DE2747378A1

DE2747378A1 - Liposomen, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2747378A1
Application number: DE19772747378
Authority: DE
Inventors: Henri Bertrand; Edgar Sache
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1976-10-23
Filing date: 1977-10-21
Publication date: 1978-04-27
Also published as: AR224100A1; FR2374910A1; JPS6055485B2; PL201666A1; FR2374910B1; US4239754A; DK470277A; SE7711895L; AU519231B2; JPS53133616A; DD138881A5; AU2993777A; ES463427A1; LU78361A1; IE45894L; NL7711610A; IE45894B1

Description

Heparin ist wegen seiner bemerkenswerten Antikoagulationseigenschaften ein weit verbreitetes Arzneimittel. Bislang war es jedoch nicht möglich, Heparin auf anderem Wege als auf dem parenteralen Wege an Patienten zu verabreichen. Üblicherweise wurde Heparin durch kontinuierliche Perfusion oder durch intravenöse oder subkutane Injektion den Patienten zugeführt.

Weiterhin ist die Wirkungsdauer des in Form von üblichen Zubereitungen verabreichten Heparins im allgemeinen, insbesondere bei intravenöser Verabreichung, ziemlich kurz, so daß es erforderlich ist, die Verabreichung und insbesondere die Injektion häufig und mindestens zweimal pro Tag zu wiederholen.

Es wurden bereits Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, Heparinpräparate zu entwickeln, die entweder auf einem anderen Wege als dem parenteralem Wege und insbesondere auf dem oralen Wege verabreicht werden können oder die, wenn sie auf parenteralem Wege verabreicht werden, eine längere Wirkungsdauer besitzen, so daß die Häufigkeit der Injektionen vermindert werden kann. Bislang haben sich diese Forschungen^ zur«SP^aMfcJ^¹^ ^neuer Verabreichungs-

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wege des Heparins, die eine Langzeitbehandlung mit längerer Wirkungsdauer als den herkömmlichen Heparinpräparaten ermöglichen würde, als nicht erfolgreich erwiesen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun zum Teil darin, diese Nachteile der herkömmlichen Zubereitungen oder Präparate zu überwinden, ein Präparat auf Heparingrundlage zu schaffen, dessen antikoagulierende Wirkung mindestens zum Teil auch dann ausgeübt wird, wenn das Präparat auf oralem Wege verabreicht v/ird, und Heparinpräparate anzugeben, die bei der Verabreichung auf parenteralem Wege, insbesondere auf intravenösem Wege, eine verlängerte Wirkungsdauer besitzen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Liposomen gelöst, die Heparin enthalten oder Heparin tragen.

Die Erfindung betrifft ferner Dispersionen von Liposomen dieser Art in einem flüssigen und insbesondere einem wäßrigen Trägermaterial. Sie betrifft ferner pahrmazeutische .Zubereitungen oder Arzneimittel, die diese Liposomen oder deren Dispersionen gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff, das die Verabreichung des Wirkstoffs ermöglicht, enthalten.

Es sind bereits aus Phospholipiden oder anderen bestimmten Lipidsubstanzen oder hydrophoben Fettmaterialien bereitete Liposomen beschrieben worden. Die Liposomen bestehen aus hydratisierten Lipidkristallen, die im allgemeinen einschichtig oder mehrschichtig (unilamellar oder multilamellar) in einem wäßrigen Medium dispergiert oder dispergierbar sind, wobei ein Teil des wäßrigen Mediums, aus dem die Kristalle hergestellt worden sind, in den Vesikeln oder Bläschen bzw. Tröpfchen zurückgehalten werden, die sich dadurch bilden, daß die Lipide

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oder Fettmaterialien in einem wäßrigen Medium "quellen", insbesondere unter der Einwirkung einer Rührwirkung oder einer Ultraschallbehandlung. Diese Liposomen können auch aus einer oder mehreren konzentrischen Lipid-Doppelschichten, die mit wäßrigen Schichten abwechseln, bestehen. Wenn die wäßrige Lösung, aus der die Liposomen gebildet wurden, eine Lösung von Heparin ist oder eine solche Lösung enthält, wird ein Teil dieser Heparinlösung durch und in den Zwischenräumen der Liposomen zurückgehalten, wodurch die erfindungsgemäßen Materialien gebildet werden.

Es hat sich gezeigt, daß diese Liposomen - die aus physiologisch verträglichen Lipiden und in einer wäßrigen Heparinlösung hergestellt worden sind - wenn sie auf oralem oder rektalem Wege verabreicht werden, in vivo bestimmte biologische Effekte, die für die Antikoagulationswirkung charakteristisch sind, und andere Heparinwirkungen ausüben.

Es hat sich ferner gezeigt, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Präparate gebildete injizierbare Dispersionen

in Abhängigkeit von ihrem Lipidgehalt nach ihrer Verabreichung auf intravenösem Wege eine verzögerte Wirkung ausüben.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch pharmazeutische Zubereitungen oder Arzneimittel, die Heparin enthaltende Liposomen in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsmittel enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der heparinhaltigen Liposomen, das darin besteht, daß man eine Dispersion von physiolgisch verträglich Lipiden, die zur Bildung von Liposomen geeignet

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sind, insbesondere von Phospholipiden, in einer Heparinlösung, vorzugsweise einer wäßrigen Heparinlösung, rührt oder vorzugsweise einer Ultraschalleinwirkung unterzieht, bis sich Liposomen bilden, die mindestens einen Teil des anfänglich in der wäßrigen Lösung enthaltenen Heparins zurückhalten.

Das erf indungsgemäß verwendete Heparin kann insbesondere irgendein Heparin sein, das für therapeutische Zwecke geeignet ist. Es kann beispielsweise in der sauren Form oder in Form eines Salzes mit einem oder mehreren Metallkationen, wie den Kationen von Natrium, Calcium oder Magnesium, verwendet werden. Man kann jedoch auch irgendein anderes Heparinpräparat verwenden, das für therapeutische Zwecke geeignet ist.

Zur Verdeutlichung der Heparinprodukte, die mit Vorteil nach der Lehre der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ohne daß hierdurch die Erfindung in irgendeiner Weise beschränkt sein soll, kann man sagen, daß Heparine mit einem Molekulargewicht von etwa 60O0 bis etwa 30 000 und einem Heparintiter von etwa 150 bis etwa 25O internationalen Einheiten pro Milligramm (IE/mg) mit Vorteil verwendet werden können. Solche Heparine, die einen großen Anteil von Heparinen mit einem Molekulargewicht von 1O OOO bis 15 000 enthalten und einen Titer innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, wurden bei den nachstehenden Beispielen verwendet. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Liposomen können offensichtlich auch andere Heparine, insbesondere solche, die größere oder geringere Molekulargewichte als die oberen bzw. unteren Grenzen des oben als Beispiel angegebenen Bereichs aufweisen, verwendet werden.

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Bezüglich der Lipide ist zu sagen, daß irgendwelche nichttoxischen, physiologisch verträglichen und stoffwechselverträglichen Lipide, die Liposomen bilden können, erfindungsganäß geeignet sind.

Die Phospholipide stellen eine wichtige Klasse von geeigneten Lipiden, wobei insbesondere (jedoch nichtausschließlich) die Phospholipide der folgenden allgemeinen Formel

3 "3
CH₂-O-P-O-R

OH
O

R₂-C-O-²CH

R₁-C-O-¹CH-

bevorzugt sind, in der

R₁ und P- von Fettsäuren, insbesondere Fettsäuren mit 14 bis 22 und insbesondere Fettsäuren mit

18 bis 20 Kohlenstoffatomen abgeleitete Reste und

R, einen Teil einer Estergruppe darstellen, wobei jene Verbindungen bevorzugt sind, die

15 man durch Verestern der Phosphorylgruppe des Phospholipids mit einem Aminoalkohol, wie Cholin (2-Hydroxyäthyltrimethyl-ammonium-hydroxid), Äthanolamin, Serin etc. oder mit einem Zuckerderivat mit einer Hydroxylgruppe, wie beispielsweise Inosit, erhält.

Erfindungsgemäß sind auch andere Lipide, die mehr oder weniger eng mit den Phospholipiden verwandt sind und Liposomen bilden können, geeignet. Als Verbindungen dieser Art kann man, ohne daß dadurch die Erfindung beschränkt sein soll, insbesondere Plasmalogene, Ganglio-

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side, Sphingolipide, Phosphoglyceride und Phosphonolipide (insbesondere jene, die sich von den Phospholipiden der obigen allgemeinen Formel dadurch unterscheiden, daß die Gruppe -OR₃ durch eine Gruppe der Formel -CH₂-CH₂-NH₃ ersetzt ist ("Lipid Biochemistry, An introduction" M.I.Gurr und A.T. James, 2.Auflage (1975) Chapman and Hall, London)), verwenden.

Weitere Beispiele von geeigneten Lipiden sind die aus Fettsäuren mit langen ungesättigten Kohlenwasserstoffketten gebildeten Produkte, wie die unter der Bezeichnung "Ufasomen" bekannten und von Gebicki und Hicks (Chemistry and Physics of Lipids, Vol. 16 (1976) 142 bis 160) beschriebenen oder
aus monoacylierten Verbindungen, die von Fettsäuren mit 8 oder mehr Kohlenstoffatomen abgeleitete Ketten aufweisen, sowie von nicht-toxischen anionischen und kationischen pharmazeutisch verträglichen Detergentien abgeleitete Produkte, die sämtlich von W.R.Hargreaves und D.W.Deamer (Conference on Liposomes and their Use in Biology and Medicine" (September 14 bis 16, 1977) New York Academy of Sciences) beschrieben worden sind, etc.

Erfindungsgemäß bevorzugte Klassen von Lipiden, die zu den Phospholipiden zählen, sind jene Verbindungen, die ungesättigte Fettsäureketten enthalten, wie jene, die 18 bis 20 Kohlenstoffatome und mindestens eine ungesättigte Bindung besitzen. Beispiele für solche ungesättigte Säuren sind ölsäure oder noch bevorzugter die sogenannten "essentiellen Fettsäuren", das heißt überwiegend entweder Linolsäure oder Linolensäure. Besonders bevorzugte Phospholipide sind jene, bei denen mindestens eine der beiden oben beschriebenen Gruppen R₁ und R- von mindestens einer der oben erwähnten "essentiellen Fettsäuren" abgeleitet ist.

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Repräsentative Phospholipide dieser bevorzugten Klasse sind die Phosphatidylcholine, bei denen mindestens eine der Acylgruppen von einer ungesättigten Fettsäure, vorzugsweise einer der "essentiellen Fettsäuren" abgeleitet ist. Ein Beispiel eines solchen bevorzugten Phospholipids ist 1 ,2-Dilinoleyl-phosphatidylcholin.

Insbesondere kann hinsichtlich der Auswahl der geeigneten Phospholipide auf die Veröffentlichung von H.Peeters "Phosphatidylcholines - Biochemical and Clinical Aspects of Essential Phospholipids", Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York (1976) verwiesen werden.

Besonders geeignete Phospholipidzubereitungen dieser Art sind im Handel erhältlich. Diesbezüglich kann man die unter der Bezeichnung V-E (Sigma) Eidotterphospholipide

15 oder die natürlichen "essentiellen Phospholipidzubereitungen", die aus Phosphatidylcholinen gebildet sind, die mit Fettsäuren verestert sind und die als Hauptanteil einfach ungesättigte oder mehrfach ungesättigte Bindungen enthalten, insbesondere 1 ^-Diacyl-sn-glycero-S-phosphoryl-

choline aus überwiegend ungesättigten Fettsäuren, wie die aus Sojabohnensamen extrahierten Materialien, nennen, wie die sogenannte EPL-Phospholipidzubereitung, die von der Firma Nattermann, Bundesrepublik Deutschland, hergestellt wird.

25 Die in dieser Weise hergestellten heparinhaltigen Liposompräparate besitzen interessante biologische Eigenschaften, insbesondere entfalten sie in vivo selbst nach oraler Verabreichung eine antikoagulierende bzw. di Blutgerinnung verhindernde Wirkung. Sie verursachen auch eine verzögerte

antikoagulierende Wirkung.

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Diese heparinhaltigen Liposompräparate, die ausgehend von Lipiden und insbesondere von Phospholipiden mit ungesättigten Fettsäureketten,die mit Vorteil von essentiellen Fettsäuren abgeleitet sind, hergestellt sind, sind von besonderem Interesse wegen der ergänzenden therapeutischen Wirkung der Phospholipide als solche, die insbesondere verträglich (und häufig auch erwünscht)ist mit der von Heparin.

Insbesondere ist bekannt, daß Phosphatidylcholine neben anderen wertvollen therapeutischen Eigenschaften eine Schutzwirkung gegen degenerative atheromatöse Prozesse oder Phänomene ausüben, wodurch die Kapillarpermeabilität und der Venentonus vermindert werden, wodurch eine Schlammbildung in dem Kapillarsystem verhindert und die Hyperadhäsivität und die Hyperaggregierbarkeit der Blutplättchen vermindert werden.

Sie wirken ferner günstig auf Leberlipidexzesse (Leberverfettung) ein und stellen im allgemeinen ein geeignetes Gleichgewicht zwischen ungesättigten und gesättigten Fetten insofern ein, als die letzteren Fette häufig im Organismus von Patienten im Überschuß auftreten, die an Gefäßerkrankungen oder Herzgefäßerkrankungen leiden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter Anwendung üblicher Methoden und Vorrichtungen durchgeführt werden. Dies betrifft insbesondere die Behandlung mit Ultraschall, die beispielsweise unter Verwendung einer Vorrichtung durchgeführt werden kann, die Metallsonden umfaßt, die in die zu behandelnde Dispersion eingeführt werden. Die Art und die Größe der letztlich gebildeten Phospholipid-Vesikel hängt natürlich von der Zeit und der Intensität der Ultraschallbehandlung, der Art der verwendeten Lipide, der Ionenstärke des Mediums, der Temperatur etc. ab. Bezüglich der angewandten Methoden kann beispielsweise auf

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das Kapitel IV der Veröffentlichung "Methods in Cell Biology", herausgegeben von David M.Prescott, Vol.XIV (1976) Seite 33, Academic Press, New York, hingewiesen werden.

Mit Vorteil erhält man die Anfangsdispersion aus einem
dünnen Film des Lipids, den man in dem Gefäß bildet,
das das Endprodukt enthalten soll, wobei dieser Film vorzugsweise dadurch gebildet wird, daß man eine Lösung der geeigneten Lipide in das Gefäß einbringt und dann das

10 Lösungsmittel verdampft. Die Heparinlösung kann dann in

das Gefäß eingeführt werden, wodurch man unter Rühren eine Dispersion der Lipide in der Heparinlösung bildet, welche Dispersion dann der Ultraschallbehandlung unterworfen
werden kann, um die oben angegebenen Ergebnisse zu er-

15 zielen.

In einer ersten Stufe bildet man eine Suspension von gequollenen Liposomen, die ein milchiges Aussehen besitzt, wobei angenommen wird, daß die Liposomen der Suspension
im wesentlichen aus einer Reihe von konzentrischen Lipiddoppelschichten bestehen, die von wäßrigen Schichten abgelöst werden, in denen das Heparin zurückgehalten wird.

Die in dieser Weise erhaltenen Liposomen können beispielsweise durch Zentrifugieren von dem wäßrigen Medium abgetrennt werden. Die in dem Sediment enthaltenen Liposomen

25 können dann gewünschtenfalls gewaschen werden, um die

nicht in die Liposomen eingeführten Wirkstoffansteile zu entfernen. Die Liposomen können dann in einen Puffer überführt und dann vorzugsweise in der Kälte und noch bevorzugter bei einer Temperatur von +4⁰C gelagert werden. Die in dieser Weise gelagerten Liposomen sind während längerer Zeitdauer stabil.

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Es hat sich jedoch gezeigt, daß man Liposomen herstellen kann, die noch größere Mengen Heparin enthalten, wenn man die Rührbedingungen, insbesondere die Bedingungen der Ultraschallbehandlung, derart steuert und verlängert, daß in der wäßrigen Heparinlösung kleinere Liposomen und insbesondere einschichtige oder unilamellare Vesikel gebildet werden.

Dies kann durch eine längere Ultraschalleinwirkung erreicht werden, die notwendigerweise unter Anwendung stärkerer elektrischer Stromintensitäten durchgeführt wird als die zuerst durchgeführte Behandlung.

Insbesondere kann man an dem Aussehen der nach der Ultraschallbehandlung erhaltenen Suspension feststellen, ob die Liposomen im wesentlichen aus einschichtigen Vesikeln bestehen oder nicht. Statt einer Suspension mit milchigem Aussehen, die man mit den mehrschichtigen Liposomen erhält, führen die einschichtigen Liposomen zu schwach durchsichtigen oder lediglich transparenten kolloidalen Suspensionen.

Die in dieser Weise gebildeten Liposomen können nicht mehr durch Ultrazentrifugieren von der Lösung abgetrennt werden. Es ist weiterhin wegen ihrer geringen Teilchen-

größe (etwa 250 bis etwa 1000 A) nicht möglich, sie zu waschen (was auch nicht notwendig erscheint). Sie können jedoch durch Gelfiltration abgetrennt werden.

Es hat sich gezeigt, daß man unter diesen Bedingungen Liposomen herstellen kann, die pro Milliliter des Liposompräparats 500 bis 2000 internationale Einheiten (IE) Heparin enthalten. Es sei in Erinnerung gerufen, daß diese Mengen dadurch gemessen werden können, daß man das in dieser Weise hergestellte und von dem Herstellungsmedium abgetrennte heparinhaltige Liposom-

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präparat in einem wäßrigen Medium der Einwirkung eines Detergens oder eines oberflächenaktiven Mittels unterwirft und die Menge des aus den Liposomen in das wäßrige Medium freigesetzten Heparins bestimmt. Vorzugsweise ent-5 hält die anfangs eingesetzte Lipidzubereitung auch einen Stabilisator, beispielsweise Cholesterin. Erforderlichenfalls kann man der anfänglich eingesetzten Lipiddispersion ein amphiphiles Mittel zusetzen, um zu erreichen, daß die gebildeten Liposomen auch elektrisch 10 geladen sind. Geeignete Mittel dieser Art sind Dicetyl-phosphat oder Phosphatidyl-serin, wenn eine negative Ladung angestrebt wird, oder Stearylamin, wenn eine positive Ladung gebildet werden soll.

Auf diese amphiphilen Mittel kann auch verzichtet werden, wie aus den folgenden Beispielen ersichtlich ist, die der weiteren Erläuterung der Erfindung dienen.

Beispiel 1

Man bereitet wird folgt eine Lipidphase aus den drei Bestandteilen Lecithin, Cholesterin und Dicetyl-phosphat

in einem Molverhältnis von 7:2:1. Man löst 26 mg ·

Lecithin, 4,4 mg Cholesterin und 3,11 mg Dicetyl-phosphat in 5 ml Chlorofom. Dann dampft man die erhaltene Lösung in einem Rundkolben bei einer Temperatur von 37⁰C zur Trockene ein. Nachdem das Chloroform verdampft ist,

liegen die Phospholipidbestandteile in Form eines dünnen Films auf der Wandung des verwendeten Gefäßes vor. Dann löst man 30 bis 50 mg Heparin in 5 ml eines 0,005m Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,2 und überführt die erhaltene Lösung unter einer Stickstoffatmosphäre in das Gefäß.

Man läßt das gebildete Medium während etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und unterwirft die gebildete Dispersion dann der Einwirkung von Ultraschallstrahlung

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(Ultraschallbehandlung) während 10 Sekunden unter Verwendung einer Ultraschallvorrichtung, die unter der Bezeichnung "Ultrasonic" erhältlich ist und bei 1,5 A während 10 Sekunden betrieben wird. Die Sonde der Ultra-Schallvorrichtung besteht aus rostfreiem Stahl, kann jedoch auch aus einem anderen Metall, wie Titan, gefertigt sein. Eine weitere Ultraschallbehandlung während 10 Sekunden bis 20 Minuten führt zu keiner merklichen Änderung des Heparingehalts der letztendlich gebildeten Liposomen, welcher Gehalt nach der in der folgenden Weise beschriebenen Methode gemessen wird.

Nach der Ultraschallbehandlung läßt man das Medium während 1 Stunde bei +4⁰C stehen und zentrifugiert es dann während 3 Stunden bei 110 000 g.

Den erhaltenen Niederschlag suspendiert man erneut in dem gleichen Phosphatpuffer und zentrifugiert während weiterer 3 Stunden bei 110 000 g. Es zeigt sich dann, daß eine aliquote Probe der überstehenden Flüssigkeit kein Heparin enthält.

Der erhaltene Niederschlag wird dann erneut in 0,3 ml des Phosphatpuffers suspendiert, worauf man eine Suspension erhält, die 9 IE Heparin enthält und in der Kälte bei einer Temperatur von +4⁰C während mehrerer Monate aufbewahrt werden kann.

25 Beispiel 2

Man bereitet Heparin enthaltende Liposomen nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, wobei man jedoch von folgenden Reaktionsteilnehmern ausgeht:

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Lecithin (aus Eidotter gewonnen,

vertrieben von der Firma Sigma, 26 mg (40 μΜοΙ)

Typ V)

Cholesterin 4,4 mg (11,4 μΜοΙ)

Die in dieser Weise erhaltenen Liposomen zeigen eine neutrale Ladung.

Beispiel 3

Man bereitet Heparin enthaltende Liposomen nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, geht jedoch von folgenden Reaktionsteilnehmern aus:

Lecithin Cholesterin Stearylamin (Octadecylamin)

26 mg (40 μΜοΙ) 4,4 mg (11,4 μΜοΙ) 1,53 mg ( 5,7 μΜοΙ)

Die in dieser Weise gebildeten Liposomen zeigen eine positive Ladung.

Die effektive Einkapselung einer gewissen Menge Heparin durch die Liposomen wird wie folgt nachgewiesen: Man gibt 0,1 ml der Liposomsuspension zu 1 ml Humanplasma. Dann mißt man die Thrombinzeit, wobei sich eine völlige Unwirksamkeit dieser Suspension gegenüber der Thrombinzeit im Vergleich zu den Ergebnissen eines Versuches zeigt, der mit einem Kontrollpräparat einer Dosis Humanplasma durchgeführt wird.

Es zeigt sich jedoch, daß, wenn man das gleiche Volumen der Liposomsuspension zuvor während 30 Minuten in Gegenwart eines gleich großen Volumens einer 1%igen Lösung eines Detergens der Art, wie es im Handel unter der Bezeichnung Triton X100 (Röhm & Haas) bekannt ist, und das dazu geeignet ist, die Lipidhülle zu beseitigen, inkubiert, die Thrombinzeit verlängert wird. Die Thrombinzeit, die von einer biologischen Heparinämie eines Kontrollplasmas abhängt, wird nach der Heparinämie-Bewertungsmethode ge-

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messen, indem man die Thrombinzeit bei variablen Konzentrationen (Raby, Annales d'anesthesiologie francaise, Vo. 5, Sonderausgabe 1954) und mit modifiziertem Standard (Raby, Coagulation IV, Coagulation intravasculaire disseminee, Masson edition 1974, Seite 188) mißt.

Die gemessene Menge beträgt bei einem Volumen von 0,1 ml der Suspension (Liposomen plus Detergens) 1,8 IE. In einer Lösung, die kein Heparin enthält, gebildete Liposomen zeigen bei der oben erwähnten Untersuchung keinerlei Wirkung, unabhängig davon, ob sie mit einem Detergens behandelt worden sind oder nicht.

Untersuchung der in vivo ausgeübten biologischen Eigenschaften der Heparin enthaltenden Liposomen:

Die Eigenschaften der Heparin enthaltenden Liposomen wurden an Blutproben untersucht, die von männlichen Kaninchen (Fauve de Bourgogne) genommen wurden, denen man zuvor pro Kaninchen mit Hilfe eines Magen-Zwölffingerdarm-Ka"theders 3,6 ml der Liposomsuspensionen in dem oben beschriebenen Puffer verabreicht hat (mit Ausnahme des in der Tabelle VI angesprochenen Kaninchens, dem unter den gleichen Untersuchungsbedingungen 10 ml oder insgesamt 180 IE verabreicht wurden). Dann wurden 30 Minuten, 1 Stunde 30 Minuten, 3 Stunden 30 Minuten, 6 Stunden 30 Minuten, 24 Stunden, 28 Stunden, 30 Stunden und 48 Stunden nach der Zwangsverabreichung der Liposomsuspensionen Blutproben genommen. Ähnliche Blutproben wurden von Kontrollkaninchen genommen, denen zuvor lediglich Wasser oder kein Heparin enthaltende Liposomen verabreicht worden waren.

Die Proben wurden in 5 ml-Röhrchen aufgefangen, die mit wasserabstoßenden Wänden (aus einem Kunststoffmaterial) ausgerüstet waren, worauf der Calciumionengehalt der

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der Proben durch Zugabe von Citrationen als Chelatkomplex gebunden wurde. Unter diesen Bedingungen werden die Blutzellenfaktoren und Piasmakontaktfaktoren, die für den Blutgerinnungsprozeß verantwortlich sind, kaum aktiviert, so daß die verschiedenen Proben in Abwesenheit von ionisiertem Calcium nicht mehr spontan gerinnen oder koagulieren.

Das Prinzip der angewandten Untersuchungsmethode besteht darin, die Gerinnungszeiten, die man in den untersuchten Proben und den Kontrollproben nach der Zugabe von Calciumchlorid zu dem Inhalt der Röhrchen nach der thrombelastographischen Technik (TEG) (G.Raby, Biologie des hemorragies et des thromboses, Masson, Paris (1966) 186 bis 188) bestimmt, zu vergleichen.

Diese Technik benutzt den Obergang eines gerinnenden Blutpräparats von dem flüssigen Zustand in den festen Zustand. Das Prinzip der Untersuchungsmethode besteht darin, ein Gefäß, in das zunächst die zu untersuchende Probe eingeführt worden ist, einer oszillierenden Winkelbewegung zu

20 unterwerfen und die Wirkung des Gerinnungseffektes auf einen Zylinder zu beobachten, der am Ende eines Torsionsdrahtes aufgehängt ist und in die Probe eintaucht. Wenn die Koagulation oder das Gerinnen beginnt, vermittelt das in den» Gefäß enthaltene Plasma dem Zylinder eine ent-

25 sprechende oszillierende Bewegung.

Die Koagulation oder Gerinnung wird von dem Augenblick (t = 0) gemessen, bei dem die Aktivierung der für die Gerinnung verantwortlichen Faktoren durch die Zugabe von Ca -Ionen unter den oben angegebenen Bedingungen erfolgt.

30 Im folgenden bedeuten:

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"r" die Induktionszeit, die dem eigentlichen Beginn des Gerinnens vorausgeht;

"ma" die Maximalamplitude der Oszillationen des Zylinders;

"k" das Zeitintervall zwischen dem Augenblick, in dem der Zylinder zu schwingen beginnt und dem Augenblick, da die Amplitude der Bewegung gleich ist der Amplitude (20 ml), die man unter den gleichen Bedingungen mit einem blutplättchenfreien Plasma erhält, dessen Fibrinogengehalt normal ist (3 bis 4 g pro 1000).

Die "Gesamtgerinnungszeit" einer Probe entspricht der Summe ^r + ki

Die Kinetik der Gerinnung wird durch die Parameter "r" und "r + k" ausgedrückt, während das dynamische Verhalten der Gerinnung sich in der Maximalamplitude "ma" der Schwingungen des Zylinders widerspiegelt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen I bis VI aufgeführt, in denen die Ergebnisse der Untersuchungen angegeben sind, die unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wurden:

Tabelle I:

Kontrollkaninchen, das nur mit Wasser behandelt worden

Tabelle II:
Kontrollkaninchen, das nur mit einer Suspension von heparinfreien Liposomen in dem gleichen Puffer behandelt worden ist;

Tabelle III:

Kaninchen, das mit der Heparin enthaltenden Liposomsuspension gemäß Beispiel 1 behandelt worden ist;

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Tabelle IV:

Kaninchen, das mit einer Heparin enthaltenden Liposom-

suspension eines anderen Ansatzes behandelt worden ist;

Tabelle V:

Kaninchen, das mit einem Heparin enthaltenden Liposompräparat aus einer Mischung von verschiedenen Ansätzen behandelt worden ist; und

Tabelle VI:

Kaninchen, das mit einer größeren Menge des Liposompräparats behandelt worden ist (10 ml pro Kaninchen).

In diesem Tabellen sind die gemessenen Werte der Parameter "r", "k", "r+k", "ma" und "TPI" angegeben, bei welch letzterem Parameter es sich um den thrombodynamischen Potentialindex handelt, der das Verhältnis

15 mxE darstellt, wobei mxE der maximalen Elastizität ent-

k
spricht und folgende Gleichung erfüllt:

_ 1OO»ma
^{mxE =} ö

Man kann ein "Thromboelastogramm" (TEG) aufzeichnen, das es ermöglicht, die in Rede stehenden Phänomene visuell 20 zu bewerten.

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Tabelle I

Kontrolle (mit H₀O behandelt)

co O <£> 00

O CO CD

	TEG des gesamten Blutes	r	k	r+k	am	TPI	8	25	53	14	Beobachtungen
/or der Behandlung	18	12	30	50	8,3
30 Minuten danach	18	13	31	50	7,7
1 Stunde 30 Minuten danach	18	11	29	47	8
3 Stunden 30 Minuten danach	19	12	31	48	7,6
6 Stunden 30 Minuten danach	Ungeeignete Probe, enthält geronnenes Blut
24 Stunden danach	17
Herzpunktur

LO I

Ca) -J OD

Tabelle II

Kontrolle (Behandlung nur mit Liposomen)

O (O OO

	TBG des gesamten Blutes	r	k	r + k	am	TPI	Beobachtungen	I	schwierige Probe
Vor der Behandlung	17	10	27	60	15			Herzpunktur
30 Minuten danach	13	8	21	69	27
1 Stunde 30 Minuten danach	20	9	29	71	27
3 Stunden 30 Minuten danach	11	11	22	69	20
6 Stunden 30 Minuten danach	18	7	25	61	22
j 24 Stunden danach	16 ; 7	ι ²³	70	I 33

I
IO

N) **» Ca) CX)

Tabelle III

Heparin enthaltende Liposomen

CD O (O OO

O (O O CD

	TEG de:	r	k	3 gesamten Blutes	am	TPI	10	32	60	15	Beobachtungen
Vor der Behandlung	9	6	r + k	70	38
30 Minuten danach	21	15	15	52	7,2
1 Stunde 30 Minuten danach	19	10	36	53	11
3 Stunden 30 Minuten danach	7	6	29	67	33
6 Stunden 30 Minuten danach	13	Ungeeignete Probe, enthält geronnenes Blut
24 Stunden danach	22
Herzpunktur

Tabelle IV

S β

"I

ο co

00

co

Heparin enthaltende Liposocnen

	TE)G des gesamten Blutes	r	k	r + k	am	TPI	I j Beobachtungen
Vor der Behandlung	24	12	36	58	11,5
30 Minuten danach	25	15	40	57	8,8
1 Stunde 30 Minuten danach	34	24	58	46	3,5
3 Stunden 30 Minuten danach	36	21	57	61	7,4
6 Stunden 30 Minuten danach	36	17	53	57	7,8
28 Stunden danach	50	21	71	50	4,7

N)

σι

U) -J 00

Tabelle V

Heparin enthaltende Liposcmen

.1

OO O (O OO

	TEG des gesamten Blutes	r	k	r + k	am	TPI	Beobachtungen	]	j
Vor der Behandlung	15	8	23	63	21			" ' I I i
30 Minuten danach	19	10	29	60	15	I
1 Stunde 30 Minuten danach	26	14 j 40	57	9,5
3 Stunden 30 Minuten danach	23	11 ! 34	61	14,1
6 Stunden 30 Minuten danach	6	7 j 13	53	16
24 Stunden danach	28	12 j 40	54 1	8,1

hf.:

- -Λ

IS)

•Ο

Tabelle VI

Heparin enthaltende Liposcroen

OO CD CD OO

O CO O O

i 30 Minuten danach

	der	Behandlung	r	TBG des	gesamter	ι Blutes	TPI	Beobachtungen
			²⁰		r + k	am	4,1
Vor		k	40	42,3
	20

, 29,6 23,3

53 ι 39,5 3,7

	16	I	3	12,	3	28,3	51	6	8,8	schwierige	Probe
1 Stunde 30 Minuten danach	24,		3	25		49,3	40,		2,7	schwierige	Probe
3 Stunden 30 Minuten danach	27,		15,	3	42,6	49		6,6	schwierige	Probe
j 6 Stunden 30 Minuten danach	39	5	33		72	43	5	3,5
24 Stunden danach	36,		27		63,5	! ⁴²'		2,6
I 48 Stunden danach

CHOAY S.A.

Aus den in den obigen Tabellen aufgeführten Ergebnissen lassen sich folgende Beobachtungen ableiten: Wenn man die Kaninchen lediglich mit Wasser oder mit heparinfreien Liposomen behandelt, so ist keine merkliche Änderung der Parameter des Plasmas dieser Kaninchen festzustellen (Tabellen I und II).

Im Fall von Kaninchen, die man mit Liposomen behandelt hat, die in ihren Vesikeln Heparin enthalten, beobachtet man jedoch eine deutliche Zunahme der Parameter "r", "k" und "r + k" (Tabellen III, IV, V und VI). Die Zunahme erreicht ihr Maximum nach 24 Stunden, während das in üblicher Weise verabreichte Heparin im Durchschnitt innerhalb von 4 Stunden nach der intravenösen Verabreichung und innerhalb von 12 Stunden nach der Verabreichung auf

15 subkutanem Wege ausgeschieden wird.

Die Wirkung auf den Parameter "r + k" ist noch 48 Stunden nach der Verabreichung zu beobachten, was auf eine sehr interessante verzögerte Wirkung hinweist, die durch die besondere erfindungsgemäße Form zurückgeht, in der das Heparin verabreicht wird.

Diese mit der erfindungsgemäßen Zubereitung erzielten Ergebnisse zeigen stets eine Wirkung in der gleichen Richtung, nämlich eine Zunahme der Parameter "r", "k" und "r + k", woraus geschlossen werden kann, daß die Heparin 5 enthaltenden Liposomen, die "per os" verabreicht wurden, stets eine Wirkung auf die Gerinnungskinetik ausüben.

Ähnliche Wirkungen beobachtet man ebenfalls an Ratten, wenn man diesen Tieren die oben beschriebenen Heparin enthaltenden Liposomen verabreicht.

Wenn man die in den vorhergehenden Beispielen beschriebene Ultraschallbehandlungsvorrichtung verwendet, kann

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man kleinere Liposomen und insbesondere einschichtige Liposomen bilden, die schwach opaleszierende oder sogar fast transparente Suspensionen ergeben, wenn man eine Suspension, die 3,47 bis 10,4 mg Lipide, wie Phospholipide, und 0,6 bis 1,75 mg Cholesterin pro Milliliter einer wäßrigen Lösung, die vorteilhafterweise 5 bis 15 mg Heparin (oder 900 bis 2700 IE Heparin) enthält, lunter Anwendung einer Stromstärke von 3 bis 8 Ampere während 30 Minuten bis 2 Stunden einer Ultraschallbehandlung unterwirft.

Beispiel 4

Man löst verschiedene Lipidproben, die jeweils aus 104 mg Phospholipiden (Nattermann EPL) und 17,6 mg Cholesterin bestehen, in 5 ml Chloroform. Dann dampft man 15 die Lösungen im Vakuum bei 37⁰C in einem Rotationsverdampfer ein, wodurch sich auf der Wandung der entsprechenden Glaskolben oder Glasgefäße dünne Lipidfilme bilden.

Dann bringt man in die Gefäße verschiedene Lösungen, die in 5 ml einer 0,15m NaCl-Lösung 50, 100 bzw. 200 mg Heparin enthalten, und Glaskügelchen ein. Man rührt die Lösungen unter einer Stickstoffatmosphäre in einer Rührvorrichtung (Vortex), wodurch die an der Glaswandung der Gefäße anhaftenden Lipide abgelöst werden und Liposomen bilden.

Man gewinnt den Gefäßinhalt in Form von milchigen Suspensionen, wobei die noch in dem Gefäß zurückgebliebenen Liposomen mit jeweils zwei zusätzlichen Mengen einer 0,15m NaCl-Lösung aufgenommen werden, worauf die gewonnenen Suspensionen vereinigt werden, wobei sich ein Endvolumen von 15 ml ergibt. Man läßt die erhaltene Suspension während einer Stunde bei Raumtemperatur stehen und unterwirft sie dann während unterschiedlichen Zeitdauern, die sich von 2 bis 120 Minuten erstrecken (2,

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5, 8, 10, 13, 25, 60, 90 bzw. 120 Minuten) unter Anwendung einer Stromstärke von 1,5 bis 8 A einer Ultraschallbehandlung.

In sämtlichen Fällen erhält man schließlich lichtdurchlässige, kolloidale Liposomsuspensionen.

Beispiel 5

Man erzielt besonders gute Ergebnisse, wenn man wie folgt

vorgeht:

Man löst 104 mg Lipide (EPL, Nattermann) und 17,6 mg

Cholesterin (Sigma aus den USA) in 5 ml Chloroform in einem Glasgefäß und dampft die erhaltene Lösung dann im Vakuum bei 37⁰C ein. Dann beschickt man die Gefäße mit einigen GlaskUgelchen und 5 ml einer 0,15m Natriumchloridlösung, die 200 mg Heparin enthält, das einen Titer von 182 ΙΕ/mg aufweist. Dann rührt man den Gefäßinhalt unter einer Stickstoffatmosphäre in einer Rühreinrichtung (Vortex), bis sämtliche an der Wandung des Glasgefäßes anhaftenden Phospholipide in der wäßrigen Heparinlösung in Suspension gegangen sind.

20 Dann werden die flüssige Suspension gewonnen und die

noch in dem Gefäß verbliebenen Liposomen durch zweimalige Zugabe von 5 ml einer 0,15m Natriumchloridlösung aufgenommen. Nach dem Vereinigen der Suspension werden die Liposomen in 15 ml einer 0,15m Natriumchloridlösung suspendiert. Man läßt die suspendierten Liposomen während 1 Stunde stehen und behandelt sie dann während 90 Minuten bei 4 A mit Ultraschall.

Die Suspension wird dann während 10 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert. Die erhaltene Suspension wird als solche bei den nachstehend beschriebenen Untersuchungen an Ratten verabreicht.

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Man verfüttert an männliche Ratten (Wistar) mit einem durchschnittlichen Gewicht von 2 95 g (220 bis 4OO g) das gemäß dem vorstehenden Beispiel hergestellte Liposompräparat in unterschiedlichen Mengen von bis zu 15 000 ΙΕ/kg Körpergewicht während variierenden Zeitdauern, die sich von 1 Tag bis zu 9 Tagen erstrecken. 1 bis 48 Stunden nach der letzten Versorgung mit dem Wirkstoff werden Blutproben genommen.

Bei den angewandten Untersuchungsbedingungen und trotz

der zu beobachtenden individuellen Unterschiede zeigt sich, daß einige der üblicherweise zur Bestimmung der Gerinnungsgeschwindigkeit einer Blutprobe oder einer Plasmaprobe benützten Parameter, das heißt die Thrombinzeit, die Howell-Zeit, die Cephalin-Kaolin-Zeit sowie die thromboelasto-

15 graphischen Phänomene, sämtlich modifiziert werden,und

zwar in Richtung auf eine Verminderung der Gerinnbarkeit der untersuchten Plasma- oder Blut-Proben. Insbesondere zeigt sich, daß die Verabreichung einer Dosis von 15 000 ΙΕ/kg Körpergewicht dazu führt, daß das Blut einiger der Ratten, die diese Dosierung erhalten haben, keine Gerinnbarkeit mehr zeigt, während die Kontrollratten, denen man pro Tier 25 000 IE Heparin in Form einer wäßrigen Lösung des Calciumsalzes von Heparin oder 22 500 IE Heparin in Form des Natriumsalzes von Heparin

25 verabreicht hat, unter ähnlichen Bedingungen keine signifikante Wirkung auf die Gerinnbarkeit ihres Blutes zeigen.

Bei einer weiteren Untersuchung verfüttert man an Mäuse (des Stammes Swiss) 0,5 ml der Suspension von Beispiel 5, während man die Kontrolltiere auf gleichem Wege mit

0,5 ml Wasser oder einer wäßrigen Lösung, die 1200 IE des Natriumsalzes von Heparin enthält, behandelt.

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Eine Stunde später werden am Schwanz der Mäuse Blutungen verursacht.

Während die mit Wasser behandelten Kontrolltiere Blutungszeiten von 2,5 bis 12 Minuten und die mit einer wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von Heparin behandelten Mäuse eine Blutungszeit von 3 bis 8 Minuten zeigen, ergibt sich bei den mit den Heparin enthaltenden Liposomen behandelten Mäusen eine Blutungszeit von 21 bis 25 Minuten (mit Ausnahme einer Maus, die eine Blutungszeit von 9 Minuten zeigte).

Bei sämtlichen Untersuchungen wurde die Behandlung der Tiere durch zwangsweises Verabreichen der untersuchten Produkte über den Magen-Zwölffingerdarm wiederholt.

Es hat sich ferner gezeigt, daß selbst 18 Stunden nach der Verabreichung einer Injektion der erfindungsgemäßen Heparin enthaltenden Liposomen an Ratten noch eine Verlängerung der Thrombinzeit gegenüber den Kontrolltieren festzustellen ist. Dies verdeutlicht die verzögerte Wirkung, die die erfindungsgemäßen Heparin enthaltenden Liposomen in vivo ausüben.

Die Heparin enthaltenden Liposomen sind ebenso wie Heparin zur Steuerung der Gerinnbarkeit des Blutes geeignet, insbesondere zur Verhinderung der Hyperkoagulierbarkeit, wie man sie beispielsweise bei Patienten antrifft, die an Gefäßerkrankungen, Venenerkrankungen oder thrombolytischen Erkrankungen leiden.

Die Verwendung von Heparin enthaltenden Liposomen ist besonders erwünscht bei Behandlungen mit Heparin, bei denen die Verabreichung auf anderem als parenteralem Wege erfolgen soll, beispielsweise auf oralem oder rektalem Wege oder in Form von Salzen etc.

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Gegenstand der Erfindung sind daher auch Arzneimittel oder pharmazeutische Zubereitungen, die die erfindungsgemäßen Heparin enthaltenden Liposomen in Kombination mit pharmazeutischen Trägermaterialien, Bindemitteln und/oder Hilfsstoffen enthalten.

Sie betrifft insbesondere oral zu verabreichende Zubereitungen, die es ermöglichen, die Heparin enthaltenden Liposomen ohne Schädigung über die Magenschleimhaut zu verabreichen. Beispielsweise werden die Heparin enthaltenden Liposomen zusammen mit einem für die orale Verabreichung geeigneten Trägermaterial, das es ermöglicht, daß der Wirkstoff nur im Zwölffingerdarm freigesetzt wird, in pharmazeutische Zubereitungen eingearbeitet, die im Magen beständig sind. Mit Vorteil formuliert man

15 die Heparin enthaltenden Liposomen in magenbeständige Kapseln, wie sie beispielsweise von der Firma Scherer hergestellt werden, wobei jede Kapsel 20 bis 500 IE Heparin enthält.

Die Heparin in ihren Vesikeln enthaltenden Liposomen können auch in einem injizierbaren Trägermaterial suspendiert werden. Ein vorteilhaftes Beispiel eines für die kontinuierliche Perfusion geeigneten Präparats enthält das in steriler Weise hergestellte Liposomprodukt, das in einer isotonischen Lösung suspendiert ist, die in Ampullen oder Fläschchen mit Volumina von 1 bis 10 ml abgefüllt ist, die jeweils 100 bis 20 000 IE Heparin enthalten.

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Claims

Patentanwälte Dipl.-Ihg. H. Weicki-jann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.WEICKMANN, Dipl.-Chem. B. Huber

S MÖNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 9» 39 21/22

Case PL-O587-77-B
HtM/th

CHOAY S.A., 48, Avenue Theophile Gautier, 75 782 Paris Cedex 16

Liposomen, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel.

PATENTANSPRÜCHE

J Heparin enthaltende oder Heparin tragende Liposomen.
2. Liposomen nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß sie einschichtig sind.

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CHOAY S.A.
3. Liposomen nach Anspruch 1,dadurch g e kennze ichnet, daß sie mehrschichtig sind.
4. Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Heparin in den Lipidvesikeln der Liposomen vorliegt.
5. Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipide der Liposomen nicht-toxische, physiologisch

10 annehmbare und stoffwechselvertragliche Lipide sind.
6. Liposomen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipide aus Phospholipiden bestehen.
7. Liposomen nach Anspruch 5,dadurch g e kennzeichnet, daß die Lipide aus der Plasmalogene, Ganglioside, Sphingolipide, Phosphoglyceride, Phosphonolipide, Ufasome, monoacylierte Verbindungen, die von Fettsäuren mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen abgeleitete Ketten aufweisen, und nicht-toxische, anionische und

kationische, pharmazeutisch verträgliche Detergentien umfassenden Gruppe ausgewählt sind.
8. Liposomen nach Anspruch 8, dadurch gekenn zeichnet, daß ihre Lipide ungesättigte Fettsäureketten aufweisen.

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9. Liposomen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Lipide von essentiellen Fettsäuren abgeleitete Fettsäureketten aufweisen.
10. Liposomen nach Anspruch 6,dadurch g e kennze ichnet, daß ihre Phospholipide mindestens zum Teil Phosphatidylcholine umfassen, bei denen mindestens eine der Fettsäureacylgruppen von einer ungesättigten Fettsäure abgeleitet ist.
11. Liposomen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppen der Phosphatidylcholine von essentiellen Fettsäuren abgeleitet sind.
12. Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 11,

dadurch gekennzeichnet, daß das Heparin Bestandteile mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 bis etwa 20 000 umfaßt.
13. Liposomen nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Heparin als Hauptbestandteil Heparin mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 10 000 bis 15 000 enthält.
14. Liposomen nach den Ansprüchen 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Titer von etwa 150 bis etwa 250 IE pro mg

2 5 aufweisen.
15. Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie frei sind von amphiphilen Mitteln.

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CHCIAY S.A.
16. Dispersion der Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in einem wäßrigen Medium.
17. Dispersion nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wäßriges

5 Medium eine isotonische Lösung enthält.
18. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es Heparin enthaltende oder Heparin tragende Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen

10 Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff enthält.
19. Arzneimittel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer für die Verabreichung auf oralem Wege geeigneten Form vor-

15 liegt.
20. Arzneimittel nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer für die Verabreichung auf parenteralem Wege geeigneten Form vorliegt.
21. Verfahren zur Herstellung der Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Dispersion der entsprechenden Lipide mit einer Heparinlösung verrührt oder der Einwirkung von Ultraschallstrahlung unterwirft, bis sich Liposomen gebildet haben, die mindestens einen Teil des anfänglich in der wäßrigen Lösung enthaltenen Heparins zurückhalten.

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CHOAY S.A.
22. Verfahren nach Anspruch 21,dadurch gekennzeichnet, daß man die das Heparin enthaltenden Liposomen aus dem flüssigen Dispersionsmedium isoliert.

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