wird gemächlich aufgelegt. Das Halte­ rungsmittel wird dann durch das Deckgläschen oder den Objektträger der Ultraviolettstrahlung einer Lichtquelle ausgesetzt, bei der es sich vorzugsweise um eine Schwarz­ licht-Fluoreszenzlampe geringer Leistung handelt, um die Polymerisation innerhalb 1 min auszuführen. Auf diese Weise werden aufeinanderfolgend aufgetragene Schichten des Halterungsmittels unter dem Deckgläschen vollständig und zu einem Stück ausgehärtet. In dem resultierenden Halterungsmittel ist überhaupt kein Lösungsmittel mehr enthalten, das sonst die Untersuchung stören könnte, die unmittelbar vorgenommen werden kann.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Tech­ nik besteht darin, daß der geringe Überschuß an Halte­ rungsmittel, der aus dem Bereich unter dem Deckgläschen herausgedrückt wird, flüssig bleibt, da er dem Sauerstoff der Atmosphäre ausgesetzt ist, der für dünne Schichten aus Reaktomeren als Polymerisationsinhibitor wirkt, was allgemein bekannt ist. Den mikroskopischen Objektträger kann man somit vollständig mit einem geeigneten Lösungs­ mittel waschen, um das überschüssige flüssige Halterungs­ mittel, das sich zwischen dem Objektträger und dem Deck­ gläschen herausgedrückt hat, zu entfernen, ohne daß dabei das polymerisierte Halterungsmittel beeinträchtigt wird. Das herausgequetschte Halterungsmittel kann auch wegge­ wischt werden, so daß dann das Präparat vollkommen trocken ist und sofort untersucht oder gestapelt wer­ den kann.

Die Erfindung sieht somit die zweimalige Anwen­ dung eines Einbettungs- oder Halterungsmittels vor. Die erste Anwendung des Halterungsmittels erfolgt in Ver­ bindung mit einem flüchtigen Lösungsmittel unmittelbar nach der Entfernung des Objektträgers aus der Klär­ lösung, und die zweite Anwendung wird mit dem reinen Halterungsmittel ausgeführt. Jedes der Halterungsmit­ tel ist polymerisierbar, und zwar vorzugsweise bei Anwendung von Ultraviolettlicht. Die benutzten Halte­ rungsmittel sind miteinander kompatibel. Bei der er­ sten Anwendung des Halterungsmittels läßt man das Lö­ sungsmittel von dem nicht abgedeckten Halterungsmittel vollständig verdampfen, wobei die Probe von dem immer noch in flüssiger Form vorliegenden Halterungsmittel durchtränkt und gegenüber einer Trocknung vollkommen geschützt ist. Während der zweiten Anwendung wird eine zusätzlich erforderliche Menge des Halterungsmittels auf die erste Halterungsmittelschicht aufgetragen. An­ schließend wird ein Deckgläschen aufgebracht, und beide Schichten werden gleichzeitig polymerisiert. Dadurch wachsen die einzeln aufgetragenen Schichten an Halte­ rungsmittel zu einer einzigen integralen Schicht zu­ sammen, die vollkommen frei von Lösungsmitteln ist. Das Präparat kann daher unmittelbar nach der Polymerisation mikroskopisch untersucht werden.

Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung zum dauerhaften und schützenden Einbetten benetzter dünner Schnitte aus biologischen Proben auf mikroskopischen Objektträgern wird somit nach der Erfindung jede Probe zunächst in einem flüchtigen Lösungsmittel gebadet, das eine geringe Konzentration aus einem ersten polymeri­ sierbaren Material enthält. Man gestattet die Ver­ dampfung dieses Lösungsmittels, so daß dann die Probe von dem flüssigen polymerisierbaren Material durch­ drungen und geschützt ist. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels wird die Probe mit einem zweiten poly­ merisierbaren Material beschichtet. Das erste und das zweite polymerisierbare Material enthalten vorzugs­ weise ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigvis­ kosen, flüssigen Acryl-Reaktomeren und aus einem ge­ genüber Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysator­ system. Ein herkömmliches Deckgläschen oder eine an­ dere planare durchsichtige Abdeckung kann auf den poly­ merisierbaren Materialien angeordnet werden. Die Poly­ merisation wird dann unter Einwirkung einer Ultravio­ lettstrahlung durchgeführt. Das jetzt polymerisierte erste und zweite Material umkapseln die Probe auf dem mikroskopischen Objektträger und bilden eine einheit­ liche Masse, die vollständig gehärtet und frei von Lösungsmitteln ist.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfin­ dung wird an Hand einer Zeichnung erläutert. Es zeigt

Fig. 1A eine perspektivische Ansicht eines Aus­ führungsbeispiels einer nach der Erfindung ausgebilde­ ten Vorrichtung zur Halterung von Gewebeproben auf mi­ kroskopischen Objektträgern und

Fig. 1B eine Schnittansicht einer Ausführungsform eines Zusatzgerätes, das in Verbindung mit der in Fig. 1A dargestellten Vorrichtung verwendet wird.

Die in der Fig. 1A dargestellte Vorrichtung ent­ hält eine Zuführeinrichtung 1 zum aufeinanderfolgenden Zuführen von mikroskopischen Objektträgern 3, von denen jeder eine Gewebeprobe 5 trägt, die zur Durchführung von Untersuchungen gehaltert oder eingebettet werden soll. Jeder mikroskopische Objektträger 3 weist einen Kennungs­ abschnitt 7 auf, der zur Identifizierung der betreffenden Gewebeprobe 5 dient. Zunächst ist die Gewebeprobe 5 auf dem betreffenden mikroskopischen Objektträger 3 in übli­ cher Weise aufgebracht, getrocknet, entparaffiniert, hy­ dratisiert, gefärbt, enthydratisiert, geklärt und dann in einer Flüssigkeit gebadet worden, die eine schwach­ konzentrierte (1% bis 25%) Lösung eines Einbettungs- oder Halterungsmittels in einem niedrigviskosen, hoch­ flüchtigen Lösungsmittel enthält. Wie es aus der Fig. 1B hervorgeht, kann sich diese Flüssigkeit in einem Behäl­ ter 9 befinden, in den unmittelbar im Anschluß an den üblichen Klärvorgang jeder mikroskopische Objektträger 3 von einem Techniker eingetaucht wird, wobei man die Ge­ webeprobe mit einem flüchtigen Lösungsmittel, beispiels­ weise Xylol, benetzt läßt. Die Flüssigkeit in dem Behäl­ ter 9 besteht beispielsweise aus Xylol, Toluol oder Freon TF und einem geeigneten Halterungsmittel. Nach dem Baden im Behälter 9 bleibt auf der Gewebeprobe 5 eine dünne Schicht aus der Flüssigkeit zurück. Dem Lösungs­ mittel in dieser Flüssigkeit wird gestattet, vollkommen zu verdampfen, so daß auf beiden Oberflächen des mikro­ skopischen Objektträgers eine sehr dünne Schutzschicht aus einem lösungsmittelfreien flüssigen Halterungsmittel zurückbleibt. Die Gewebeprobe 5 bleibt daher benetzt und wird von dem Halterungsmittel durchdrungen. Die auf die­ se Weise behandelten mikroskopischen Objektträger 3 wer­ den dann nacheinander in die Zuführeinrichtung 1 gegeben, so daß sie aufeinanderfolgend zu einer Beschichtungsein­ heit 11 gelangen, wie es aus der Fig. 1A hervorgeht.

Die Beschichtungseinheit 11 arbeitet derart, daß sie auf der Gewebeprobe 5 eine zweite Schicht aus dem gleichen Einbettungs- oder Halterungsmittel vorsieht, das ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigviskosen flüssi­ gen Acryl-Reaktomeren, wie Monomeren oder Oligomeren von Methacrylaten, Acrylaten und Vinylen, und ferner aus einem gegenüber Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysa­ tor enthält, wie Benzoin, Benzoeäther, Acetophenon oder Michler's Keton. Darüber hinaus veranlaßt die Beschich­ tungseinheit 11, daß die Schichten aus dem Halterungs­ mittel einer ultravioletten Strahlung ausgesetzt werden, deren Spitzenwert nahe bei dem Absorptionsmaximum des Katalysators liegt, wobei beide Schichten gleichzeitig polymerisiert werden. Danach laufen die mikroskopischen Objektträger 3 nacheinander durch eine Waschstation 13, in der die Oberflächen jedes Objektträgers gewaschen werden, um das gesamte daran befindliche, nicht poly­ merisierte Halterungsmittel zu entfernen. Die gewasche­ nen mikroskopischen Objektträger 3 gelangen dann aufein­ anderfolgend zu einer Trockenstation 15, um die Verdamp­ fung der Waschlösung zu beschleunigen. Schließlich er­ reichen sie eine Stapeleinrichtung 17, in der die fertig­ bearbeiteten mikroskopischen Objektträger 3 gesammelt werden, die dann zur unmittelbaren Untersuchung zur Ver­ fügung stehen. Die für das Einbetten bzw. Haltern, Wa­ schen und Trocknen benötigte gesamte Bearbeitungszeit beträgt für jeden einzelnen Objektträger vom Zeitpunkt der Eingabe in die Beschichtungseinheit 11 an etwa 2 min.

Es folgt eine genauere Beschreibung der darge­ stellten Vorrichtung. Jeder mikroskopische Objektträ­ ger 3 mit einer aufgebrachten Gewebeprobe 5 wird im An­ schluß auf das manuelle Eintauchen in die im Behälter 9 enthaltene Flüssigkeit und nach dem Herausnehmen aus dem Behälter 9 von Hand auf die Zuführeinrichtung 1 gelegt. Obwohl das Baden der Objektträger und die Eingabe in die Vorrichtung nach der Fig. 1A als manueller Vorgang er­ läutert ist, kann man diesen Bearbeitungsprozeß auch in die Zuführeinrichtung 1 einbeziehen und somit automati­ sieren. Die Zuführeinrichtung 1, von der in der Fig. 1A lediglich ein Teil gezeigt ist, enthält eine Parallel­ riemenanordnung aus endlosen Riemen 19 und 21 und eine Antriebsrolle 23. Die Antriebsrolle 23 und eine zugehö­ rige nicht dargestellte Leerlaufrolle sind vorzugsweise entlang ihrer mittigen Umfangsoberflächen eingeschnit­ ten, um Schultern zu bilden, über die die Riemen 19 und 21 gezogen sind. Jeder Objektträger 3 wird so auf die parallelen Riemen 19 und 21 gelegt, daß sich die Gewebe­ probe 5 auf der Unterseite des Objektträgers befindet, also zwischen den Riemen angeordnet ist. Zusätzlich sind neben den Riemen 19 und 21 zwei parallele Führungen vor­ gesehen, von denen lediglich die eine Führung 55 gezeigt ist und die dazu dienen, die Objektträger 3 in geeigne­ ter Weise auszurichten und in der ausgerichteten Lage zu halten.

Der Durchtritt jedes mikroskopischen Objektträ­ gers 3 durch die Zuführeinrichtung 1 wird von einer Fühleranordnung abgetastet, die im Hinblick auf die Ver­ arbeitung jedes Objektträgers den Betrieb der darge­ stellten Vorrichtung einleitet. Diese Fühleranordnung enthält einen Finger 25, der an dem einen Ende einer drehbaren Welle 27 befestigt ist. Die Welle 27 wird durch Lager 28 so abgestützt, daß der Finger 25 nach unten in den Spalt zwischen den Riemen 19 und 21 ragt. Beim Vorbeilaufen eines Objektträgers 3 veranlaßt der abtastende Finger 25 eine Drehbewegung der Welle 27, die daraufhin einen Mikroschalter 29 betätigt. Der auf diese Weise betätigte Mikroschalter 29 leitet den Be­ trieb der Beschichtungseinheit 11 ein. Die Beschich­ tungseinheit 11 enthält eine zwischen Leerlaufrollen 35 und 37 horizontal ausgerichtete Stütze oder Platte 31, über die ein kontinuierliches, optisch glattes Band 33 gezogen wird. Das Band 33 kommt von einer Vorratsrolle 39 und wird von einer Aufwickelrolle 41 vorgeschoben. Leerlaufrollen 36 und 38 sorgen für eine geeignete Span­ nung des Bandes 33. Der Betrieb der Aufwickelrolle 41 wird vom Mikroschalter 29 eingeleitet. Die Betätigung des Mikroschalters 29 löst darüber hinaus die Abgabe des Halterungsmittels auf die obere Oberfläche 43 des Ban­ des 33 zur endgültigen Einkapselung der auf dem Objekt­ träger 3 befindlichen Gewebeprobe 5 aus. Der Objektträ­ ger gelangt dann auf das Band 33 und wird zur Beschich­ tungseinheit 11 weiterbewegt.

Ein Spender 45 ist oberhalb und nahe bei der oberen Oberfläche 43 des Bandes 33 angeordnet und über ein Ventil 47 sowie eine Leitung 49 mit einer unter Druck stehenden Quelle 51 verbunden, die das Einbettungs- oder Halterungsmittel enthält. Durch das Schließen des Mikroschalters 29 wird das Ventil 47 unter Beachtung einer geeigneten Verzögerung betätigt, um eine kontinu­ ierliche Menge 53 an Halterungsmittel auf die Oberflä­ che 43 des Bandes 33 zu geben. Die Länge der faden- oder bandförmigen Menge 53 entspricht vorzugsweise der Länge eines mikroskopischen Objektträgers. Weiterhin wird die Halterungsmittelmenge mit einer solchen Geschwindigkeit abgegeben, daß letztlich zwischen den sich gegenüber­ stehenden Oberflächen des Objektträgers 3 und des Ban­ des 33 eine dünne Schicht aus dem Halterungsmittel ge­ bildet wird. Dies wird noch im einzelnen erläutert.

Aus der Fig. 1A geht hervor, daß die mikroskopi­ schen Objektträger 3 aufeinanderfolgend von den Riemen 19 und 21 der Zuführeinrichtung 1 auf eine erste Rampen­ anordnung aus den bereits genannten Führungen 55 gelan­ gen, von denen lediglich die eine dargestellt ist. Die Führungen 55 sind spiegelbildlich in L-förmiger Gestalt vorgesehen, um eine Schulter zu bilden, die den Objekt­ träger 3 trägt und zu seiner Orientierung dient. Die Neigung der Führungen 55 ist an dieser ersten Rampenan­ ordnung so gewählt, daß der mikroskopische Objektträger 3 unter Einwirkung der Schwerkraft auf das Band 33 gelangt. In Anbetracht des Vorschubs des Bandes 33 gelangt der Objektträger 3 auf die Halterungsmittelmenge 53, die der Spender 45 auf die Oberfläche des Bandes 33 aufge­ tragen hat. Wenn das Band 33 anfangs mit der Vorderkan­ te des mikroskopischen Objektträgers 3 in Berührung kommt, veranlaßt der sich anlegende Objektträger, daß das Halterungsmittel zu den Rändern hin gedrückt wird. Dies hat zur Folge, daß sich das Halterungsmittel in dem gesamten Bereich der sich gegenüberstehenden Oberflächen des Bandes und des Objektträgers ausbreitet. Das Band 33 übernimmt somit die Funktion des in der üblichen Technik benutzten Deckgläschens. Das Volumen des auf das Band 33 aufgebrachten Halterungsmittels sollte nur um weniges die Menge übertreffen, die erforderlich ist, um die Ausbil­ dung einer kontinuierlichen Schicht des Halterungsmittels zwischen den sich gegenüberstehenden Oberflächen sicher­ zustellen. Die zwangsläufig erfolgende Ausbreitung des Halterungsmittels zwischen den sich gegenüberstehenden Oberflächen des mikroskopischen Objektträgers 3 und des Bandes 33 sowie die Planparallelität des Bandes 33 ge­ währleisten, daß irgendwelche bestehenden Oberflächen­ unregelmäßigkeiten in der ersten Schicht aus dem Halte­ rungsmittel aufgefüllt werden und daß die endgültige Schicht aus dem Halterungsmittel optisch glatt und eben bzw. planar ist.

Wenn das Band 33 unter der Einwirkung der Auf­ wickelrolle 41 weiter vorgeschoben wird, läuft der mi­ kroskopische Objektträger 3 durch eine Kammer 57, die eine geeignete Schwarzlichtlampe enthält, um die Halte­ rungsmittelschichten zwischen den einander gegenüber­ liegenden Oberflächen des Objektträgers 3 und des Ban­ des 33 zu polymerisieren. Die nicht dargestellte Lampe wird von dem Mikroschalter 29 gleichzeitig mit der Be­ tätigung der Aufwickelrolle 41 eingeschaltet. Somit werden in der Kammer 57 die Halterungsmittelschichten zwischen dem Band 33 und dem Objektträger 3 vollständig polymerisiert.

Wie es aus der Fig. 1A hervorgeht, wird die Rich­ tung des Bandes 3 hinter der Leerlaufrolle 37 umgelenkt, und zwar mit Hilfe der Leerlaufrolle 38, die als Span­ nungsrolle dient. Dabei wird das Band 33 von der Ober­ fläche des jetzt polymerisierten Halterungsmittels abge­ schält und von der Aufwickelrolle 41 aufgenommen. Die jetzt freiliegende Oberfläche des die Gewebeprobe 5 ein­ kapselnden Halterungsmittels ist infolge der Beschaffen­ heit des Bandes 33 im wesentlichen optisch glatt und pla­ nar. Irgendwelche geringfügigen Überschußmengen des Hal­ terungsmittels, die aus dem Bereich zwischen dem Band 33 und dem mikroskopischen Objektträger 3 herausgedrückt wurden sowie eine auf den Oberflächen des Objektträgers befindliche Schutzschicht haben an der Reaktion nicht teilgenommen, da die Polymerisation infolge des Ausgesetzt­ seins gegenüber dem Sauerstoff in der Atmosphäre ver­ hindert worden ist. Die mikroskopischen Objektträger 3 gelangen dann auf eine zweite Rampenanordnung, die eben­ falls aus den spiegelbildlich angeordneten, L-förmigen Führungen 55 gebildet wird. Unter der Einwirkung der Schwerkraft gelangen die mikroskopischen Objektträger 3 an der zweiten Rampenanordnung auf eine Parallelriemen­ anordnung aus miteinander verketteten Riemen 61 und 63. Die Riemen 61 und 63 sind über Schultern gezogen, die an den stirnseitigen Enden einer geeigneten Antriebs­ rolle 65 und einer zugehörigen Leerlaufrolle 67 ausge­ bildet sind. Die mittige Umfangsoberfläche der Rollen 65 und 67 ist vorzugsweise mit einer Ausnehmung verse­ hen. Die Antriebsrolle 65 wird gleichzeitig mit der Ab­ gabe eines mikroskopischen Objektträgers 3 auf die zweite Rampenanordnung betätigt, und zwar ebenfalls von dem Mi­ kroschalter 29 mit entsprechender Verzögerung.

Die Waschstation 13 enthält eine Kammer 69 mit Öffnungen in gegenüberliegenden Wandabschnitten 71 und 73, so daß die endlosen Riemen 61 und 63 durch die Kam­ mer 69 laufen können. Abschnitte 75 der Führungen 55 halten die Orientierung der mikroskopischen Objektträ­ ger 3 auf den Riemen 61 und 63 während des Durchtritts durch die Kammer 69 aufrecht. Von einem Behälter 77 wird ein geeignetes Waschfluid, beispielsweise Freon TF, zu­ geführt, um die nicht reagierten Anteile des Einbettungs- oder Halterungsmittels von den Oberflächen des mikrosko­ pischen Objektträgers 3 zu entfernen. Der Behälter 77 enthält eine Verdrängerpumpe, die gleichzeitig mit dem Antrieb der Antriebsrolle 65 vom Mikroschalter 29 be­ tätigt wird. Der Auslaß der Pumpe führt zu einer Lei­ tung 79, die in zwei Leitungen 81 und 83 aufzweigt. Die Auslässe der Leitungen 81 und 83 sind derart angeordnet, daß das von der Pumpe geförderte Waschfluid auf die un­ tere und obere Oberfläche des mikroskopischen Objektträ­ gers 3 gelangt, während er die Kammer 69 passiert. Vor­ zugsweise sind die Auslässe der Leitungen 81 und 83 so ausgerichtet, daß der Waschfluidstrahl im wesentlichen senkrecht auf die Oberflächen des Objektträgers 3 auf­ trifft. Das Waschfluid wird am Boden der Kammer 69 ge­ sammelt und gelangt dann über einen Abfluß 85 und eine Leitung 87 zurück in den Behälter 77.

Der aus der Kammer 69 austretende und von den Riemen 61 und 63 weiterbewegte Objektträger 3 gelangt dann zwischen Gebläse 88 und 89, die gleichzeitig mit der Betätigung der Antriebsrolle 65 und der Betätigung der Pumpe im Behälter 77 eingeschaltet worden sind. Die Gebläse 88 und 89 sind derart angeordnet, daß sie warme Luft auf die untere und obere Oberfläche des mikroskopi­ schen Objektträgers 3 blasen, um irgendwelche daran an­ haftende Reste des Waschfluids zum Verdampfen zu bringen. Mit diesem Bearbeitungsvorgang ist die Halterung oder Einbettung der Gewebeprobe 5 auf dem mikroskopischen Objektträger 3 beendet, und der Objektträger steht für die unmittelbare Untersuchung zur Verfügung.

Im Anschluß an den Trocknungsvorgang gelangt der mikroskopische Objektträger 3 von den Riemen 61 und 63 in eine Stapeleinrichtung 17. Die Stapeleinrichtung 17 enthält einen Speicherbehälter 91, der eine mit ihm ein­ stückige Rampe 93 aufweist, über die die mikroskopischen Objektträger 3 aufeinanderfolgend von den Riemen 61 und 63 in den Speicherbehälter gleiten. Die Enden der Füh­ rungen 55 arbeiten mit der Rampe 93 zusammen, um die Orientierung der mikroskopischen Objektträger aufrecht­ zuhalten. Der Speicherbehälter 91 weist einen Doppel­ boden 97 auf, der von einer Feder 99 nach oben gedrückt wird, um das Auftreffen der mikroskopischen Objektträ­ ger 3 so klein wie möglich zu halten. Der Speicherbehäl­ ter 91 hat vorzugsweise vier Seitenwände, von denen in der Zeichnung zwei weggelassen sind, um das Aufstapeln der gesammelten mikroskopischen Objektträger 3 besser darzustellen. Da das Halterungsmittel, das die Gewebe­ probe 5 auf dem Objektträger 3 einkapselt, vollkommen zur Reaktion gebracht und getrocknet worden ist, hat das sofortige Aufstapeln der Objektträger weder eine nachteilige Beeinträchtigung der optischen Eigenschaf­ ten noch ein nachteiliges Zusammenkleben der Objekt­ träger zur Folge.

Die Betriebsweise der in der Fig. 1A dargestell­ ten Vorrichtung wurde im Zusammenhang mit dem Einbet­ ten von Gewebeproben auf einzelnen mikroskopischen Ob­ jektträgern beschrieben. Die Komponenten der Vorrichtung werden dabei von dem Mikroschalter 29 derart gesteuert, daß sie jeweils für eine hinreichend lange Zeit in Be­ trieb sind, um die einzelnen mikroskopischen Objektträ­ ger beim Durchgang durch die Vorrichtung zu bearbeiten. Dieselben Komponenten könnte man auch auf einer konti­ nuierlichen Basis betreiben, um Gewebeproben einzubet­ ten, die aufeinanderfolgend und automatisch von der Zu­ führeinrichtung 11 eingegeben werden könnten.

Hieraus sieht man, daß lediglich ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert wurde. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Prinzips sind zahlreiche Abwandlungen und Modifikationen denkbar.

Claims (27)

1. Verfahren zum Haltern gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe auf der Oberfläche eines durchsichtigen Substrats, bei dem eine Schicht aus einem polymerisierbaren Material auf der die biologische Probe tragenden Oberfläche des durchsichtigen Substrats aufgebracht wird, die mit dem polymerisierbaren Material bedeckte Probe mit einem plana­ ren Bauteil abgedeckt wird, das für Sauerstoff undurchläs­ sig ist, und die Schicht aus dem polymerisierbaren Material polymerisiert wird, das im polymerisierten Zustand durch- sichtig ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbringen der Schicht aus dem polymerisierbaren Material derart vorgenommen wird, daß zunächst die mit einem ersten flüchtigen Lösungsmittel benetzte und auf der einen Oberfläche des durchsichtigen Substrats angeordnete biologische Probe mit einem zweiten flüchtigen Lösungsmittel gebadet wird, das eine schwache Konzentration eines ersten polymerisierbaren Materials zum Durchdringen der Probe ent­ hält, und anschließend nach dem Verdampfen des zweiten Lö­ sungsmittels eine dünne Schicht aus einem zweiten polymeri­ sierbaren Material auf der von dem ersten polymerisierbaren Material durchsetzten Probe aufgebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite Material gleichzeitig polyme­ risiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens das zweite Material ein gegenüber Ultra­ violettlicht empfindliches Katalysatorsystem enthält und daß wenigstens das zweite Material zu seiner Polarisation einer Ultraviolettstrahlung ausgesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem planaren Bauteil und dem Substrat das überschüssige erste und zweite Material herausgedrückt wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nur Teile des zwischen dem Substrat und dem planaren Bauteil angeordneten ersten und zweiten Material polymeri­ siert werden.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat zum Entfernen von nicht polymerisierten Mengen des ersten und des zweiten Materials von der Sub­ stratoberfläche gewaschen wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Polymerisation des ersten und des zweiten Materials das planare Bauteil entfernt wird.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl das erste als auch das zweite Material im poly­ merisierten Zustand einen Brechungsindex haben, der demje­ nigen der Probe angenähert ist.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite Material nach der Polymeri­ sation den gleichen Brechungsindex haben.

10. Vorrichtung zum Haltern gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe auf der Oberfläche eines durchsich­ tigen Substrats, gekennzeichnet durch einen Behälter (9) zum Baden des die Probe tragenden Substrats in einer Lösungsmittellösung aus polymerisierbarem Material zwecks Ausbildung einer ersten Schicht auf der Oberfläche des Substrats (3) und zwecks Durchdringung der Probe (5), einen Spender (45 bis 51) zum Aufbringen einer zweiten Schicht eines polymerisierbaren Materials auf der ersten Schicht im Anschluß an das Verdampfen des Lösungsmittels von der ersten Schicht, ein planares Teil (33), das gegenüber Sauerstoff undurchlässig ist, zum Ausbilden der freien Oberfläche der zweiten Schicht als eine optisch glatte Ebene, die sich im wesentlichen parallel zu derjenigen des Substrats (3) er­ streckt, und eine Strahlungsquelle zur Polymerisation der ersten und der zweiten Schicht zwecks Einkapselung der Probe.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Schicht ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigviskosen flüssigen Acryl-Reaktomeren und einem gegen­ über Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysatorsystem enthält.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Schicht jeweils ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigviskosen flüssigen Acryl-Reaktomeren und einem gegenüber Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysa­ torsystem enthalten und daß zur Polymerisation der ersten und der zweiten Schicht eine Strahlungsquelle für Ultra­ violettlicht vorgesehen ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Schicht im polymerisierten Zustand einen Brechungsindex haben, der im wesentlichen innerhalb des Bereiches von 1,530 bis 1,570 liegt.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Materialien, die die erste und die zweite Schicht bilden, jeweils flüssige Acryl-Reaktomere enthalten, die aus einer Gruppe bestehend aus Methacrylat-, Acrylat- und Vinyl-Monomeren und -Oligomeren ausgewählt sind.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß unter der Einwirkung der Schwerkraft überschüssiges Material, das die erste und die zweite Schicht bildet, zwischen dem Substrat (3) und dem planaren Teil (33) herausgedrückt wird.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sich das planare Teil (33) wenigstens über der Probe (5) erstreckt, die von dem Substrat (3) getragen wird.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Förder- und Führungseinrichtung (31, 35, 55) vorge­ sehen ist, die das planare Teil (33) auf die zweite Schicht legt, bevor die erste und die zweite Schicht in einer Kammer (57) polymerisiert werden, wobei das mit der zweiten Schicht in Berührung stehende planare Teil (33) optisch glatt ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß Führungen (37, 55) vorgesehen sind, die das planare Teil (33) im Anschluß an die Polymerisation in der Kammer (57) von der ersten und zweiten Schicht entfernen.

19. Vorrichtung zum Haltern gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe auf der Oberfläche eines durchsichtigen Substrats, gekennzeichnet durch eine Förder- und Führungseinrichtung (19, 21, 31, 33, 35, 37, 61, 63, 65) zum Vorschieben einer Anzahl aufeinander­ folgender, probentragender Substrate (3) längs einer vorbe­ stimmten Bahn, wobei jedes Substrat (3) auf seiner einen Oberfläche die Probe (5) trägt und mit einem flüchtigen Lösungs­ mittel benetzt ist, das eine niedrige Konzentration eines ersten polymerisierbaren Materials enthält, ein längs dieser Bahn angeordneter Spender (45 bis 51), der diese Oberfläche jedes Substrats und das Material im Anschluß an die Verdamp­ fung des Lösungsmittels aus dem ersten Material mit einem schwachflüchtigen, niedrigviskosen polymerisierbaren zweiten Material bedeckt, ein planares Teil (33), das die freie Ober­ fläche des zweiten Materials in eine optisch glatte Ebene aus­ gestaltet, die im wesentlichen parallel zur Ebene des Sub­ strats (3) verläuft, und eine längs der Bahn angeordnete Strahlungsquelle zum Polymerisieren des ersten und des zwei­ ten Materials, wobei das erste und das zweite Material im polymerisierten Zustand durchsichtig sind.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das planare Teil (33) sich wenigstens über die Probe (5) erstreckt und gegenüber Sauerstoff undurchlässig ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das die Oberfläche des zweiten Materials optisch glatt ausbildende planare Teil (33) ein kontinuierliches Band ist, das in enger Nachbarschaft zu der Bahn bewegbar ist, und daß die Förder- und Führungseinrichtung (19, 21, 31, 33, 35, 37, 61, 63, 65) das Band mit der Schicht aus dem zweiten Material in Berührung bringt.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß Führungen (37, 38) vorgesehen sind, die im Anschluß an die Polymerisation des zweiten Materials das Band von der Oberfläche der zweiten Schicht wegführen.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß längs der Bahn eine Waschstation (13) zum Waschen der Substrate (3) nach erfolgter Polymerisation des ersten und des zweiten Materials vorgesehen ist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Spender (45 bis 51) das zweite Material auf das Band aufträgt und daß die Förder- und Führungseinrichtung (19, 21, 31, 33, 35, 37, 61, 63, 65) das Substrat (3) auf das Band auflegt.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und zweite Material ein gegenüber Ultraviolett­ licht empfindliches Katalysatorsystem enthalten und daß längs der Bahn eine Polymerisationskammer (57) angeordnet ist, die zur Polymerisation der ersten und der zweiten Schicht die Strahlungsquelle enthält, die für UV-Licht ausgelegt ist.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, gekennzeichnet durch ein Gebläse (88, 89) zum Trocknen von jedem der Substrate (3) aufeinanderfolgend und im Anschluß an den Waschvorgang.

27. Vorrichtung nach Anspruch 26, gekennzeichnet durch einen Behälter (17) zum Sammeln der Substrate (3) aufeinan­ derfolgend und im Anschluß an den Trockenvorgang.