DE2754351A1

DE2754351A1 - Verfahren und vorrichtung zum haltern gefaerbter duenner schnitte einer biologischen probe

Info

Publication number: DE2754351A1
Application number: DE19772754351
Authority: DE
Inventors: Julius Intraub; Leonard Ornsteing; Hazel E Williams
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-12-10
Filing date: 1977-12-07
Publication date: 1978-06-15
Also published as: BE860067A; IT1091166B; CH626174A5; CA1081591A; SE439696B; FR2373805A1; DE2754351C2; FR2373805B1; JPS626177B2; AU501982B2; JPS5372639A; US4120991A; GB1586618A; AU2789277A; SE7708010L; NL7710904A

Description

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TECrZIICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Verfahren und Vorrichtung zum Haltern gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe

Die Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren und einer Vorrichtung zum schnellen Herstellen von dauerhaften, optisch durchsichtigen Präparaten von biologischen Proben auf mikroskopischen Objektträgern für cytologische, histologische und pathologische Untersuchungen.

Es ist auf dem Gebiet der Medizin allgemein üblich, dünne Schnitte biologischer Proben zur mikroskopischen Untersuchung auf Glasplättchen anzubringen. Diese Schnitte sind zur Erleichterung der Untersuchung gefärbt und entwässert und wurden einem Einbettungsoder Kalterungsvorgang ausgesetzt. Bei diesem Halterungsvorgang wird im allgemeinen jede einzelne Probe von einem Medium umschlossen, das von dem mikroskopischen Objektträger getragen wird. In diesem Einbettungsmedium ist die Probe für eine praktisch unendlich lange Zeit konserviert. Es besteht derzeit die Neigung, als Einbettungsmedium oder Halterungsmittel eine Lösungsmittellösung aus harten Kunstharzen zu verwenden. Diese Kunstharze sind derart gewähltj daß sie (1) keine Verblassung der Farben bewirken, mit denen die Proben behandelt sind, (2) im Laufe der Zeit möglichst wenig vergilben und (3) nach dem Trocknen einen Brechungsindex haben, der sehr dicht bei dem durchschnittlichen Brechungsindex (1,530 bis 1,570) der Gewebe liegt. Bei der Verwendung eines Halterungsmittel mit eiTfien Brechungsindex, der nahe bei demjenigen des Gewebes liegt, wird eine nahezu vollkommene Durchsichtigkeit erreicht. Sehr oft wird ein Pinenharz als Halterungsmittel

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verv/endet. Andere verfügbare Halterungsmittel sind in der Tabelle 5-1 auf der Seite 98 der Druckschrift "Histopathic Technique and Practical Histo-chemistry" zusammengestellt.

Im allgemeinen wird das Halterungsmittel in einer Lösungsmittelmenge aufgelöst, um zum bequemen Auftragen eines gesteuerten Volumens auf die Probe eine geeignete Viskosität einzustellen. Um eine für die mikroskopische Untersuchung erforderliche planare obere Oberfläche zu erhalten, ist es im allgemeinen üblich, über das aufgetragene Halterungsmittel ein Deckgläschen zu schieben, solange das Halterungsmittel noch in flüssiger Form vorliegt. Um das gesamte Lösungsmittel zu entfernen, dessen Gegenwart die mikroskopische Untersuchung stören kann, werden die Objektträger einem langwierigen Trockenvorgang unterzogen, der einige Tage oder noch länger dauern kann. Während dieses Vorganges werden die Objektträger in eine horizontale Lage gebracht und manchmal in einer warmen Umgebung gehalten, um die Verdampfung des Lösungsmittels zu erleichtern. Die Verdampfung des Lösungsmittels ist wesentlich, und zwar (1) um das Halterungsmittel zu härten, (2) um das Deckgläschen abzudichten, so daß man den Objektträger leicht und bequem handhaben kann, und (3) um während der mikroskopischen Untersuchung eine optische Störung durch restliches Lösungsmittel zu vermeiden, das einen niedrigen Brechungsindex hat.

Zur Zeit werden der Einbettungs- oder Halterungsvorgang sowie der Trockenvorgang von Hand im Labor ausgeführt. Nach der Entfernung des Objektträgers aus der sog. Klärlösung und dem schnellen Abtrocknen der Klärlösung werden im allgemeinen von einem Techniker einige Tropfen des Halterungsmittels auf die Probe aufgebracht. Die Menge des Halterungsmittels sollte gerade hinreichend

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sein, urn den Raum zwischen dem anschließend aufgebrachten Deckgläschen und der Probe auszufüllen. Unmittelbar nach den Aufbringen des Halterungsmittels legt der Techniker das Deckgläschen sehr sanft auf das Halterungsmittel auf. Diese Technik sieht vor, daß zunächst die eine Seite des Deckgläschens mit dem Halterungsmittel in Berührung gebracht wird. Das Deckgläschen wird dann nach unten in seine richtige Lage geschoben, wobei es einen Teil des Halterungsmittels vor sich herschiebt. Oft ist es notwendig, daß die Lage des Deckgläschens durch den Techniker korrigiert werden muß, um das Halterungsmittel als dünne gleichförmige Schicht auszubilden und unter dem Deckgläschen eingefangene Luftblasen zu entfernen sowie das Deckgläschen über der Probe richtig zu zentrieren. Irgendwelche überschüssigen Mengen des Halterungsmittels, die über das Deckgläschen hinaus herausgedrückt v/erden, müssen schnell und sorgfältig entfernt werden, beispielsweise mit Hilfe eines absorptionsfähigen Papiers.

Die größten Schwierigkeiten bei der Einbettung oder Halterung der Proben sind: (1) Nachdem die Probe aus dem Klärmittel entfernt worden ist, führt eine verzögerte Anwendung des Halterungsmittels zu einer Austrocknung der Probe, womit eine Verschlechterung der Gewebestruktur verbunden ist. (2) Die Menge des Halterungsmittels ist nicht richtig ausgewählt, so daß der resultierende Film unter dem Deckgläschen entweder zu dick oder zu dünn ist oder die Ebene des Deckgläschens nicht parallel zu dem mikroskopischen Objektträger verläuft. (3) Bei einem zu schnellen oder flüchtigen Auflegen des Deckgläschens können Luftblasen eingefangen werden, deren Freigabe oder Entfernung zunehmend schwieriger wird, je mehr das Halterungsmittel trocknet.

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Die herkömmlichen Verfahren, die nur kurz erläutert worden sind, sind mit an sich gut bekannten Nachteilen behaftet:

1. Da die Probe, wenn man eine Trocknung zuläßt, Schaden nehmen kann, muß der Techniker das Halterungsmittel sorgfältig und schnell auftragen.

2. Da das Lösungsmittel in dem Einbettungs- oder Halterungsmittel einen niedrigen Brechungsindex hat und während des Trockenvorganges nur langsam unter dem Deckgläschen herausdiffundiert, wird das Halterungsmittel im allgemeinen mit einer minimalen Menge an Lösungsmittel angesetzt, die gewöhnlich gerade ausreicht, um das Halterungsmittel bequem aufzutragen. Wenn dann aber das Aufschieben des Deckgläschens verzögert wird, kann die Trocknung der Oberfläche des Halterungsmittels einsetzen, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, daß Luftblasen unter dem Deckgläschen eingefangen werden. Das Deckgläschen muß folglich sowohl sorgfältig als auch schnell auf dem Halterungsmittel angeordnet v/erden.

3. Falls ein Überschuß des Halterungsmittels aufgetragen worden ist, muß dieser Überschuß über die Kanten des Deckgläschens hinaus gedrückt werden. Die Entfernung der überschüssigen Menge kann die Anwendung eines geeigneten Lösungsmittels erforderlich machen, das unter das Deckgläschen fließen und dann auch darunter befindliches Halterungsmittel entfernen kann. Es treten dann wieder Lufträume auf, die die Untersuchung stören können.

4. Während des Trockenvorganges muß man den Objektträger für eine beachtlich lange Zeitspanne auf eine ebene horizontale Oberfläche setzen. Eine Neigung des Objektträgers während dieses Vorganges veranlaßt nämlich oft, daß das Deckgläschen von dem Gewebeschnitt herunterrutscht. Da die Ränder des Halterungsmittels geringfügig über den Rand des Deckgläschens hinausragen und die Diffusion des Lösungsmittels unter dem Deckgläschen heraus

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die Ränder des Deckgläschens in einem klebrigen Zustand hält, ist es nicht möglich, die Objektträger bis zur vollständigen Beendigung des Trockenvorganges in einer effizienten V/eise zu speichern bzw. zu lagern.

5. Selbst nach einem sehr langen Trockenvorgang bleibt eine minimale Menge des Lösungsmittels unter dem Kittenabschnitt des Deckgläschens. Da das Lösungsmittel einen verhältnismäßig niedrigen Brechungsindex hat, sind die optischen Eigenschaften des Objektträgers für eine relativ lange Zeit nicht optimal.

6. Falls die Gewebeprobe eine erhöhte Stelle aufweist, ist unter dem Dackgläschen eine dicke Halterungsmittelschicht erforderlich. Dadurch wird der Trockenvorgang verzögert, und als Ergebnis der Verdampfung des Lösungsmittels kommt es zu einer beachtlichen Schrumpfung des Halterungsmittels. Diese Schrumpfung tritt oft ungleichmäßig und nur an bestimmten Stellen auf, so daß es unter den Deckgläschen zur Ausbildung von Lufträumen kommt, die Gewebeeinzelheiten abdecken.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, zum Einbetten oder Haltern von Gewebeproben ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, die die Gesamtbearbeitungszeit beträchtlich herabsetzen.

I,^Tach der Erfindung soll insbesondere der bei der üblichen Technik erforderliche, äußerst lange Trockenvorgang vermieden v/erden, und zwar unter Schaffung von mechanisch stabilen und trocken eingebetteten Proben, die sofort zur Untersuchung zur Verfügung stehen.

'weiterhin sollen die Präparate der Proben optisch klar und stabil sein und einen Brechungsindex haben» der sehr dicht bei demjenigen der Probe liegt.

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Nach der Erfindung wird ein Halterungsmittel verwendet, das ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigviskosen, flüssigen Acryl-Reaktomeren und ein gegenüber Ultraviolettlicht empfindliches Katalysatorsystem enthält. Dieses Halterungsmittel wird für die endgültige Einkapselung benutzt. Das Halterungsmittel bleibt in einem frei fließenden Zustand, bis es polymerisiert ist. Mach der Polymerisation wird daraus ein gehärtetes, optisch klares Medium, das gegenüber Lösungsmitteln undurchlässig und beständig ist und die Probe vollständig einkapselt. Dieses Halterungsmittel veranlaßt weder ein Verblassen noch eine Schwächung der Farben und bleibt klar und farblos. Die Acryl-Reaktomeren sind so gewählt, daß sie nach der Polymerisation einen endgültigen Brechungsindex zwischen 1,530 bis 1,570 (im allgemeinen 1,550) haben, der demjenigen der Probe angepaßt ist. Der Brechungsindex kann bekanntlich durch Beimengen von zwei Komponenten mit einem niedrigeren bzw. höheren Brechungsindex und durch entsprechendes Verändern der Anteile gesteuert werden. Man kann auf d\c;je Weise irgendeinen passenden Zwischenwert einstellen.

Da dem enthydratisierten Schnitt eine Trocknung nicht gestattet sein soll, wird der die Probe tragende Objektträger anfangs in einer niedrigviskosen, hochflüchtigen Lösungsmittellösung einer niedrigen Konzentration eines Einbettungs- oder Halterungsmittels gebadet. Bei diesem Halterungsmittel kann es sich um das gleiche Material wie bei dem Halterungsmittel handeln, das für die endgültige Einkapselung verwendet wird. Man kann aber auch ein äquivalentes kompatibles Material verwenden, das nach der Polymerisation den gleichen Brechungsindex hat. Im Anschluß an das Bad findet eine Trockenlegung statt. Im Gegensatz zu den üblichen Verfahren wird dabei das Lösungsmittel vollständig verdampft, so daß die Probe mit einer lösungsmittelfreien,

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jedoch flüssigen, sehr dünnen Schutzschicht aus dem Halterungsmittel überzogen bleibt, wodurch ein Austrocknen verhindert v/ird. Da die Komponenten dieses Halterungsmittels eine äußerst schwache Flüchtigkeit haben, findet keine beachtliche Verdampfung statt. Das Ge\7ebe bleibt somit von dem Halterungsmittel benetzt und durchdrungen. Wenn das Lösungsmittel verdampft ist, was im allgemeinen 1 min lang dauert, v/ird eine geeignete endgültige Volumenmenge oder Schicht des endgültigen einkapselnden Halterungsmittels auf den benetzten Schnitt gebracht, und das Deckgläschen wird gemächlich aufgelegt. Das Halterungsmittel wird dann durch das Deckgläschen oder den Objektträger der Ultraviolettstrahlung einer Lichtquelle ausgesetzt, bei der es sich vorzugsweise um eine Schwarzlicht-Fluoreszenzlampe geringer Leistung handelt, um die Polymerisation innerhalb 1 min auszuführen. Auf diese V/eise werden aufeinanderfolgend aufgetragene Schichten des Halterungsmittels unter dem Beckgläseaen vollständig und zu einem Stück ausgehärtet. In dem resultierenden Halterungsmittel ist überhaupt kein Lösungsmittel mehr enthalten, das sonst die Untersuchung stören könnte, die unmittelbar vorgenommen werden kann.

Ein W3iterer Vorteil der erfindungsgemäßen Technik besteht darin, daß der geringe Überschuß an Halterungsmittel, der aus dem Bereich unter dem Deckgläschen herausgedrückt wird, flüssig bleibt, da er dem Sauerstoff der Atmosphäre ausgesetzt ist, der für dünne Schichten aus Reaktomeren als Polymerisationsinhibitor wirkt, was allgemein bekannt ist. Den mikroskopischen Objektträger kann man somit vollständig mit einem geeigneten Lösungsmittel waschen, um das überschüssige flüssige Halterungsmittel, das sich zwischen dem Objektträger und dem Deckgläschen herausgedrückt hat, zu entfernen, ohne daß dabei das polymerisierte Halterungsmittel beeinträchtigt wird. Das herausgequetschte Halterungsmittel kann auch v/egge-

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wischt werden, so daß dann das Präparat vollkommen trocken ist und sofort untersucht oder gestapelt werden kann.

Die Erfindung sieht somit die zweimalige Anwendung eines Einbettungs- oder Halterungsmittels vor. Die erste Anwendung des Halterungsmittels erfolgt in Verbindung mit einem flüchtigen Lösungsmittel unmittelbar nach der Entfernung des Objektträgers aus der Klärlösung, und die zweite Anwendung wird mit dem reinen Halterungsmittel ausgeführt. Jedes der Halterungsmittel ist polymerisierbar, und zwar vorzugsweise bei Anwendung von Ultraviolettlicht. Die benutzten Halterungsmittel sind miteinander kompatibel. Bei der ersten Anwendung des Halterungsmittels läßt man das Lösungsmittel von dem nicht abgedeckten Halterungsmittel vollständig verdampfen, wobei die Probe von dem immer noch in flüssiger Form vorliegenden Halterungsmittel durchtränkt und gegenüber einer Trocknung vollkommen geschützt ist. Während der zweiten Anwendung wird eine zusätzlich erforderliche Menge des Halterungsmittels auf die erste Halterungsmittelschicht aufgetragen. Anschließend wird ein Deckgläschen aufgebracht, und beide Schichten werden gleichzeitig polymerisiert. Dadurch wachsen die einzeln aufgetragenen Schichten an Halterungsmittel zu einer einzigen integralen Schicht zusammen, die vollkommen frei von Lösungsmitteln ist. Das Präparat kann daher unmittelbar nach der Polymerisation mikroskopisch untersucht werden.

Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung zum dauerhaften und schützenden Einbetten benetzter dünner Schnitte aus biologischen Proben auf mikroskopischen Objektträgern wird somit nach der Erfindung jede Probe zunächst in einem flüchtigen Lösungsmittel gebadet, das eine geringe Konzentration aus einem ersten polymeri-

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sierbaren Material enthält. Man gestattet die Verdampfung dieses Lösungsmittels, so daß dann die Probe von dem flüssigen polymerisierbaren Material durchdrungen und geschützt ist. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels v/ird die Probe mit einem zweiten polymerisierbaren Material beschichtet. Das erste und das zweite polymerisierbare Material enthalten vorzugsweise ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigviskosen, flüssigen Acryl-Reaktomeren und aus einem gegenüber Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysatorsystem. Ein herkömmliches Deckgläschen oder eine andere planare durchsichtige Abdeckung kann auf den poly merisierbaren Materialien angeordnet werden. Die Polymerisation wird dann unter Einwirkung einer Ultraviolettstrahlung durchgeführt. Das jetzt polymerisierte erste und zweite Material umkapseln die Probe auf dem mikroskopischen Objektträger und bilden eine einheitliche Masse, die vollständig gehärtet und frei von Lösungsmitteln ist.

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Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung wird an Hand einer Zeichnung erläutert. Es zeigt:

Fig. 1A eine perspektivische Ansicht eines Ausführungsbeispiels einer nach der Erfindung ausgebildeten Vorrichtung zur Halterung von Gewebeproben auf mikroskopischen Objektträgern und

Fig. 13 eine Schnittansicht einer Ausführungsform eines Zusatzgerätes, das in Verbindung mit der in Fig. 1A dargestellten Vorrichtung verwendet wird.

Die in der Fig. 1A dargestellte Vorrichtung enthält eine Zuführeinrichtung 1 zum aufeinanderfolgenden Zuführen von mikroskopischen Objektträgern 3, von denen jeder eine Gewebeprobe 5 trägt, die zur Durchführung von Untersuchungen gehaltert oder eingebettet werden soll. Jeder mikroskopische Objektträger 3 weist einen Kennungsabschnitt 7 auf, der zur Identifizierung der betreffenden Gev/ebeprobe 5 dient. Zunächst ist die Gewebt.probe 5 auf dem betreffenden mikroskopischen Objektträger 3 in üblicher Weise aufgebracht, getrocknet, entparaffiniert, hydratisiert, gefärbt, enthydratisiert, geklärt und dann in einer Flüssigkeit gebadet worden, die eine schwachkonzentrierte (Λ% bis 25%) Lösung eines Einbettungsoder Halterungsmittels in einem niedrigviskosen, hochflüchtigen Lösungsmittel enthält. Wie es aus der Fig. 1B hervorgeht, kann sich diese Flüssigkeit in einem Behälter 9 befinden, in den unmittelbar im Anschluß an den üblichen Klärvorgang jeder mikroskopische Objektträger von einem Techniker eingetaucht wird, wobei man die Gewebeprobe mit einen flüchtigen Lösungsmittel, beispielsweise Xylol, benetzt läßt. Die Flüssigkeit in dem Behälter 9 besteht beispielsweise aus Xylol, Toluol oder Freon TF und einem geeigneten Halterungsmittel. Nach dem Baden im Behälter 9 bleibt auf der Gewebeprobe 5 eine

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dünne Schicht aus der Flüssigkeit zurück. Dem Lösungsmittel in dieser Flüssigkeit wird gestattet, vollkommen zu verdampfen, so daß auf beiden Oberflächen des mikroskopischen Objektträgers eine sehr dünne Schutzschicht aus einem lösungsmittelfreien flüssigen Halterungsmittel zurückbleibt. Die Gewebeprobe 5 bleibt daher benetzt und v/ird von dem Halterungsmittel durchdrungen. Die auf diese Weise behandelten mikroskopischen Objektträger 3 werden dann nacheinander in die Zuführeinrichtung 1 gegeben, so daß sie aufeinanderfolgend zu einer Beschichtungseinheit 11 gelangen, wie es aus der Fig. 1A hervorgeht.

Die Beschichtungseinheit 11 arbeitet derart, daß sie auf der Gewebeprobe 5 eine zweite Schicht aus dem gleichen Einbettungs- oder Halterungsmittel vorsieht, das ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigviskosen flüssigen Acryl-Reaktomeren, wie Monomeren oder Oligomeren von Methacrylaten, Acrylaten und Vinylen, und ferner aus einen gegenüber Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysator enthält, wie Benzoin, Benzoeäther, Acetophenon oder Michler's Keton. Darüberhinaus veranlaßt die Beschichtungseinheit 11, daß die Schichten aus dem Halterungsmittel einer ultravioletten Strahlung ausgesetzt werden, deren Spitzenwert nahe bei dem Absorptionsmaximum des Katalysators liegt, wobei beide Schichten gleichzeitig polymerisiert werden. Danach laufen die mikroskopischen Objektträger 3 nacheinander durch eine Waschstation 13, in der die Oberflächen jedes Objektträgers gewaschen werden, um das gesamte daran befindliche, nicht polymerisierte Halterungsmittel zu entfernen. Die gewaschenen mikroskopischen Objektträger 3 gelangen dann aufeinanderfolgend zu einer Trockenstation 15» um die Verdampfung der Waschlösung zu beschleunigen. Schließlich erreichen sie eine Stapeleinrichtung 17, in der die fertigbearbeiteten mikroskopischen Objektträger 3 gesammelt werden, die dann zur unmittelbaren Untersuchung zur Ver-

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fügung stehen. Die für das Einbetten bzw. Haltern, Waschen und Trocknen benötigte gesamte Bearbeitungszeit beträgt für Jeden einzelnen Objektträger vom Zeitpunkt der Eingabe in die BeSchichtungseinheit 11 an etwa 2 min.

Es folgt eine genauere Beschreibung der dargestellten Vorrichtung. Jeder mikroskopische Objektträger 3 mit einer aufgebrachten Gewebeprobe 5 wird im Anschluß auf das manuelle Eintauchen in die im Behälter 9 enthaltene Flüssigkeit und nach dem Herausnehmen aus dem Behälter 9 von Hand auf die Zuführeinrichtung 1 gelegt. Obwohl das Baden der Objektträger und die Eingabe in die Vorrichtung nach der Fig. 1A als manueller Vorgang erläutert ist, kann man diesen Bearbeitungsprozeß auch in die Zuführeinrichtung 1 einbeziehen und somit automatisieren. Die Zuführeinrichtung 1, von der in der Fig. 1A lediglich ein Teil gezeigt ist, enthält eine Parallelriemenanordnung aus endlosen Riemen 19 und 21 und eine Antriebsrolle 23. Die Antriebsrolle 23 und eine zugehörige nicht dargestellte Leerlaufrolle sind vorzugsweise entlang ihrer mittigen Umfangsoberflächen eingeschnitten, um Schultern zu bilden, über die die Riemen 19 und 21 gezogen sind. Jeder Objektträger 3 wird so auf die parallelen Riemen 19 und 21 gelegt, daß sich die Gewebeprobe 5 auf der Unterseite des Objektträgers befindet, also zwischen den Riemen angeordnet ist. Zusätzlich sind neben den Riemen 19 und 21 zwei parallele Führungen vorgesehen, von denen lediglich die eine Führung 55 gezeigt ist und die dazu dienen, die Objektträger 3 in geeigneter Weise auszurichten und in der ausgerichteten Lage zu halten.

Der Durchtritt jedes mikroskopischen Objektträgers 3 durch die Zuführeinrichtung 1 wird von einer Fühleranordnung abgetastet, die im Hinblick auf die Ver-

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arbeitung jedes Objektträgers den Betrieb der dargestellten Vorrichtung einleitet. Diese Fühleranordnung enthält einen Finger 25, der an dem einen Ende einer drehbaren Welle 27 befestigt ist. Die Welle 27 wird durch Lager 28 so abgestützt, daß der Finger 25 nach unten in den Spalt zwischen den Riemen 19 und 21 ragt. Beim Vorbeilaufen eines Objektträgers 3 veranlaßt der abtastende Finger 25 eine Drehbewegung der Welle 27, die daraufhin einen Mikroschalter 29 betätigt. Der auf diese Weise betätigte Mikroschalter 29 leitet den Betrieb der Beschichtungseinheit 11 ein. Die Beschichtungseinheit 11 enthält eine zwischen Leerlaufrollen und 37 horizontal ausgerichtete Stütze oder Platte 31, über die ein kontinuierliches, optisch glattes Band 33 gezogen wird. Das Band 33 kommt von einer Vorratsrolle 39 und wird von einer Aufwickelrolle 41 vorgeschoben. Leerlaufrollen 36 und 38 sorgen für eine geeignete Spannung des Bandes 33. Der Betrieb der Aufwickelrolle 41 wird vom Mikroschalter 29 eingeleitet. Die Betätigung des Mikroschalters 29 löst darüberhinaus die Abgabe des Halterungsmittels auf die obere Oberfläche 43 des Bandes 33 zur endgültigen Einkapselung der auf dem Objektträger 3 befindlichen Gewebeprobe 5 aus. Der Objektträger gelangt dann auf das Band 33 und wird zur Beschichtungseinheit 11 weiterbewegt.

Ein Spender 45 ist oberhalb und nahe bei der oberen Oberfläche 43 des Bandes 33 angeordnet und über ein Ventil 47 sowie eine Leitung 49 mit einer unter Druck stehenden Quelle 51 verbunden, die das Einbettungsoder Halterungsmittel enthält. Durch das Schließen des Mikroschalters 29 wird das Ventil 47 unter Beachtung einer geeigneten Verzögerung betätigt, um eine kontinuierliche Menge 53 an Halterungsmittel auf die Oberfläche 43 des Bandes 33 zu geben. Die Länge der faden- oder bandförmigen Menge 53 entspricht vorzugsweise der Länge

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eines mikroskopischen Objektträgers. Weiterhin wird die Halterungsmittelmenge mit einer solchen Geschwindigkeit abgegeben, daß letztlich zwischen den sich gegenüberstehenden Oberflächen des Objektträgers 3 und des Bandes 3.5 eine dünne Schicht aus dem Halterungsmittel gebildet wird. Dies wird noch im einzelnen erläutert.

Aus der Fig. 1A geht hervor, daß die mikroskopischen Objektträger 3 aufeinanderfolgend von den Riemen 19 und 21 der Zuführeinrichtung 1 auf eine erste Rampenanordnung aus den bereits genannten Führungen 55 gelangen, von denen lediglich die eine dargestellt ist. Die Führungen 55 sind spiegelbildlich in L-förmiger Gestalt vorgesehen, um eine Schulter zu bilden, die den Objektträger 3 trägt und zu seiner Orientierung dient. Die Neigung der Führungen 55 ist an dieser ersten Rampenanordnung so gewählt, daß der mikroskopische Objektträger unter Einwirkung der Schwerkraft auf das Band 33 gelangt. In Anbetracht des Vorschubs des Bandes 33 gelangt der Objektträger 3 auf die Halterungsmittelmpn&e 53, die der Spender 45 auf die Oberfläche des Bandes 33 aufgetragen hat. Wenn das Band 33 anfangs mit der Vorderkante des mikroskopischen Objektträgers 3 in Berührung kommt, veranlaßt der sich anlegende Objektträger, daß das Halterungsmittel zu den Rändern hin gedrückt wird. Dies hat zur Folge, daß sich das Halterungsmittel in dem gesamten Bereich der sich gegenüberstehenden Oberflächen des Bandes und des Objektträgers ausbreitet. Das Band 33 übernimmt somit die Funktion des in der üblichen Technik benutzten Deckgläschens. Das Volumen des auf das Band 33 aufgebrachten Halterungsmittels sollte nur um weniges die Menge übertreffen, die erforderlich ist, um die Ausbildung einer kontinuierlichen Schicht des Halterungsmittels zwischen den sich gegenüberstehenden Oberflächen sicherzustellen. Die zwangsläufig erfolgende Ausbreitung des Halterungsmittels zwischen den sich gegenüberstehenden

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Oberflächen des mikroskopischen Objektträgers 3 und des Bandes 33 sowie die Planparallelität des Bandes 33 gewährleisten, daß irgendwelche bestehenden Oberflächenunregelmäßigkeiten in der ersten Schicht aus dem Halterungsmittel aufgefüllt werden und daß die endgültige Schicht aus dem Halterungsmittel optisch glatt und eben bzw. planar ist.

Wenn das Band 33 unter der Einwirkung der Aufwickelrolle 41 weiter vorgeschoben wird, läuft der mikroskopische Objektträger 3 durch eine Kammer 57, die eine geeignete Schwarzlichtlampe enthält, um die Halterungsmittelschichten zwischen den einander gegenüberliegenden Oberflächen des Objektträgers 3 und des Bandes 33 zu polymerisieren. Die nicht dargestellte Lampe wird von dem Mikroschalter 29 gleichzeitig mit der Betätigung der Aufwickelrolle 41 eingeschaltet. Somit werden in der Kammer 57 die Halterungsmittelschichten zwischen dem Band 33 und dem Objektträger 3 vollständig polymerisiert.

Wie es aus der Fig. 1A hervorgeht, wird die Richtung des Bandes 3 hinter der Leerlaufrolle 37 umgelenkt, und zwar mit Hilfe der Leerlaufrolle 38, die als Spannungsrolle dient. Dabei wird das Band 33 von der Oberfläche des jetzt polymerisierten Halterungsmittels abgeschält und von der Aufwickelrolle 41 aufgenommen. Die jetzt freiliegende Oberfläche des die Gewebeprobe 5 einkapselnden Halterungsmittels ist infolge der Beschaffenheit des Bandes 33 im wesentlichen optisch glatt und planar. Irgendwelche geringfügigen Überschußmengen des Halterungsmittels, die aus dem Bereich zwischen dem Band 33 und dem mikroskopischen Objektträger 3 herausgedrückt wurden sowie eine auf den Oberflächen des Objektträgers befindliche Schutzschicht haben an der Reaktion nicht teilgenommen, da die Polymerisation infolge des Ausgesetzt-

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seins gegenüber dem Sauerstoff in der Atmosphäre verhindert worden ist. Die mikroskopischen Objektträger 3 gelangen dann auf eine zweite Rampenanordnung, die ebenfalls aus den spiegelbildlich angeordneten, L-förmigen Führungen 55 gebildet wird. Unter der Einwirkung der Schwerkraft gelangen die mikroskopischen Objektträger 3 an der zweiten Rampenanordnung auf eine Parallelriemenanordnung aus miteinander verketteten Riemen 61 und 63. Die Riemen 61 und 63 sind über Schultern gezogen, die an den stirnseitigen Enden einer geeigneten Antriebsrolle 65 und einer zugehörigen Leerlaufrolle 67 ausgebildet sind. Die mittige Umfangsoberflache der Rollen 65 und 67 ist vorzugsweise mit einer Ausnehmung versehen. Die Antriebsrolle 65 wird gleichzeitig mit der Abgabe eines mikroskopischen Objektträgers 3 auf die zweite Rampenanordnung betätigt, und zwar ebenfalls von dem Mikroschalter 29 mit entsprechender Verzögerung.

Die Waschstation 13 enthält eine Kammer 69 mit Öffnungen in gegenüberliegenden Wandabschnitten 71 und 73, so daß die endlosen Riemen 61 und 63 durch die Kammer 69 laufen können. Abschnitte 75 der Führungen 55 halten die Orientierung der mikroskopischen Objektträger 3 auf den Riemen 61 und 63 während des Durchtritts durch die Kammer 69 aufrecht. Von einem Behälter 77 wird ein geeignetes Waschfluid, beispielsweise Freon TF, zugeführt, um die nicht reagierten Anteile des Einbettungsoder Halterungsmittels von den Oberflächen des mikroskopischen Objektträgers 3 zu entfernen. Der Behälter 77 enthält eine Verdrängerpumpe, die gleichzeitig mit dem Antrieb der Antriebsrolle 65 vom Mikroschalter 29 betätigt wird. Der Auslaß der Pumpe führt zu einer Leitung 79, die in zwei Leitungen 81 und 83 aufzweigt. Die Auslässe der Leitungen 81 und 83 sind derart angeordnet, daß das von der Pumpe geförderte Waschfluid auf die untere und obere Oberfläche des mikroskopischen Objektträ-

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gers 3 gelangt, während er die Kammer 69 passiert. Vorzugsweise sind die Auslässe der Leitungen 81 und 83 so ausgerichtet, daß der Waschfluidstrahl im wesentlichen senkrecht auf die Oberflächen des Objektträgers 3 auftrifft. Das Waschfluid wird am Boden der Kammer 69 gesammelt und gelangt dann über einen Abfluß 85 und eine Leitung 87 zurück in den Behälter 77.

Der aus der Kammer 69 austretende und von den Riemen 61 und 63 weiterbewegte Objektträger 3 gelangt dann zwischen Gebläse 88 und 89, die gleichzeitig mit der Betätigung der Antriebsrolle 65 und der Betätigung der Pumpe im Behälter 77 eingeschaltet worden sind. Die Gebläse 88 und 89 sind derart angeordnet, daß sie warme Luft auf die untere und obere Oberfläche des mikroskopischen Objektträgers 3 blasen, xxsa. irgendwelche daTan anhaftende Reste des Waschfluids zum Verdampfen zu bringen. Mit diesem Bearbeitungsvorgang ist die Halterung oder Einbettung der Gewebeprobe 5 auf dem mikroskopischen Objektträger 3 beendet, und der Objektträger steht für die unmittelbare Untersuchung zur Verfügung.

Im Anschluß an den Trocknungsvorgang gelangt der mikroskopische Objektträger 3 von den Riemen 61 und 63 in eine Stapeleinrichtung 17. Die Stapeleinrichtung 17 enthält einen Speicherbehälter 91, der eine mit ihm einstückige Rampe 92 aufweist, über die die mikroskopischen Objektträger 3 aufeinanderfolgend von den Riemen 61 und 63 in den Speicherbehälter gleiten. Die Enden der Führungen 55 arbeiten mit der Rampe 93 zusammen, um die Orientierung der mikroskopischen Objektträger aufrechtzuhalten. Der Speicherbehälter 91 weist einen Doppelboden 97 auf, der von einer Feder 99 nach oben gedrückt wird, um das Auftreffen der mikroskopischen Objektträger 3 so klein wie möglich zu halten. Der Speicherbehälter 91 hat vorzugsweise vier Seitenwände, von denen in

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der Zeichnung zwei weggelassen sind, um das Aufstapeln der gesammelten mikroskopischen Objektträger 3 besser darzustellen. Da das Halterungsmittel, das die Gewebeprobe 5 auf dem Objektträger 3 einkapselt, vollkommen zur Reaktion gebracht und getrocknet worden ist, hat das sofortige Aufstapeln der Objektträger weder eine nachteilige Beeinträchtigung der optischen Eigenschaften noch ein nachteiliges Zusammenkleben der Objektträger zur Folge.

Die Betriebsweise der in der Fig. 1A dargestellten Vorrichtung wurde im Zusammenhang mit dem Einbetten von Gewebeproben auf einzelnen mikroskopischen Objektträgern beschrieben. Die Komponenten der Vorrichtung werden dabei von dem Mikroschalter 29 derart gesteuert, daß sie jeweils für eine hinreichend lange Zeit in Betrieb sind, um die einzelnen mikroskopischen Objektträger beim Durchgang durch die Vorrichtung zu bearbeiten. Die selben Komponenten könnte man auch a'if einer kontinuierlichen Basis betreiben, um Gewebeproben einzubetten, die aufeinanderfolgend und automatisch von der Zuführeinrichtung 11 eingegeben werden könnten.

Hieraus sieht man, daß lediglich ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert wurde. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Prinzips sind zahlreiche Abwandlungen und Modifikationen denkbar.

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Claims

TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Patentansprüche

1. Verfahren zum Haltern gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe,

dadurch gekennzeichnet, daß eine dünne Schicht eines polymerisierbaren Materials auf der Oberfläche einer lösungsmittelnassen Probe aufgebracht wird, um die Probe zu durchdringen, daß das Lösungsmittel verdampft wird, daß die Probe mit einem planaren Bauteil abgedeckt wird, das für Sauerstoff undurchlässig ist, und daß die dünne Schicht aus dem Material polymerisiert wird, wobei die polymerisierte dünne Materialschicht durchsichtig ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß das polymerisierte Material einen Brechungsindex hat, der demjenigen der Probe angenähert ist.

3. Verfahren zum Haltern gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe,

dadurch gekennzeichnet, daß eine mit einem ersten flüchtigen Lösungsmittel benetzte und auf der einen Oberfläche eines durchsichtigen Substrats angeordnete biologische Probe mit einem zweiten flüchtigen Lösungsmittel gebadet wird, das eine schwache Konzentration eines polymerisierbaren Materials zum Durchdringen der Probe enthält, daß das zweite Lösungsmittel verdampft wird, daß eine dünne Schicht aus einem zweiten

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polymerisierbaren Material auf dem ersten Material vorgesehen wird, daß die Probe mit einem planaren Bauteil abgedeckt wird, das für Sauerstoff undurchlässig ist, und daß das erste und das zweite Material polymerisiert werden, die beide im polymerisierten Zustand durchsichtig sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite Material gleichzeitig polymerisiert v/erden.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens das zweite Material ein gegenüber Ultraviolettlicht empfindliches Katalysatorsystem enthält und daß wenigstens das zweite Material zu seiner Polarisation einer Ultraviolettstrahlung ausgesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem planaren Bauteil und dem Substrat das überschüssige erste und zweite Material herausgedrückt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß nur Teile des zwisehen dem Substrat und dem planaren Bauteil angeordneten ersten und zweiten Materials polymerisiert werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat zum Entfernen von nicht polymerisierten Mengen des ersten und des zweiten Materials von der Substratoberfläche gewaschen wird.

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9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Polymerisation des ersten und zv/eiten Materials das planare Bauteil entfernt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl das erste als auch das zweite Material im polymerisierten Zustand einen Brechungsindex haben, der demjenigen der Probe angenähert ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und das zweite Material nach der Polymerisation den gleichen Brechungsindex haben.

12. Vorrichtung zur Halterung gefärbter dünner Schnitte einer biologischen Probe auf der Oberfläche eines durchsichtigen Substrats,
gekennzeichnet durch Mittel (9) zum Aufbringen einer Lösungsmittellösung aus polynieri sierbarem Material zwecks Ausbildung einer ersten Schicht auf der Oberfläche des Substrats (3) und zwecks Durchdringung der Probe (5), Mittel (45 bis 51) zum Aufbringen einer zweiten Schicht eines polymerisierbaren Materials auf der ersten Schicht im Anschluß an das Verdampfen des Lösungsmittels von der ersten Schicht, Mittel (31, 33) zum Ausbilden der oberen Oberfläche der zweiten Schicht als eine optisch glatte Ebene, die sich im wesentlichen parallel zu derjenigen des Substrats (3) erstreckt, und Mittel (57) zur Polymerisation der ersten und der zweiten Schicht zwecks Einkapselung der Probe.

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1:5. Vorrichtung nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Ausbilden der oberen Oberfläche der zv/eiten Schicht als optisch glatte Ebene ein planares Teil (33) aufv/eisen, das gegenüber Sauerstoff undurchlässig ist und sich wenigstens über die Probe (5) erstreckt.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzei chnet, daß die zweite Schicht ein Gemisch aus schwachflüchtigen_f niedrigviskosen flüssigen Acryl-Reaktoraeren und einem gegenüber Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysatorsystem enthält.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Schicht jeweils ein Gemisch aus schwachflüchtigen, niedrigviskosen flüssigen Acryl-Reaktomeren und einem gegenüber Ultraviolettlicht empfindlichen Katalysatorsystem enthalten und daß zur Polymerisation der ersten und der zweiten Schicht eine Strahlungsquelle (57) für Ultraviolettlicht vorgesehen ist.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Schicht im polymerisierten Zustand einen Brechungsindex haben, der im wesentlichen innerhalb des Bereiches von 1,530 bis 1,570 liegt.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Materialien, die die erste und die zv/ei te Schicht bilden, jeweils flüssige Acryl-Reaktoinere enthalten, die aus einer Gruppe bestehend aus Methacrylat-, Acrylat-und Vinyl-Monomeren und -Oligomeren ausgewählt sind.

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18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, die das überschüssige Material, das die erste und die zv/eite Schicht bildet, zwischen dem Substrat (3) und dem planeren Teil (33) herausdrückt.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das planare Teil (33) wenigstens über der Probe (5) angeordnet ist, die von dem Substrat (3) getragen wird.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (11) vorgesehen sind, die das planare Teil (33) auf die zweite Schicht legen und danach die erste und die zweite Schicht polymerisieren, wobei das mit der zweiten Schicht in Berührung stehende planare Teil optisch glatt ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (37, 38) vorgesehen sind, die das planare Teil (33) im Anschluß an die Polymerisation von der ersten und zweiten Schicht entfernen.

22. Vorrichtung zur Halterung gefärbter dünner Schnitte biologischer Gewebeproben,
gekennzeichnet durch Mittel (19, 21, 33, 55, 61, 63) zum Vorschieben einer Anzahl aufeinanderfolgender, probentragender Substrate (3) längs einer vorbestimmten Bahn, wobei jedes Substrat (3) auf seiner einen Oberfläche eine Gewebeprobe (5) trägt und mit einem flüchtigen Lösungsmittel benetzt ist, das eine niedrige Konzentration eines ersten polymerisierbaren Materials enthält, längs dieser Bahn angeordnete Mittel (31, 33, 45 bis 51), die diese Oberfläche jedes Substrats

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und das erste Material im Anschluß an die Verdampfung des Lösungsmittels aus dem ersten Material mit einem schv/achflüchtigen, niedrigviskosen polymeri si erbaren zv/eiten Materials bedecken, Mittel (31, 33), die die obere Oberfläche des zweiten Materials in eine optisch glatte Ebene ausgestalten, die im wesentlichen parallel zur Ebene des Substrats (3) verläuft, und längs der Bahn angeordnete Mittel (57) zum Polymerisieren des ersten und des zweiten Materials, wobei das erste und das zweite Material im polymerisierten Zustand durchsichtig sind.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel, die die Oberfläche des zweiten Materials als optisch glatte Ebene ausbilden, ein planares Teil (31) enthalten, das gegenüber Sauerstoff undurchlässig ist und sich wenigstens über die Gewebeprobe (5) erstreckt.

24. Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß die die Oberfläche des zweiten Materials optisch glatt ausbildenden Mittel ein kontinuierliches Band (33), das in enger Nachbarschaft zu der Bahn bewegbar ist, und Mittel (31) enthalten, die das Band (33) mit der Schicht aus dem zweiten Material in Berührung bringen.

25. Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (37, 38) vorgesehen sind, die im Anschluß an die Polymerisation des zweiten Materials das Band (33) von der Oberfläche der zweiten Schicht entfernen.

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26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, d adurch gekennzeichnet, daß längs der Bahn Mittel (13) zum Waschen der Substrate (3) nach erfolgter Polymerisation des ersten und des zweiten Materials vorgesehen sind.

27. Vorrichtung nach Anspruch 24, gekennzeichnet durch Mittel (45 bis 51) zum Auftragen des zweiten Materials auf das Band (33) und durch Mittel (19, 21, 55) zum Auflegen des Substrats (3) auf das Band (33).

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das erste und zweite Material ein gegenüber Ultraviolettlicht empfindliches Katalysatorsystem enthalten und daß längs der Bahn Mittel (57) angeordnet sind, die zur Polymerisation der ersten und der zweiten Schicht eine Strahlungsquelle für Ultraviolettlicht aufweisen.

29. Vorrichtung nach.Anspruch 26, gekennzeichnet durch Mittel (88, 89) zum Trocknen von jedem der Substrate

(3) aufeinanderfolgend und im Anschluß an den Waschvorgang,

30. Vorrichtung nach Anspruch 29, gekennzeich net durch Mittel (17) zum Sammeln der Substrate (3) aufeinanderfolgend und im Anschluß an den Trockenvorgang.

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