DE2746275C2 - Adsorptionsmittel für Proteine - Google Patents

Adsorptionsmittel für Proteine

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Description

in der R ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis 10 C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ein Methoxyrest, eine Acetoxygruppe oder ein unsubstituierter oder substituierter Phenylrest der Formel
ist (worin R' ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis 10 C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ein Methoxyrest oder Acetoxyrest ist),
und 2 bis 98 Gew.-% wenigstens eines vernetzbaren Monomeren, wobei das Copolymerisat einen mittleren Porendurchmesser (d) von 40 bis 9000 Ä und ein Gesamtporenvolumen von 0,05|/Xml bis 1,5 j/X ml/g Copolymerisat im trockenen Zustand hat, worin X den Gewichtsanteil des vernetzbaren Monomeren in Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtmonomeren, bezeichnet.
2. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyangruppen enthaltende Monomere Acrylnitril, Methacrylnitril oder ein Gemisch von Acrylnitril und Methacrylnitril ist.
3. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzbare Monomere ein Monomeres mit 2 bis 4 Vinylgruppen ist.
4. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzbare Monomere ein
Monomeres der allgemeinen Formel
CH2 V
35 C-C-
R:
■i
CH- CH2- O
Ri
— C (B)
R, O CH2
ist, worin Ri und R2 Wasserstoffatome oder Methylreste sind und η eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist.
5. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der Poren mit einem Durchmesser von 0,5 d bis 2 d nicht größer als 60% des gesamten Porenvolumens ist.
6. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Copolymerisat Kugelform aufweist.
Die Erfindung betrifft ein neues Adsorptionsmittel für Proteine, das aus einem porösen Copolymerisat eines speziellen, Cyangruppen enthaltenden Monomeren mit einem vernetzbaren Monomeren besteht und durch den so speziellen Bereich des mittleren Porendurchmessers und durch sein spezielles Gesamtporenvolumen gekennzeichnet ist, wodurch sein Adsorptionsvermögen für Proteine erheblich gesteigert werden kann.
Proteine werden bekanntlich an verschiedenen Stoffen, z. B. anorganischen Substanzen wie Aktivkohle, Kieselsäureanhydrid, Celite, Aluminiumoxyd, Kieselgel, Hydroxyapatit, Calciumphosphat und Magnesiumsilicat, und natürlichen polymeren Substanzen wie Stärke, Gluten und Inulin physikalisch adsorbiert. Diese Substanzen werden in der Praxis zur Klärung von proteinhaltigen Flüssigkeiten, zur Entfernung von in sehr geringen Mengen vorliegenden Proteinen und zur Reinigung oder Trennung von Proteinen verwendet. Es besteht jedoch die Tatsache, daß die Anwendungsbereiche der vorstehend genannten Adsorptionsmittel aus verschiedenen Gründen erheblich begrenzt sind. Beispielsweise weisen diese Substanzen häufig spezielle Eigenschaften gegenüber Proteinen, z. B. eine begrenzte Selektivität auf. Außerdem unterliegen die Lösungsbedingungen, z. B. der bo pH-Wert und dergleichen bei der Adsorption, für die sie verwendet werden, Begrenzungen. Ferner verursachen sie gelegentlich eine chemische Reaktion mit gewissen Proteinen oder Substanzen, mit denen sie gleichzeitig vorliegen, und einige dieser Adsorptionsmittel haben ungenügende mechanische Festigkeit.
Angesichts dieses Standes der Technik wurden von der Anmelderin Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, ein vielseitiges Adsorptionsmittel für Proteine zu entwickeln. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein poröses Copolymerisat vom Polyacrylnitriltyp die Fähigkeit hat, die verschiedensten Proteine in großen Mengen zu adsorbieren. Der Erfindung liegt diese Feststellung zu Grunde.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Adsorptionsmittel gemäß obigem Patentanspruch 1.
Wie nachstehend ausführlicher dargelegt werden wird, hat das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfin-
dung eine äußerst poröse Struktur und die Fähigkeit, die verschiedensten Proteine in großen Mengen zu adsorbieren. Ferner ist das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung chemisch stabil und zersetzt Proteine nicht Außerdem weist es eine ausgezeichnete mechanische Festigkeit auf. Bei Verwendung des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung kann daher das Adsorptionsverfahren erheblich vereinfacht und erleichtert und leicht im großtechnischen Maßstab durchgeführt werden. Ferner läßt sich das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung leicht herstellen. Dies sind Vorteile des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung gegenüber den vorstehend genannten üblichen Adsorptionsmittel für Proteine.
Als spezielle Beispiele von Cyangruppen enthaltenden Monomeren der allgemeinen Formel (A), die eine wiederkehrende Einheit des Copolymerisats des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung darstellen, seien genannt:
Acrylnitril, Methacrylnitril, Λ-Chloracrylnitril, Vinylidencyanid, Λ-Bromacrylnitril,
Λ-Fluoracrylnitril, Λ-Methoxyacrylnitril, «-Acetoxyacrylnitril, Λ-Äthylacrylnitril, «-Isopropylacrylnitril.it-n-Amylacrylnitril.df-Phenylacrylnitril,
«-(Methoxyphenyl)acrylnitrile, Λ-Tolylacrylnitrile, «-(Chlorphenyl)acrylnitrile,
«-(Cyanphenyl)acrylnitrile, Λ-n-Hexylacrylnitnl und Λ-Neopentylacrylnitril.
Diese Monomeren können allein oder in Mischung verwendet werden. Der Gehalt an Cyangruppen enthaltendem Monomeren im Copolymeren beträgt 2 bis 98%, vorzugsweise 4 bis 95%, Viiobei ein Gehalt von 6 bis 90 Gew.-% besonders bevorzugt wird.
Der bevorzugte Gehalt des Cyangruppen enthaltenden Monomeren hängt weitgehend von den Eigenschaften eines zu adsorbierenden Proteins oder einer Lösung, die ein zu adsorbierendes Protein enthält, ab. Wenn jedoch der Anteil des Cyangruppen enthaltenden Monomeren zu hoch ist, wird im allgemeinen der Vernetzungsgrad verringert, wodurch sich Nachteile wie Instabilität der Porenstruktur, übermäßiges Quellen oder Schrumpfen und Verschlechterung der mechanischen Festigkeit ergeben. Wenn andererseits der Anteil des Cyangruppen enthaltenden Monomeren zu niedrig ist, kann keine ausreichende Adsorptionswirkung im erhaltenen Adsorptionsmittel erreicht werden. Demgemäß ist die Verwendung einer zu großen oder einer zu kleinen Menge des Cyangruppen enthaltenden Monomeren zu vermeiden.
Das Copolymerisat gemäß der Erfindung kann auch ein oder mehrere andere Monomere, die mit dem die Cyangruppe enhaltenden Monomeren copolymerisierbar sind, enthalten. Als Beispiele solcher Monomerer seien genannt:
Kohlenwasserstoffverbindungen, z. B. Styrol, Methylstyrole, Äthylstyrole, Vinylnaphthaline, Butadien, Isopren und Piperylen, Styrolderivate, z. B.
Chlorstyrole, Bromstyrole, Ν,Ν-Dimethylaminostyrole, Nitrostyrole und Chlonnethylaminostyrole, Vinylsulfidderivate, z. B.
Methylvinylsulfid, Phenylvinylsulfid, Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, Acrylsäureester, z. B.
Methylacrylat und Chlormethylacrylat, Methacrylsäureester, z. B.
Cyclohexylmethacrylat, Dimethhylaminoüthylmethacrylat, Glycidylmethacrylai:,
Tetrahydrofurfurylmethacrylat und Hydroxyäthylmethacrylat, Itaconsäureester, z. B.
Dimcthylitaconat, Diäthylitaconat und Di-n-butylitaconat, Vinylketone, z. B.
Methylvinylketon und Äthylisopropenylketon, Vinylidenverbindungen, z. B.
Vinylidenchlorid und Vinylindenbromid, Acrylamidderivate, z. B.
Acrylamid, N-Butoxymethylacrylamid und N1N-Dimethylaminoäthylacrylamid. Vinylester von Fettsäuren, z. B.
Vinylacetat und Vinylcaprat, Thiofettsäurederivate, z. B.
Methylthioacrylat und Vinylthioacetat, und heterocyclische Vinylverbindungen, z. B.
N-Vinylsuccinimid, N-Vinylpyrrolidon, n-Vinylphthalimid, N-Vinylcarbazol, Vinylfurane,
Vinylimidazole, Methylvinylimidazole, Vinylpyrazole, Vinyloxazolidone, Vinylthiazole,
Vinylpyridine, Methylvinylpyridine und 2,4-Dimethyl-6-vinyl-triazin.
Diese Monomeren können allein oder in Mischung verwendet werden.
Der hier gebrauchte Ausdruck »vernetzbare Monomere« bezeichnet Monomere, die mehrere Gruppen der Formel
CH2=C
enthalten.
Als spezielle Beispiele vernetzbarer Monomerer, die die andere wiederkehrende Einheit des Copolymerisats des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung darstellen, seien genannt:
Divinylbenzolc, Divinylioluole, Divinylxylole, Divinylnaphthaline, Divinyläthylben/ole.
Trivinylbenzole. Divinyldiphenyle, Divinyldibenzylc, Divinylphcnyläiher, to
Divinyldiphenylamine, Divinylsiilfon, Divinylketoii, Divinylpyridine, Divinylchinolinc, Diallylphthalat, Diallylmaleat, Diallylfumarat, Diallylcarbonat, Diallyloxalat, Diallyladipat, Diallyltartrat, Diallylamin. Triallylamin, Triallylphosphat.
Triallyltricarballylat.N.N'-Äthylendiacrylamid, N.N'-Methylendimethacrylamid,
Äthylenglykoldimethacrylat, Polyäthylenglykoldimethacrylat, 1 ,3-ButylenglykoldimethacryIat,
Dipropylenglykoldimethacrylat.Polyäthyiengiykoldiacrylat.Polypropylenglykoldiacrylat,
Trimethylolpropantrimethacrylat, Pentaerythrittetramethacrylat, 1 ,3-Butylenglykoldiacrylat,
Trimethylolpropantriacrylat, Per.taerythrittetraacrylat Triallylisocyanurat,
13,5-Triacryloy !hexahydro- ',3,5-triazin und Diallylmelamin.
Diese Monomeren werden allein oder in Mischung verwendet. Bevorzugt hiervon werden Monomere mit
2 bis 4 Vinylgruppen. Vernetzbare Monomere, beispielsweise Vernetzungsmittel vom Koiilenwasserstoff-
typ, z. B. Divinylbenzole, und Vernetzungsmittel vom Typ der Fettsäureester, z. B. Äthylenglykoldimetha-Ciylat, werden besonders bevorzugt. Beispielsweise haben Vernetzungsmittel vom Fettsäureestertyp die folgende aligemeine Formel (B):
CH2 V c—c—o-
CH-CH2-O
-C-C (B)
R1 O CH2
Hierin stehen Ri und R2 für ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest, und η ist eine ganze Zahl von 1 bis 30. Der Anteil des vernetzbaren Monomeren beträgt 2 bis 98 Gew.-%, vorzugsweise 5—90 Gew.-%, wobei 8 bis 80 Gew.-% besonders bevorzugt werden. Wenn der Gehalt an vernetzbarem Monomerem zu niedrig ist, werden Quellung oder Schrumpfung in ungünstiger Weise verstärkt, während die mechanische Festigkeit veschlechtert wird. Wenn andererseits der Gehalt an vernetzbarem Monomerem zu hoch ist und der Vernetzungsgrad übermäßig stark erhöht wird, wird die Geschwindigkeit der Diffusion eines Proteins in die Poren des Copolymerisats verringert.
Das Copolymerisat, das das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung darstellt, hat eine Porenstruktur aus zahllosen Poren mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 40 bis 9000 Ä, vorzugsweise
von 50 bis 5000 Ä, wobei ein Durchmesser von 60 bis 3000 Ä besonders bevorzugt wird. Wenn der mittlere Porendurchmesser zu klein ist, wird das Eindringen oder die Adsorption eines Proteins in die Poren des Copolymerisats unmöglich oder die Diffusionsgeschwindigkeit sehr stark verringert. Ein zu großer mittlerer Porendurchmesser hat Nachteile wie Verkleinerung der Oberfläche mit großem Einfluß auf das Adsorptionsvermögen und Verschlechterung der mechanischen Festigkeit zur Folge.
Die Verteilung des Porendurchmessers ist ebenfalls ein Faktor mit großem Einfluß auf das Adsorptionsvermögen. Bevorzugt wird ein Volumen der Poren mit einem Durchmesser von 0,5 d bis 2 d (wobei d der mittlere Porendurchmesser ist) von nicht mehr als 60%, insbesondere von nicht mehr als 50% des gesamten Porervolumens. Zwar kann keine untere Grenze dieses Wertes festgelegt werden, da das Volumen der Poren mit einem Durchmesser, der sich dem mittleren Porendurchmesser nähert, natürlicherweise groß sein muß, jedoch muß die untere Grenze des genannten Wertes unbedingt 20% oder mehr betragen, und im allgemeinen liegt die untere Grenze bei 30%. Wie die nachstehende Beschreibung zeigt, hat das poröse Copolymerisat gemäß der Erfindung mit einer Verteilung des Porendurchmessers in einem solchen weiten Bereich ein sehr hohes Adsorptionsvermögen für Proteine.
Das Porenvolumen ist ferner ein Faktor mit großem Einfluß auf das Adsorptionsverrnögen für Proteine.
Speziell ist es im Rahmen der Erfindung unerläßlich, daß das gesamte Porenvolumen im Bereich von
0,05 /Xm! bis 1,5 /XmI pro Gramm des trockenen Copolymerisats liegt, wobei X der Gewichtsanteil des vernetzbaren Monomeren in Gew.-% der Gesamtmonomeren ist und das gesamte Porenvolumen vorzugsweise im Bereich von 0,2/"XmI bis 1,3/XmI pro Gramm des trockenen Polymerisats liegt. Wenn das Porenvolumen zu gering ist, steht keine ausreichende Oberfläche für die Adsorption zur Verfügung. Wenn das Porenvolumen zu groß ist, wird nicht nur die mechanische Festigkeit des Copolymerisats verschlechtert, sondern auch das Adsorptionsvermögen, d. h. die Proteinmenge, die pro Volumeneinheit des Copolymerisats adsorbiert werden kann, stark verringert. Im letzteren Fall neigt das Copolymerisat zu Deformierung, so daß bei Verwendung des Copolymerisats bei dem Säulenverfahren der Druckabfall häufig außergewöhnlich stark in einem solchen Maße steig», daß eine Lösung des Proteins die Säule nicht zu durchdringen vermag.
Nachstehend werden die Methoden beschrieben, die im Rahmen der Erfindung zur Bestimmung der Porencharakteristiken angewandt wurden.
Der mittlere Porendurchmesaer, die Verteilung des Porendurchmessers und das Porenvolumen werden unter Verwendung eines Quecksilber-Penetrationsporosimeters gemessen. Hierbei wird Quecksilber unter steigendem Druck in die Poren des zu prüfenden porösen Materials gepreßt. Das Porenvolumen wird aus der in den Poren der Probe eingeschlossenen Quecksilbermenge bestimmt. Der Porendurchmesser wird auf der Grundlage des Prinzips berechnet, daß der Durchmesser einer Pore umgekehrt proportional dem Druck ist, der notwendig ist, um das Quecksilber in die Poren zu pressen. Diese Meßmethode wird ausführlich in Kapitel 10 von »Fine Particle Measurement« von Clyde Orr, Jr., und J. M. Dallavalle (heraus-
fe-5 gegeben von The Maemillan Company, New York 1959) und in »Industrial and Engineering Chemistry« 17,
Heft 12 (1945) 782 — 786 von H. L. Ritter und L C. Drake beschrieben. Die Messung wurde grundsätzlich gemäß A NS1/ASTM D2873-70 (Reapproved 1976) unter Verwendung eines Quecksilber-Penetrationsporosimeters. Modell 905-1 (Hersteller Micromeritics Instrument Corporation, USA) durchgeführt. Die Werte
des eingedrungenen Volumens wurden ermittelt, indem Quecksilber unter den in der folgenden Tabelle genannten Drücken in die Poren gepreßt wurde.
psi bar psi bar psi bar
14,7 1.01 350 24.1 5000 345
20 1.38 450 31.0 7000 483
35 2.41 650 44.8 10000 690
45 3.10 850 58.6 15000 1034
85 5.86 1150 79.3 20000 1379
100 6.90 1500 103 30000 2069
125 8.62 2000 138 40000 2758
175 12.1 3000 207 50000 3448
250 17.2 4000 276
Mit Hilfe dieser Methode können sogar Poren mit einem Porendurchmesser bis hinab zu 35 bis 40 Ä gemessen werden. Im Rahmen der Erfindung bedeutet der Ausdruck »Pore« eine mit der Außenseite des Copolymerisats in Verbindung stehende offene Pore mit einem Durchmesser von wenigstens 40 Ä, und das Porenvolumen wird für diese offenen Poren bestimmt. Die Penetrometerwerte wurden in Abhängigkeit vom absoluten Gesamtdruck auf halblogarithmischem Vierphasen-Koordinatenpapier gezeichnet, und die Punkte wurden mit einem Bogenlineal verbunden. Die erhaltene Kurve stellt ein Profil der scheinbaren Intervall-Porengrößenverteilung dar. Der »mittlere Porendurchmesser« wird als Wert von r definiert, mit dem ein maximaler Wert von dV/d log r in der erhaltenen Kurve erhalten wird, wobei r den Porendurchmesser und V das mit dem Quecksilber-Penetrationsporosimeter gemessene kumulative Porenvolumen bezeichnet. Im Rahmen der Erfindung wird das »gesamte Porenvolumen« als Volumen des Quecksilbers definiert, das während der Zeit, in der der Quecksilberdruck von 3,85 bar bis 3448 bar bei der Quecksilber-Penetrationsmethode erhöht wird, in die Poren einer Probe von 1 g des trockenen Copolymerisats gepreßt wird.
Das Schüttgewicht ist als weiterer Index oder Anhaltspunkt für die Porosität zu nennen. Im Rahmen der Erfindung wurde das Schüttgewicht nach der folgenden Methode bestimmt:
Eine Probe des Copolymerisats wurde in eine mit einem Glasfilter versehene Kolonne gefüllt, worauf genügend Wasser durch die Kolonne geleitet und das Volumen des mit der Probe gefüllten Teils der Kolonne gemessen wurde. Dann wurde die Probe ausreichend getrocknet und ihr Gewicht ermittelt. Das Schüttgewicht wurde durch Dividieren des Gewichts durch das Volumen berechnet.
Nachstehend wird eines der Verfahren zur Herstellung der als Adsorptionsmittel dienenden Copolymerisate gemäß der Erfindung beschrieben.
Ein Verfahren zur Herstellung von hochporösen vernetzten Copolymerisaten wurde bereits beschrieben (siehe DE-PS ... (Patentanmeldung P 26 18 481.6), US-Patentanmeldung 6 77 120. britische Patentanmeldung 17 664/76 und französische Patentanmeldung 76-11 919). Dieses Verfahren ist auf die Herstellung der porösen Copolymeriste gemäß der Erfindung wirksam anwendbar, d. h. das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung kann hergestellt werden durch Copolymerisation eines Monomerengemisches aus 2 bis 98 Gew.-% wenigstens eines Cyangruppen enthaltenden Monomeren der allgemeinen Formel
CH2=C (A)
worin R ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis 10 C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ein Methoxyrest, ein Acetoxyrest oder ein unsubstituierter oder substituierter Phenylrest der Formel
R'
ist, worin R' ein Wasserstoffatom, ein Alkylrest mit 1 bis 10 C-Atomen, ein Halogenatom, eine Cyangruppe, ein Methoxyrest oder ein Acetoxyrest ist und 2 bis 98 Gew.-% wenigstens eines vernetzbaren Monomeren in Gegenwart eines organischen Mediums, das mit keinem der Monomeren reagiert und aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
(I) ein gemischtes organisches Medium, das im wesentlichen aus wenigstens einer aus Flüssigkeiten der Gruppe (i) gewählten Flüssigkeit und wenigstens einer anderen, aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) : gewählten Flüssigkeit besteht,
(H)1I ein gemischtes organisches Medium, das im wesentlichen aus wenigstens einer aus Flüssigkeiten der ■ !Gruppe (ii) gewählten Flüssigkeit und wenigstens einer anderen, aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) j j gewählten Flüssigkeit besteht,
ni| ein organisches Medium, das aus einer aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) gewählten Flüssigkeit besteht
und
(IV) ein gemischtes organisches Medium, das aus wenigstens zwei aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) gewählten Flüssigkeiten besteht,
worin die Flüssigkeiten der Gruppe (i) alle Homopolymeren der gewählten Monomeren lösen,
die Flüssigkeiten der Gruppe (ii) keines der gewählten Homopolymeren lösen und
die Flüssigkeiten der Gruppe (iii) wenigstens ein Homopolymeres der gewählen Monomeren, aber wenigstens ein anderes Homopolymeres aus dem gewählten Monomeren nicht lösen.
Im Rahmen der Erfindung wird die folgende Methode zur Auswahl einer organischen Flüssigkeit angewandt:
Zu einer organischen Flüssigkeit werden 5 Gew.-% eines Monomeren und 0,1 Gew.-% 2,2-Azobisisobutyroni-ίο tril gegeben. Die erhaltene Lösung wird in einem verschlossenen Glasrohr 8 Stunden bei der gleichen Temperatur, wie sie für die Polymerisationsreaktion gemäß der Erfindung anzuwenden ist, polymerisiert, worauf das Reaktionsgemisch beobachtet wird. Wenn das gebildete Polymerisat ausgefällt worden ist, wird die organische Flüssigkeit als »organische Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren nicht löst«, bezeichnet. Wenn das gebildete Polymerisat in der organischen Flüssigkeit gelöst ist, wird die organische Flüssigkeit als »organisehe Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren löst«, bezeichnet. Ferner wird bei einem als Monomeres verwendeten vernetzbaren Monomeren., das mehrere Gruppen der Formel
CH2=C
enthält, in Fällen, in denen das Reaktionsgemisch des gebildeten Polymerisats und die organische Flüssigkeit undurchsichtig ist, die organische Flüssigkeit als »organische Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren nicht löst«, bezeichnet, und wenn das Reaktionsgemisch durchsichtig ist, wird die organische Flüssigkeit als »organische Flüssigkeit, die ein Homopolymeres des Monomeren löst«, bezeichnet.
Die Löslichkeiten bestimmter Polymerisate in organischen Flüssigkeiten werden von J. Brandrup und E. H. Immergut in »Polymer Handbook«, Kapitel IV, Seite 185-234 (1966) und Kapitel IV, Seite 241 -265,2. Auflage 1975, angegeben. Dieses Handbuch ist vorteilhaft bei der Wahl von Lösungsmitteln und Nichtlösern.
Man ist allgemein der Ansicht, daß die Löslichkeit von Polymerisaten in organischen Flüssigkeiten nach dem relativen Wert der jeweiligen Löslichkeitsparameter bewertet wird. Diese Methode ist jedoch nur auf Polymerisate mit verhältnismäßig niedriger Polarität anwendbar. Wenn eine solche Methode auf Polymerisate, die eine polare Monomereinheit, z. B. eine Cyangruppen enthaltende Monomereinheit enthalten, angewandt wird, führt die Wahl von organischen Flüssigkeiten nach Löslichkeitsparametern häufig zu Irrtümern.
Das Verfahren zur Herstellung eines Copoiymerisats mit einer gewünschten Porenstruktur wird nachstehend beschrieben.
Zunächst kann der gewünschte Porendurchmesser nach den folgenden Methoden erhalten werden: Die Polymerisation wird unter Verwendung eines organischen Mediums durchgeführt, das wenigstens eine geeignete Flüssigkeit, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) gewählt ist, enthält. Wenn der Porendurchmesser eines erhaltenen Polymerisats kleiner ist als gewünscht, kann er durch Zusatz wenigstens einer Flüssigkeit, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (ii) gewählt ist, zum organischen Medium vergrößert werden. Wenn der Porendurchmesser größer ist als gewünscht, kann er durch Zusatz wenigstens einer Flüssigkeit, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (i) gewählt ist, zum organischen Medium verkleinert werden. Wenn ein organisches Medium, das wenigstens zwei Flüssigkeiten enthält, die aus Flüssigkeiten der Gruppe (iii) gewählt sind, verwendet wird, kann der Porendurchmesser genau eingestellt werden. Im allgemeinen kann bei Verwendung mehrerer Flüssigkeiten der Porendurchmesser im gebildeten Copolymerisat durch entsprechende Veränderung des Mischungsverhältnisses der Flüssigkeiten stufenlos verändert werden.
Zweitens kann das gewünschte Porenvolumen durch Einstellung der folgenden Bedingungen erhalten werden: Das Porenvolumen des gebildeten Copoiymerisats hängt von seinem Porendurchmesser und von der verwendeten Menge des organischen Mediums ab. Wenn der Porendurchmesser gering ist, wird der größte Teil des organischenn Mediums zum Quellen des Polymernetzwerks verbraucht. Dies hat zur Folge, daß das Porenvolumen kleiner wird. Andererseits ist es mit steigendem Anteil des vernetzbaren Monomeren an den Gesamtmonomereri zur Sichersie'lung des genügenden Porenvolumen erforderlich, die zuzusetzende Menge des organischen Mediums zu erhöhen. Einer der Gründe hierfür liegt darin, daß zwar die Neigung eines schwach vernetzten Copoiymerisats in einer wäßrigen Lösung zum Quellen zu einer Vergrößerung seines Porenvolumens führt, jedoch ein stark vernetztes Copolymerisat eine geringere Quellneigung hat und daher die Vergrößerung seines Porenvolumens durch Quellen in einer wäßrigen Lösung geringer ist. Ein anderer Grund liegt darin, daß, je höher der Vernetzungsgrad ist, um so dichter die dreidimensionale Struktur der Polymerkette des gebildeten Copoiymerisats und es um so schwieriger wird, Mikroporen zu bilden, die Adsorptionsstellen für ein daran zu adsorbierendes Protein darstellen. Wenn beispielsweise die auf die Gesamtmonomeren bezogene Menge der gesamten Flüssigkeiten in Gew.-% mit D und die auf die Gesamtmonomeren bezogene Menge des vernetzbaren Monomeren in Gew.-% mit X bezeichnet wird, wird vorzugsweise die Bedingung 7fX<D < 500 fX insbesondere die Bedingung 20fX<D < 200/Xerfüllt, wobei die Erfüllung der Bezeichnung 34 /TT < D < 150 /^"besonders bevorzugt wird.
Nachstehend werden spezielle Beispiele von Kombinationen von Flüssigkeiten, die für die Herstellung von Copolymerisaten gemäß der Erfindung zu verwenden sind, genannt
Im Falle der Copolymerisation von Acrylnitril mit Divinylbenzol und Äthylstyrol können Dimethylformamid, n-Methylacetamid, Nitromethan, Dimethylsulfoxyd, Benzonitril, ^-Butyrolacton, Ν,Ν-Dimethylacetarnid, Acetophenon u. dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (i), aromatische Kohlenwasserstoffe, z. B. Toluol, Xylol, Äthylbenzol
oder Tetralin, und Cyclohexanon, Anisol, Chlorbenzol, Dichlorbenzol, Methylbenzoate, Äthylbenzoate, Benzylalkohol, Methylenchlorid, Chloroform und Dioxan u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (iii) und aliphatisch^ Kohlenwasserstoffe, z. B. Heptan und Decalin, aliphatische Alkohole, z. B. n-Butanol, Cyclohexanol und Isooctylalkohol. und Amylacetat, Dibutylphthalat, Dioctylphthalat u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (ii) verwendet werden. r,
Im Falle der Copolymerisation von Acrylnitril mit Äthylenglykoldimethaciylat können beispielsweise Dimethylformamid, Dimethylsull'oxyd, ^-Butyrolacton und Ν,Ν-Dimethylacetamid als Flüssigkeit der Gruppe (i), Toluol, Methyläthylketon, Dioxan, Cyclohexanon, Methylenchlorid, Chlorbenzol u. dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (iii) und Heptan, Octan, n-Butanol und Isopropanol als Flüssigkeit der Gruppe (ii) verwendet werden.
Für die Copolymerisation von Methacrylnitril mit Divinylbenzol und Äthylvinylbenzol können beispielsweise Pyridin, Nitromethan, Benzonitril, Cyclohexanon, Methyläthylketon und ^-Butyrolacton als Flüssigkeit der Gruppe (i), Toluol, Äthylbenzol, Tetralin, Butylacetat, Äthylpropionat u. dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (iii) und Heptan, Butanol, lsooctanol, Cyclohexanol, Dioctylphthalat u.dgl. als Flüssigkeit der Gruppe (ii) verwendet werden.
Außer den vorstehend als Beispiele genannten Flüssigkeiten können die verschiedensten anderen Fiüssigkeiten verwendet werden, nachdem die Lösungseigenschaften dieser Flüssigkeiten untersucht worden sind.
Die Polymerisation zur Herstellung der Copolymerisate gemäß der Erfindung kann entweder als radikalische Polymerisation oder ionische Polymerisation durchgeführt werden, jedoch ist es im allgemeinen zweckmäßig, ein Polymerisationsverfahren anzuwenden, bei dem eine Lösung oder eine wäßrige Suspension eines Gemisches aus Medium und Monomerem, in dem ein freie Radikale bildender Initiator gelöst ist, erhitzt wird. Ein freiradikalischer Initiator, der im Gemisch des Mediums und der Monomeren löslich und bei der Reaktionstemperatur zersetzbar ist, wird für die radikalische Polymerisation verwendet. Als Beispiele bevorzugter freiradikalischer Initiatoren seien genannt: Acylperoxyde, z. B. Benzoylperoxyd und Lauroylperoxyd, Azonitrile, z. B. 2,2'-Azobisisobutyronitril und U'-Azobisicyclohexancarbonitril), Peroxyde, z. B. Di-t-butylperoxyd, Dicumylperoxyd und Methyläthylketonperoxyd, und Hydroperoxyde, z. B. Cumolhydroperoxyd und t-Butylhydroperoxyd. Die Reaktion wird bei Temperaturen von 10° bis 2000C, vorzugsweise 20° bis 150°C durchgeführt, wobei Temperaturen von 30° bis 100°C besonders bevorzugt werden. Wenn Monomere einschließlich Acrylnitril im offenen System po'ymerisiert werden, muß die Polymerisationstemperatur erniedrigt werden, da Acrylnitril einen niedrigen Siedepunkt hat. Daher wird in diesem Fall als Polymerisationsinitiator teilweise oder ganz ein Initiator des Typs mit niedriger Zersetzungstemperatur, z. B. 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril), 2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitril), t-Butylpervalerat oder Diisobutylperoxycarbonat, verwendet.
Besonders bevorzugt als Polymerisationsverfahren für die Herstellung der Copolymerisate gemäß der Erfindung wird die Suspensionspolymerisation unter Verwendung von Wasser als Suspendiermedium, wobei ein körniges Harz leicht erhältlich ist. Acrylnitril ist in Wasser leicht löslich. Wenn jedoch Acrylnitril mit einer in Wasser unlöslichen Flüssigkeit oder einem in Wasser unlöslichen Monomeren gemischt wird, wird die Löslichkeit in Wasser stark verringert.
Bei Verwendung einer wasserlöslichen organischen Flüssigkeit oder eines wasserlöslichen Monomeren für die Durchführung der Polymerisation ist die Suspensionspolymerisation nicht zweckmäßig. In diesem Fall wird vorzugsweise ein Verfahren angewandt, bei dem zunächst durch Lösungspolymerisation ein voluminöses Produkt hergestellt und dann auf eine geeignete Korngröße gemahlen wird.
Als Beispiele geeigneter Suspendiermittel, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, seien genannt: Natürlich polymere Substanzen, z. B. Stärke, Tragantgummi und Gelatine, modifizierte natürliche polymere Substanzen, z. B. Hydroxyäthylcellulose, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose, wasserlösliche synthetische polymere Substanzen, z. B. Polyacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, teilweise verseiftes Polyvinylacetat und Polyvinylalkohol, und anorganische Substanzen, z. B. Bariumsulfat, Talkum, Hydroxyapatit, Bentonit, Kieselsäureanhydrid und Calciumcarbonat.
Bei Verwendung von leicht wasserlöslichen organischen Flüssigkeiten oder Monomeren wie Acrylnitril wird zur Regelung ihrer leichten Löslichkeit vorzugsweise ein anorganisches Salz, z. B. Natriumchlorid oder Calciumchlorid, der wäßrigen Phase zugesetzt.
Es hat sich gezeigt, daß die Cyangruppen enthaltenden, porösen, vernetzten Copolymerisate gemäß der Erfindung, die nach dem vorstehend beschriebenen typischen Verfahren hergestellt worden sind, ausgezeichnete Eigenschaften als Adsorptionsmitte! für Proteine haben. Auf diese ausgezeichneten Eigenschaften wird im folgenden nacheinande: eingegangen.
1) Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung hat eine poröse Struktur.
Die Eignung und Leistungsfähigkeit eines Adsorptionsmittels wird in erster Linie nach der Adsorptionsgeschwindigkeit und nach dem Adsorptionsvermögen bewertet. Die Zahl der verfügbaren üblichen Adsorptionsmittel mit Porenstruktur ist nicht gering. Eines der charakteristischen Merkmale der Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung gegenüber diesen üblichen Adsorptionsmitteln besteht darin, daß die Porenstruktur nach Belieben eingestellt und verändert werden kann. Beispielsweise kann im Copolymerisat gemäß der Erfindung der mittlere eo Porendurchmesser nach Belieben auf einen Wert im Bereich von 40 bis 9000 A eingestellt werden. Andererseits wird es bevorzugt, daß der Bereich der Porendurchmesserverteilung eine gewisse Breite hat. Die Anwesenheit von Poren mit großem Durchmesser erhöht erheblich die Diffusionsgeschwindigkeit eines Proteins in die Poren des Copolymerisate, und wenn Poren mit kleinem Durchmesser in großen Mengen vorhanden sind, wird die innere Oberfläche des Copolymerisate vergrößert Es hat sich gezeigt, daß ein Copolymerisat gemäß der Erfindung mit einer Porendurchmesserverteilung in einem verhältnismäßig weiten Bereich hohe Adsorptionsgeschwindigkeit und hohes Adsorptionsvermögen aufweist Wenn ein bestimmtes Protein adsobiert werden soll, ist eine Porenstruktur vorhanden, die für die Adsorption dieses Proteins optimal ist. Richtlinien für die Einstellune
einer optimalen Porenstruktur können nicht einfach gegeben werden, jedoch muß für die Erzielung einer optimalen Porenstruktur in erster Linie die Molekülgröße eines zu adsorbierenden Proteins berücksichtigt werden. Im allgemeinen haben Proteine eine Molekülgröße im Bereich von etwa 10 A bis zu einigen hundert A. Damit das Protein in die Poren des Copolymerisats diffundieren kann und das Protein in der Porenstruktur adsorbiert wird, müssen im Copolymerisat Poren ausgebildet werden, deren Durchmesser größer ist als wenigstens die Molekülgröße des Proteins.
Es wurde gefunden, daß ein optimaler mittlerer Porendurchmesser in Abhängigkeit von der Molekülgröße eines zu adsorbierenden Proteins vorliegt. Beispielsweise lassen die Ergebnisse der in den folgenden Beispielen 8 bis 12 beschriebenen Versuche erkennen, daß Proteine mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 80 000
ίο in größten Mengen an einem Copolymerist mit einem mittleren Porendurchmesser von 200 Ä adsorbiert werden, während Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 100 000 in großen Mengen an einem Copolymerisat mit einem mittleren Porendurchmesser von 1200 A adsorbiert werden. Diese Ergebnisse lassen erkennen, daß bei einem Protein mit großer Molekülgröße ein großer Porendurchmesser notwendig ist, damit das Protein in genügendem Maße diffundieren kann. Im einzelnen kann eine optimale Porenstruktur erreicht werden, indem im Copolymerisat geeignete Porencharakteristiken in Abhängigkeit von der Molekülgröße und -form, eines zu adsorbierenden Proteins eingestellt werden. Gelegentlich ist es möglich, ein bestimmtes Protein allein aus mehreren Proteinen selektiv zu adsorbieren.
2) Das als Adsorptionsmittel dienende Copolymerisat gemäß der Erfindung hat die Fähigkeit, verschiedene Proteine in großen Mengen zu adsorbieren.
Die Ergebnisse der in den Beispielen beschriebenen Versuche zeigen, daß die veschiedensten Proteine von den Peptiden mit einem Molekulargewicht von ewa 1000 bis zu makromolekularen Proteinen mit Molekulargewichten von einigen hunderttausend durch das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung in großen Mengen von beispielsweise einigen hundert mg pro Gramm des trockenen Copolymerisats adsorbiert werden können.
Außerdem wird das Adsorptionsvermögen der Copolymerisate gemäß der Erfindung für Proteine in keiner Weise durch den isoelektrischen Punkt beeinflußt, der als weiterer wichtiger Faktor, der das Protein kennzeichnet, anzusehen ist. Beispielsweise zeigen die Beispiele 8 bis 12, daß die Copolymerisate gemäß der Erfindung ein sehr hohes Adsorptionsvermögen für die verschiedensten Proteine mit einem isoelektrischen Punkt im weiten Bereich von 4,7 bis 10,4 aufweisen.
Es hat sich gezeigt, daß die als Adsorptionsmittel dienenden Copolymerisate gemäß der Erfindung ein hohes Adsorptionsvermögen für Enzyme sowie für gewöhnliche einfache Proteine aufweisen.
3) Das als Adsorptionsmittel dienende Copolymerisat gemäß der Erfindung zeichnet sich durch hohe mechanische Festigkeit aus.
Von Stärke, Cellulose, Dextran u. dgl. abgeleitete Polymerisate wurden bisher in großem Umfang als Träger für die Trennung, Reinigung und Bindung von Proteinen verwendet. Als typische Beispiele solcher Polymerisate sind durch Epichlorhydrin vernetztes Dextran und durch Epichlorhydrin vernetzte Agarose zu nennen. Diese von natürlichen Stoffen abgeleitete Träger quellen jedoch in hohem Maße und haben schlechte mechanische Festigkeit. Daher werden sie unter Druck leicht deformiert oder gebrochen, so daß der Durchlauf von proteinhaltigen Flüssigkeiten häufig durch den Druckanstieg gehemmt wird. Daher können diese Adsorptionsmittel kaum in großtechnischem Maßstab verwendet werden. Im Gegensatz hierzu haben die Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung eine hohe mechanische Festigkeit, die für dreidimensionale vernetzte Polymerisate naturgegeben ist. Daher können die Copolymerisate gemäß der Erfindung vorteilhaft in dem in eine Kolonne gepackten Zustand für die Chromatographie verwendet werden.
4) Es ist allgemein bekannt, daß hinsichtlich des Adsorptionsvermögens, der mechanischen Festigkeit und der Leichtigkeit des Durchgangs einer Flüssigkeit Adsorptionsmittel mit Kugelform besonders bevorzugt werden. Im Rahmen der Erfindung kann ein Protein-Adsorptionsmittel, das aus einem Copolymerisat mit Kugelform besteht, durch Suspensionspolymerisation unter Verwendung von Wasser als Suspensionsmittel leicht hergestellt werden.
5) Eine der bevorzugten Eigenschaften eines Adsorptionsharzes besteht darin, daß das Harz inaktiv ist und in einem weiten pH-Bereich verwendet werden kann. Da Polyacrylnitril, Polydivinylbenzol u. dgl. diese Eigenschaft verleihen, weist das Copolymerisat gemäß der Erfindung diese Eigenschaft auf, falls nicht ein Monomeres mit hohen Reaktionsvermögen dem als Ausgangsmaterial verwendeten Monomerengemisch zugesetzt wird. Vielseitige anorganische Adsorptionsmittel wie aktiviertes Aluminiumoxyd und Kieselgel zersetzen ein Adsorbat zuweilen. Im Gegensatz hierzu weist das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung Vorteile gegenüber diesen vielseitigen anorganischen Adsorptionsmitteln auf, weil es für die verschiedensten Substrate unter Arbeitsbedingungen in einem weiten Bereich anwendbar ist
6) Ferner kann das Copolymerisat gemäß der Erfindung wiederholt eingesetzt und sein Adsorptionsvermögen für lange Zeiträume mit geringerer Verschlechterung hoch gehalten werden. Das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung weist somit einen sehr hohen praktischen Wert und Nutzen auf.
Wie die vorstehende Beschreibung zeigt, weist das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung verschiedene vorteilhafte Eigenschaften auf. Einer der Gründe hierfür liegt darin, daß das vernetzbare Monomere in die Struktureinheiten des Copolymerisats, das das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung darstellt, eingebaut ist Eine Cyangruppen enthaltende poröse Masse kann beispielsweise erhalten werden, indem eine Polymerlösung, die Polyacrylnitril enthält, einem Nichtlöser zugesetzt und hierdurch das Polymerisat ausgefällt wird,
oder indem Polyacrylnitril auf die Oberfläche einer porösen Substanz beispielsweise nach einem Verfahren aufgebracht wird, bei dem eine Polyacrylnitrillösung mit der porösen Substanz zusammengeführt und das Lösungsmittel abgedampft wird.
Das Copolymerisat gemäß der Erfindung mit dreidimensionaler vernetzter Struktur weist in verschiedener Hinsicht Vorteile gegenüber solchen porösen Produkten auf. Beispielsweise kann die Porenstruktur im Copolymerisat gemäß der Erfindung leicht eingestellt und geregelt werden, und die einmal gebildete Porenstruktur verändert oder deformiert sich in geringerem Maße beim Durchleiten von Flüssigkeiten oder durch Anwendung von äußerem Druck. Demgemäß zeigt das Copolymerisat gemäß der Erfindung ein hohes Adsorptionsvermögen, das für lange Zeiträume unverändert bleibt. Ferner hat das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung ein hohes Adsorptionsvermögen, das für lange Zeiträume unverändert bleibt Ferner hat das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung hohe mechanische Festigkeit, und das Copolymerisat, das das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung darstellt, wird in den zu behandelnden Flüssigkeiten nicht gelöst.
Der hier gebrauchte Ausdruck »trockenes Copolymerisat« oder »Copolymerisat im trockenen Zustand« bezeichnet das Copolymerisat, dessen Gewicht nach dem folgenden Trockenverfahren im wesentlichen konstant geworden ist.
Nach der Copolymerisation wird das erhaltene Copolymerisat mit einem nicht über 1200C siedenden Lösungsmitiel gut gewaschen und dann bei 700C getrocknet Das Gewicht des Copolymerisats wird in bestimmten Abständen gemessen. Wenn der Unterschied zwischen zwei gemessenen Gewichten des Copolymerisats in einem Abstand von 24 Stunden geringer als 1% des später gemessenen Gewichts ist, gilt das Copolymeriset als ein Copolymerisat, dessen Gewicht im wesentlichen konstant geworden ist. Das Trocknen kann unter vermindertem Druck durchgeführt werden, um die Trockenzeit zu verkürzen.
Im Rahmen der Erfindung ist unter »Protein« eine makromolekulare stickstoffhaltige Verbindung zu verstehen, die ein Molekulargewicht von nicht weniger als 500 hat und im wesentlichen aus mehreren Λ-Aminosäuren besteht, die über eine Säureamidbindung, d. h. eine Peptidbindung, aneinander ^ ibunden sind.
Als Beispiele von Proteinen, die durch das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbiert werden können, seien genannt: Avidin, Albumine, z. B. Serumalbumin, Ovalbumin, Conalbumin. Lactalbumin: Leucosin, Ricin und Legumelin, Erythrocruorin, Phosphorproteine, z. B. Casein, Vitellin und Phosvitin, Globuline, z. B. Serumglobu-Hn, Ovoglobulin, Lactoglobulin, Legumin, Edestin, Phaseolin, und Glycinin, Protamine, z. B. Salmin und Clupein, Myoproteine, z. B. Myosin, Actin, Tropomyosin und Myogen, Histon, Prothrombin, Hämerythrin, Hämoglobin, Hämocyanin, Myoglobin, Lipoproteine, z. B. Rhodopsin, Lipovitellin und Proteolipid, Glykoproteine, z. B. Ovomucoid, Kallidin und Bradykinin, Inhibitoren gegen Enzyme, z. B. Antipain und Pepstatin, Plasmaproteine, z. B. Antitrypsin, Ceruloplasmin, Haptoglobin, Makroglobuün, Hämopexin, Transferrin, Glykoprotein, Prothrombin und Fibrinogen, toxische Proteine, z. B. Erabutoxin, Butulinustoxin, Cardiotoxin, Bungarotoxin, Ricin und Abrin, Hormone, z. B. Angiotensin, Glucagon, Oxytocin, Vasopressin, Argininvasotocin, Insulin, somalotropische Hormone, lactogenes Hormon, adrenocorticotropisches Hormon, somatotropische Hormone und Melanocyt-stimutierende Hormone, Antibiotika, z. B. Gramicidine, Collistin, Tyrocidine, Bacitracin und Polymyxin, und Enzyme.
Als spezielle Beispiele der Enzyme seien genannt:
Oxidoreduktasen, ;c. B. Alkoholdehydrogenase (1.1.1.1), Glycerindehydrogenase (1.1.1.6), Glycerinphosphatdehydrogenase (1.1.1.8),/?-Hydroxybutyratdehydrogenase (1.1.1.30), Malatdehydrogenase (1.1.1.37), Isocitratdehydrogenase (1.1.1.41), Lactatdehydrogenase (1.1.1.27), Galactosedehydrogenase (1.1.1.48), Glucose-ß-phosphatdehydrogenase (1.1.1.49), Glucoseoxydase (1.1.3.4), Cholesterinoxydase (1.1.3.6), Galactoseoxydase (1.1.3.9), Xanthinoxydase (1.2.3.2), Glutamatdehydrogenase (1.4.1.2), L-Aminosäureoxydase (1.4.3.2), D-Aminosäureoxydase (1.4.3.3), Pyridinnucleotidtranshydrogenase (1.6.1.1), Uricase (1.7.3.3), Cytoehrom (1.9.3.1),Tyrosinase (1.10.3.1), Katalase (1.11.1.6), Peroxydase (1.11.1.7) und Lipoxygenase (1.13.1.13), Transferasen, z. B. Transaldolase (2.2.1.2), Phosphorylase (2.4.1.1), Dextransaccharase (2.4.1.5), Levansaccharase (2.4.1.14), Purinnucleosidphosphorylase (2.4.2.1), trans-N-Glykosidase (2.4.2.6),Glutamin-brenztraubensäuretransaminase (2.6.1.2), Hexokinase (2.7.1.1), Pyruvatkinase (2.7.1.40), Carbamatkinase (2.7.2.2). Phosphoglyceratkinase (2.7.2.3), Creatinkinase (2.7.3.2), N AD-Pyrophosphorylase (2.7.7.1), RNA- nucleotidyltransferase (2.7.7.6), Polynucleotid-phosphorylase (2.7.7.8) und Ribonuclease (2.7.7.16), Hydrolasen, z.B. Lipase (3.1.1.3), Acetylcholinesterase (3.1.1.7), Cholesterinesterase (3.1.1.13), Lipoproteinlipase (3.1.1.34), alkalische Phosphatasen (3.1.3.1), Säurephosphatasen (3.1.3.2), Phosphodiesterase (3.1.4.1), Desoxyribonuclease (3.1.4.5). *-Amylase (3.2.1.1), ^-Amylase (3.2.1.2), Cellulase (3.2.1.4), Dextranase (3.2.1.11), Pectinase (3.2.1.15), Lysozym (3.2.1.17), Neuraminidase (3.2.1.18), Λ-Galactosidase (3.2.1.22),/?-Galactosidase (3.2.1.23), Invertase (3.2.1.26), Hyaluronidase (3.2.1.35), Leucinaminopeptidase (3.4.1.1), Carboxypeptidase (3.4.2.3), Prolidase (3.4.3.7), Pepsin (3.4.4.1), Rennin (3.4.4.3), Urokinase,Trypsin (3.4.4.4), Elastase (3.4.4.7), Papain (3.4.4.10), Ficin (3.4.4.12), Renin, Thrombin (3.4.4.13), Subtilisin (3.4.4.16), Subtilopeptidase A (3.4.4.16), Chymotrypsin (3.4.4.5), Kallikrein (3.4.21.8), Asparaginase (3.5.1.1), Glutaminase (3.5.1.2), Urease (3.5.1.5), Penicillinamidase (3.5.1.11), Aminocylase (3.5.1.14), Penicillinase (3.5.2.6), Adenindeaminase (3.5.4.2). ATPase (3.6.1.3), Myosin-ATPase (3.6.1.3). Apyrase (3.6.1.5), ATP-Deaminase, AMP-Deaminase, Glucosidase, Subtilisin und Cephalosporinacylase, Lyasen, z. B. Asparagat-4-decarboxyläse (4.1.1.12), Aldolase (4.1.2.7). Aminosäuredecarboxylasc, Fumarase (4.2.1.2),Tryptophanase, 2-Phosphoglycera(dehydrate (4.2.1.11). Try ptophansy nt hase (4.2.1.20), Asparagase (4.3.1.1), und Cysteindesulfhydr;i<;e(4.4.l.1), Isomerasen, z. B. Aminosäureaecmase.Glucosephosphaüsomenise (5.3.1.9) und Glucoseisomcrase und Ligasen. /. B. Succinyl-CoA-Synthetase (6.2.1.4) und Citratsäuresynthase.
Die Zahlen in Klammern entsprechen der Enzym-Nomenklatur (Recommendations of the International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classification of Enzyme).
Auf Grund der vorstehend genannten verschiedenen Eigenschi· hen können die Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung für die verschiedensten Anwendungsgebiete, die nachstehend beschrieben werden, wirksam eingesetzt werden.
1) Reinigung und Abtrennung von Proleinen
Die Absorptionsmittel gemäß der Erfindung vermögen auf Grund ihrer hervorragenden selektiven Adsorptionseigenschaften Proteine, die in wäßrigen Medien enthalten sind, wirksam und selektiv zu adsorbieren.
Die Adsorption von Proteinen aus Proteinlösungen oder Proteindispersionen unter Verwendung des Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung wird im allgemeinen bei einem pH-Wert von 7 durchgeführt, kann jedoch auch bei einem pH-Wert im weiten Bereich von 1 bis 11 durchgeführt werden. Der für die Adsorption geeignete pH-Wert hängt von der Stabilität und dem isoelektrischen Punkt des zu adsorbierenden Proteins ab und v.-ird daher in Abhängigkeit von der Art des zu adsorbierenden Proteins bestimmt Es ist zweckmäßig, daß das Protein während des Adsorptionsvorganges in einer Pufferlösung gelöst ist, so daß der pH-Wert konstant gehalten werden kann. Als Beispiele geeigneter Pufferlösungen sind Puffer des Typs Glycin-Natriumchlorid-Salzsäure, Puffer des Typs Essigsäure-Natriumacetat, Puffer des Typs KaliumdihydrogenphosphatDinatriumhydrogenphosphat, Puffer des Typs Natriumhydroxid-Natriumchlorid-Glycin und Tris(hydroxymethyl)aminomethan zu nennen. Die Adsorption kann bei Temperaturen im Bereich von 2° bis 95° C, vorzugsweise 5° bis 60° C durchgeführt werden, wobei eine Temperatur von 10° bis 40°C besonders bevorzugt wird. Bei einer zu hohen Temperatür besteht die Möglichkeit, daß das Protein abgebaut wird. Bei zu niedriger Temperatur kann die Adsorptionsgeschwindigkeit des Proteins geringer werden.
Die Adsorption von Proteinen gemäß der Erfindung kann im allgemeinen durchgeführt werden, indem das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung mit einer Lösung oder Dispersion des Proteins zusammengeführt wird. Das Adsorptionsverfahren wird nachstehend ausführlich erläutert
Die Adsorption von Proteinen kann vorgenommen werden, indem das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung Protcinlösungen oder Proteindispersionen zugesetzt wird (Chargenverfahren). Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung kann für die Adsorption ohne Trocknung nach der Copolymerisation verwendet werden. Die pro Liter der zu behandelnden Lösung oder Dispersion zu verwendende Menge des Adsorptionsmittels muß im Bereich von 0,02 g bis 300 g, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 200 g liegen, wobei eine Menge von 1 bis 100 g auf Trockenbasis besonders bevorzugt wird. Da die adsorbierte Proteinmenge um so größer und die Adsorptionsgeschwindigkeit um so höher ist, je größer die Adsorptionsmittelmenge ist, sollte die zu verwendende Menge des Adsorptionsmittels in Abhängigkeit von der Menge des zu adsorbierenden Proteins und von der gewünschten Adsorptionszeit bestimmt werden. Die Adsorptionszeit liegt vorzugsweise im Bereich von 1 Minute bis 500 Stunden, insbesondere im Bereich von 5 Minuten bis 200 Stunden. Nach Bedarf wird die Lösung bewegt oder geschüttelt, um die Adsorption zu erleichtern und die für die Adsorption erforderliche Zeit zu verkürzen. Wenn die Lösung oder Dispersion bewegt oder geschüttelt wird, kann die Adsorptionszeit im Bereich von 10 Sekunden bis 100 Stunden, vorzugsweise im Bereich von 1 Minute bis 50 Stunden, insbesondere im Bereich von 10 Minuten bis 20 Stunden liegen.
Die Adsorption von Proteinen kann auch durchgeführt werden, indem Proteinlösungen oder -dispersionen durch eine Kolonne oder ein Filter, das mit dem Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung gefüllt ist, geleitet werden (kontinuierliches Verfahren). Das Mengenverhältnis zwischen Adsorptionsmittel und der zu behandelnden Lösung oder Dispersion ist fast das gleiche wie beim Chargenverfahren. Bei diesem kontinuierlichen Verfahren kann die Raumströmungsgeschwindigkeit der zu behandelnden Lösung oder Dispersion im Bereich von 0,01 Std.-1 bis 1000 Std.-', vorzugsweise im Bereich von 0,02 bis 500 Std.-', insbesondere im Bereich von 0,04 bis 100 Std.-1 liegen. Eine zu hohe Raumströmungsgeschwindigkeit hat Druckabfall und/oder Verringerung der Adsorptionsgeschwindigkeit zur Folge.
Anorganische oder organische Salze können einer Proteinlösung oder -dispersion zugesetzt werden, um den pH-Wert einzustellen, die Löslichkeit des Proteins zu steigern und/oder die zu adsorbierende Menge des Proteins zu erhöhen. Als spezielle Beispiele solcher Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumacetat und Natriumeitrat zu nennen. Die zuzusetzende Menge des Salzes beträgt im allgemeinen nicht mehr als 30 Gew.-%, vorzugsweise nicht mehr als 20 Gew.-%, bezogen auf die Proteinlösung oder -dispersion. Zu dem gleichen Zweck können wasserlösliche organische Substanzen der Proteinlösung oder -dispersion zugesetzt werden. Als spezielle Beispiele solcher wasserlöslichen organischen Substanzen sind Aceton, Methanol, Äthanol und Dimethylformamid zu nennen. Die zuzusetzende Menge der wasserlöslichen organischen Substanz beträgt nicht mehr als 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht mehr als 30 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 20 Gew.-% der Proteinlösung oder -dispersion.
Die Adsorptionszeit wird in geeigneter Weise in Abhängigkeit vom Zustand und von der Konzentration der zu behandelnden Proteinlösung und vom Adsorptionssystem, von der Adsorptionstemperatur und von anderen Bedingungen festgelegt.
Vor der Durchführung der Adsorption in der Praxis müssen optimale Bedingungen eingestellt werden. Dies wird erreicht, indem das Adsorptionsvermögen des Adsorptionsmiuels im Verlaufe der Zeit quantitativ bestimmt wird. Das Adsorptionsvermögen des Adsorptionsmittels für Proteine wurde nach den folgenden Methoden bestimmt: Zunächst wurde für den Fall der Durchführung der Adsorption nach dem Chargenverfahren die Konzentration des Proteins in der zu behandelnden Lösung oder Dispersion bestimmt. Die durch das Adsorptionsmittel adsorbierte Proteinmenge wurde aus dem Unterschied zwischen der Konzentration des Proteins in der ursprünglichen Lösung oder Dispersion und derjenigen in der behandelten Lösung oder Dispersion berechnet. Zweitens wurde im Falle der Durchführung der Adsorption nach dem kontinuierlichen Verfahren die zwischen dem Granulat des Adsorptionsmittcls vorhandene Proteinlösung oder -dispersion mit dem gleichen
Lösungsmittel das die Proteinlösung oder -dispersion enthielt, herausgewaschen. Das zum Waschen verwendete Volumen des Lösungsmittels betrug das 5fache des scheinbaren Volumens des Adsorptionsmittels. Die Menge des Proteins in der behandelten Lösung oder Dispersion einschließlich der Waschflüssigkeit wurde bestimmt. Der Unterschied zwischen der Proteinmenge in der ursprünglichen Lösung oder Dispersion und derjenigen in der behandelten Lösung oder Dispersion ist die vom Adsorptionsmittel adsorbierte Proteinmenge. Das Adsorptionsvermögen des Adsorptionsmittels für Proteine wird in mg adsorbiertes Protein pro g des trockenen Adsorptionsmittels angegeben. .
In letzter Zeit wurden technische'Anwendungen von Proteinen eingehend auf verschiedenen Gebieten untersucht Hierbei hat sich gezeigt daß die Entwicklung eines Adscrptionsverfahrens, das in allen vorstehend genannten funktionellen Aspekten ausgezeichnet ist, in der Technik gewünscht wird. In diesem Sinne stellen die Adsorptionsmittel für Proteine und das Verfahren gemäß der Erfindung einen großen technischen Fortschritt
Bei der Adsorptionschromatographie, die ein typisches Beispiel einer Abtrennung und Reinigung von natürlichen organischen Verbindungen im Laboratoriumsmaßstab ist wird der Unterschied der Adsorptionskraft zwischen einem Adsorptionsmittel und zu behandelnden Substanzen oder einem Lösungsmittelmolekül ausgenutzt. Bei diesem Trenn- und Reinigungsverfahren werden heute anorganische Substanzen wie Aktivkohle, Aluminiumoxyd, Siiiciumdioxyd, Calciumphosphat und Magnesiumsilicat als Adsorptionsmittel verwendet. Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung weist Vorteile in verschiedener Hinsicht gegenüber diesen üblichen Adsorptionsmitteln auf. Beispielsweise kann das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung in einer viel besseren Kugelform hergestellt werden. Seine mechanische Festigkeit ist sehr hoch, und das Adsorptionsmittel kann wiederholt verwendet werden. Daher ist es bei Verwendung des Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung möglich, die Adsorptionschromatographie im großen Maßstab durchzuführen. Ferner ist das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung frei von einem bei anorganischen AdsorptionsmiUeln häufig vorhandenen Nachteil, d. h. dem Nachteil, daß zu trennende Substanzen durch die Adsorptionsmittel zersetzt werden. Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung ermöglicht daher eine sehr stabile Handhabung instabiler Proteine. Auf Grund dieser Vorteile kann das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung wirksam als Träger für die Adsorptionschromatographie verwendet werden. Ferner ist bei geschickter Ausnutzung der vorstehend genannten Beziehung zwischen dem Porendurchmesser und dem Adsorptionsvermögen für Proteine auch eine selektive Trennung von Proteinen möglich.
Die Desorption eines vom Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbierten Proteins kann durch Schwächen der Adsorptionskraft zwischen dem Adsorptionsmittel und dem Protein beispielsweise nach einer der folgenden repräsentativen Methoden oder einer Kombination dieser Methoden erreicht werden:
1. Eine Methode, bei der eine Elutionslösung, die ein Salz enthält für den Fall verwendet wird, in dem die Proteinlösung oder -dispersion kein Salz enthält.
2. Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die ein Salz enthält, dessen Konzentration von derjenigen des Salzes in der Proteinlösung oder -dispersion verschieden ist, für den Fall verwendet wird, in dem die Art des Salzes in der Elutionslösung die gleiche ist wie in der Proteinlösung oder -dispersion.
3. Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die ein anderes SaIi. als die Proteinlösung oder -dispersion enthält verwendet wird. .
4. Ein Verfahren, bei dem in Fällen, in denen die Proteinlösung oder -dispersion kein wasserlösliches organi sches Lösungsmittel enthält, eine Elutionslösung verwendet wird, die ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel enthält.
5. Ein Verfahren, bei dem in Fällen, in denen die Art des Lösungsmittels in der Elutionslösung die gleiche ist wie in der Protcinlösung oder -dispersion, eine Elutionslösung verwendet wird, die ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel enthält, dessen Konzentration von derjenigen des Lösungsmittels in der Proteinlösung oder -dispersion verschieden ist.
6. Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung verwendet wird, die eine andere Art eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels als die Proteinlösung oder -dispersion enthält.
7. Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die ein Tensid enthält, verwendet wird.
8. Ein Verfahren, bei dem die Desorption bei einer anderen Temperatur als die Adsorption durchgeführt wird.
9. Ein Verfahren, bei dem eine Elutionslösung, die einen anderen pH-Wert als die Proteinlösung oder -dispersion hat, verwendet wird.
Als spezielle Beispiele der vorstehend genannten Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumacetat und Natriumeitrat zu nennen. Als spezielle Beispiele der vorstehend genannten wasserlöslichen organischen Lösungsmittel sind Aceton, Methanol, Äthanol und Dimethylforamid zu nennen. Geeignete Bedingungen für die Elutionsbehandlung werden in Abhängigkeit von der Art des zu eluierenden adsorbierten Proteins und von der Zusammensetzung und Struktur des Adsorptionsmittels gewählt.
2) Entfernung von Proteinen
Bei gewissen Produkten wird die Qualität äußerst stark verschlechtert, wenn geringfügige Proteinmengen darin enthalten sind. Ais Beispiel solcher Produkte kann roher japanischer Sake genannt werden. Roher japanischer Sake ist trübe, wenn Proteine darin enthalten sind. Durch Verwendung des Adsorptionsmittels gemäß der <r> Erfindung können Proteine, die in rohem japanischem Sake enthalten sind, mit Sicherheit mit hohem Wirkungsgrad entfernt werden, und die Qualität des Sake kann ohne jede Verschlechterung der Eigenschaften des Produkts erheblich verbessert werden. Ferner weist das Verfahren zur Abtrennung der Proteine unter Verwcn-
dung des Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung große Vorteile gegenüber üblichen Verfahren wie Koagulierung und Fällung unter Verwendung von Persimonen-Tannin, Superzentrifugalabscheidung und Trennverfahren unter Verwendung eines Enzyms hinsichtlich der Leichtigkeit des Adsorptionsvorganges und der Nachbehandlung auf. Dieses Verfahren ermöglicht die vollständige, wirtschaftlich vorteilhafte Entfernung der Proteine. Das Verfahren gemäß der Erfindung eignet sich ebenso für die K lärung von Getränken wie Bier, Wein u. dgl. und von anderen Produkten.
Das Protein-Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung eignet sich ferner für die Entfernung von Proteinen aus proteinreichen Abwässern (z. B. Abwässern, die bei Lebensmittelverarbeitungsverfahren anfallen). In diesemFall weist das Verfahren unter Verwendung des Protein-Adsorptionsmittels gemäß der Erfindung Vorteile gegenüber üblichen biologischen Verfahren, z. B. gegenüber dem Belebtschlammverfahren u. dgl. auf, weil die Behandlung in kürzerer Zeit durchgeführt und der Raumbedarf für die Behandlung erheblich verringert werden kann.
3) Verwendung als Copolymer-Protein-Verbundmaterialien
Vorstehend wurde die Verwendung des erfindungsgemäßen Copolymerisats selbst als Adsorptionsmittel beschrieben. Nachstehend wird auf die Vorteile eines Verbundmaterials eingegangen, das ein poröses Copolymerisat und ein Protein enthält
Im lebenden Körper· sind paarweise die verschiedensten Substanzen mit bestimmter Wechselwirkung, beispielsweise ein Enzym und ein Substrat, ein Enzym und ein Inhibitor sowie ein Antigen und ein Antikörper vorhanden. Ein Komplex wird aus diesen paarweise vorliegenden Substanzen gebildet Einige Komplexe sind sehr stabil, jedoch sind, einige der anderen Komplexe nur vorübergehend als Zwischenstufen vorhanden und werden leicht zersetzt. Enzym-Substrat-Komplexe gehören zum letztgenannten Typ. Unter diesen Substanzen befinden sich zahlreiche Proteine, und wenn sie am Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbiert und fixiert werden, können sie den verschiedensten Anwendungen zugeführt werden.
Ein an einem in Wasser unlöslichen Träger fixiertes Enzym ist als immobilisiertes Enzym allgemein bekannt. Ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen durch physikalische Adsorption hat gegenüber der chemischen Bindungsmethode den Vorteil, daß das Enzym durch die Fixierbehandlung kaum abgebaut wird und der Träger mit dem dran fixierten Enzym ständig gebraucht werden kann, während ihm frisches Enzym zugeführt wird. Die praktische Anwendung dieses Verfahrens ist jedoch nicht weit fortgeschritten, weil das Adsorptionsvermögen des Trägers gering und die am Träger adsorbierte Enzymmenge begrenzt ist.
Im Gegensatz hierzu hat das Protein-Adsoi ptionsmittel gemäß der Erfindung ein so hohes Adsorptionsvermögen für Proteine, daß wenigstens einige zehn mg eines Proteins pro g des trockenen Copolymerisats adsorbiert werden können. Ferner läßt sich das einmal adsorbierte Protein durch destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser und Gebrauchswasser kaum eluieren, so daß das Verbundmaterial aus dem Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung und dem daran adsorbierten Enzym als solches für enzymatische Reaktionen verwendet werden kann.
Die Affinitätschromatographie ist ein Trennverfahren, das auf dem Prinzip beruht, daß eine physiologisch aktive Substanz an einem Träger fixiert wird und eine andere physiologisch aktive Substanz durch Ausnutzung der Wechselwirkung zwischen den beiden physiologisch aktiven Substanzen abgetrennt wird. In letzter Zeit hat dieses Verfahren große Aufmerksamkeit in der Technik auf sich gezogen. Das Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung wird wirksam als Träger für die Durchführung dieses Trennverfahrens verwendet. Als typische Beispiele von Stoffen, die im Adsorptionsmittel adsorbiert und fixiert werden, sind Enzyme, Antigene und Antikörper zu nennen. Übrigens verursacht die Verwendung eines bifunktionellen Reaktanten, der als Proteinvernetzungsmittel bekannt ist, z. B. Glutaraldehyd, keinerlei Störung, wenn diese Proteine am Adsorptionsmittel gemäß der Erfindung adsorbiert sind. Im Gegenteil kann in diesem Fall die Bindungskraft zwischen dem Adsorptionsmittel und dem Protein und die Bindungskraft zwischen den Proteinen selbst gesteigert und der Anwendungsbereich des Verfahrens erweitert werden.
Bei einem Copolymer-Protein-Verbundmaterial beträgt die Proteinmenge vorzugsweise wenigstens 10 mg, insbesondere wenigstens 20 mg pro Gramm des trockenen Copolymerisats.
so Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert.
Beispiel 1
In einen mit Rückflußkühler, doppelflügeligem Rührer und Thermometer versehenen Dreiliter-Dreihalskolben wurden 55 g frisch destilliertes Acrylnitril, 45 g Divinylbenzol (das eine Reinheit von 56% hatte und 44% Vinyläthylbenzol als Verunreinigung enthielt, nachstehend als »56%iges Divinylbenzol« bezeichnet), 130 g Acetophenon, 120 g Decalin, 1 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und 1 g2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) gegeben. Durch Rühren wurde eine homogene Lösung gebildet. Dieser Lösung wurden 127Og destilliertes Wasser zugesetzt, in dem 6,25 g teilweise verseiftes Polyvinylacetat (mit einer Viskosität von 2"? cPs, gemessen bei 20"C ho an einer 2%igen wäßrigen Lösung, und einem Vcrseifungsgrad von 88%) und 12,5 g Natriumchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 45°C, 2 Stunden bei 500C, 2 Stunden bei 60°C und 4 Stunden bei 700C erhitzt, während es mit 300 UpM gerührt wurde. Während der Reaktion wurden Proben in bestimmten Abständen genommen. Ein Benzolextrakt der Probe wurde durch Gaschromatographie analysiert. Die Menge der verbliebenen Monomeren wurde gemessen, um die Ausbeute an Copolymerisat zu bestimmen. Hierbei wurde b5 bestätigt, daß unter den vorstehend genannten Bedingungen die Ausbeute an Copolymerisat über 98% lag. Da Acrylnitril einen niedrigen Siedepunk; hat, mußte der Wirkungsgrad des Rückflußkühlers durch Durchleiten von kaltem Wasser gesteigert werden.
Das erhaltene Copolymerisat hatte eine gute Kugelform. Der Korndurchmesser war im Bereich von 60 bis
120 μ verteilt. Nach NaÜklassierung unter Verwendung eines Siebes mit einer Maschenweite von 74 μ wurden nicht umgesetzte Monomere und organische Flüssigkeiten mit Methanol entfernt. Ein Teil des als Rückstand verbleibenden Copolynierisats wurde entnommen und 18 Stunden bei 60° Gunter vermindertem Druck getrocknet, wobei eine Probe für die Messung mit einem Porosimeter erhalten wurde. Der Rest des Copolymerprodukts wurde mehrmals mit Wiasser gewaschen.
Die Messungen ergaben, daß das gebildete Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,21 g/ml, einen mittleren Porendurchmesser von 1200 Ä Und ein gesamtes Porenvolumen von 2,28 cmVg hatte. Ferner Wurde festgestellt, daß das Volumen der P'oren mit einem Durchmesser im Bereich von 600 bis 2400 Ä 0,87 cm3/g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als »R-l« bezeichnet.
Beispiel 2
Ein Copolymerisat in Granulatform wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch das Acetophenon in einer Menge von 200 g und das Decalin in einer Menge von 50 g verwendet wurden. Der Korndurchmesser war im Bereich von SO bis 140 μ verteilt, und das Copoiymerisat hatte ein Schüttgewicht von 0,25 g/cm3, einen mittleren Porendurchmesser von 200 A und ein Gesamtporenvolumen von 1,83 cmVg. Ferner wurde festgestellt, daß die Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 100 bis 400 Ä ein Volumen von 0,86 cmVg hatten.
Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als »R-2« bezeichnet.
Beispiel 3
Ein Copolymerisat in Granulatform wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch 250 g Benzonitril an Stelle des flüssigen Gemisches von Acetophenon und Decalin zugesetzt wurden. Es wurde festgestellt, daß der Korndurchmesser im Bereich von 70 bis 150 μ verteilt war und das Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,28 g/cm3, einen mittleren Porendurchmesser von 80 Ä und ein Gesamtporenvolumen von 1,18 ml/g hatte. Das Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 40 bis 160 Ä betrug 0,50 cm3/g. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als »R-3« bezeichnet
Vergleichsbeispiel 1
In den bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch verwendeten Kolben wurden 110 g Acetonitril, 90 g 56°/oiges Divinylbenzol, 2 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und 2 g 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) gegeben. Dem Ansatz im Kolben wurden 1000 g destilliertes Wasser zugesetzt, das 5 g des gleichen teilweise verseiften Polyvinylacetals wie in Beispiel 1 und 15 g Natriumchlorid gelöst enthielt. Während das Gemisch mit 350 UpM gerührt wurde, wurde die Polymerisation nach dem gleichen Temperaturprogramm wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet. Die Ausbeute an Copolymerisat berug 97%. Messungen ergaben, daß das erhaltene Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,62 g/cm3 hatte. Die Messung mit dem Porosimeter ergab, daß keine Porenstruktur im Copolymerisat ausgebildet worden war. Dieses Copolymerisat wird nachstehend als »C-l« bezeichnet.
B e i s ρ i e 1 4
Ein Copolymerisat wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch 100 g Acetophenon und 50 g Decalin als Flüssigkeiten verwendet wurden. Es zeigte sich, daß der Korndurchmesser im Bereich von 100 bis 180 μ verteilt war und das Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,31 g/cm3, einen mittleren Porendurchmesser von 1100 Ä und ein Gesamtporenvolumen von 0,97 cm3/g hatte. Ferner wurde gefunden, daß das Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 550 bis 2200 Ä 0,40 cm3/g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als »R-4« bezeichnet
Beispiel 5
In den in Beispiel 1 beschriebenen Kolben wurden 10 g Hydroxyapatit, 10 g Hydroxyäthylcellulose mit einer Viskosität von 250 cPs, gemessen bei 20°C an einer 2%igen wäßrigen Lösung, 20 g Calciumchlorid und 2000 ml destilliertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde bei 70° C gerührt, bis sich eine homogene Lösung bildete. Die Temperatur der Flüssigkeit wurde dann auf 30° C gesenkt Während die wäßrige Lösung mit 300 UpM gerührt wurde, wurde eine homogene Lösung aus 50 g Acrylnitril, 10 g Äthylenglykoldimethacrylat, 40 g Styrol, 300 g Chlorbenzol, 0,25 g t-Butylpervalerat und 0,75 g Benzoylperoxyd auf einmal der wäßrigen Lösung zugesetzt Die Reaktion wurde nach dem vorbestimmten Temperaturprogramm, nämlich 30 Minuten bei 3O0C, 1 Stunde bei 40° C, 2 Stunden bei 50° C 2 Stunden bei 60° C 2 Stunden bei 70° C und 2 Stunden bei 80° C durchgeführt Das erhaltene Copolymerisat wurde mit Wasser gut gewaschen, worauf die Porencharakteristiken gemessen wurden. Es wurde gefunden, daß der Korndurchmesser im Bereich von 90 bis 260 μ verteilt war und das Copolymerisat einen mittleren Porendurchmesser von 500 Ä und ein Gesamtporenvolumen von 2,02 ml/g hatte. Ferner wurde festgestellt daß das Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 250 bis 1000 A 1,03 cm3/g betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als »R-5« bezeichnet
10
40 45 50 55
Beispiel 6
In den in Beispiel 1 beschriebenen Kolben wurde eine Lösung aus 50 g Methacrylnitril, 50 g Divinylbenzol von 80% Reinheit, 200 g Äthylbenzol, 100 g Isooctanol und 1 g Lauroylperoxyd gegeben. Eine gesondert hergestellte Suspendierlösung (1650 g einer wäßrigen Lösung, die 8 g Methylcellulose mit einer Viskosität von 100 cPs, gemessen bei 20°C an einer 2%igen wäßrigen Lösung, und 48 g Natriumchlorid enthielt) wurde dem Ansatz im Kolben zugesetzt. Während das Gemisch bei 200 UpM gerührt wurde, wurde es eine Stunde bei 60° C, 4 Stunden bei 750C und 3 Stunden bei 90°C gerührt. Das erhaltene Copolymerisat wurde mit Wasser gewaschen, worauf seine Porencharakteristiken gemessen wurden. Es wurde gefunden, daß der Korndurchmesser im Bereich von 150 bis 250 μ verteilt war und das Copolymerisat ein Schüttgewicht von 0,20 g/cm3, einen mittleren Porendurchmesser von 3000 Ä und ein Gesamtporenvolumen von 2,68 cmVg hatte. Es wurde ferner gefunden, daß das Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 1500 bis 6000 Ä 1,05 cmJ/g betrug, Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als »R-6« bezeichnet.
Beispiel 7
In ein druckfestes 100-ml-Glasgefäß wurden 20 g Acrylnitril, 5 g Ν,Ν'-Äthylendiacrylamid, 0,2 g 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril), 30 g Dimethylformamid und 20 g Toluol gegeben. Das Gefäß wurde verschlossen und das Gemisch bewegt, bis sich eine homogene Lösung bildete. Die Lösung wurde 2 Stunden bei 40° C, 4 Stunden bei 60° C und 2 Stunden bei 8O0C erhitzt. Das verschlossene Gefäß wurde gekühlt und dann zerbrochen. Das erhaltene Copolymerisat wurde isoliert, gemahlen, nach der Naßmethode unter Verwendung von Sieben mit Maschenweiten von 74 bis 177 μ klassiert und mit einer genügenden Menge Aceton gewaschen, um die flüssigen Komponenten zu entfernen. Dann wurden die Eigenschaften des Copolymerisats mit einem Porosimeter bestimmt. Das Copolymerisat hatte ein Schüttgewicht von 0,26 g/cm3, einen mittleren Porendurchmesser von 800 A und ein Gesamtporenvolumen von 1,65 cm3/g. Das Volumen der Poren mit Durchmessern im Bereich von 400 bis 1600 A betrug 0,73 cmVg. Das poröse Copolymerisat wird nachstehend als »R-7« bezeichnet.
Beispiel 8
Zu 10 ml einer Lösung, die 30 mg eines der in Tabelle 1 genannten Proteine enthielt, wurden 0,5 g des nassen porösen Copolymerisats R-I gegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 300C geschüttelt. Eine Fällung wurde durch Zentrifugalabscheidung entfernt. Die Konzentration des Proteins im Überstand wurde nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern gemessen (O. H. Lowry und Mitarbeiter, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265). Der Unterschied zwischen der so bestimmten Proteinkonzentration und der für das vom Copolymerisat R-I freie System gemessenen Proteinkonzentration wurde als die Menge des adsorbierten Proteins angenommen. Für Urease, Katalase, «-Chymotrypsin, Trypsin und Pepsin wurde ferner die restliche enzymatische Aktivität im Überstand gemessen.
Ferner wurde die enzymatische Aktivität der am Copolymerisat adsorbierten Enzyme nach den nachstehend beschriebenen üblichen Methoden bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt. Die adsorbierte Menge der Proteine ist in mg/g trockenes Copolymerisat angegeben.
Die Aktivität der Urease wurde nach der Methode von D. D. Vanslyke und Mitarbeitern (J. Biol. Chem. 154 (1944) 623) und die Aktivität der Katalase nach der Methode von H. U. Bergmeyer bestimmt (Biochem. Z. 327 (1955) 255). Die Aktivität von «-Chymotrypsin wurde nach der Methode G. W. Schwert und Mitarbeitern (Biochem. Biophysica Acta 16 (1955) 570) und die Aktivität von Pepsin nach der Methode von L M. Baker und Mitarbeitern (J. Biol. Chem. 211 (1954) 701) bestimmt
Tabelle 1
Protein
Molekulargewicht Isoelektrischer Punkt
Urease der 470 000
Jackbaumfrucht
Katalase von 240 000
60 Rindsleber
Menschl. 160 000
^-Globulin
Menschl. 68 000
Hämoglobin
I 65 Ovalbumin 45 000
I Pepsin 35 000
I ^-Chymotrypsin von 25 000
I Rinderpankreas
5.0—5.1
5.8—73 6.8-7.0
4.7 1.0 9.1
Menge des
adsorbierten
Proteins,
mg 		Aktivität des
adsorbierten
Enzyms,
% 		Restliche
Aktivität
des Enzyms
im Überstand
Vo
160 11 33
60 3 73
100 — —
110 — —
90
120
110		 10
8		 50
45
14
Beispiel 9
Auf die in Beispiel 8 beschriebenen Weise wurde Trypsin (mit einem Molekulargewicht von 20 000 und einem isoelektrischen Punkt von 10,0) am porösen Copolymerisat R-I adsorbiert. Die Menge des adsorbierten Proteins betrug 130 mg/g trockenes Copolymerisat und die restliche enzymatische Aktivität im Überstand 45%. Das erhaltene Copolymer-Protein-Verbundmaterial wurde in eine Kolonne gefüllt. Eine 0,05-molare Tris(Hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung von Benzoylargininäthylesterhydrochlorid als Substrat (Konzentration 34 g/l, pH 8,0) wurde mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 2 Std.-1 durch die Säule geleitet. Nach einer Kontaktdauer von 96 Std. betrug die relative Aktivität des adsorbierten Enzyms 70%.
Die Aktivität des Trypsins wurde nach der Methode von G. W. Schwert und Mitarbeitern (Biochem. Biophysica Acta 16(1955) 570) bestimmt.
Beispiel 10 und Vergleichsbeispiel 2
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die Mengen des an den porösen Copolymeren R-2 und R-3 adsorbierten Proteins für die in Tabelle 1 genannten Proteine und Trypsin bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt.
Zum Vergleich wurden die am nicht-porösen Harz C-I adsorbierten Mengen dieser Proteine bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 genannt.
Tabelle 2
Protein Menge des adsorbierten Proteins, R-3 C-1
mg/g trockenes Copolymerisat 10 0
R-2 20 0
Urease 20 0 0
Catalase 30 50 -·)
^-Globulin 10 30 10
Hämoglobin 110 60 -·)
Ovalbumin 50 80 10
Pepsin 80 80 5
«-Chymotrypsin 130
Trypsin 140
— *) Nicht gemessen.
Beispiel 11
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die in Tabelle 3 genannten Proteine am Copolymerisat R-I adsorbiert. Das Copolymer-Protein-Verbundmaterial wurde in eine Kolonne gefüllt. Dann wurde das Verbundmaterial mit Wasser in einer Menge, die dem 3fachen Fassungsvermögen der Kolonne entsprach, gewaschen. Das Protein wurde mit einer Elutionslösung in einer Menge, die dem 5fachen Fassungsvermögen der Kolonne entsprach, eluiert Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3
Protein
Molekulargewicht
Isoelektr. Punkt
Menge des adsorbierten Proteins (mg/g trockenes Copolymere«)
Elutionslösung
Proteingewinnung,
Albumin von
menschl Serum
Cytochrom C
vom Pferdeherz
Bacitracin
65 000 4,7 170
13 000 10 30
1 400 7 130
20%iges(V/V)
Aceton
0,2-molarer
Phosphatpuffer
0,In-HCI
91
70
85
Beispiel 12 und Vergleichsbeispiel 3
Die Mengen des an den porösen Copolymerisaten R-2 und R-3 adsorbierten Proteins wurden für die in Tabelle 3 genannten Proteine nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt Zum Vergleich wurden die Mengen der am nicht porösen Harz C-I adsorbierten Proteine in der gleichen Weise bestimmt Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 4 genannt
15
Tabelle 4
P.otein
Menge des adsorbierten Proteins, mg/g des trockenen Copolymerisate R-2 R-3 C-I
Serumalbumin Cytochrom C Bacitracin
180
150
100
10
120
— *) Nicht gemessen.
Beispiel 13
Durch eine Kolonne, die einen Innendurchmesser von 1,1 cm hatte und mit 10 ml des porösen Copolymerisate R-I gefüllt war, wurden 21 roher japanischer Sake, der nach dem üblichen Verfahren hergestellt worden war, mit einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 10 Std.-' geleitet. Vor und nach der Behandlung wurde die Flüssigkeit der Superzentrifugalabscheidung (30 Minuten unter 50 000 G) unterworfen. Die Trockengewichte der vor und nach der Behandlung in der Kolonne erhaltenen Fällungen wurden gemessen und verglichen. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Fällung
Roher japanischer Sake
Behandelter japanischer Sake
Entfernte Menge der Fällung
105 ppm 5 ppm 95%
Beispiel 14
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die Trypsinmengen, die an den porösen Copolymerisaten R-4, R-5, R-6 und R-7 adsorbiert wurden, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.
Tabelle 5
Copolymerisat Menge des adsorbierten Trypsins, mg/g des trockenen Copolymerisate
R-4 80
R-5 120
R-6 100
R-7 150
Beispiel 15 bis 18
Die Polymerisation wurde in dem gleichen Kolben wie in Beispiel 1 auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt, wobei jedoch die Zusammensetzung des Ansatzes unterschiedlich war. Die Zusammensetzung des Ansatzes und die Porencharakteristiken sind in Tabelle 6 genannt
Tabelle 6
50 Beispiel 55 16(R-16) Monomeres Flüssigkeit Schüttgewicht Mittlerer Gesamtporen- Porenvolumen
Nr. Porendurchmesser volumen (0,5 d bis
17(R-17) (A) 2d)
15(R-15) AN 10g CH 20g 0,22 g/ml 1400 A 1,88 ml/g —" 0,77 ml/g
60 18(R-18) DVB 90g IAA 180g
AN 46g CH 66g 0,19 g/ml 500A 1,52 ml/g 0,61 ml/g
DVB 54g IAA 154g
AN 64g CH 40g 0,19 g/ml 2800 A 1,99 ml/g 0,98 ml/g
DVB 36g IAA 160g
AN 82g CHlOOg 0,17 g/ml 2400 A 1,44 ml/g 0,60 ml/g
DVB 18g IAAlOOg
AN —Acrylnitril CH = Cyclohexanon DVB =56%iges Divinylbenzo!
IAA =-Isoamylacetat
Porenvolumen (0,5 d bis 2 d): Volumen der Poren mit einem Porendurchmesser im Bereich von 0,5 d bis 2 d.
Die gemäß den Beispielen 15 bis 18 erhaltenen porösen Copolymerisate werden nachstehend als »R-15«, »R-16«, »R-17« und »R-18« bezeichnet
16
Vergleichsbeispiel 4
In den gleichen Kolben wie in Beispiel 1 wurden 20 g Acrylnitril, 180 g 56%iges Divinylbenzol, 2 g 2£'-Azobisisobutyronitril und 2 g 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) und 1000 g reines Wasser gegeben, in dem 5 g des gleichen teilweise verseiften Polyvinylacetats wie in Beispiel 1 gelöst waren. Dem Ansatz wurden 15 g Natriumchlorid zugesetzt. Während das Gemisch bei 350 UpM gerührt wurde, wurde die Polymerisation nach dem gleichen Temperaturprogramm wie in Beispiel 1 durchgeführt. Ebenso wurde die Aufarbeitung auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt Die Ausbeute an Copolymerisat betrug 98% und das Schüttgewicht des erhaltenen Copolymerisate 0,59 g/cm3. Die Messungen mit dem Porosimeter ergaben, daß das Copolymerisat keine Poren enthielt Dieses Copolymerisat wird nachstehend als »C-4« bezeichnet
Vergleichsbeispiel 5
In den gleichen Kolben wie in Beispiel 1 wurden eine homogene Lösung von 100 g 56%igem Divinyibenzol, 80 g Tetralin, 120 g Cyclohexanol und 1 g Benzoylperoxyd gegeben. Dieser Lösung wurden 1500 g reines Wasser zugesetzt, das 9 g Methylcellulose (mit einer Viskosität von lOOcPs, gemessen bei 200C an einer 2°/oigen wäßrigen Lösung) gelöst enthielt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 6O0C, 3 Stunden bei 700C und 4 Stunden bei 8O0C gerührt wobei ein Copolymerisat mit einem Korndurchmesser von 60 bis 200 μ und einem Schüttgewicht von 0,23 g/cm3 erhalten wurde. Die Messungen mit einem Porosimeter ergaben, daß der mittlere Porendurchmesser 1300 Ä, das gesamte Porenvolumen 1,63 ml/g und das Volumen der Poren mit einem Durchmesser von 650 bis 2600 A 0,53 g/cm3 betrug. Dieses poröse Copolymerisat wird nachstehend als »C-5« bezeichnet.
Beispiel 19 und Vergleichsbeispiel 6
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden die Mengen des an den porösen Copolymerisaten R-15, R-16, C-4 und C-5 adsorbierten Proteins bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 genannt.
Im vorliegenden Fall wurden Serumalbumin, Λ-Chymotrypsin und Lipase als zu untersuchende Proteine verwendet.
Tabelle 7
Protein Adsorbierte Menge des Proteins
mg/g des trockenen Copolymerisats R-15 R-16 C-4 C-5
Serumalbumin 120 150 10 30
^-Chymotrypsin 90 90 5 20
Lipase 130 190 10 30
Beispiel 20
Ein Gemisch von 80 g Λ-Chloracrylnitril, 20 g Trimethylolpropantrimethacrylat, 300 g Toluol und 1 g Benzoylperoxyd wurde der Suspensionspolymerisation in einer wäßrigen Lösung aus 2000 g reinem Wasser, 20 g Carboxymethylcellulose mit einer Viskosität von 300 cPs (gemessen bei 20° C an einer 2°/oigen wäßrigen Lösung) und 40 g Natriumchlorid unterworfen. Das Temperaturprogramm der Polymerisation und die Aufarbeitung waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser: 5000 A
Gesamtporenvolumen: 2,42 cm3/g 5C
Volumen der Poren mit einem
Durchmesser im Bereich von
2500 bis 10 000 A: 1,36 cm3/g
Be is pi el 21 5'
Ein Gemisch von 50 g Λ-Phenylacrylnitril, 50 g 8O°/oigem Divinylbenzol, 200 g ;'-Butyrolacton und 2 g 2,2'-Azobisisobutyronitril wurde der Suspensionspolymerisation in einer wäßrigen Suspension von 80 g BaSC>4 und 10 g der in Beispiel 6 genannten Methylcellulose in 2000 g reinem Wasser unterworfen. Das Temperaturprogramm der Polymerisation und die Aufarbeitung waren die gleichen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das erhaltene 6( Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 800 Ä
Gesamtporenvolumen 2,03 ml/g
Volumen der Poren mit einem t>:
Durchmesser im Bereich von
400 bis 1600A 1,01 cmVg
Beispiel 22 Zu 100 ml einer 0,1-molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0), in der 50 mg Urease (760 Einheiten/mg) gelöst
waren, die aus der Jaclcbrotbaumfrucht extrahiert worden war, wurden 10 g des nassen porösen Copolymerisats
R-16 gegeben. Die erhabene Suspension wurde 4 Std. bei 25° C gerührt Das erhaltene Verbundmaterial aus Copolymerem und Urease wurde in eine Kolonne gefüllt (Innendurchmesser 1,5 cm, Höhe 10 cm), die mit Mantel
und Glasfilter versehen war. Durch die Kolonne wurden 50 ml 0,1-molare Phosphatpufferlösung (25° C, pH 7,0) von oben nach unten geleitet Anschließend wurde eine 0,1-molare wäßrige Harnstofflösung (pH 7,0} bei 37° C mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 200 ml/Std. durch die Kolonne geleitet Die Bestimmung des erhaltenen
ίο Ammoniaks ergab, daß die Zersetzung des Harnstoffs 95% betrug.
Die enzymatische Aktivität der Urease wurde nach der folgenden Methode bestimmt: Die enzymatische Reaktion des Harnstoffs wurde bei einem pH-Wert von 7,0 bei 37° C durchgeführt Das erhaltene Ammoniak wurde mit Hilfe der Nesslerschen kolorimetrischen Analyse bestimmt Die enzymatische Aktivität der Urease, die für die Bildung von 1 μ Mol Ammoniak/Std. erforderlich ist wird als 1 Einheit bewertet
Beispiel 23
Jeweils 1 g der in Tabelle 8 genannten trockenen porösen Copolymerisate wurden zu 10 ml Rinderserum gegeben, das 120 mg Proteine enthielt. Die erhaltenen Suspensionen wurden 2 Stunden bei 35° C geschüttelt. Die Proteine im Überstand und die am porösen Copolymerisat adsorbierte Proteinmenge wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 genannt
Die Proteine wurden durch Messung der optischen Dichte (278 π>μ) bestimmt. Tabelle 8
Copolymerisat Menge der adsorbierten Proteine,
mg/g des trockenen Copolymerisats
R-I 78
R-16 63
R-17 61
R-18 58
Vergleichsbeispiel 7
Ein Gemisch von 90 g 56%igem Divinylenzol, 10 g Styrol, 50 g Toluol, 100 g sek.-Butanoi und 1 g Benzoylperoxyd wurde der Suspensionspolymerisation im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise unterworfen. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 200 A Gesamtporenvolumen 0,78 ml/g Dieses Copolymerisat wird als »C-7« bezeichnet.
Vergleichsbeispiel 8
In die gleiche Kolonne wie ein Beispiel 22 wurde 1 g des trockenen Copolymerisats C-7 gefüllt Durch die Kolonne wurden Methanol und dann 200 ml Wasser geleitet, wobei das nasse Copolymerisat erhalten wurde. Unter Verwendung dieses nassen Copolymerisats wurden im wesentlichen die gleichen Versuche, die in Beispiel 22 beschrieben wurden, wiederholt. Eine Adsorption von Urease wurde nicht festgestellt.
Vergleichsbeispiel 9
Ein Gemisch von 55 g Acrylnitril, 45 g 56%igem Divinylbenzol, 30 g Decalin, 1 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und
1 g 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) wurde im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise der Suspensionspolymerisation in einer wäßrigen Lösung unterworfen, die aus 650 g reinem Wasser, 3 g teilweise
ω verseiftem Polyvinylacetat, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, und 6 g Natriumchlorid bestand. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 600 Ä
Gesamtporenvolumen 0,20 ml/g
Die am erhaltenen Copolymerisat adsorbierte Proteinmenge wurde nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 genannt.
io
Tabelle 9
Protein
Menge des adsorbierten Proteins
mg/g des trockenen Copolymerisats
Katalase 10
Hämoglobin 15
Trypsin..-r ...,. ... I 10
Bacitracin. 25
. ... Beispiel 24
Die Mengen des an den porösen Copolymerisaten R-5, R-6, R-20 und R-21 adsorbierten Proteins wurden nach der folgenden Methode bestimmt: In eine Glaskolonne (Innendurchmesser 1,5 cm, Höhe 10 cm) mit Mantel und Glasfilter wurden 2 g des jeweiligen porösen Copolymerisats gefüllt. Durch die Säule wurden 50 ml Methanol und dann 200 ml Wasser geleitet. Anschließend wurden 100 ml Wasser, das jeweils 100 mg der in Tabelle 10 genannten Proteine enthielt, von oben nach unten bei 3O0C und einer Raumströmur.gsgeschwindigkeit von 4 Std.-' und anschließend 10 ml Wasser durchgeleitet Die durchgeleitete Flüssigkeit wurde eingedampft, worauf die restlichen Proteine gewogen wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 10 genannt.
Tabelle 10
Protein
Menge des adsorbierten Proteins,
mg/g des trockenen Copolymerisats
^-Globulin 32 36 21
Hämoglobin 28 35 31
Urease 41 35 26
Vasopressin 29 31 —
Fibrinogen 38 19 —
Be ispiel 25
26
33
32
In eine Kolonne (Innendurchmesser 1 cm, Höhe 10 cm), die mit einem Glasfilter versehen war, wurden 5 g des nassen Copolymerisats R-19 gefüllt. Zu 10 ml Rinderblut wurden 1 mg des Natriumsalzes von Heparin und 90 ml Wasser gegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei 300C und einer Raumströmungsgeschwindigkeit von 15 Std.-1 durch die Kolonne geleitet. Hierbei wurden 98% des in der Lösung enthaltenen Hämoglobins am Copolymerisat adsorbiert. Das Hämoglobin wurde durch Adsorption bei 555 μιη und 430 μιη im sichtbaren Spektrum bestimmt.
Beispiel 26
Im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde ein Gemisch von 50 g Acrylnitril, 30 g Styrol, 20 g Äthylenglykoldimethacrylat, 100 g Toluol, 10 g Polystyrol mit einem Molekulargewicht von 40 000 und 2 g 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril) der Suspensionspolymerisation in einer wäßrigen Lösung von 1000 g reinem Wasser, 5 g teilverseiftem Polyvinylacetat, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, und 10 g Natriumchlorid unterworfen. Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
Mittlerer Porendurchmesser 2000 Ä
Gesamtporenvolumen 0,82 cmVg
Volumen der Poren mit einem Durchmesser im Bereich von
1000-4000 Ä 0,54 cnWg
Die am erhaltenen porösen Copolymerisat adsorbierte Menge des Proteins wurde nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 11 genannt.
Tabelle 11
Protein
Menge des adsorbierten Proteins
mg/g des trockenen Copolymerisats
Trypsin
Ovalbumin
Serumalbumin
30 18 42
19
Vergleichsbeispiel 10
Im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde die Suspensionspolymerisation durchgeführt, wobei als Monomere 12 g 56°/oiges Divinylbenzol und 48 g Acrylnitril, als organische Flüssigkeit 260 g Toluol s und 40 g Cyclohexanol und als Initiator 0,4 g 2,2'-Azobisisobutyronitril und 0,4 g 2,2'-Azobis(dimethylvaleronitril) verwendet wurden. Das erhaltene Copolymerisat war so spröde, daß es beim Klassierungsvorgang leicht zusammenfiel. Das Reaktionsgemisch wurde daher in ein Becherglas gegeben. Dem Gemisch wurde warmes Wasser von 50°C in der lOfachen Menge der für die Polymerisationsreaktion verwendeten wäßrigen Lösung zugesetzt Das hierbei erhaltene Gemisch wurde sachte gerührt und dann stehen gelassen. Der erhaltene ίο Überstand wurde entfernt Diese Reihe von Maßnahmen wurde zweimal wiederholt Anschließend wurden die gleichen Maßnahmen zweimal unter Verwendung von Aceton in einer Menge, die dem lOfachen scheinbaren Volumen des Copolymerisats entsprach, und anschließend zweimal unter Verwendung von Wasser wiederholt Das erhaltene Copolymerisat hatte die folgenden Porencharakteristiken:
15 Mittlerer Porendurchmesser 1500A
Gesamtporenvolumen 5,12 ml/g
In eine Kolonne mit einem Innendurchmesser von 1 cm und einer Höhe von 10 cm wurden 5 g des nassen Copolymerisats gefüllt Eine wäßrige Lösung von Ovalbumin wurde durch die Kolonne geleitet Das Filter 20 wurde durch das Pulver des Copolymersats verstopft und der Durchlauf der Flüssigkeit im Laufe des Adsorptionsvorgangs verhindert
Die am Copolymerisat adsorbierte Menge des Proteins wurde nach der in Beispiel 8 beschriebenen Chargenmethods bestimmt Sie betrug 110 mg/g, jedoch betrug das Schüttgewicht nur 0,05. Daher war die pro Volumeneinheit adsorbierte Proteinmenge gering, und starke Pulverisierung des Copolymerisats wurde selbst während 25 der chargenweise durchgeführten Adsorption festgestellt.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Adsorptionsmittel für Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem porösen Copolymerisat besteht, das hergestellt worden ist durch Copolymerisation eines Monomerengemisches aus 2 bis 98 Gew.-% wenigstens eines Cyangruppen enthaltenden Monomeren der allgemeinen Formel
CN
CHj=C (A)
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